MikroRNA uttrykk profiler av menneskelige iPS celler, retinal pigment epitelet avledet fra iPS, og Fetal Netthinne Pigment Epitel

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den mikroRNA (miRNA) profiler av menneskeskapte-pluripotent stem (iPS) celler, retinal pigment epitel (RPE) stammer fra menneskeskapte-pluripotent stem (iPS-celler) (iPS-RPE), og foster RPE, ble sammenlignet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Greene, W. A., Muñiz, A., Plamper, M. L., Kaini, R. R., Wang, H. C. MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (88), e51589, doi:10.3791/51589 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Målet med denne rapporten er å beskrive protokollene for å sammenligne mikroRNA (miRNA) profiler av menneskeskapte-pluripotent stem (iPS-celler), retinal pigment epitel (RPE) utledet fra menneskelige iPS-celler (iPS-RPE), og foster RPE. Protokollene omfatter innsamling av RNA for analyse ved microarray, og analyse av mikroarray data for å identifisere miRNAs som er differensielt uttrykt blant tre celletyper. Metodene for kultur iPS-celler og foster RPE er forklart. Protokollen som brukes for differensiering av RPE fra menneskelige iPS er også beskrevet. Den RNA ekstraksjon teknikk vi beskriver ble valgt for å tillate maksimal gjenvinning av svært små RNA for bruk i en miRNA microarray. Til slutt blir cellemessige og nettverksanalyse av microarray data forklart. Disse teknikkene vil lette sammenligning av de miRNA profiler av tre forskjellige celletyper.

Introduction

Stamceller har kapasitet til å replikere uten grense, og potensialet til å differensiere til alle somatiske celletype. Utvikling av teknikker for å omprogrammere somatiske celler i pluripotent stamceller, har medført stor spenning i forskersamfunnet og blant klinikere, som bruk av personlig vev gjenfødelse er på horisonten en. Indusert-pluripotent stamceller (iPS-celler) viser samme funksjonene i ubegrenset replicative potensial og pluripotency som embryonale stamceller (ES-celler) mens omgå de etiske dilemmaer knyttet til ESCs. I tillegg vil pasient-avledet stamceller ikke stimulerer en immunrespons, i stor grad øke sannsynligheten for vellykket terapeutiske anvendelser 2-3. Under bestemte kultur vilkår, har iPS-celler er vist å differensiere i flere ulike celletyper in vitro, inkludert cardiomyocytes, nerveceller, betaceller i bukspyttkjertelen, leverceller, og retinal pigmentert epitel (RPE) 4-12.

Den RPE er en spesialisert lag av pigmenterte epitel-celler lokalisert på baksiden av retina som utfører flere funksjoner som er avgjørende for visuell helse og funksjon, for eksempel absorpsjon av strølys, fagocytose av fotoreseptoren ytre segmenter, og behandling av retinoider for produksjonen av visuell chromophore. Dysfunksjon av RPE på grunn av skade eller sykdom dypt påvirker fotoreseptoren helse og visuell funksjon som gjenspeiles av de blindende sykdommer som er et resultat av underliggende RPE patologi som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), Stargardts sykdom, og retinitis pigmentosa (RP) 13. Virkelig effektive behandlinger som kan gjenopprette synet har ikke blitt oppnådd, og utskifting av sykelig RPE med sunn RPE kan være det beste alternativet for å hindre tap av syn 14-15. RPE avledet fra iPS (iPS-RPE) er en mulig kilde til celler for å erstatte den skadede RPE. iPS-RPE uttrykker kjennetegntic RPE proteiner LRAT, CRALBP, PEDF, og RPE65; viser den klassiske svært pigmentert sekskantede RPE morfologi; og utfører RPE funksjoner som fagocytose, retinoid prosessering og sekresjon av 11 - cis-retinal 5,16. Men før IPS-RPE kan benyttes terapeutisk, er IPS-RPE må være grundig karakterisert. Å forstå de faktorer som styrer RPE differensiering er nødvendig for å forbedre utbyttet og renheten av de celler som skal brukes for kliniske formål.

Celledifferensiering er et resultat av svært regulert genekspresjon. Epigenetisk ombygging av genomet og koordinering av transkripsjonsfaktorer er nødvendig for celle skjebne beslutninger som oppstår under differensiering og utvikling 17. Regulering av melding RNA (mRNA) oversettelse av mikroRNA (miRNA) presenterer enda et nivå for regulering som påvirker celle skjebne en. MiRNAs er korte, ~ 22 nt, lengder av nukleotider som enten undertrykke oversettelse avbinding til 3 'UTR av mRNA eller mål-mRNA for nedbrytning. MiRNAs er påvist i nesten alle vev og til dags dato har over 2000 unike menneskelige microRNAs har blitt registrert i miRBase database. Siden mirnas krever bare delvis komplementaritet å binde seg til målet mRNA, kan en enkelt miRNA potensielt binde seg til flere titalls eller hundrevis av mål, og vice versa, dvs. en enkelt mRNA kan bli målrettet av flere forskjellige miRNAs. Dette promiskuøs bindende karakteristisk dramatisk øker nivået av kompleksitet regulering samt vanskelighetsgraden av å bestemme funksjonene til individuelle mirnas og rollen hver spiller i cellulære funksjoner 18-21. Likevel, har studier vist at miRNA foredler genuttrykk under differensiering ved å påvirke DNA metylering status 17. I en studie mer spesifikke for RPE, ble miR-204/211 vist seg å fremme epitelial fenotype av RPE 22. En annen gruppe analyserte miRNA profilav RPE under differensiering fra ES-celler og avslørte distinkt sett av miRNA er uttrykt i løpet av differensiering prosessen 23. Faktisk kan miRNA profiler entydig skille celletyper, inkludert ES-celler, forløper celler og terminalt differensierte celler 24,25. Over 250 mirnas er uttrykt i netthinnen. Basert på disse studiene, hypotese vi at miRNAs spiller en viktig rolle under differensiering av RPE fra iPS.

Målet med denne rapporten er å beskrive protokollene for differensiering av RPE fra IMR90-4 iPS-celler, samling av RNA for analyse av microarray, og analyse av microarray data for å identifisere mirnas som er forskjellig uttrykt mellom tre celletyper, iPS-celler , iPS-RPE og foster RPE. Total RNA ble hentet fra kulturer av hver celletype og hybridisert til en miRNA microarray, som inneholder prober spesifikke for 1205 menneskelige miRNAs og 144 viral miRNAs. Mikromatriser resultater ble sammenligned for å finne ut hvilke mirnas var forskjellig uttrykt mellom de ulike celletyper. miRNAs med 2 ganger eller mer ganger endring i ekspresjon ble valgt ut for videre analyse. En miRNA analyse program ble brukt til å identifisere potensielle mål av forskjellig uttrykt mirnas og å generere mobilnettverk som reguleres av de valgte mirnas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Utarbeidelse av kultur reagenser og kultur plater

  1. mTeSR1 media: Forbered mTeSR1 media i henhold til produsentens anvisninger. Tine 100 ml mTeSR1 5x supplement natten ved 4 ° C. Tilsett 100 ml mTeSR1 5x supplement til 400 ml mTeSR1 basale media og bland godt. Dette mediet er stabile ved 4 ° C i opp til 2 uker, og ved -20 ° C i 6 måneder.
  2. Differensiering middel: Tilbered differensiering medier i DMEM/F12, hvorved 0,1 mM β-mercaptoethanol, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 2,0 mM L-glutamin, 10% knockout serum og 10 ug / ml gentamicin.
  3. iPS-RPE media: Forbered iPS-RPE media i MEM å gi 1x N1 supplement, 0,1 mM unødvendige aminosyrer, 250 mikrogram / ml taurin, 13 ng / ml trijod-L-thyronine natriumsalt, 20 ng / ml hydrokortison, 5 mikrogram / ml gentamicin og 15% FBS 26.
  4. Trijod-L-tyronin-natriumsalt stamløsning. For å fremstille stamløsning oppløse 1,0 mg av trijod-L-tyroninnatrium-salt i 1 N natriumhydroksyd ved forsiktig virvlet. Deretter tilsettes 49,0 ml av basemateriale for å gjøre 50,0 ml 20 mikrogram / ml av trijod-L-tyronin-natriumsalt. Forbered alikvoter og fryse ved -20 ° C inntil nødvendig. Bruk passende mengde for å oppnå ønsket konsentrasjon i sluttkulturmedier.
  5. Hydrokortison-stamoppløsning: For å fremstille en stamoppløsning hydrokortison, oppløse 1 mg av hydrokortison i 1 ml absolutt etanol ved forsiktig omrøring. Deretter tilsettes 19,0 ml av basemateriale i 20 ml hydrokortison stamløsning av 50 pg / ml. delmengde og fryse ved -20 ° C inntil nødvendig. Bruk passende volum til å oppnå den ønskede konsentrasjon i sluttkulturmedia.
  6. Fetal RPE vekstmedium. Forbered vekstmedier ved å blande alle reagenser i RTEGM kit i basal media, i henhold til instruksjonene fra produsenten unntatt for FBS.
  7. Fetal RPE plating media. Forbered pletteringsmateriale ved å overføre en liten mengde av vekstmateriale til en steril beholder og endd FBS i en slutt-konsentrasjon på 2%.
  8. Dispase: Forbered arbeidsløsning av dispase av 1 mg / ml i DMEM/F12.
  9. Matrigel belagte plater: Forbered matrigel i DMEM/F12 til 0,08 mg / ml.
  10. Coat hver brønn i en 6-brønns plate med 1,0 ml av løsningen matrigel.
  11. Inkuber de belagte plater ved romtemperatur i 1,0 timer.
  12. Etter 1,0 timers inkubasjon suge overflødig DMEM/F12.
  13. Legg 0,5 ml mTeSR1 media for å unngå uttørking. De Matrigel belagte plater er nå klar til bruk.

2. IPS Kultur

  1. Før iPS celle seeding har alle rør, varme mTESR1 media til romtemperatur, og de matrigel belagte plater klar.
  2. Raskt tine IMR90-4 ips celler i et 37 ° C vannbad. Fjern deretter cryovial fra vannbadet og sterilisere med 70% etanol.
  3. Overfør cellene til en 15 ml konisk rør ved hjelp av en 2 ml pipette for å minimalisere brudd på celleaggregatene.
  4. Drop-messig legge 5 ml warm mTeSR1 media til cellene og bland forsiktig. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur og fjern supernatanten.
  5. Nøye resuspendere celleaggregater i 2 ml mTeSR1 media og frø cellene til en brønn av en seks-brønners plate.
  6. Sett platen i en 37 ° C inkubator og kultur med 5% CO2, 95% luftfuktighet.
  7. Endre iPS cellekultur media daglig. Udifferensierte kolonier vises 5-7 dager etter såing. Sjekk for udifferensierte kolonier som er klare for passasje (kolonier med et tett sentrum).

Tre. Aging av iPS celler

  1. Før begynnelse til passasjen iPS celler, har alle rør, dispase løsning, DMEM/F12 og mTERS1 materiale oppvarmet til romtemperatur, og matrigel belagte plater klar.
  2. Før passering iPS-celler, fjern eventuelle områder av differensiering ved å skrape området og aspirere media. Differensiering bør være under 20% av brønnen for høyekvalitet kulturer. Skylles forsiktig IPS celle-inneholdende godt med 2 ml DMEM/F12 og tilsett 1 ml av 1 mg / ml dispase til hver brønn.
  3. Inkuber ved 37 ° C i 7 min. Aspirer dispase og forsiktig skylle cellekolonier med 2 ml DMEM/F12 to ganger.
  4. Etter skylling, tilsett 2 ml mTSER1 til hver brønn.
  5. Ved hjelp av en 5 ml pipette forsiktig skrape kolonier av platen for å danne aggregater.
  6. Overfør de demonterte kolonier i et 15 ml konisk rør. Legg tilstrekkelige mTeSR1 media grunnlag for neste passering av celler.

4. Differensiering av iPS celler til iPS-RPE

  1. Plate iPS-celler på en nylig belagt plate i mTESR1 media.
  2. Tillat iPS cellekolonier å utvide for 4-5 dager i kultur.
  3. Innbytter mTeSR1 media med 4 ml differensiering media. Endre halvparten av media hver 3. dag.
  4. Tillat pigmenterte foci å dyrke store nok til å være manuelt dissekert ut av kulturen (40-50 dager).
  5. Bruk en200 mL pipette tips til å kutte rundt og løfte de pigmenterte kolonier.
  6. Samle og basseng de dissekerte kolonier i en 15 ml konisk tube.
  7. Deretter tilsett 5 ml av DMEM/F12 til de sammenslåtte RPE celler og sentrifuger ved 300 xg i 5 min to ganger.
  8. Forbered en enkelt celle løsning ved inkubasjon den samlede iPS-RPE med 0,25% trypsin EDTA.
  9. Skyll iPS-RPE celler med iPS-RPE media og plate de innsamlede cellene på en fersk matrigel belagt godt i 4 ml av iPS-RPE media.
  10. Kultur cellene for tre uker før passering. Endre media hver 3. dag. For forsøket, plate iPS-RPE på 100.000 celler / cm 2. Samle celler på dag 17. Count dagen for seeding som Dag 0.

5. Prøvetaking

  1. iPS Cell Collection
    1. Kultur iPS-celler til udifferensierte kolonier er observert å være tett i sentrum.
    2. Skyll koloniene i DMEM/F12.
    3. Distansere inn enkeltceller ved hjelp accutas e. Samle cellene inn i en 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 300 xg i 5 min. Aspirer supernatant. Suspender i 2 ml DMEM/F12.
  2. Fetal RPE Collection
    1. Skyll Fetal RPE cellekulturer med DMEM/F12 og distansere inn enkeltceller ved hjelp av 0,25% trypsin EDTA.
    2. Samle cellene i et 15 ml konisk rør. Sentrifuger ved 300 x g i 5 min. Aspirer supernatant. Suspender i 2 ml DMEM/F12.
  3. iPS-RPE Cell Collection
    1. Når iPS-RPE nå passasje 3 og passasje 5, samle cellene på dag 17 etter passering. Skyll IPS-RPE to ganger i PBS og forberede en enkelt cellesuspensjon ved inkubasjon med 1,0 ml av 0,25% trypsin.
    2. Nøytraliser trypsin med 2 ml iskald iPS-RPE media.
    3. Samle cellene i et 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 300 xg i 5 min. Aspirer supernatant.
    4. Resuspender cellesuspensjonen i 3 ml buffer flekker fra microbead kit.
ve_title "> 6. negativ seleksjon av iPS-RPE å fjerne udifferensierte celler

  1. Hold alle reagenser ved 4 ° C inntil bruk, men fungerer ikke på is. Sentrifuger cellesuspensjonen fra trinn 5.3.4 ved 300 x g i 5 min. Aspirer supernatant.
  2. Resuspender celler i 100 pl buffer flekker fra microbead kit per 2 x 10 6 celler.
  3. Tilsett 10 ul av anti-TRA-1-60-PE antistoff per 2 x 10 6 celler.
  4. Bland godt og inkuber ved 4 ° C i 10 min.
  5. Vask cellene i 1-2 ml buffer per 2 x 10 6 celler. Sentrifuger i 10 minutter ved 300 x g. Aspirer supernatant.
  6. Suspender cellene i 80 mL av flekker buffer per 2 x 10 6 celler. Tilsett 20 mL av anti-PE merket microbeads (fra kit) per 2 x 10 6 celler. Bland godt. Inkuber i 15 min ved 4 ° C.
  7. Til 1-2 ml av fargings buffer per 2 x 10 6 celler. Sentrifuger i 10 minutter ved 300 x g. Aspirer supernatant.
  8. Suspender cellene i 500 & #956, l av flekker buffer.
  9. Magnetisk celleseparering:
    1. Plasser kolonnen i magnetisk celle sorter. Vask kolonne med 3 ml av fargings buffer.
    2. Påfør cellesuspensjon fra 6,8 til kolonnen.
    3. Plasser et rør på den negative port å samle TRA-1-60 negative celler.

7. Total RNA Extraction

  1. Lyse av celler ved å kjøre prøvene gjennom en kommersielt tilgjengelig mikrosentrifuge homogenisator minispinnkolonne utformet for nukleinsyre minipreps.
  2. Utdrag total RNA fra iPS-celler, iPS-RPE og foster RPE med kommersielt tilgjengelige RNA ekstraksjon kit utviklet for å bevare små RNA-molekyler 27.
  3. Bestem total RNA konsentrasjoner ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer.

8. Bioanalyzer og microarray analyse

  1. Kontroller RNA integritet med Bioanalyzer i forbindelse med kommersielt tilgjengelig RNA kvalitet kit.
  2. Inkuber 100 ngtotal RNA med kalvetarm fosfatase ved 37 ° C i 30 min
  3. Denaturere RNA ved å bruke 100% DMSO ved 100 ° C i 5 min.
  4. Etiketten prøvene med PCP-Cy3 ved anvendelse av T4-ligase ved inkubasjon ved 16 ° C i 1 time.
  5. Hybridiserer på en 8_x_15K format menneskelige miRNA array.
  6. Vask arrays i henhold til produsentens instruksjoner og skanne med en oppløsning på 5 mikrometer ved hjelp av en skanner.
  7. Tilegne seg data ved hjelp av microarray funksjonen utvinning programvare kompatibel med miRNA microarray.
  8. Behandle miRNA signaler å bestemme den relative nivået av uttrykk i hver prøve.
  9. Sammenligne uttrykket nivåer av hver miRNA mellom utvalgsgrupper. Velg mirnas med minst to-ganger forskjell uttrykk for videre analyse.
  10. Ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare for dataanalyse, følg instruksjonene for å generere varme kart for visualisering av forskjellig uttrykt miRNAs 28.

9. Pathway Analysis

  1. Lagre data fra mirnas valgt i 8,9 i Excel-format.
  2. Logg deg inn i nett RNA pathway analyseprogram. Last opp Excel-filen. Velg "Fleksibel Format" for filformat og velg "Agilent" fra rullegardinlisten for identifikator type.
  3. Under rådata overskriften, tildele "ID" for å sondere ID-kolonnen og tildele "Observasjon 1" og "logg ratio" til loggen rasjon kolonnen. Velg "ignore" for alle andre kolonner.
  4. Velg parametre for analyse som følger: Tillit: eksperimentelt observert bare; inkluderer direkte og indirekte relasjoner; og inkluderer endogene kjemikalier; Velg Oppfinnsomhet kunnskapsbase som referansesettet. Velge den database fra referanse molekyler som omfatter data fra alle dyrearter, alle cellelinjer og vev, og alle mutasjoner.
  5. Kjør nettverk og sti analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

iPS-celler (Figur 1a) ble dyrket i differensiering forhold for å indusere differensiering i iPS-RPE celler. Den iPS-RPE utstilt klassiske RPE fenotype av sekskantede pigmentert cellemorfologi (Figur 1B) ligner på foster RPE (figur 1C).

For bedre å forstå den rollen som miRNA kan spille i løpet av prosessen med differensiering fra iPS til iPS-RPE, ble utført microarray analyse av miRNA uttrykk. Total RNA ble samlet inn fra iPS-celler, foster RPE, og iPS-RPE bruker Mirvana miRNA isolasjon kit for å sikre maksimal oppbevaring av små RNA. RNA ble kvantifisert og testet for renhet før hybridisering til microarray labchip. Prober som representerer 1205 og 144 human virus miRNAs ble brukt til å analysere miRNA uttrykk fra hvert prøvesett. Signalene ble analysert for å bestemme de relative nivåer av ekspresjon av hvert miRNA fra hver prøve. Dataene ble brukt til å sammenligne miRNA e Xpression profilen til iPS-RPE til iPS og foster RPE. Varme kartene ble generert for å muliggjøre visualisering av differensial miRNA uttrykk mellom gruppene (figur 2a). 83 mirnas som var ulikt uttrykt i iPS forhold til iPS-RPE, med 47 mirnas oppregulert i iPS forhold til iPS-RPE, og 36 downregulated i IPS (Figur 2b). 110 mirnas var ulikt uttrykt i foster RPE forhold til iPS-RPE, med 61 mirnas oppregulert i fRPE, og 49 downregulated i fRPE forhold til iPS-RPE (figur 2C). Pathway analyse med oppfinnsomhet IPA programvare angitte forskjellig uttrykt MiRNAs målet transkripsjoner for gener som er involvert i cellulær utvikling, vekst, spredning og overlevelse, cellesyklus, og cellulær bevegelse. MiRNAs uttrykt i øyevevet in vivo ble funnet å være beriket i iPS-RPE og foster RPE forhold til iPS (figur 3 og 4).

t "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 1
Figur 1. Lysfelt bilder av iPS, foster RPE, og iPS-RPE. Lysfelt bilder (100X) av iPS-celler før differensiering, foster RPE, og RPE avledet fra iPS. Både foster RPE og iPS-RPE vise klassisk RPE morfologi av sekskantede formen og pigmentering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 2
Figur 2. MiRNA uttrykk profil fra iPS-RPE forhold til iPS og foster RPE. A) Heat kart skildre den relative graden av differensial uttrykk for miRNAs. Fargenskala representerer uttrykket nivåer av miRNA som ovenfor (rød), under (grønn), eller ved bety uttrykk nivå (svart) på tvers av alle prøvene. B) Sammenligning av miRNA profiler av iPS-RPE til iPS-celler. C) Sammenligning av miRNA profiler av iPS-RPE til foster RPE. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. A) Network analyse av miRNA uttrykk profiler av foreldre iPS-celler versus iPS-avledet RPE. De øverste fire nettverkene vises separat (til venstre) og slått sammen (i midten). B) Pathway analyse av forskjellig uttrykt miRNAs. Please klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. A) Network analyse av miRNA uttrykk profiler av fosterets RPE versus iPS-avledet RPE. Den øverste syv nettverkene vises separat (til venstre) og slått sammen (i midten). B) Pathway analyse av forskjellig uttrykt miRNAs. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I konklusjonen, beskriver denne rapporten metodene som brukes til kultur iPS-celler, iPS-RPE og foster RPE. RPE avledet fra iPS er morfologisk og funksjonelt lik foster RPE. Den iPS-RPE uttrykker også karakteristiske RPE gener inkludert RPE65, CRALBP, PEDF, og LRAT 16. For ytterligere å karakterisere disse cellene, ble RNA ekstrahert og brukt til å utføre mikromatriseanalyse for å identifisere differensielt uttrykt miRNA. Analyse av signal intensiteter avslørte at flest forskjellig uttrykt miRNAs ble oppdaget i fosterets RPE versus iPS-RPE sammenligninger, noe som tyder på iPS-RPE kan være mer moden. Fremtidige studier er planlagt å validere disse resultatene med RT-PCR.

Det er flere kritiske punkter under dette eksperimentet som må nøye utført for å sikre suksess for analysen og oppkjøpet av nøyaktige data. Den første viktig skritt oppstår under kultur iPS-celler. iPS-celler må forbli i et pluripotent staten for å opprettholde sin stemness. Cellene må være nøye inspisert daglig for tegn på differensiering. Udifferensierte iPS-celler vokse som kompakte flercellede kolonier. Cellene bør ha en høy atom til cytoplasma-forhold og fremtredende nukleoli. IPS kolonier er kjennetegnet ved en tydelig kant, med flere lag av celler ved senteret. Tegn på differensiering inkluderer tap av definerte koloni grenser, ikke-uniform cellemorfologi, og utseendet på åpenbare celletyper, for eksempel nerveceller og fibroblaster. Enkelt celler som har differensiert kan fjernes ved dispase og skylling, men kolonier med disse egenskapene må fjernes manuelt fra kulturen 29..

Fremstilling av RNA for mikromatriseanalyse er det neste kritisk trinn. Inkonsekvent RNA kvalitet er en betydelig kilde til variasjon i microarray data. RNA ekstraksjon bør gi høy molekylvekt og minimalt degradert RNA for best resultat. VellykketRNA ekstraksjon vil gi total RNA med minimal degradering og fri for forurensende RNases. Etter bestemmelse av RNA-konsentrasjonen ved spektrofotometri ved 260 nm, må renheten av prøven blir bestemt ved 230 og 280 nm for å detektere forurensning med polysakkarider eller proteiner. Den 230:260:280 ratio for RNA bør være 1:02:01 å indikere høy kvalitet RNA uten forurensning 30.

Ved planlegging av microarray eksperimentet, er det mest kritiske trinn inkludering av negative kontroller for å sikre at hybridiseringen til probene er spesifikke, og for å kjøre hver prøve in triplo for å sikre at de signaler som detekteres er gyldige for dette prøvesett. I løpet av analysen av mikromatriser resultater, er et sentralt punkt bakgrunnskorreksjon, hvor bakgrunnsstøyen subtraheres fra den observerte signal til å gi den sanne signalintensiteten for hver spesiell sonde. Dette trinnet vil eliminere falske positiver, mens fremhever de sanne positive signaler. </ P>

Til slutt, i løpet av nettverk og sti analyse av mikromatriser resultater, er det viktigste trinnet å etablere riktige parametre og filtre før kjøring av analysen. Dette trinnet vil avgjøre hvilke databaser vil bli brukt av programvare for å generere nettverk og identifisere cellulære mekanismer som er påvirket av de mirnas vist seg å være forskjellig uttrykt i sammenligningene.

Etter oppkjøpet av data ved hjelp av metodene som beskrives i denne rapporten, er det nødvendig å vurdere begrensningene i disse analysene under tolkning av resultatene. Selv om det neppe er det fortsatt mulig at RPE kultur er ikke en homogen populasjon av RPE celler. Den anti-TRA-1-60 sorteringsprosessen er en negativ utvelgelsesprosess som fjerner cellene som fremdeles uttrykker stamcelle markører; men det garanterer ikke de gjenværende cellene er rene RPE celler. Selv morfologisk cellene vise klassiske RPE morfologi av pigmentering ennd polygonal celleform, er det mulig at ikke alle celler er RPE.

Microarray eksperimenter kan gi falske positive for ekspresjon av RNA, særlig i tilfelle av microRNA på grunn av den meget korte sekvenser. Selv om microarray system som brukes for dette eksperimentet inkludert flere sonder for å målrette ulike regioner av hvert mål, skal resultatene alltid godkjennes av QRT-PCR.

Analyse av microarray data ved oppfinnsomhet IPA er avhengig av mengden og kvaliteten på informasjonen i Oppfinnsomhet database. Mye av den informasjon om genfunksjon og cellulære veier er avledet fra eksperimenter utført på transformerte cellelinjer, eller i sammenheng med kreftforskning. Derfor, kan resultatet av sti-og nettverksanalyse som bruker dette programmet ikke alltid være relevant for primærceller eller i dette tilfellet, stamceller.

Til tross for disse begrensninger, kan metodene beskrevet i dette dokumentet, brukes tilkultur iPS-celler og foster RPE, stammer RPE fra iPS-celler, og utvinning av RNA for microarray analyse av miRNA. De data som genereres av disse analysene kan anvendes for å identifisere miRNAs involvert i differensiering prosessen, så vel som de som regulerer RPE funksjoner.

Selv om flere mirnas ble funnet å være forskjellig uttrykt i foster RPE vs iPS-RPE sammenligning enn i iPS vs iPS-RPE sammenligning, det er mange mulige årsaker til dette. Først av alt, når denne analysen ble utført, miRNA microarray plattform var i stand til å oppdage 1205 mennesker og 144 viral miRNAs. Siden den gang har plattformen blitt utvidet til å omfatte prober for over 2000 mennesker miRNAs. Det er absolutt mulig at miRNA differensial uttrykk profiler vil endre seg dersom flere mirnas oppdages. Av de 1349 miRNAs oppdages av denne analysen, har de fleste av miRNAs viste ingen forskjell i ekspresjon mellom celletypene (figurene 2B og 2C

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Meningene eller påstander som finnes her, er de private visninger av forfatterne og skal ikke tolkes som offisiell eller som gjenspeiler synspunktene til Department of the Army eller Department of Defense.

Denne forskningen ble utført mens forfatterne Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, og Ramesh R. Kaini holdt en National Research Council postdoktor Associateship på USAISR.

Microarray-analyser ble utført av Greehey Barnas Cancer Research Institute microarray Kjerne Facility og bioinformatikk avdeling ved UT Health Science Center San Antonio.

Dette arbeidet ble støttet av US Army Klinisk Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) og Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5X supplement Stem Cell Technologies 5850
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-β-mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-l-thyronine sodium salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Fetal RPE media RTEGM kit Life Technologies 195406
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Trypsin Hyclone(Fisher) 25200-072
Miltenyi Biotec washing buffer StemGent 130-092-987
Miltenyi Biotec rinsing buffer StemGent 130-092-222
Anti-TRA-1-60 microbead kit StemGent 130-095-816
Miltenyi Biotec cell sorter column StemGent 130-021-101
RNeasy micro kit Qiagen 74004
QIA shredder Qiagen 79654
RNA 6000 Pico LabChip kit Agilent G2938-90046
Human miRNA microarray v16 Agilent G4471A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
  2. Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
  3. Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
  4. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
  5. Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
  6. Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
  7. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
  8. Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
  9. Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
  10. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
  11. Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
  12. Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
  13. la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
  15. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
  16. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
  17. Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
  18. Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
  19. Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
  20. Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
  21. Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
  22. Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
  23. Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
  24. Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
  25. Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
  26. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
  27. Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. (2013).
  28. Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. (2011).
  29. Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. (2010).
  30. The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics