Dissecção e Análise de Downstream da Zebra Finch embriões em estágios iniciais de desenvolvimento

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Murray, J. R., Stanciauskas, M. E., Aralere, T. S., Saha, M. S. Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development. J. Vis. Exp. (88), e51596, doi:10.3791/51596 (2014).

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Abstract

O passarinho de zebra (Taeniopygia guttata) tornou-se um modelo cada vez mais importante organismo em muitas áreas de pesquisa, incluindo toxicologia 1, 2, 3 comportamento e memória e aprendizagem 4,5,6. Como a única ave canora com um genoma seqüenciado, o tentilhão tem um grande potencial para o uso em estudos de desenvolvimento; No entanto, as fases iniciais de desenvolvimento da zebra Finch não ter sido bem estudado. A falta de pesquisa em desenvolvimento Finch zebra pode ser atribuída à dificuldade de dissecção do ovo pequeno e embrião. O seguinte método de dissecação minimiza os danos do tecido embrionário, o que permite a investigação da morfologia e a expressão do gene em todos os estádios de desenvolvimento embrionário. Isto permite que ambos campo brilhante e as imagens de embriões qualidade de fluorescência, a utilização em procedimentos moleculares, tais como hibridação in situ (ISH), ensaios de proliferação celular, e a extracção de ARN para ensaios quantitativos, tais como rea quantitatival-time PCR (qtRT-PCR). Esta técnica permite que os investigadores a estudar estágios iniciais de desenvolvimento que antes eram de difícil acesso.

Introduction

O objetivo geral desta técnica é obter zebra Finch (Taeniopygia guttata) embriões desde os primeiros estágios da embriogênese para uso em uma ampla gama de estudos de desenvolvimento. Passarinho de zebra tornaram-se o modelo predominante songbird organismo e têm sido amplamente utilizados em uma variedade de campos, incluindo toxicologia 1,2, 3 comportamento, memória e aprendizagem 4,5,6, neuroanatomia comparativa 7,8 e desenvolvimento da linguagem 9,10 . Como a única ave canora com um genoma seqüenciado, o tentilhão permite o estudo molecular e genética da ordem Passeriformes, o que representa mais de 50% das espécies de aves conhecidas 11, 12,13.

Apesar do uso de adulto e tentilhão juvenil em uma diversificada gama de campos, poucos estudos foram realizados em embriões zebra passarinho, especialmente durante os estágios iniciais de desenvolvimento. Isto pode ser atribuído ao tamanho pequeno do seu ovos umª embriões, e seu status como uma nova 14,15,16 organismo modelo para estudos em que o frango (Gallus gallus domesticus) já foi usado como um sistema de 17,18,19,20,21 modelo predominante. No entanto, como os alunos não-vocais, as galinhas não são um sistema modelo adequado para estudar a base genética da aprendizagem vocal, desenvolvimento da aprendizagem vocal, herdabilidade, comportamento, eo circuito córtico-basal gânglios envolvidos na aprendizagem de motor 10.

É importante notar que os embriões zebra passarinho são muito mais delicada e mais facilmente danificadas do que embriões de galinha durante a dissecção e procedimentos moleculares. Em particular, o maior cuidado é necessário ao executar passos permeabilização de embriões passarinho de zebra. Detergentes fortes e enzimas que não iria prejudicar um embrião de galinha pode danificar embriões passarinho de zebra. Em termos de cuidados gerais, é necessário colocar ovos passarinho de zebra em pequenos copos antes da colocação em uma incubadorapara evitar que se quebre rolando durante a incubação.

Passarinho de zebra são passíveis de estudos comportamentais, de forma fácil e prolífica raça durante todo o ano em cativeiro, e são aprendizes vocais. Estas características permitem o uso de passarinho de zebra para atender à necessidade de um organismo modelo que integra o desenvolvimento, genética e aspectos comportamentais da linguagem. Os métodos de dissecções detalhadas abaixo, combinadas com um guia de preparação desenvolvido recentemente específico para zebra finch 22, fazer o tentilhão um modelo de desenvolvimento padronizado organismo cada vez mais útil. No entanto, a obtenção de embriões em estágios iniciais pode ser assustador. Este protocolo permite aos investigadores obter facilmente embriões em fase inicial. Estudos que investigam o desenvolvimento inicial ea base molecular do desenvolvimento de comportamentos complexos em zebra passarinho, ou os efeitos toxicológicos de desenvolvimento em outros pequenos, aves passeriformes vai encontrar esta metodologia dissecção útil.

Protocol

Declaração de Ética: Os métodos foram realizados com tentilhões-zebra domesticados da colônia de reprodução no College of William and Mary. Todos os procedimentos seguiram as orientações da RSPCA 23 e foram aprovados pelo College of William and Mary OLAW (Office of Laboratory Animal Welfare) Bem-Estar Animal Assurance (# A3713-01) e teve Comitê Institucional Animal Care e Use (IACUC) aprovação (# 2013-06 -02-8721-Dacris).

1. Coleção do ovo e Incubação

  1. Estabelecer pares passarinho de zebra em uma luz 14:10: Ciclo escuro. Fornecimento de alimentos, água, feno, e um ad libitum ninho. Nota: Cuidados de rotina e de reprodução de tentilhões-zebra tem sido bem descrita 23.
  2. Prepare uma incubadora garota normal com prateleiras inclinadas. Nota: Manter a incubadora artificial a 37,5 (+ / - 1) ° C, com 80 - 95% de humidade por adição de água para o fundo da incubadora numa base diária. Permitir que a incubadora a equilibrar durante dois diasantes de usar.
    1. Selecione copos de alimentação pequenas (5 x 7,6 cm) de pelo menos 2,5 cm de profundidade para manter os ovos na incubadora. Forre o fundo e as bordas inferiores do copo com duas camadas de papel toalha para que o copo é preenchido, enquanto ainda permitindo que os ovos para rolar com facilidade. Colocar estes copos em prateleiras oscilantes da incubadora. Nota: O excesso de enchimento pode inibir a laminação, o que vai impedir de incubação bem sucedida devido a aderência embrionário para o interior do invólucro.
  3. Recolher os ovos em duas horas após o início do ciclo de luz. Nota: Isso minimiza discrepâncias no desenvolvimento palco para um determinado tempo de incubação devido a incubação dos pais.
    1. Pegar ovos suavemente com o polegar eo dedo indicador na ponta e na base ao longo do comprimento do ovo. Use um maçante, lápis macio grafite 4B para rotular a data prevista e do tempo coletados do ninho. Nota: O lápis 4B mais suave reduz o risco do lápis quebra a frágil casca de ovo.
    2. 1.3.2) Coloque 1-5 ovos rotulados em cada c-se na incubadora de modo que os ovos pode rolar livremente para impedir a adesão embrionário para o interior da concha. Nota: Colocar mais de 5 ovos em um copo pode impedir rolamento dos ovos individuais e reduzir a viabilidade de embriões.

2. Remoção de Embrião de ovo

  1. Para se preparar para a dissecação, reunir os seguintes materiais: um bisturi limpo, pinças de ponta fina, e duas finas ponta fórceps extras. Colocam-se 10 x 10 cm peso de papel sobre a base do escopo de dissecação para proporcionar uma superfície limpa, não absorvente para dissecção. Nota: O papel pesar é fundamental, pois permite fácil manipulação da gema e é a melhor superfície para cortar as delicadas membranas com um bisturi.
  2. Prepara-se uma alíquota de solução salina de tampão fosfato (PBS 1X) num tubo de polipropileno de 50 ml, e adquirir, pelo menos, três pipetas de transferência e um pequeno balde de lixo. Se fixar os embriões, prepare uma alíquota de 4% paraformaldeído (PFA) Atenção:. Vapores PFA são tóxicos, umad todas as etapas que envolvem PFA deve ser feito dentro de um exaustor para minimizar a exposição. Se o Flash congelamento dos embriões, obter nitrogênio líquido e mantê-lo perto do escopo dissecar. A esterilidade não é um problema para este protocolo de dissecação, mas garantir que todos os materiais estão limpos.
  3. Remover os ovos da incubadora no ponto de tempo necessária para a fase desejada, conforme descrito no guia de paragem zebra Finch 22. Nota: Retire os ovos após 36 horas de incubação para dissecar fase 6 embriões (Figura 4A) 22 e remover os ovos após 56 horas de incubação para dissecar palco 12 embriões (Figura 3A) 22.
  4. Usando uma lâmpada iluminador de fibra óptica, vela do ovo, segurando-o ao longo de seu eixo e brilho de luz vertical através do ovo para iluminar o interior. Colocar a ponta da luz atrás do ovo e da gema e localizar o embrião em desenvolvimento.
    1. Posicionar o bisturi no lado oposto da gema e cortar ao longo do ovo a partir de ponta debase com pressão fraca.
  5. Remover o conteúdo do ovo aplicando-se cuidadosamente a pressão na ponta e base do ovo com o polegar e o dedo indicador, ou empurrando com cuidado para além da casca do ovo ao longo do corte com uma pinça. Abra o ovo diretamente sobre o papel pesar para que a gema rola suavemente para fora.
  6. Examinar a gema para a zona branca de junção, o que é visível como um anel branco fraco circundando o desenvolvimento embrionário e orientar a gema usando extra fino desviado fórceps de modo a que o embrião está localizado no centro.
    Nota: Se um círculo branco fraco na superfície da gema não for observado, tomar as pinça fina e delicadamente rolar a gema sobre até que o embrião é em cima da gema. Nota: Para as fases 1-9 22, o disco embrionário é menor do que 6 mm de diâmetro e é visível como, um disco ligeiramente opaca fraco na superfície da gema - ver Figura 1 por referência. Para os estágios 10 e mais velhos 22, piscinas de sangue permitem melhorou visibility do embrião, mas tome cuidado para evitar a perfuração do saco vitelino, pois isso faz com que a localização do embrião difícil.

3. Separação de embriões a partir de tecido extra-embrionário

  1. Perfurar as bordas da gema para aliviar a pressão (Figura 1B), e fazem cortes individuais em todo o comprimento do diâmetro vitelino ao lado do disco embrionário. Repetir tornando estas linhas diagonais até que a secção da gema contendo o embrião foi separado com sucesso (Figura 1B). Nota: Este passo permite que a massa de gema para permanecer intacta, mas a pressão reduzida na superfície da gema permite uma maior precisão no corte em torno do embrião, a prevenção de danos em estruturas embrionárias.
  2. Retirar as bordas da gema com uma pipeta de transferência. Nota: Remover o máximo possível de gema, mas deixa uma pequena quantidade de modo a que o embrião não adere à superfície seca do papel de pesar e desgaste.
  3. Lavar o disco embrionário por dispensing 1X PBS, a um ângulo de 45 ° em direcção ao fundo do embrião. Colocar a ponta da pipeta de transferência próxima para não acima do disco embrionário. Se as necessidades de gema adicionais a serem removidos, separar qualquer gema com o bisturi sobre o papel antes de pesar transferência do embrião para a placa de Petri. Nota: Este método remove o embrião a partir da superfície do papel de pesagem.
  4. Transferir o embrião usando uma pipeta de transferência, juntamente com um volume mínimo de 1X PBS para uma pequena placa de Petri de plástico. Lavar o embrião adicionando mais 1X PBS para a placa de Petri e pingando 1X PBS próximo, mas não directamente sobre o embrião. Agitar a placa de Petri para lavar e remover gema residual, incline a placa de Petri, e remover resíduos 1X PBS com a pipeta de transferência.
    Nota: Quando o 1X PBS é removida, o embrião normalmente não aderem ao fundo da placa de Petri de plástico, porque é a superfície escorregadia com residual 1X PBS. No entanto, mais 1X PBS pode ser adicionada se o embrião adere ao prato.
    Se fixação tele embrião, siga os passos 3.5 e 3.6. Se o Flash congelamento do embrião, pule para o passo 3.8 imediatamente.
  5. Se a fixação do embrião para hibridação in situ, adicionar imediatamente PFA a 4% para a placa de Petri, para submergir o embrião. Gotejamento PFA a 4% directamente sobre o topo do embrião, a fim de achatar; isso impede que o embrião do curling. Corrigir o embrião em PFA a 4% a 4 ° C durante 12 hr.
    1. Após a fixação, desidratar embriões em metanol graduada soluções (MeOH) e armazenar a -20 ° C em 100% de MeOH.
  6. Se o embrião está entre as fases 1-8 22, remover a membrana vitelina aderido ao embrião. Nota: Este passo pode ser feito durante ou após fixação. Os embriões com menos de estágio 8 22 não são facilmente visualizados, porque eles aderem à membrana vitelina, obscurecendo estruturas essenciais, como visto na Figura 2A.
    1. Segure a borda da membrana que se estende para além da zona de junção com uma pinça extra fino. Carefully virar o embrião sobre várias vezes para lavar grânulos de vitelo residuais e para soltar a aderência do disco embrionário para a membrana vitelina. Nota: Não toque no centro do embrião, pois isso irá danificar estruturas embrionárias.
    2. Se uma lacuna não aparece entre a zona de junção e a membrana vitelina, gentilmente arranhar a zona de junção com o extra fino ponta fórceps para soltá-lo da membrana vitelina. Segure a membrana vitelina com o extra fino ponta pinça e puxe-o para longe do embrião. Se necessário, puxe o embrião longe da membrana vitelina agarrando a borda periférica do disco embrionário na zona de junção.
    3. Descarte a membrana vitelina em risco biológico 1 resíduos (nível de biossegurança 1) após a remoção.
  7. Ao realizar um ensaio ISH em jovens estágios embrionários, siga todo protocolos montagem ISH padrão para embriões de galinha 24, 25, mas considere as seguintes sugestões. Para reduzir os danos aos embriões durante o procedimento ISH, usar um único frasco de vidro 5 ml com tampa de rosca para cada embrião. Apenas encher frascos com 2-3 ml de solução, garantindo que os embriões são totalmente submerso. Frascos nutar verticalmente colocando frascos de 5 ml num suporte de isopor (ou qualquer cremalheira que vai manter os frascos seguros) que é presa a um nutator. Nota: Esta precaução evita o embrião seja rompida, o que pode ocorrer quando se entra em contacto com a tampa do frasco durante nutação horizontal.
  8. Para os embriões fase 0-6 22, trata-se com 5 ug / ml de proteinase K em 1X PTW durante 5 min à temperatura ambiente. Treat embriões encenado 7 - 12 22 com 10 ug / ml de proteinase K em 1X PTW durante 10 min a 37 ° C para reduzir a coloração de fundo.
  9. Para produzir uma reacção colorida suficiente para detectar baixos níveis de expressão de genes em fases 1-10 22, incubar com uma concentração de sonda de 10 ng / ml durante 12 horas. Para os estágios mais antigos, incubar com 1 & #956; g / ml de concentração de sonda a 60 ° C.
  • Se o embrião de congelamento flash, rapidamente adicionar 2-3 ml 1X PBS para a placa de Petri após dissecção e incline a placa de Petri para separar o embrião dos grânulos de vitelo. Remover o líquido e repetir 2 - 3 vezes para remover todos gema. Usando bem cotado fórceps, transferência de embriões para um tubo de microcentrífuga pré-rotulados e congelamento de flash em nitrogênio líquido antes de armazenar a -80 ° C.
  • 4. EdU celular Ensaio de Proliferação. Incorporação e Detecção de EdU em Zebra Finch Embriões.

    1. Candle o ovo usando uma lâmpada de iluminador de fibra óptica para localizar o embrião ou gema.
    2. Marcar o lado oposto do ovo para a localização do embrião ou gema de ovo dentro do para garantir que o embrião não seja danificada durante o processo de microinjecção.
    3. Linha de um prato de plástico de 60 mm e argila de modelagem e moldá-lo na forma de uma bacia para manter o ovo na orientação desejada. O local marcado deve serorientado para permitir a inserção da agulha de microinjecção utilizando o micromanipulador. Nota: O barro vai estabilizar o óvulo durante a microinjeção e em toda a incubação no passo 4.11.
    4. Puxe duas agulhas microinjeção capilares de vidro. Blunt uma agulha para fazer um buraco no ovo no local marcado. Prepare a segunda agulha microinjeção para injecção por backloading-lo com óleo mineral e inseri-lo na microinjetor.
    5. Definir o volume de solução lançado por injecção para 59,8 nl no microinjetor.
    6. Coloque a agulha de microinjecção com a solução estoque EdU 10 mM.
    7. Criar um buraco no casco no local marcado com o capilar de vidro, embotada, tomando cuidado para não quebrar a casca ou soltar pedaços da casca do ovo para a cavidade. Orientar o ovo de forma que o furo está a um ângulo de 45 °, permitindo que a agulha de microinjecção para ser inserida directamente na cavidade para a gema ou embrião.
    8. Usando o micromanipulador, inserir ocarregado agulha aproximadamente 1,0 cm para dentro da cavidade.
    9. Injectar a quantidade desejada da solução EdU directamente sobre o embrião em desenvolvimento ou gema. Nota: Um máximo de 478 nl Edu pode ser injetado, sem resultar em morte embrionária.
    10. Imediatamente embrulhar o ovo e o suporte de argila com múltiplas camadas de película de plástico para cobrir o ovo e o recipiente para evitar a dessecação do embrião durante a incubação. Fita as extremidades do plástico moldado para a parte inferior do recipiente para evitar que o plástico se desenrole durante a incubação. Nota: O plástico só deve ser removida imediatamente antes da dissecação.
    11. Permitir que as células em proliferação recentemente para incorporar o EdU por incubação do ovo, a 37 ° C até à fase desejada seja atingida. Após a injeção, não retorne ovo para inclinar prateleiras na incubadora. Coloque a argila prato forrado envolto em plástico na superfície estável dentro da incubadora.
    12. Retire o filme plástico e dissecar o embrião seguindo o protocolo acima mencionado.Corrigir o embrião em PFA a 4% e incubar 12 horas a 4 ° C como descrito acima. Após a fixação, lava-se com etanol a 100% (EtOH), durante 5 min e armazenar em fresco EtOH a 100% a -20 ° C até análise posterior.

    5. Edu "Clique em" Protocolo de Reação

    Os seguintes passos são realizados todos em frascos de vidro.

    1. Rehidratar embriões com sucessivas lavagens de 5 min a seguinte:
    2. EtOH, EtOH a 75% e 25% desionizada estéril destilada (sdd) de água, 50% de EtOH e 50% sdd água, 25% de EtOH e 75% 1X PTW, 100% 1X Ptw
    3. Lavar três vezes em 100% 1X PTW durante 10 min cada.
    4. Dilui-se o aditivo de tampão de reacção (Kit de componentes F) através da combinação de uma parte da solução de estoque de tampão 10X (10 mL) a 9 partes de sdd água (90 mL).
    5. Preparar a mistura de reacção num tubo separado, misturando o seguinte: 875 ul de PBS 1X, 20 ul de CuSO 4, 5 ul de azida, 100 ul de tampão de reacção diluída aditivo.Nota: O volume da mistura de reacção pode ser reduzida. A reacção funcionará se o embrião está completamente coberta na mistura de reacção. Adicionar o aditivo de tampão de reacção diluída (passo 5.3) imediatamente antes da utilização. Todos os passos subsequentes são realizados no escuro. Cubra os embriões com papel alumínio para proteger da luz.
    6. Cobrir os tubos de ensaio com folha de alumínio, e incube-as verticalmente à temperatura ambiente durante duas horas, colocando-os num suporte de isopor ligado a um nutator.
    7. Lavar os embriões 3 vezes em 1X PBS fresco durante 10 min cada.
    8. Incubar os embriões em fresco PFA a 4% durante a noite a 4 ° C.
    9. Lavar 3 vezes em 1X PBS durante 10 min cada e armazenar em fresco 1X PBS a 4 ° C. Cubra os embriões com papel alumínio até que uma análise mais aprofundada.

    Representative Results

    Os passos no diagrama da Figura 1 indica a aparência do embrião, enquanto ligado à membrana vitelina (A) e demonstrar o método adequado para separar o embrião da gema (B). O embrião pode ser identificado por a zona de junção, o que é muito mais leve do que a membrana vitelina. O embrião é em si, muitas vezes difíceis de distinguir até que a gema é cortado. Uma vez que o embrião é dissecado a partir do ovo, que pode ser fixo ou flash congelado para uso futuro. Se uma hibridização in situ está prevista para o embrião dissecado, que é necessário para remover a membrana vitelina que é aderida ao embrião através da zona de junção. Figura 2 ilustra o melhor visibilidade do embrião uma vez que este é removido da membrana (C), ea maneira correta de descascar a membrana vitelina (A, B). Após a dissecção e fixação, toda montagem de hibridação in situ foi efectuada tal como visto na Figura 3 (A, A ', B, B') E Figura 4 (A, A', B, B ') e Figura 5 (A, B, C) ​​para detectar diferenças em orthodenticle homeobox 2) expressão (OTX2 em embriões developmentally expostos a doses baixas de metilmercúrio. Figura 5 mostra resultados da sonda sentido, demonstrando falta de fundo. Na Figura 4, apesar de ter sido dissecada do ovo ao mesmo ponto de tempo, o embrião developmentally expostos ao metil-mercúrio (metilmercúrio) progrediu para a fase 5 22 (B, B '), enquanto que o embrião de controlo desenvolvida para a fase 6 22 (A, A '). O grupo de embriões dissecados e mostrado na Figura 4 foram recolhidas a partir do ninho e retirado da incubadora nos mesmos tempos. Embora alguma variação natural está presente em desenvolvimento, com base em dados anteriores de dissecção, é pouco provável que as variações de temperatura na incubadora causaria apenas os embriões de metilmercúrio 2,4 ppm ser desenpmentally retardada. As diferenças de estágios indicam mudanças na proliferação celular em embriões developmentally expostas ao metilmercúrio.

    Antes de dissecção, EdU foi injectada num ovo dia 2 e deixou-se incubar durante a noite. Após a dissecção e a fixação da fase 16 22 embrião, EdU foi visualizada usando o "clique" química, permitindo a detecção de células que proliferam como pode ser visto na Figura 6 (A, B, C). É importante acompanhar atentamente os momentos ao colocar ovos na incubadora e durante dissecações, como a exposição ao metilmercúrio ou da realização do ensaio EdU pode interromper a progressão do desenvolvimento. Os primeiros injecção foi efectuada no dia 0, que foi o dia da colheita, tal como especificado no passo 1.3. Este embrião foi dissecado aproximadamente 38 horas depois (fase 7 22). A taxa de sobrevivência foi encontrada em cerca de 90% (o mesmo ritmo que os embriões de controlo), enquanto a quantidade de injecção foi de 478 nl sob.

    22 embriões, uma extracção de RNA foi feita de acordo com o protocolo do fabricante, com nenhuma optimização necessário, como pode ser visto na Figura 7. A remoção da membrana vitelina é desnecessária para a extracção de ARN e posteriores aplicações de qRT-PCR.

    Nota: Todos os valores de embriões são orientadas de modo que as regiões anterior e posterior são na parte superior e na parte inferior da imagem, respectivamente.

    Figura 1
    Figura 1. Procedimento para localizar e dissecar embriões zebra passarinho, encena 1-10 22. Localize embrião por suavemente ondulado a gema até que o disco branco fraco é aparente (A). Uma vez que oembrião está localizado no centro da gema, a gema é dissecado de uma forma passo a passo (B), onde o primeiro corte alivia a pressão da membrana vitelina (1) e os cortes posteriores (2) limitam a zona de junção (zj) que está aderidas à membrana vitelina. Barras de escala representam um milímetro.

    Figura 2
    Figura 2. Remoção de membrana vitelina e visibilidade de estruturas embrionárias. Após remoção do embrião da gema, lugar de embriões em uma placa de Petri contendo 4% de PFA. Se uma hibridização in situ tem de ser realizada, a visibilidade das estruturas embrionárias é essencial e pode ser conseguido pela remoção da membrana vitelina (A). Segure a membrana vitelina com extra fino ponta fórceps e delicadamente descascar-lo longe do embrião ao manipular o embrião diretamente na borda mais externa, se necessário(B). Remoção da membrana vitelina aumenta a clareza de estruturas embrionárias, embriões e permite a ser trabalhada ou processado com hibridação in situ (C). Barras de escala representam 1 ​​mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 3
    Figura 3. Whole montagem de hibridização in situ realizada em embriões tentilhão developmentally expostos ao metilmercúrio. Padrões de expressão de orthodenticle homeobox 2 (OTX2) foram caracterizados em embriões expostos a 0,0 ppm metilmercúrio (A, A ') e 2,4 ppm metilmercúrio (B, B ') através da alimentação parental. O doRsal (A) e ventral (A ') a expressão de OTX2 é visível em todas as vesículas do mesencéfalo e ópticas durante o estágio 12 22. Os embriões do grupo de tratamento foram dissecados no mesmo ponto de tempo, mas foram desenvolvimento retardado, como visto na dorsal (B) e vista ventral (B ') das estruturas da cabeça, que são característicos da etapa 11 22 Abreviaturas:. mb, mesencéfalo; op, vesícula óptica. Barras de escala representam um milímetro.

    Figura 4
    Figura 4. Whole montagem   in situ   hibridização realizada em embriões zebra passarinho developmentally expostos ao metilmercúrio. padrões de expressão de orthodenticle homeobox 2 (OTX2) foram caracterizados em fase 6 22 embry OS expostas a 0,0 ppm de metilmercúrio (A, A ') e fase 5 22 embriões expostos ao metil-mercúrio 2,4 ppm (B, B'), através de dieta parental. Abreviaturas: AM, margem anterior da mesoderme; não, notocorda, mesoderme notocorda; po, proamnion, blastopore anterior; ps, linha primitiva 22. Barras de escala representam um milímetro.

    Figura 5
    Figura 5. Whole mount in situ   hibridização realizada em embriões tentilhão usando sonda sentido. (A) Fase 5 22 embrião. (B) Fase inicial 6 22 embrião. (C) Stage 11 22 embrião. Barras de escala representam um milímetro.

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    Figura 6. EdU incorporação e de proteção em embriões de passarinho de zebra. Edu "clique em" química foi usado para detectar células em proliferação em um estágio embrionário 16 22 (A, B, C). EdU é incorporado no ADN em vez de timidina 26, 27 e é detectada através de clique química 27. A proliferação é claramente visível nas bordas laterais dos somitos e do tailbud. O painel A mostra a proliferação ocorre exclusivamente na parte posterior do embrião e também mostra as células proliferativas individuais. O painel B mostra os locais de proliferação em todo o embrião. O painel C mostra a região anterior, e mostra a telencéfalo altamente proliferativo (te) em maior detalhe. Abreviaturas: af, dobra amniótico; FLB, membro anterior botão; hlb, hindlimb botão; le, vesícula do cristalino; ms, mesencéfalo; mt, Metencéfalo; OPC, copo óptica; pa, arco da faringe; sm, mesoderme somite; tb, tailbud; te, telencéfalo. Barras de escala representam 1 ​​mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 7
    Figura 7. Qualidade de RNA extraído de embriões dissecados zebra Finch. Controlo (0,0 ppm) e 1,2 ppm de metilmercúrio embriões foram dissecadas e rapidamente congelados como descrito no passo 3.8. Cada pista apresenta RNA extraído a partir de dois embriões homogeneizados de cada grupo de tratamento.

    Discussion

    O recente desenvolvimento de um guia de preparo embrionário 22 e anotação do genoma fazer o tentilhão um organismo modelo para estudos de desenvolvimento desejável. No entanto, o pequeno tamanho e fragilidade dos embriões zebra passarinho, que variam entre 3 e 7 mm de estágios 1 - 10 22, pode tornar difícil dissecções 11, 14. Localizando e de forma limpa retirar embriões a partir da superfície da gema pode ser um desafio. Este protocolo fornece detalhes suficientes para realizar o procedimento com facilidade. Este protocolo demonstra as etapas críticas que não são tipicamente conhecidos, mas são necessárias para garantir uma dissecção de sucesso. Por exemplo, é essencial para deixar uma pequena camada de gema de entre o embrião e a folha de papel de pesagem para evitar que adere.

    Tanto a identificação e remoção do embrião pode ser difícil. Para solucionar a identificação do embrião sobre a superfície da gema, brilho de luz directamente por cima da gema após temfoi removido do ovo, e olhar para a gema de um ângulo de 45 ° para encontrar o embrião. Uma vez que o embrião está localizado, a gema de corte em peso de papel, tendo o cuidado de não destruir o embrião.

    Se outras aplicações incluem imagiologia por diferenças anatómicas, hibridação in situ, ou de ensaios de proliferação celular, é importante remover a membrana vitelina em fase 1-8 22 para uma melhor visualização das estruturas. Se passando por dificuldades ao remover a gema ou a membrana vitelina em estágios iniciais, fixe o embrião em PFA 4% antes de lavá-lo em 1X PBS para reduzir a fragilidade embrionário. Ao primeiro remover a membrana vitelina durante a dissecção, como descrito, as estruturas são claramente visíveis e intacto em embriões tentilhão após a realização de uma hibridização in situ.

    Uma limitação do Edu é que a administração de volumes de dosagem sobre 478 ligações nl a fatalidade embrionário. No entanto, a vasta gama de dosagem permite varyinníveis de g de marcação de proliferação celular.

    A reação "click" utilizado neste kit é o de cobre (I)-catalisada por Alcino-Azida-cicloadição (Cu (I) AAC). Nesta reacção especifica, uma molécula de análogo da timidina contendo alcino (EdU) é constituída por células em divisão activa. O grupo alcino no EdU se projecta a partir da estrutura helicoidal do ADN, e é detectada pela exposição a uma molécula de azida conjugado com uma molécula de verde, fluorescente que se liga ao grupo alcino livre. A fluorescência verde indica que as células em proliferação recentemente no embrião. A bio-ortogonalidade da azida e os grupos alcino impede a coloração não específica, porque estas espécies reactivas não estão naturalmente presentes nos organismos. Além disso, porque o ADN não necessita de ser desnaturado de modo a que a reacção ocorra, uma análise posterior dependente de DNA podem ser facilmente realizados 27.

    Uma limitação inerente do método é o tamanho pequeno e fragility de embriões passarinho de zebra. Retirar a membrana vitelina de embriões encena 1-15 22 pode resultar em estruturas embrionárias prejudiciais se não for realizado com cautela. No entanto, este protocolo simplifica o método de dissecação, permitindo aos investigadores utilizar estágios embrionários iniciais para analisar anomalias estruturais e expressão de genes que não foram anteriormente estudadas em profundidade. Este protocolo abre o caminho para uma infinidade de ensaios celulares-molecular que permitirá que os investigadores a determinar as origens do desenvolvimento de fenótipos adultos. Por exemplo, será possível analisar a expressão de genes implicados na aprendizagem vocal sob diversas condições ambientais ou após tratamentos farmacológicos nas primeiras fases de desenvolvimento 28, 29,30,31. Apesar de não demonstrado neste trabalho, este método potencialmente permite a outros procedimentos, como radioativa em hibridização in situ em cortes de tecidos passarinho de zebra e eletroporação / in ovo Cirurgia 32, 33,34. Dado que o tentilhão foi estabelecida como um organismo modelo importante dentro de um vasto corpo de literatura, esses estudos fornecem oportunidades inexploradas para ligar mecanismos de desenvolvimento com a fisiologia eo comportamento adulto, em especial, o desenvolvimento da linguagem 7, 9.

    Disclosures

    Os autores não têm nada a revelar.

    Acknowledgments

    Os autores agradecem as suas fontes de financiamento, do Instituto Médico Howard Hughes Programa de Educação de Graduação Ciência da College of William and Mary; Patrocinador Grant: NIH (MSS); Número Grant: R15NS067566. Eles também reconhecem o apoio do College of William and Mary, do Departamento de Biologia e Faculdade de Artes e Ciências de assistência com cuidados com os animais.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Chicken egg incubator We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model   
    Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit Invitrogen C10337 Detection of cell proliferation. 
    Dissection microscope  We use Olympus SZ61
    7'' Drummond capillary for Nanoject II injector Drummond 3-00-203-G/X
    Drummond Nanoject II microinjector Drummond
    Dumont Tweezers #55 World Precision Instruments 14099
    Ethanol (EtOH)
    50 ml Falcon tube (polypropylene) Fisher Scientific 06-443-18 
    FastPrep Lysis Matrix H tubes MP biomedicals 6917-100 Used for RNA extraction, used to homogenize embryos
    Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) Dolan-Jenner Industries  Fiber-Lite MI-150 
    Glass vials with screw cap (DEPC treated) Fisher Scientific 03-338A
    Microcentrifuge eppe tube (1.5 ml) Fisher Scientific 05-408-129
    Mineral oil Sigma-Aldrich M-8410
    Modeling Clay Any brand
    Narshige PB-7 needle puller Narshige
    Omni Bead Ruptor Homogenizer OMNI International 19-010 Used for RNA extraction
    4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g paraformaldehyde, 350 ml sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x PBS Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. 
    Phosphate buffered saline (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1,800 ml Barnstead H2O, adjust pH to 7.4
    Phosphate buffered saline (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2.013 g KCL, 80.063 g NaCl, 2.722 g KH2PO4 monobasic, 14.196 g Na2HPO4 dibasic, 200 ml Barnstead H2O, adjust pH to 6.5
    Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1x PTw): 1,800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, adjust pH to 7.4, 2 ml Tween-20
    35 ml Plastic Petri dish  Fisher Scientific 08-757-100A
    plastic wrap Any brand
    Prepease RNA Spin Kit PrepEase, Affymetrix 78766 1 KT Used for RNA extraction, used to homogenize embryos
    Reaction Mix: 875 μl 1xPBS, 100 mM 20 μl CuSO4 (Kit Component E), 5 μl Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100 μl diluted reaction buffer additive (Kit Component F) Invitrogen C10337 Detection of cell proliferation. 
    sdd H2O
    Seed cup  We use it as a container when incubating eggs
    Stainless steel scalpel 
    Standard nest box We use Abba Plastic Finch Nestboxes
    4 ml, Teflon Lined Cap, Glass Vials Fisher Scientific 02-912-352
    Transfer pipettes (polyethylene) Fisher Scientific 13-711-7M 
    4 x 4 weigh paper Fisher Scientific 09-898-12B

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    References

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