MicroRNA Expression Profiler af menneskelige iPS celler, retinale pigmentepitel arvet fra iPS og Føtal retinale pigmentepitel

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

MicroRNA (miRNA) profiler af human induceret pluripotente stamceller (iPS-celler), retinal pigment epitel (RPE) fra humant induceret pluripotente stamceller (iPS) celler (iPS-RPE), og føtal RPE, blev sammenlignet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Greene, W. A., Muñiz, A., Plamper, M. L., Kaini, R. R., Wang, H. C. MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (88), e51589, doi:10.3791/51589 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Formålet med denne rapport er at beskrive de protokoller til sammenligning af microRNA (miRNA) profiler af human induceret pluripotente stamceller (iPS-celler), retinal pigment epitel (RPE) afledt af humane iPS celler (iPS-RPE), og føtal RPE. Protokollerne omfatter indsamling af RNA til analyse ved microarray og analyse af microarray data til at identificere miRNA, der udtrykkes forskelligt blandt tre celletyper. Metoderne til dyrkning af iPS celler og føtale RPE er forklaret. Den protokol, der anvendes til differentiering af RPE fra human iPS er også beskrevet. RNA-ekstraktion teknik beskriver vi blev udvalgt til at tillade maksimal genvinding af meget små RNA til anvendelse i en miRNA microarray. Endelig cellulære vej og netværk analyse af microarray data forklaret. Disse teknikker vil lette sammenligningen af ​​de miRNA profiler af tre forskellige celletyper.

Introduction

Stamceller har evnen til at replikere uden begrænsning og potentialet til at differentiere til enhver somatiske celletype. Udviklingen af teknikker til at omprogrammere somatiske celler i pluripotente stamceller har fremkaldt stor begejstring i forskerkredse og blandt klinikere, som fremkomsten af personlige vævsregenerering er på horisonten 1.. Induceret pluripotente stamceller (iPS-celler) udviser de samme funktioner i ubegrænset replikation potentiale og pluripotency som embryonale stamceller (ES) celler, mens omgå de etiske dilemmaer, der er forbundet med økonomiske og sociale råd. Desuden vil patientens stamceller ikke stimulerer et immunrespons, hvilket øger sandsynligheden for vellykket terapeutiske anvendelser 2-3. Under bestemte dyrkningsbetingelser har iPS celler blevet vist at differentiere til flere forskellige celletyper in vitro, herunder cardiomyocytter, neuroner, pancreas-beta-celler, hepatocytter og retinal pigment epithelium (RPE) 4-12.

RPE er en specialiseret lag af pigmenterede epitelceller placeret på bagsiden af ​​nethinden, der udfører en række funktioner, der er afgørende for visuel sundhed og funktion, såsom absorption af falsk lys, fagocytose af fotoreceptor ydre segmenter, og behandling af retinoider til fremstilling af visuel chromophor. Dysfunktion af RPE grund af skader eller sygdom påvirker dybt fotoreceptor sundhed og visuel funktion som det fremgår af blindende sygdomme, som er resultatet af underliggende RPE patologi, såsom aldersrelateret makulær degeneration (AMD), Stargardts sygdom og retinitis pigmentosa (RP) 13.. Virkelig effektive behandlinger, der kan genoprette vision ikke er blevet nået, og udskiftning af syge RPE med sund RPE kan være den bedste mulighed for at forhindre tab af synet 14-15. RPE afledt iPS (iPS-RPE) er en mulig kilde til celler til at erstatte den beskadigede RPE. iPS-RPE udtrykker kendetegntic RPE proteiner LRAT, CRALBP, PEDF og RPE65; viser den klassiske stærkt pigmenteret sekskantede RPE morfologi; og udfører RPE funktioner såsom fagocytose, retinoid behandling, og sekretion af 11 - cis retinal 5,16. Men før iPS-RPE kan bruges terapeutisk, IPS-RPE skal være grundigt karakteriseret. Forståelse af de faktorer, der styrer RPE differentiering er nødvendig for at forbedre udbyttet og renheden af ​​de celler, der skal anvendes til kliniske anvendelser.

Celledifferentiering er resultatet af stærkt reguleret genekspression. Epigenetisk ombygning af genomet og koordinering af transkriptionsfaktorer er nødvendige for celle skæbne beslutninger, der opstår under differentiering og udvikling 17.. Regulering af besked RNA (mRNA) oversættelse af microRNA (miRNA) præsenterer endnu et niveau af regulering, der påvirker celle skæbne 1. MiRNA er korte, ~ 22 nt, længder af nukleotider, der enten undertrykke oversættelsebinding til 3'UTR af mRNA eller målrette mRNA for nedbrydning. MiRNA er blevet påvist i næsten alle væv og til dato har over 2.000 unikke menneskelige microRNA er blevet registreret i miRBase databasen. Da miRNA kræver kun delvis komplementaritet til at binde til target mRNA, kan en enkelt miRNA potentielt binder til ti eller hundrede mål, og vice versa, dvs en enkelt mRNA kan målrettes ved flere forskellige miRNA. Denne promiskuøs binding egenskab dramatisk øger niveauet af kompleksitet regulering samt sværhedsgraden bestemme funktionerne enkelte miRNA og den rolle hver spiller i cellulære funktioner 18-21. Ikke desto mindre har undersøgelser vist, at miRNA raffinerer genekspression under differentiering ved at påvirke DNA methylering status 17. I en undersøgelse mere specifik RPE blev miR-204/211 vist sig at fremme epitel fænotype af RPE 22. En anden gruppe analyserede miRNA profilenaf RPE under differentiering fra ES-celler og afslørede forskellige sæt miRNA udtrykkes under differentieringsprocessen 23. Faktisk kan miRNA profiler utvetydigt at skelne celletyper, herunder ES-celler, precursorceller og terminalt differentierede celler 24,25. Over 250 miRNA er udtrykt i nethinden. Baseret på disse studier, vi hypotesen, at miRNA spiller en vigtig rolle under differentieringen af ​​RPE fra iPS.

Formålet med denne rapport er at beskrive de protokoller for differentiering af RPE fra IMR90-4 iPS celler, samling af RNA til analyse ved microarray og analyse af microarray data til at identificere miRNA, der udtrykkes forskelligt blandt tre celletyper, iPS celler IPS-RPE og føtal RPE. Totalt RNA blev ekstraheret fra kulturer af hver celletype og hybridiseret til en miRNA microarray indeholdende prober specifikke for 1.205 miRNAer og 144 virale miRNA. Microarray resultater blev sammenlignd for at bestemme, hvilke miRNA blev differentielt udtrykt blandt de forskellige celletyper. miRNA med 2 gange eller mere fold ændring i ekspressionen blev udvalgt til yderligere analyse. En miRNA analyse software program der blev brugt til at identificere potentielle mål for de differentielt udtrykte miRNA og skabe mobilnetværk reguleret af de udvalgte miRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Udarbejdelse af Kultur Reagenser og dyrkningsplader

  1. mTeSR1 medier: Forbered mTeSR1 medier i overensstemmelse med producentens anvisninger. Optøs 100 ml mTeSR1 5x supplement natten over ved 4 ° C. Tilsæt 100 ml mTeSR1 5x supplement til 400 ml mTeSR1 basale medier og bland godt. Dette medie er stabilt ved 4 ° C i op til 2 uger og ved -20 ° C i 6 måneder.
  2. Differentiering medier: Forbered differentiering medier i DMEM/F12 til opnåelse af 0,1 mM β-mercaptoethanol, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 2,0 mM L-glutamin, 10% knockout serum og 10 pg / ml gentamicin.
  3. iPS-RPE medier: Forbered iPS-RPE medier i MEM til opnåelse 1x N1 supplement, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 250 ug / ml taurin, 13 ng / ml triiod-L-thyronin natriumsalt, 20 ng / ml hydrocortison, 5 ug / ml gentamicin og 15% FBS 26.
  4. Triiod-L-thyronin natriumsalt stamopløsning. At forberede stamopløsning opløses 1,0 mg triiod-L-thyroninnatriumsalt i 1 N natriumhydroxid ved forsigtigt hvirvlende. Næste tilsættes 49,0 ml basismedier at 50,0 ml 20 ug / ml triiod-L-thyronin natriumsaltet. Forbered alikvoter og nedfryses ved -20 ° C indtil brug. Brug passende volumen for at opnå den ønskede koncentration i den endelige kultur medier.
  5. Hydrocortison stamopløsning: At forberede en hydrocortison stamopløsning, opløseliggøre 1 mg hydrocortison i 1 ml absolut ethanol ved forsigtig rystning. Næste tilføje 19,0 ml base-medier til 20 ml hydrocortison stamopløsning på 50 pg / ml. alikvot og fryse ved -20 ° C indtil brug. Brug passende mængde for at opnå den ønskede koncentration i den endelige kulturmedier.
  6. Føtal RPE vækstmediet. Forbered vækstmediet ved at blande alle reagenser i RTEGM kit i den basale medier, ifølge producentens instruktioner med undtagelse af FBS.
  7. Føtal RPE plating medier. Forbered plating medier ved at overføre en lille mængde af vækstmedier til en steril beholder og endd FBS til en slutkoncentration på 2%.
  8. Dispase: Forbered brugsopløsning af dispase på 1 mg / ml i DMEM/F12.
  9. Matrigel coatede plader: Forbered matrigel i DMEM/F12 til 0,08 mg / ml.
  10. Coat hver brønd i en plade med 6 brønde med 1,0 ml matrigel løsning.
  11. Inkubér coatede plader ved stuetemperatur i 1,0 timer.
  12. Efter 1,0 timers inkubation, aspirere overskydende DMEM/F12.
  13. Tilsæt 0,5 ml mTeSR1 medier for at undgå udtørring. Matrigel coatede plader er nu klar til brug.

2.. IPS Kultur

  1. Forud for iPS cellepodning har alle rør, varm mTESR1 medier til stuetemperatur, og Matrigel coatede plader klar.
  2. Hurtigt tø IMR90-4 iPS celler i et 37 ° C vandbad. Derefter fjerne cryovial fra vandbadet og sterilisere bruge 70% ethanol.
  3. Overfør cellerne til et 15 ml konisk rør ved anvendelse af en 2 ml pipette for at minimere afbrydelse af celleaggregater.
  4. Drop-wise tilsættes 5 ml warm mTeSR1 medier til cellerne og bland forsigtigt. Centrifuger cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten fjernes.
  5. Opblande forsigtigt celleaggregater i 2 ml mTeSR1 medier og frø cellerne på én brønd i en seks brønde.
  6. Pladen anbringes i en 37 ° C inkubator og kultur med 5% CO2, 95% fugtighed.
  7. Skift iPS cellekultur medier dagligt. Udifferentierede kolonier vises 5-7 dage efter såning. Check for udifferentierede kolonier, der er klar til passage (kolonier med en tæt center).

3.. Passage af iPS celler

  1. Forud for begyndelsen til passage iPS-celler, har alle rør, dispase løsning, DMEM/F12 og mTERS1 medier opvarmet til stuetemperatur, og matrigel overtrukne plader klar.
  2. Før passage iPS celler, fjern eventuelle områder af differentiering ved at skrabe området og aspirere medierne. Differentiering bør forblive under 20% af brønden i højkvalitet kulturer. Skyl forsigtigt iPS-celle-holdige godt med 2 ml DMEM/F12 og tilsættes 1 ml af 1 mg / ml dispase til hver brønd.
  3. Der inkuberes ved 37 ° C i 7 min. Aspirer dispase og skyl forsigtigt celle kolonier med 2 ml DMEM/F12 to gange.
  4. Efter skylning, tilsættes 2 ml mTSER1 til hver brønd.
  5. Anvendelse af en 5 ml pipette forsigtigt at skrabe kolonier af pladen til dannelse af aggregater.
  6. Overfør de løsrevne kolonier til et 15 ml konisk rør. Tilføj tilstrækkelige mTeSR1 medier til frø næste passage af celler.

4.. Differentiering af iPS celler til iPS-RPE

  1. Plate iPS-celler på en nyligt belagt plade i mTESR1 medier.
  2. Tillad iPS cellekolonier at ekspandere i 4-5 dage i kultur.
  3. Stedfortræder mTeSR1 medier med 4 ml differentiering medier. Skift den ene halvdel af medierne hver 3 dage.
  4. Tillad pigmenterede foci at vokse store nok til at blive manuelt dissekeret ud af kultur (40-50 dage).
  5. Brug en200 ul pipettespids til at skære rundt og løft pigmenterede kolonier.
  6. Indsamle og samle dissekerede kolonier i en 15 ml konisk rør.
  7. Derefter tilsættes 5 ml DMEM/F12 til de samlede RPE celler og centrifuger ved 300 xg i 5 min to gange.
  8. Forbered en enkelt celle løsning ved at inkubere den poolede iPS-RPE med 0,25% trypsin EDTA.
  9. Skyl iPS-RPE celler med IPS-RPE medier og plade de indsamlede celler på en frisk Matrigelcoatede godt i 4 ml iPS-RPE medier.
  10. Kultur cellerne i 3 uger forud for passage. Skift medierne hver 3 dage. Til eksperimentet plade iPS-RPE på 100.000 celler / cm 2. Saml celler på dag 17.. Tæl dagen for såning som dag 0.

5.. Prøvetagning

  1. iPS Cell Collection
    1. Kultur iPS celler indtil udifferentierede kolonier observeret til at være tæt på centrum.
    2. Skyl kolonierne i DMEM/F12.
    3. Dissocierer i enkelt-celler ved anvendelse accutas e. Opsamle cellerne i en 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 300 xg i 5 min. Aspirat supernatant. Resuspender i 2 ml DMEM/F12.
  2. Fetal RPE Collection
    1. Skyl føtalt RPE cellekulturer med DMEM/F12 og dissociere i enkelte celler ved anvendelse af 0,25% trypsin EDTA.
    2. Opsaml cellerne i et 15 ml konisk rør. Centrifuger ved 300 xg i 5 min. Aspirat supernatant. Resuspender i 2 ml DMEM/F12.
  3. iPS-RPE Cell Collection
    1. Når iPS-RPE nå passage 3 og passage 5, indsamle cellerne på dag 17 efter passage. Skyl iPS-RPE to gange i PBS og udarbejde en enkelt cellesuspension ved inkubering med 1,0 ml 0,25% trypsin.
    2. Neutralisere trypsin med 2 ml iskold iPS-RPE medier.
    3. Opsamle cellerne i et 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 300 xg i 5 min. Aspirat supernatant.
    4. Resuspender cellesuspensionen i 3 ml farvningsbuffer fra mikrokugle kit.
ve_title "> 6. negativ udvælgelse af iPS-RPE fjernes udifferentierede celler

  1. Opbevar alle reagenser ved 4 ° C indtil brug, men virker ikke på is. Centrifuge celle suspension fra trin 5.3.4 ved 300 xg i 5 min. Aspirat supernatant.
  2. Resuspender cellerne i 100 pi farvningsbuffer fra mikroperle kit per 2 x 10 6 celler.
  3. Tilsæt 10 ul af Anti-TRA-1-60-PE-antistof pr 2 x 10 6 celler.
  4. Bland godt, og der inkuberes ved 4 ° C i 10 min.
  5. Vask cellerne i 1-2 ml buffer pr 2 x 10 6 celler. Centrifuger i 10 minutter ved 300 x g. Aspirat supernatant.
  6. Resuspender celler i 80 pi farvningsbuffer per 2 x 10 6 celler. Tilsæt 20 ul af anti-PE mærkede mikrokugler (fra kit) pr 2 x 10 6 celler. Bland godt. Inkuber i 15 minutter ved 4 ° C.
  7. Tilføj 1-2 ml farvning buffer pr 2 x 10 6 celler. Centrifuger i 10 minutter ved 300 x g. Aspirat supernatant.
  8. Resuspender celler i 500 & #956, l farvningsbuffer.
  9. Magnetisk celleseparation:
    1. Placer kolonne i magnetisk cellesorteringsapparat. Skyl søjlen med 3 ml farvningsbuffer.
    2. Anvend celle suspension fra 6,8 på søjlen.
    3. Placer et rør på den negative havn at indsamle de TRA-1-60 negative celler.

7.. Total RNA-ekstraktion

  1. Lyse af cellerne ved at køre prøver gennem en kommercielt tilgængelig mikrocentrifuge homogenisator mini spinkolonne designet til nukleinsyre minipreps.
  2. Uddrag totalt RNA fra iPS celler, iPS-RPE og føtal RPE med kommercielt tilgængelige RNA ekstraktion kit beregnet til at bevare små RNA-molekyler 27.
  3. Bestem den samlede RNA-koncentrationer under anvendelse af en NanoDrop spektrofotometer.

8.. Bioanalyzer og microarray-analyse

  1. Kontroller RNA integritet med Bioanalyzer i forbindelse med kommercielt tilgængelige RNA kvalitet kit.
  2. Inkuber 100 ngtotal-RNA med kalvetarmphosphatase ved 37 ° C i 30 minutter
  3. Denaturere RNA ved anvendelse af 100% DMSO ved 100 ° C i 5 min.
  4. Mærk prøverne med PCP-Cy3 anvendelse af T4-ligase ved inkubation ved 16 ° C i 1 time.
  5. Hybridisere på en 8_x_15K format human miRNA array.
  6. Vask arrays i henhold til fabrikantens anvisninger og scanne med en opløsning på 5 m ved hjælp af en scanner.
  7. Anskaf data ved hjælp af microarray feature extraction software kompatibelt med miRNA microarray.
  8. PROCES miRNA signaler til at bestemme det relative niveau af udtryk i hver prøve.
  9. Sammenligne ekspressionsniveauerne af hver miRNA mellem prøvegrupperne. Vælg miRNA med mindst to-fold differentielle ekspression til yderligere analyse.
  10. Brug kommercielt tilgængeligt software til dataanalyse, følg vejledningen for at generere varme kort til visualisering af differentielt udtrykte miRNA 28.

9. Pathway Analysis

  1. Gemme data fra de udvalgte i 8,9 i Excel-format miRNA.
  2. Log ind på online-RNA vej analyseprogram. Upload Excel-fil. Vælg "Fleksibel format" for filformat og vælg "Agilent" fra drop down listen for identifier type.
  3. Under rå kursdata, tildele "ID" til sonde id-kolonne og tildele "Observation 1" og "log forholdet" til log ration kolonne. Vælg "ignorere" for alle andre kolonner.
  4. Vælg parametre til analyse som følger: Tillid: eksperimentelt kun observeret; omfatter direkte og indirekte forbindelser; og omfatter endogene kemikalier; Vælg Ingenuity Knowledge base som reference sæt. Vælg den database af reference molekyler, der indeholder data fra alle arter, alle cellelinjer og væv, og alle mutationer.
  5. Kør netværk og gangsti analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

iPS-celler (figur 1a) blev dyrket i differentiering betingelser for at inducere differentiering i iPS-RPE celler. IPS-RPE udstillet klassiske RPE fænotype af sekskantede pigmenteret Cellemorfologien (figur 1B) ligner føtal RPE (figur 1C).

For bedre at forstå den rolle, som miRNA kan spille i løbet af processen af ​​differentiering fra iPS til iPS-RPE blev microarray analyse af miRNA-ekspression udført. Total RNA blev opsamlet fra iPS celler, føtal RPE og iPS-RPE vha. Mirvana miRNA isolation kit til at sikre maksimal tilbageholdelse af små RNA. RNA blev kvantificeret og testet for renhed før hybridisering til microarray LabChip. Sonder, der repræsenterer 1.205 mennesker og 144 virale miRNA blev brugt til at analysere miRNA udtryk fra hver prøve sæt. Signalerne blev analyseret for at bestemme de relative niveauer af ekspression af hver miRNA fra hver prøve. Dataene blev brugt til at sammenligne miRNA e Xpression profilen af ​​iPS-RPE til iPS og føtal RPE. Heat maps blev genereret for at muliggøre visualisering af forskellen miRNA udtryk mellem grupperne (figur 2A). 83 miRNA, der blev udtrykkes forskelligt i iPS forhold til iPS-RPE, med 47 miRNA opreguleret i IPS i forhold til iPS-RPE, og 36 nedreguleret i IPS (figur 2B). 110 miRNA blev udtrykkes forskelligt i føtal RPE i forhold til iPS-RPE, med 61 miRNA opreguleres i fRPE, og 49 nedreguleret i fRPE forhold til iPS-RPE (figur 2C). Pathway analyse med Ingenuity IPA software angivet de differentielt udtrykte miRNA target udskrifter for gener involveret i cellulære udvikling, vækst, spredning og overlevelse, cellecyklus, og cellulære bevægelse. MiRNA udtrykt i okulære væv in vivo blev anset for at være beriget i iPS-RPE og føtalt RPE forhold til iPS (fig. 3 og 4).

t "fo: keep-together.within-side =" altid "> Figur 1
Figur 1.. Lysfelt billeder af iPS, føtal RPE og iPS-RPE. Lysfelt billeder (100X) af iPS celler forud for differentiering, føtal RPE, og RPE stammer fra iPS. Både fosterets RPE og iPS-RPE vise klassisk RPE morfologi sekskantet form og pigmentering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2.. MiRNA udtryk profil fra iPS-RPE i forhold til iPS og føtal RPE. A) varme kort skildrer den relative grad af differentieret ekspression af miRNA. Farvenskala repræsenterer ekspressionsniveauerne af miRNA som ovenfor (rød), nedenfor (grøn), eller på betyder udtrykket niveau (sort) på tværs af alle prøverne. B) Sammenligning af miRNA profiler af iPS-RPE til iPS celler. C) Sammenligning af miRNA profiler af iPS-RPE til føtal RPE. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3.. A) Netværk analyse af miRNA udtryk profiler af forældrenes iPS celler versus iPS-afledt RPE. De øverste 4-netværk vises separat (til venstre) og fusioneret (centrum). B) Pathway analyse af differentielt udtrykte miRNA. Please klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4.. A) Netværk analyse af miRNA udtryk profiler af føtal RPE versus iPS-afledt RPE. De øverste 7 netværk vises separat (til venstre) og fusioneret (centrum). B) Pathway analyse af differentielt udtrykte miRNA. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Afslutningsvis denne rapport beskriver de metoder, der anvendes til kultur iPS celler, iPS-RPE og føtal RPE. RPE stammer fra iPS er morfologisk og funktionelt ligner føtal RPE. IPS-RPE udtrykker også karakteristiske RPE gener, herunder RPE65, CRALBP, PEDF og LRAT 16.. For yderligere at karakterisere disse celler blev RNA ekstraheret og anvendt til at udføre microarray analyse for at identificere differentielt udtrykte miRNA. Analyse af signalintensiteter afslørede, at det største antal differentielt udtrykte miRNA blev opdaget i foster RPE versus iPS-RPE sammenligninger, hvilket tyder på iPS-RPE kan være mere moden. Fremtidige undersøgelser er planlagt til at validere disse resultater med RT-PCR.

Der er flere kritiske punkter i løbet af dette eksperiment, der skal omhyggeligt udføres for at sikre succes for analysen og erhvervelse af nøjagtige data. Det første afgørende skridt opstår under kultur iPS celler. iPS celler skal forblive i et pluripotent stat til at opretholde deres stemness. Cellerne skal omhyggeligt inspiceres dagligt for tegn på differentiering. Udifferentierede iPS celler vokser som kompakte flercellede kolonier. Cellerne bør have en høj nukleart til cytoplasma ratio og fremtrædende nucleoli. IPS kolonier er kendetegnet ved en tydelig grænse med flere lag af celler i centrum. Tegn på differentiering omfatte tab af definerede koloni grænser, uensartet cellemorfologi, og fremkomsten af ​​indlysende celletyper, såsom neuroner og fibroblaster. Enkelte celler, der er differentieret kan fjernes ved dispase og skylning imidlertid kolonier med disse karakteristika skal fjernes manuelt fra kulturen 29.

Udarbejdelse af RNA til microarray analyse er det næste afgørende skridt. Inkonsistent RNA kvalitet er en væsentlig kilde til variation i microarray data. RNA ekstraktion bør give høj molekylvægt og minimalt nedbrudt RNA for de bedste resultater. VellykketRNA-ekstraktion vil give total RNA med minimal nedbrydning og fri for forurenende RNaser. Efter bestemmelse af RNA-koncentrationen ved spektrofotometri ved 260 nm, bør renheden af ​​prøven bestemmes ved 230 og 280 nm for at påvise forurening med polysaccharider eller protein. Den 230:260:280 ratio for RNA bør være 01:02:01 at indikere høj kvalitet RNA uden forurening 30.

Ved planlægning af microarray eksperiment mest kritiske trin er medtagelsen af ​​negative kontroller for at sikre, at hybridisering til proberne er specifik og til at køre hver prøve i tre eksemplarer til at sikre, at de signaler, detekterede gyldig for det prøvesæt. Under analyse af microarray resultater, et centralt punkt er korrektion baggrund, hvor baggrundsstøj subtraheres fra den observerede signal for at give et korrekt signal intensitet for hver enkelt probe. Dette skridt vil eliminere falske positiver, mens de fremhæver de sande positive signaler. </ P>

Til sidst, under netværk og sti analyse af microarray resultater, det vigtigste skridt er at etablere de korrekte parametre og filtre inden analysen. Dette trin vil afgøre, hvilke databaser skal anvendes af softwaren til at generere de netværk og identificere cellulære veje, der er påvirket af miRNA vist sig at være differentielt udtrykt i sammenligningerne.

Efter erhvervelsen af ​​data ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i denne rapport, er det nødvendigt at overveje de begrænsninger af disse analyser i fortolkning af resultaterne. Skønt usandsynligt, er det stadig muligt, at RPE kulturen ikke er en homogen population af RPE-celler. Anti-TRA-1-60 sortering proces er en negativ udvælgelse proces, der fjerner de celler, der stadig udtrykker stamceller markører; men det garanterer ikke de resterende celler er rene RPE celler. Skønt morfologisk cellerne udviser klassiske RPE morfologi pigmentering ennd polygonal celle form, er det muligt, at ikke alle celler er RPE.

Microarray eksperimenter kan frembringe falske positive for ekspression af RNA, især i tilfælde af microRNA grund af de meget korte sekvenser. Selvom microarray-system, der anvendes til dette forsøg omfattede flere sonder til at målrette forskellige områder af hvert mål, skal resultaterne altid valideres af qRT-PCR.

Analyse af microarray data Ingenuity IPA er afhængig af mængden og kvaliteten af ​​information i Ingenuity databasen. Mange af oplysningerne om gen-funktion og cellulære veje stammer fra eksperimenter udført på transformerede cellelinier eller i forbindelse med kræftforskning. Derfor kan resultaterne af gangsti og netværk analyse ved hjælp af dette program ikke altid være relevant for primære celler eller i dette tilfælde, stamceller.

På trods af disse begrænsninger, kan de metoder, der er beskrevet i denne rapport skal bruges tilkultur af iPS-celler og føtal RPE, afledt RPE fra iPS celler, og udvinding af RNA til microarray analyse af miRNA. De data, der genereres af disse assays kan anvendes til at identificere miRNA er involveret i differentieringsprocessen, såvel som dem, der regulerer RPE funktioner.

Selv om flere miRNA viste sig at være forskelligt udtrykt i fosterstilling RPE vs iPS-RPE sammenligning end i iPS vs iPS-RPE sammenligning, der er mange mulige årsager til dette. Først og fremmest på det tidspunkt, denne analyse blev udført, miRNA microarray platform var i stand til at detektere 1.205 mennesker og 144 virale miRNA. Siden den tid har den platform, blevet udvidet til at omfatte prober til over 2.000 menneskelige miRNA. Det er bestemt muligt, at miRNA differentierede udtryk profiler vil ændre sig, hvis der registreres flere miRNA. Af de 1.349 miRNA påvises ved denne assay fleste miRNA viste ingen forskel i ekspression mellem celletyper (figur 2B og 2C

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Udtalelserne eller påstande, der er indeholdt heri, er de private synspunkter forfatternes og skal ikke opfattes som tjenestemand eller som afspejler de synspunkter, Department of the Army eller det amerikanske forsvarsministerium.

Denne forskning blev udført, mens forfatterne Whitney A. Greene, Alberto Muñiz og Ramesh R. Kaini afholdt en National Research Council postdoc Associateship på USAISR.

Microarray analyser blev udført af Greehey Børns Cancer Research Institute Microarray Core Facility og Bioinformatik Institut på UT Health Science Center i San Antonio.

Dette arbejde blev støttet af US Army Klinisk Rehabiliterende Medicin Research Program (CRMRP) og militære operationelle Medicine Research Program (MOMRP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5X supplement Stem Cell Technologies 5850
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-β-mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-l-thyronine sodium salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Fetal RPE media RTEGM kit Life Technologies 195406
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Trypsin Hyclone(Fisher) 25200-072
Miltenyi Biotec washing buffer StemGent 130-092-987
Miltenyi Biotec rinsing buffer StemGent 130-092-222
Anti-TRA-1-60 microbead kit StemGent 130-095-816
Miltenyi Biotec cell sorter column StemGent 130-021-101
RNeasy micro kit Qiagen 74004
QIA shredder Qiagen 79654
RNA 6000 Pico LabChip kit Agilent G2938-90046
Human miRNA microarray v16 Agilent G4471A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
  2. Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
  3. Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
  4. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
  5. Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
  6. Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
  7. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
  8. Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
  9. Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
  10. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
  11. Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
  12. Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
  13. la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
  15. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
  16. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
  17. Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
  18. Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
  19. Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
  20. Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
  21. Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
  22. Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
  23. Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
  24. Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
  25. Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
  26. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
  27. Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. (2013).
  28. Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. (2011).
  29. Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. (2010).
  30. The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics