Imaging Cleared Intakta biologiska system på cellnivå av 3DISCO

Neuroscience
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO. J. Vis. Exp. (89), e51382, doi:10.3791/51382 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Den histologiska undersökningen av biologiska vävnader är en grundläggande strategi för att förstå vilken typ av molekyler / celler i deras naturliga sammanhang. Idealt är högupplösande avbildning av hela organet mest informativa och önskas. Eftersom ljuset har ett begränsat inträngningsdjup, på grund av spridning 1, fasta organ måste sektionerad för att utföra hög upplösning mikroskopisk avbildning. Därför är de flesta av de histologiska studier görs på några vävnadssektioner som representerar endast en liten del av organet. I vissa studier, till exempel, de som syftar till att spåra ut neuronala kopplingar i hjärnan eller ryggmärgen, alla sektioner vävnad från målorganen samlas och avbildas på en 3D-rekonstruktion. Dock har vävnadssnittning och efterföljande avbildning av enskilda avsnitt olika begränsningar. Dessa inkluderar att vara tidskrävande och leder till en ofullständig 3D-rekonstruktion av vävnaden, på grund av mekaniska snedvridningar och svåratalet i anpassningen av de resulterande bilderna.

Nyligen har clearing-och bild intakta transparenta organ tagits fram som en viktig lösning på denna brist 2,3. Vid röjning, är hela organet återges transparent vilket gör att imaging ljus att resa end-to-end (figur 1) för att producera högupplösta bilder av den unsectioned orgel med hjälp av en laserskanning mikroskop såsom en multifoton eller ljus-ark mikroskop ( Figur 2). Olika forskargrupper har utvecklat nya vävnad clearing-protokoll för att kunna bilden sitt vävnaden av intresse för olika ändamål. Dessa inkluderar organiskt lösningsmedel 2-5, vatten 6,7 och elektrofores baserad 8 clearingprotokoll. Bland dem, 3-dimensionell avbildning av lösningsmedel rensas organ eller 3DISCO är en lätt tillämplig protokoll på en mängd olika biologiska prover, inklusive centrala nervsystemet (CNS) organ, immun organ och solida tumörer. I additjon, kan den kombineras med olika mikroskopitekniker som ljus ark fluorescensmikroskopi (LSFM), multi fotonen och konfokal laserscanningsmikroskopi. 3DISCO baseras på clearing med lätt tillgängliga och billiga reagens, såsom tetra-hydrofuran (THF) och dibensyleter (DBE) 4. Hela protokollet kan ta så kort som 3-4 timmar. Således är 3DISCO en robust och snabb teknik jämfört med traditionella histologiska metoder som kan ta veckor till månader att slutföra 9.

Protocol

Alla djurförsök har utförts i enlighet med IACUC (Institutional Animal Care och användning kommittén) föreskrifter om möss ~ 3-5 månader gammal. Författaren förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

1. Animal perfusion och Tissue Förberedelser

Timing: 30-60 min per mus + efter fixering (några timmar till över natten).

  1. Väg djuret och söva använda ketamin (80-200 mg / kg) och xylazin (7-20 mg / kg) eller 2,5% avertin (0,5 ml per 25 g kroppsvikt IP).
  2. Vänta några minuter för anestesi för att ta fullständig effekt.
  3. Nyp tån och svans av djuret för att se till att djuret är helt sövd.
  4. BEGJUTA djuret först vid RT med 0,1 M fosfatbuffert (PB) eller 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under 5-10 min tills blod bort fullständigt från vävnaden.
  5. Växla perfusionen till fixeringslösning: 4% PFA i 0,1 M PB (eller 0,1 M PBS) och fortsätt perfusionmed 4% PFA i 30 till 40 minuter vid en hastighet av 3 ml / min.
  6. Dissekera orgeln / s intresse försiktigt utan att skada, till exempel, undvika att punktera och klämma den vävnad som håller på att dissekeras.
  7. Ta bort extra vävnad som omger organen (bindväv, meningerna eller dura materia) i en petriskål fylld med PBS.
  8. Post-fix organen i 4% PFA för några timmar eller över natten vid 4 ° C. Undvik lång efter fixering eftersom PFA kan utsläcka signalen eller öka autofluorecense övertid 10 speciellt för GFP-kanal (som är ett mindre problem i röda och bortre röda kanaler).
  9. Tvätta organen 2-3x med PBS vid RT strax innan clearingförfarandet.

2. Vävnads Clearing

Timing: 2-3 tim för små organ och 1-4 dagar för stora organ.

Obs: Den fluorescerande märkning av vävnaderna genom transgenuttryck, viral transfektion, färgämne Spåra eller antikroppsmärkning bör slutföras innan du rensar. Alla vävnadsclearing steg utförs vid RT. De clearinglösningar THF, DBE, Babb (1 del bensylalkohol och 2 del bensylbensoat) och diklormetan är giftiga och inandning (utföra experiment i ordentligt ventilerat dragskåp) och direkt kontakt med huden bör undvikas (använd nitrilhandskar).

  1. Förbered 50% (vol / vol), 70%, och 80% THF utspädningar i destillerat vatten i separata glasflaskor som följer: För 50% THF, till exempel, blanda 25 ml THF och 25 ml destillerat vatten i en glasflaska med volymen av större än 50 ml.
  2. Blanda lösningar genom att försiktigt skaka flaskan i en 1-2 min.
  3. Märk glasflaska tydligt.
  4. Stäng säkert flaskorna och hålla arbetslösningar i ett mörkt skåp. För bästa resultat, använd inte samma arbetslösningar längre än 1-2 veckor. Därför beställer clearinglösningar som den minsta volymen tillgänglig för att kunna använda nya stamreagens.
  5. Fyll glasflaskor (t.ex. 2-3 ml) med den första clearinglösning, 50% THF, och överföra organ från PBS i glasflaskor för att starta clearing.
  6. Säkert stänga glasflaskor med tillhörande lock och använd en rotator (t.ex. ett hjul omrörare) för omrörning.
  7. Använd aluminiumfolie för att täcka och hålla glasflaskor i mörker. Starta rotator omröras samplen i de glasflaskor för den angivna tiden (tabell 1) vid en konstant hastighet (~ 30 rpm).
  8. Avlägsna clearing lösning och lägga till nästa en i protokollet när tiden i tabell 1 är slutförd.
  9. Samla clearingavfall till glasavfallsbehållare som hålls i en huva.
    Upprepa föregående steg för varje clearinglösning i protokollet till slutet. Använd en ny pasteurpipett när ett nytt clearinglösning tillsätts (t.ex. byte från THF till DBE).
  10. Vid slutclearingsteget med BABB eller DBE kan inkubationstiderna förlängas eller shortened tills proverna blir helt transparent i synligt ljus (eller gulaktig / transparent om det är en mycket stor vävnad som hjärnan).
  11. Håll rensas organ i den slutliga clearinglösning på alla gånger inklusive avbildningssteg.

3. Förbereda Cleared Organ för Imaging

Timing: 5-15 min.

OBS: Bild clearade organ så snart som en fullständig utläkning uppnås. I detta syfte följande steg för att förbereda prover för ljus-ark mikroskopi (t.ex. Ultra) eller konfokala / multi-foton mikroskopi avbildning.

OBS: Cleared organ kommer att förlora sin fluorescens styrka över tid (i synnerhet fluorescerande proteiner t.ex. GFP, antikropps märkning är mer motståndskraftig och kan även ge bättre resultat med längre inkubationer). För avbildning kan olika fluorescerande mikroskopi tekniker kan användas så länge som korrekt hantering av de organ i Clearing lösning uppnås.

  1. För lätt-ark mikroskopi
    1. Placera eller montera provet på lämpligt sätt.
    2. Fäst rensas orgel genom att manuellt vrida skruven i provhållaren 4.
    3. Doppa provet i avbildningskammaren (företrädesvis gjord av glas) av thelight ark mikroskop som är fylld med BABB eller DBE, vilket som användes vid den slutliga clearingsteget.
  2. För flera foton / konfokalmikroskopi
    1. Montera provet på en avbildning slide (eller avbildning kammare) med den slutliga bildlösning för att kunna bilden med en multi foton eller konfokalmikroskopi, som normalt använder olja eller vatten nedsänkta mål.
    2. Använd dentala cement för att göra en ram runt vävnaden.
    3. Fyll poolen med BABB eller DBE strax innan dentalcement blir helt stel.
      Obs! Dentala cement stelnar snabbt; öva några gånger för att bekanta sig med det innan du försöker själva proven.
    4. Placera omedelbartden rensas prov i mitten av poolen och täck den med ett täckglas.
    5. Tryck på täckglaset tills det är helt förseglad med tandcement och rör vid ytan av den rensas organ, vilket gör det möjligt att nå den maximala bilddjupet genom konfokala / multi-foton mikroskopi.
      Anmärkningar: Detta säkerställer att ingen clearinglösning kommer att spillas under avbildning. Undvik att doppa avbildningslinsen direkt i clearing-lösning, som kan skada objektivet om det inte är resistent mot BABB / DBE eller har en skyddskåpa.

4. Imaging Cleared Organs

Timing: 15-45 min.

  1. Samla en z-scan som omfattar hela rensas vävnaden (om den använda objektivet tillåter) till bästa upplösning som mikroskopet kan leverera.
  2. Zooma in på de områden av intresse för att samla in bilder med högre upplösning.

5. Prövning av data med Software Amira

  1. Ladda bild series till programvara Amira med ResolveRT modul.
  2. Mata in korrekta voxel storlekar i "Bild Läs Parameter"-fönstret och tryck på ok.
  3. Välj "Multi Planer Se" sub-applikation. Använd sedan "Tjocklek" reglaget för att välja den optimala tröskeln för de gråvärden, om justering av 2D-och 3D-värden.
  4. Visualisera provet genom att bläddra i skivor i olika 2D-orienteringar och använda gröda-hörnmodul i 3D-vy.
    Anm: En detaljerad felsökningsguide för protokollet återfinns i Ertürk m.fl. 4.

Representative Results

Nervceller är starkt polariserade celler med extremt lång morfologi. Deras funktion beror på de anslutningar som de bildar mellan varandra och med andra vävnader. Därför är det mycket viktigt att kartlägga den strukturella organisationen av neuronerna för att förstå hur de fungerar i hälsa och sjukdom. Men spåra sådana enorma neuronala kopplingar i hela nervsystemet-nyligen namngivna connectomics 11 - fortfarande ett av de svåraste utmaningarna i neurovetenskap. I detta syfte har både EU-12 och USA 13 initierat stora projekt för att kartlägga den mänskliga hjärnan.

Medan 3DISCO kan användas på olika organ, har det varit särskilt användbart för att spåra långa neuronala anslutningar i ryggmärgen och hjärnan. Exempelvis med användning av Ultramicroscopy skanningar av stora clearas ryggmärgssegment, de axonala förbindelser kan följas över centimeter i gnagare ryggmärgen (Figur 2). På ett liknande sätt kan hela rensas mushjärna (figur 3a) och hippocampus (figur 3b) skall avbildas följa neuronala anslutningar i hjärnan.

När konfokala eller flera foton mikroskopi används på clearade organ, kan bildupplösning förbättras avsevärt, särskilt i z-mått. Exempelvis flerfotonavbildning uppklarade ryggmärg från GFP-M linjemöss (figur 4a) uppnår en sömlös bild genom hela djup (~ 1,5-2 mm) i ryggmärgen. Confocal micro på rensas ryggmärgen ger bättre upplösning på ett liknande sätt (figur 4b och c). Multi foton mikroskopi avbildning av clearade hjärnor ger mycket hög upplösning för att visualisera fina detaljerna i neuronala strukturer inklusive Dendritutskotten (Figur 5). Proverna för 3DISCO kan märkas på olika sätt, bland annat transgenexpression, viral transfektion, färgämne spårning och märkning antikropp. Till exempel är det möjligt att märka hela kärlsystemet i hjärnan (fig 6a och b) och ryggmärgen (fig 6c och d) med användning av lektin-konjugerat fluorescerande spårämnen 4, som kan användas för att undersöka blod-hjärn-barriären (BBB ) i hälsa och sjukdom.

Både mikroglia och astrocyter är starkt inblandad i patologin vid neurodegeneration inklusive Alzheimers sjukdomar och traumatiska skador 14,15. Använda 3DISCO, kan studeras deras täthet och fördelning i ryggmärgen (Figur 7) eller hjärnan.

Icke-neuronala vävnader kan också avbildas. Till exempel kan Clara celler i hela gnagar lungorna vara immunolabeled med antikroppar och avbildas utan sektionering på en enda cell nivå (figur 8). På samma sätt är det möjligt att rensa och bildceller, t.ex.alfaceller i unsectioned bukspottkörteln vävnad (Figur 9).

Figur 1
Figur 1. 3DISCO vävnad clearing gör unsectioned vävnader transparent för djup vävnad avbildning. Oförtullade (a) och rensas (b) ryggmärgsvävnad som ses av synligt ljus. Vid röjning, blir djup vävnad laser-scanning mikroskopi möjligt. (C) Oförtullade och rensas ryggmärgs vävnader avbildas av 2-foton mikroskopi. Skala barer i a, b = 0,5 mm och i c = 100 nm.

Figur 2
Figur 2. 3DISCO avbildning av ryggmärgen att följa axonal anknytningar. Den dissekerade ryggmärg från Thy-1 GFP transgen mus linje (GFP-M) delas upp i mindre bitar (~4 mm). Efter efter clearing protokoll för små vävnader (tabell 1) de transparenta ryggmärg visualiserades med hjälp av Ultra. 3D-rekonstruktioner av en ~ 4 mm ryggmärgssegment i horisontell (a), koronalt (b) och sagittalvy (c). (D) Representant spåras axoner (röd) visas i gråskala transparent vy. (E) Hög förstoring vy av den indikerade regionen i (d). Skalstrecken på a, b, c, d = 0,5 mm och i e = 20 | im.

Figur 3
Figur 3. 3DISCO avbildning av rensas hjärnan och hippocampus. Exempel på clearade hjärnor och hippocampus av GFP-M möss avbildas med en ultramicroscope. 3D-visualiseringar av hela hjärnan (a) och hippocampus (b) visar det neuronala näRKS i de avbildade genomskinliga vävnader. Skala barer i a = 2 mm och i B = 20 um.

Figur 4
Figur 4. Tissue clearing förhöjer upplösningen som erhålls genom flerfoton och konfokalmikroskopi. Transparenta ryggmärgs segment från GFP-M möss avbildas av multifoton (a) eller konfokalmikroskopi (b, c). Observera att rensa avsevärt förbättrar upplösningen och bilddjup avslöjar den fina strukturen av axoner och dendriter. Skalstrecken på a = 100 ^ m och i b, c = 20 pm.

Figur 5
Figur 5. 3DISCO avbildning av Dendritutskotten. Transparent hjärnvävnad från GFP-M möss avbildas av multifoton. 3D-visualiseringar av skannade cortex region presenteras i vertiska (a) och horisontella perspektiv (b). (C) ~ 50 fim utsprång från de angivna nivåerna i (a, b). (D) Hög förstoring av det angivna området i (c) visar de fina detaljerna i de neuronala strukturer inklusive Dendritutskotten (pilspetsar). Skala barer i en = 50 um, i b, c = 25 nm, i d = 5 nm.

Figur 6
Figur 6. 3DISCO i kärlsystemet. För att märka blodkärlen i hela organ, var lektin-FITC färgämne används under perfusion (före clearing) som beskrivs 16. Det är anmärkningsvärt att nämna att vi funnit att svansvenen injektion av spårämnet ger bättre signal över hjärt perfusion av spårämnet. Efter att samla de fasta hjärna och ryggmärg, de rensas och jagskadad av Ultramicroscopy. 3D-visualisering av hela mushjärna vaskulaturen i heatmap (a) och gråskale-(a). (B) 3D visualisering av kärlsystemet hos en mus ryggmärg segmentet i heatmap (c) och gråskala (d). De heatmaps genererades utifrån intensiteten av lektin färgning; blå: låg intensitet (bakgrund) och röd: hög intensitet (kärlsystemet). Skalstrecken på a = 2 mm, b = 1 mm, och i c, d = 250 | im.

Figur 7
Figur 7. 3DISCO av gliaceller i rensas CNS vävnad. De ryggmärg av transgena möss som uttrycker GFP i mikroglia TGH (CX3CR1-EGFP) eller astrocyter TGN (hGFAP-ECFP) röjdes och avbildas av flera foton mikroskopi. 3D-rendering av mikroglia visas som ytan volym visualisering (a) och öppen utsikt ( (C) En optisk projektion (~ 50 mikrometer) presenteras för att visa detaljerna i mikroglia i ryggmärgen. 3D-rendering av astrocyter visas som ytan volym visualisering (a) och öppen utsikt (b). (F) En optisk utsprång (~ 50 ^ m) presenteras för att visa detaljerna i de astrocyter i ryggmärgen. Skalstrecken på a, b, d, e = 100 ^ m och i C, F = 50 | im.

Figur 8
Figur 8. 3DISCO av en hel-mount lunga lob med antikropp färgning av clara celler. För antikroppar färgning hela-berget av lunglober, var 10 veckor gamla BALB / C honmöss perfusion genom höger kammare med PBS för att ta bort blod från lungorna. Lungor därefter uppblåst med 4% PFA och fast O / N vid RT i fixativ minst tre gånger volymen av the vävnad. Nästa dag avlägsnades lungorna korthet sköljdes i PBS och den högra loben placerades i 5 ml av 1% Triton X-100 i PBS under permeabilisering för 48 h eller tills vävnaden sjönk. Alla färgningar utfördes i 0,2% Triton X-100 i PBS innehållande 5% FBS och 2% BSA och sköljningar var i 0,2% Triton X-100 i PBS. Färgning med anti-CC10 var för 72 timmar vid 4 ° C följt av omfattande tvättningar i ca 6 timmar. Fluorescent märkning av den primära antikroppen uppnåddes med anti-get-Alexa Fluor-594 sekundär antikropp över natten vid 4 ° C följt av omfattande tvättningar i 6 timmar till över natten. Följande dag var färgade lober clearas av 50%, 70%, och 80% THF i 30 min vardera följt av tre 30 min tvättar i 100% THF, följt av 20 min i DCM, följt av 30 min i DBE. Skalstrecken i a och b = 1 mm och i c = 100 | im.

Figur 9
Figur 9. 3DISCO av bukspottkörteln. Efter perfusion av möss som beskrivits ovan i protokollet, bukspottkörteln dissekerades och rensas med den korta protokollet. Den fluorescens som härrör från ROSA26 LSL tdTomato rekombination inducerad av tamoxifen-behandling av möss som bär en 200 kb BAC-transgen som spänner över den endogena mus-glukagon-lokuset med CreERT2 införda i ATG hos glukagon. De pilspetsar markerar några av de fluorescerande-märkta alfaceller i holmen. Skala barer i a, b och c = 1 mm och i d = 500 nm.

Tabell 1
Tabell 1. Vävnads clearing protokoll för olika vävnader. Exempel på vävnads clearing protokoll för olika vävnader. Observera att clearingtiden för varje steg kan förkortas eller förlängas efter behov för att förbättra clearing prestanda. Den ungefärliga vikten av små vävnader är ~ 20-100 mg och hjärnan är ~ 300-500 mg.TTP :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av den här tabellen.

Discussion

Vävnads clearing metoder syftar till att minska spridningen av imaging ljus genom att matcha brytningsindex för olika vävnadsskikt i clearade organ. Som ett resultat kan det bildgivande ljuset tränger djupt in i vävnader och stimulera de märkta celler / molekyler. Denna gamla begreppet vävnad clearing 17 har fått allt större uppmärksamhet efter det första sofistikerad tillämpning av tekniken på intakta mushjärnor av Dodt och kollegor 2. Sedan dess finns det en snabbt växande lista över clearingmetoder inklusive 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLARITY och SeeDB 3,4,7,18-20. I huvudsak de alla syftar till att göra de organ transparenta för djup vävnad avbildning genom att bevara den fluorescerande märkningen. Bland dem, 3DISCO står ut som en av de mest enkla och reproducerbara metoder. Det är relativt snabbt jämfört med andra clearing metoder som nämnts ovan (1-5 dagar vs 2-3 veckor för vuxna hjärnor, respektive) 21. Det har redan blivit succétillämpas fullt ut till olika organ såsom hjärna, ryggmärg, lymfkörtlar, mjälte, lungor, solida tumörer, bukspottkörtel, och bröstkörtlar 3,4,9. Dessutom har flera publikationer av oberoende forskargrupper redan använt denna metod för att få avbildning resultat 22,23. Likväl kan olika vävnadsclearingförfaranden vara fördelaktigt för olika förhållanden. Till exempel, medan Sca / e och SeeDB gäller bäst på embryonala vävnader 6,7, de är vattenbaserade clearingmetoder, vilket kan vara lättare att hantera under avbildning. I motsats härtill är KLARHET en komplicerad och kostsam clearing metod. Men det kan vara fördelaktigt i samband med märkning av antikroppen, särskilt i stora vävnader såsom hjärna 8.

Det mest kritiska steget för att uppnå bästa resultat bildbehandling från 3DISCO är vävnad märkning, som sker innan vävnaden clearing. Det är viktigt att börja med den starkaste fluorescerande signal möjlig. Detta kan be uppnås på olika sätt, bland annat transgent uttryck av fluorescerande proteiner, spårning av syntetiska färgämnen, viral transfektion eller märkning antikropp. Man bör komma ihåg att alla clearingförfarandet kommer att minska fluorescenssignalen av vävnaderna. Därför, om den fluorescerande signalen inte är tillräckligt stark i början - det vill säga det är inte lätt upptäckas innan clearing-avbildning av de clearade vävnader kommer att leverera dåliga resultat.

Det finns vissa begränsningar för clearing metoder som väntar på förbättringar. En kritisk begränsning är att eftersom clearing reagens förändra strukturen på de röjda organ, kan de inte användas på levande vävnad. Därför bör experiment som med fotoaktiverbart mEos2 24 utföras innan det fastställs och clearing. Vid röjning, blir super-upplösning avbildning av fluorescenssignalen från ljusa och fotostabila proteiner möjligt. Dessutom, eftersom clearing-protokollet minskarintensiteten av fluorescerande proteiner, kan clearas organ inte lagras under längre perioder. Det är viktigt att notera att vissa organ är svårare att rensas. Speciellt om de dissekerade organ behåller höga halter av blodkroppar (t.ex. mjälte, lever), de är relativt svåra att rensa och bild. Det är också relativt svårare att uppnå en fullständig clearing för stora vävnader såsom vuxen gnagare hjärnan. Sådana vävnader kan behöva längre inkubationstider, vilket kan, å andra sidan, minskar den fluorescerande signalen. Vidare utveckling av mikroskopi metoder som kan bild stora transparenta organ på en gång på en hög upplösning är en väntan behöver åtgärdas. En annan viktig begränsning av tekniken är vävnads märkning. Samtidigt som en stark fluorescerande signal via genetisk eller virus uttryck är perfekt, kan inte varje cell eller molekyl märkas genetiskt eller viralt. Å andra sidan, är antikroppsmärkning av tjocka vävnader inte är ett enkelt förfarande, eller till och med inte possible i de flesta fall. Det kan behöva speciella permeabilization protokoll och långa inkuberingstider (flera dagar till några veckor) 3. Det är också viktigt att komma ihåg att vävnaderna krympa ~ 20% i varje dimension (mätt för ryggmärgsvävnad) efter röjning främst på grund av uttorkning och delipidering. Denna krympning inträffar ratiometrically och bör korrigeras i kvantifiering steg. Som observerats i de presenterade resultaten, fluorescerande strukturer förblir intakta, vilket är tecken på protein integritet i de röjda vävnaderna. På grund av den hydrofoba naturen hos den slutliga raderas vävnad, kan den inte färgas vidare med antikroppar eller bäddas in i vatteninnehållande lösningar t.ex. Focusclear-som används i KLARHET-eller 80% glycerol. Slutligen är det en utmaning att analysera väldigande storlekar av bilddata. Till exempel när en hel mus hjärna skannas på en cellulär upplösning, skulle det vara mycket svårt att spåra och kvantifiera önskad structures (t.ex. neuronal eller glia-nät) och jämföra över olika prover på ett automatiserat sätt. Sammanfattningsvis, medan forskare syftar till att ta reda på nya clearingmetoder, de olika utmaningarna ovan (svårigheten att rensa olika vävnader, avbildning med hög upplösning på större områden, och komplicerade dataanalys) bör förbättras parallellt.

Sammanfattningsvis nyligen utvecklade mjukpappersröjningsteknik inklusive 3DISCO, elegant visa att hög upplösning 3D-avbildning av intakta organ är nu möjligt. Med hjälp av dessa metoder, kan forskarna få anatomisk information av celler och molekyler i den intakta organ. Dessa banbrytande 3D imaging studier på genomskinligt organ inspirerar allt fler forskare att dechiffrera komplexa anatomiska och molekylära organisationer av vävnader / organ i hälsa och sjukdom.

Disclosures

Det finns inget att lämna ut.

Acknowledgments

Vi tackar C. Höjer för kritisk läsning av manuskriptet, B. Bingöl (Genentech) för deltagande i skript berättelser, N. Bien-Ly för att dela upplevelsen av förbättrad kärlavbildning med svansvenen injektion av lektin färgämne, och M Solloway (Genentech ) för de möss som användes i bukspottkörteln imaging. GFP-M linje skapades av J. Sanes (Washington University i St Louis) och CX3CR1-GFP möss av R. Littman (NYU). Arbetet stöds av Genentech, Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thy-1 GFP (GFP-M) mouse Can be obtained from Jackson.
CX3CR1 GFP mouse Can be obtained from Littman lab at NYU.
TgN(hGFAP-ECFP) mouse Can be obtained from Jackson.
Paraformaldehyde Sigma P6148
Na2HPO4 Mallinckrodt 7917-16
NaH2PO4 Mallinckrodt 7892-04
2-2-2 Tribromoethanol Sigma T48402
2-Methyl-2-butanol Sigma 152463 Used to prepare Avertin solution.
Saline Braun
Tetrahydrofuran Sigma 186562-12X100ML
Dichloromethane Sigma 270997-12X100ML
Dibenzyl ether Sigma Sigma, 108014-1KG
Benzyl alcohol Sigma 305197-100ML
Benzyl benzoate Sigma B6630-250ML
Lectin FITC Sigma L0401-1MG
anti-CC10 Santa Cruz SC-9772 0.388888889
Heparin APP pharmaceuticals 504001 Used in perfusion.
Glass vials VWR 548-0554
Forceps FST 11251-10
Mini Rotator VWR 100498-878
Aluminum Foil Fisherbrand 01-213-104
100 ml Media Storage Bottles Kimax Media Bottles EW-34523-00
Minipuls evolution perfusion pump with MF4* medium flow pump head Gilson, Inc F110701 and F117606
Microscopy slide VWR 48311-703
FastWell Grace Bio-Labs FW20
Cover slip Corning 2940-245
Glass petri dish Corning Pyrex 3160-101
Dental cement Lang Dental 1223PNK
Quantofix Peroxide Test Strips Sigma 37206
Amira with RT resolve microscopy module Visage Imaging image analysis software
Imaris Bitplane imaging image analysis software
ImageJ NIH freeware

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tuchin, V. Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis. SPIE Press. (2007).
  2. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  3. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18, 166-171 (2012).
  4. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  5. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, (2012).
  6. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  7. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  8. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  9. Erturk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
  10. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
  11. Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome. Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).
  12. Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy. Cornea. 25, 497-498 (2006).
  13. Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).
  14. Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. Microglia in neurodegenerative disease. Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).
  15. Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice. Neurology. 2, 679-689 (2006).
  16. Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
  17. Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten. S. Hirzel. (1903).
  18. Smith, C., et al. The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury. Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).
  19. Zotova, E., et al. Microglial alterations in human Alzheimer's disease following Abeta42 immunization. Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).
  20. Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. Bilateral cochlear implantation in Friedreich's ataxia: A case study. Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).
  21. Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).
  22. Luo, X., et al. Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury. Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).
  23. Soderblom, C., et al. Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury. J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).
  24. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6, 131-133 (2009).

Comments

1 Comment



  1. Conventionally we are limited in the knowledge of biology and science due to lack of resources and researches. But now as we are moving in new era, researchers are getting great benefit to study developmental problems and disease. Now various medical devices are out there whose example is available at http://www.ilexmedical.com/products.php?act=cat helping researchers to look inside an organism and figure out what exactly went wrong and when. Researchers can thoroughly look tissues, organs and even an entire body without any trouble. Certainly such techniques are practical for many fields in biology!!!!

    Reply
    Posted by: Isabella L.
    March 25, 2015 - 8:13 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics