Dissection und Downstream-Analyse von Zebra Finch Embryos in frühen Stadien der Entwicklung

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Murray, J. R., Stanciauskas, M. E., Aralere, T. S., Saha, M. S. Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development. J. Vis. Exp. (88), e51596, doi:10.3791/51596 (2014).

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Abstract

Der Zebrafink (Taeniopygia guttata) ist ein zunehmend wichtiger Modellorganismus in vielen Bereichen der Forschung einschließlich Toxikologie 1, 2, 3 Verhalten und Gedächtnis-und Lern 4,5,6. Als der einzige Singvogel mit einem sequenzierten Genoms hat die Zebrafinken ein großes Potenzial für den Einsatz in Entwicklungsstudien; jedoch die frühen Stadien der Zebrafinken Entwicklung nicht gut untersucht. Mangel an Forschung in Zebrafinken Entwicklung ist auf die Schwierigkeit der Zerlegung der kleinen Ei und Embryo zugeschrieben werden. Die folgende Präparation Verfahren minimiert embryonalen Gewebeschäden, die zur Untersuchung der Morphologie und Genexpression in allen Stadien der embryonalen Entwicklung ermöglicht. Dies ermöglicht sowohl Hellfeld-und Fluoreszenzbildqualität von Embryonen, verwenden Sie in der molekularen Verfahren wie die in-situ-Hybridisierung (ISH), Zellproliferationsassays und RNA-Extraktion zur quantitativen Assays wie quantitative real-time PCR (qtRT-PCR). Diese Technik ermöglicht Ermittler frühen Phasen der Entwicklung, die bisher nur schwer zugänglich waren zu studieren.

Introduction

Das Ziel dieser Technik ist es, Zebrafinken (Taeniopygia guttata) Embryonen aus den frühesten Stadien der Embryogenese für den Einsatz in einer breiten Palette von Entwicklungsstudien zu erhalten. Zebra-Finken haben sich die vorherrschende Singvogel Modellorganismus und haben ausführlich in einer Vielzahl von Bereichen, einschließlich Toxikologie 1,2, 3 Verhalten, Gedächtnis und Lernen 4,5,6, vergleichende Neuroanatomie 7,8, 9,10 und Sprachentwicklung eingesetzt . Als der einzige Singvogel mit einem sequenzierten Genoms ermöglicht die Zebrafinken molekulare und genetische Untersuchung der Passeriformes Ordnung, die über 50% der bekannten Vogelarten, 11, 12,13 darstellt.

Trotz der Verwendung von erwachsenen und jugendlichen Zebrafinken in einer Vielfalt von Bereichen haben nur wenige Studien auf Zebrafink Embryonen insbesondere während der frühen Phasen der Entwicklung durchgeführt wurde. Dies ist auf die geringe Größe der Eier zurückzuführennd Embryonen und ihre neueren Status als Modellorganismus für 14,15,16 Studien, in denen das Huhn (Gallus gallus domesticus) wurde zuvor als vorherrschende Modellsystem verwendet, 17,18,19,20,21. Als nicht-stimmlichen Lernenden sind jedoch Hühner kein geeignetes Modellsystem für die Untersuchung der genetischen Grundlagen der Spracherwerb, die Entwicklung von Spracherwerb, Erblichkeit, das Verhalten und den kortikalen Basalganglien-Schaltung in 10 motorischen Lernen beteiligt.

Es ist wichtig zu beachten, dass Zebrafinken Embryonen sind viel empfindlicher und leicht beschädigt, als Hühnerembryonen bei der Präparation und molekulare Verfahren. Insbesondere ist größere Sorgfalt erforderlich, wenn die Durchführung Permeabilisierung Schritte auf Zebrafinken Embryonen. Starke Reinigungsmittel und Enzyme, die nicht schaden würde einen Hühnerembryo können Zebrafinken Embryonen schädigen. In Bezug auf die allgemeine Pflege, ist es notwendig, Zebrafinken Eier in kleinen Tassen vor der Platzierung in einem Brutschrank gestelltum sie zu brechen beim Rollen während der Inkubation zu verhindern.

Zebrafinken sind zugänglich für Verhaltensstudien, einfach und produktiv zu züchten jährig in Gefangenschaft, und Gesangslernende. Diese Eigenschaften ermöglichen die Verwendung von Zebrafinken, die Notwendigkeit für einen Modellorganismus, die Entwicklung, Genetik und Verhaltensaspekte der Sprache integriert ehen. Die Dissektionen Methoden unten beschrieben, verbunden mit einem neu entwickelten Inszenierung Führungs spezifischen Zebrafinken 22, machen den Zebrafinken ein immer nützlich, standardisierte Entwicklungsmodell Organismus. Allerdings erhalten Embryonen in frühen Stadien kann entmutigend sein. Dieses Protokoll ermöglicht die Ermittler leicht Embryonen im Frühstadium zu erhalten. Studien, die die frühe Entwicklung und der molekularen Entwicklungs Grundlage komplexer Verhaltensweisen in Zebrafinken oder die toxikologischen Wirkungen auf die Entwicklung in anderen klein, Sperlingsvögel finden diese Dissektion Methodik nützlich.

Protocol

Ethik-Erklärung: Die Methoden wurden mit domestizierten Zebrafinken aus der Brutkolonie am College of William and Mary durchgeführt. Alle Verfahren gefolgt RSPCA Richtlinien 23 und wurden von der College of William and Mary OLAW (Office of Laboratory Animal Welfare) Tierschutz Assurance (# A3713-01) zugelassen und hatte Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Genehmigung (# 2013-06 -02 bis 8721-dacris).

1. Egg-Sammlung und Inkubation

  1. Stellen Zebrafinken Paare auf einem 14.10 Licht: Dunkel-Zyklus. Liefern Nahrung, Wasser, Heu und einen Nistkasten ad libitum. Hinweis: Regelmäßige Pflege und Zucht für Zebrafinken hat gut beschrieben worden 23.
  2. Bereiten Sie eine Standard-Küken Inkubator mit Neige Regalen. Hinweis: Halten des künstlichen Inkubator bei 37,5 (+ / - 1) ° C 80 - 95% Feuchtigkeit durch Zugabe von Wasser auf den Boden des Inkubators auf einer täglichen Basis. Lassen Sie den Inkubator für zwei Tage ins Gleichgewichtbevor Sie.
    1. Wählen Sie kleine Futterbecher (5 x 7,6 cm) mindestens 2,5 cm tief, um Eier in den Inkubator zu halten. Den Boden und unteren Rand der Tasse mit zwei Lagen Küchenpapier, so dass die Tasse ist gepolstert, während weiterhin die Eier leicht rollen. Legen Sie diese Tassen auf den Regalen Kippen des Inkubators. Hinweis: Zu viel Polsterung können Roll hemmen, die erfolgreiche Inkubation durch embryonale Haftung an der Innenschale verhindert.
  3. Sammeln der Eier bei zwei Stunden nach dem Beginn der Lichtzyklus. Hinweis: Dies minimiert Abweichungen in Entwicklungsphase für eine bestimmte Inkubationszeit wegen Eltern Inkubation.
    1. Pick up Eier vorsichtig mit Daumen und Zeigefinger an der Spitze und Basis entlang der Länge des Eies. Verwenden Sie eine matte, weiche 4B Bleistift, um die festgelegten Datum und Zeit aus dem Nest gesammelt zu beschriften. Hinweis: Das weichere Bleistift 4B verringert das Risiko des Bleistifts Brechen der zerbrechlichen Eierschale.
    2. 1.3.2) Legen Sie 1-5 markierte Eier in jedem cim Brutschrank so daß Eier frei rollen embryonale Haftung auf dem Inneren des Gehäuses zu verhindern. Hinweis: Wenn sich mehr als 5 Eier in einer Tasse können Rollen der einzelnen Eier zu verhindern und reduzieren die Lebensfähigkeit von Embryonen.

2. Entfernung der Embryo aus Egg

  1. Um für die Präparation vorzubereiten, montieren die folgenden Materialien: ein sauberes Skalpell, Pinzette mit feiner Spitze und zwei extra feine Spitze Pinzette. Zeigen 10 x 10 cm wiegen Papier auf der Basis des Binokular, um eine saubere, nicht-saugfähige Oberfläche für die Präparation zu liefern. Hinweis: Das Papiergewicht ist entscheidend, denn es ermöglicht eine einfache Handhabung des Eigelbs und die beste Oberfläche für das Schneiden der empfindlichen Membranen mit einem Skalpell.
  2. Vorbereitung eines Aliquots phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1X PBS) in einem 50 ml Polypropylen-Röhrchen, und mindestens drei Transferpipetten und eine kleine Abfallbehälter zu erwerben. Wenn die Festsetzung der Embryonen, bereiten einen aliquoten Teil 4% Paraformaldehyd (PFA). Vorsicht: PFA Dämpfe sind giftig, eind alle Schritte mit PFA sollte in einem Abzug durchgeführt werden, um die Exposition zu minimieren. Wenn Flash Einfrieren der Embryonen zu erhalten flüssigem Stickstoff und halten Sie sie in der Nähe des Binokular. Sterilität ist nicht ein Problem für diese Präparation-Protokoll, sondern sicherzustellen, dass alle Materialien sind sauber.
  3. Entfernen Sie das Ei aus dem Brutschrank bei dem für die gewünschte Stufe, wie in der Zebrafinken Inszenierung Führung 22 beschrieben benötigt Zeitpunkt. Hinweis: Entfernen Sie Eier nach 36 h Inkubation zu Stufe 6 Embryonen (4A) 22 sezieren und Eier zu entfernen nach 56 h Inkubation Stufe sezieren 12 Embryonen (3A) 22.
  4. Mit Hilfe eines faseroptischen Beleuchtungslampe, Kerzen das Ei, indem Sie sie entlang der vertikalen Achse und Glanz Licht durch das Ei, um den Innenraum zu beleuchten. Setzen Sie die Spitze des Lichts hinter dem Ei und suchen Sie das Eigelb und den sich entwickelnden Embryo.
    1. Positionieren Sie das Skalpell auf der gegenüberliegenden Seite der Dotter und schneiden entlang der Ei von der Spitze bisBasis mit schwachen Druck.
  5. Die Inhalte des Eis vorsichtig entfernen, indem Druck auf die Spitze und der Basis des Ei mit dem Daumen und dem Zeigefinger oder durch Abdeckung vorsichtig auseinander die Eierschale entlang dem Schnitt mit einer Pinzette. Öffnen Sie das Ei direkt über dem Papier wiegen, so dass das Eigelb rollt vorsichtig heraus.
  6. Untersuchen Sie das Eigelb für die weiße Zone der Kreuzung, die als schwachen weißen Ring um die embryonale Entwicklung zu sehen ist, und richten das Eigelb mit extra feine Spitze Pinzette, so dass der Embryo in der Mitte.
    Hinweis: Wenn ein schwacher weißer Kreis auf der Oberfläche des Eigelbs nicht beachtet wird, nehmen Sie die feinen Pinzette und sanft rollen, bis das Eigelb über der Embryo auf dem Eigelb. Hinweis: Für die Stufen 1-9 22, ist die Keimscheibe weniger als 6 mm im Durchmesser und ist als eine schwache, leicht opake Scheibe auf der Oberfläche des Eigelbs sichtbar - siehe Abbildung 1 als Referenz. Für Stufen 10 und älter 22, Blutpools ermöglichen verbesserte visibility des Embryos, aber darauf achten, um zu vermeiden, Punktion der Dottersack, da dies das Auffinden des Embryos schwierig.

3. Trennung von Embryo aus extra-embryonalen Gewebe

  1. Stechen Sie die Kanten des Dotters, um Druck (Abbildung 1B) zu entlasten, und stellen Einzelschnitte über die Länge des Dotterdurchmesser neben der Keimscheibe. Wiederholen Herstellung dieser Diagonalen, bis der Abschnitt des Eigelbs, das die Embryos erfolgreich getrennt werden (Fig. 1B). Anmerkung: Dieser Schritt ermöglicht dem Dottermasse intakt zu bleiben, aber der Unterdruck auf der Oberfläche des Dotters ermöglicht mehr Präzision beim Schneiden um den Embryo und verhindert Schäden an embryonalen Strukturen.
  2. Entfernen der Kanten des Eigelbs mit einer Transferpipette. Hinweis: Entfernen Sie so viel wie möglich Eigelb, aber lassen Sie eine kleine Menge, so dass der Embryo nicht auf die trockene Oberfläche der Papiergewicht und Verschleiß haften.
  3. Waschen Sie die Keimscheibe durch Dispensing 1X PBS bei 45 °-Winkel zum Boden des Embryos. Setzen Sie die Spitze des Transferpipette neben-nicht oben embryonalen Platte. Wenn zusätzliche Eigelb entfernt werden muss, trennen jeden Eigelb mit dem Skalpell auf dem Papiergewicht, bevor die Übertragung des Embryos in eine Petrischale. Hinweis: Dieses Verfahren entfernt die Embryos aus der Oberfläche der Papiergewicht.
  4. Übertragen des Embryos unter Verwendung einer Transferpipette zusammen mit einem minimalen Volumen von 1X PBS auf eine kleine Petrischale aus Kunststoff. Indem mehr 1X PBS in die Petrischale und Tropf 1X PBS in der Nähe, aber nicht direkt an, den Embryo zu waschen, den Embryo. Schwenken Sie die Petrischale mit der Transferpipette waschen und Rest Eigelb, neigen Sie die Petrischale, und entfernen Abfall 1X PBS.
    HINWEIS: Wenn das 1X PBS entfernt wird, der Embryo in der Regel nicht auf den Boden der Petrischale zu halten, weil die Kunststoffoberfläche rutschig mit Rest 1X PBS ist. Es können jedoch mehr 1X PBS aufgenommen werden, wenn der Embryo klebt an der Schale.
    Wenn Befestigungs ter Embryo, befolgen Sie die Schritte 3.5 und 3.6. Wenn Flash Einfrieren des Embryos, fahren Sie sofort mit Schritt 3.8.
  5. Wenn die Festsetzung der Embryo für eine in situ-Hybridisierung, sofort auf die Petrischale hinzuzufügen 4% PFA, den Embryo einzutauchen. Drip 4% PFA direkt auf der Spitze des Embryos, um sie zu glätten; dies verhindert, dass der Embryo aus Eisstockschießen. Fix den Embryo in 4% PFA bei 4 ° C für 12 Stunden.
    1. Nach der Fixierung, dehydrieren Embryonen in abgestuften Methanol (MeOH)-Lösungen und bei -20 ° C in 100% MeOH.
  6. Wenn der Embryo zwischen den Stufen 1-8 22, entfernen Sie die Dotterhaut des Embryos eingehalten werden. Anmerkung: Dieser Schritt kann während oder nach der Fixierung erfolgen. Die Embryonen, die jünger als 22 Stufe 8 sind nicht leicht sichtbar, weil sie auf die Dotterhaut haften, verdeckt Schlüsselstrukturen wie in 2A gesehen.
    1. Fassen Sie den Rand der Membran, die über den Bereich der Kreuzung mit extra feinen Pinzette erstreckt. CAREFUlly Flip den Embryo über mehrmals weg zu waschen Restdotterkörnchen und die Einhaltung der embryonalen Platte auf die Dotterhaut zu lösen. Hinweis: Berühren Sie nicht die Mitte des Embryos, da dies embryonalen Strukturen beschädigen.
    2. Wenn eine Lücke nicht zwischen der Zone des Übergangs und der Dotterhaut erscheinen, sanft kratzen die Zone der Kreuzung mit der extra feine Spitze Pinzette, um sie vom Dotterhaut zu lösen. Fassen Sie die Dotterhaut mit dem extra feinen Spitzen Pinzette und ziehen Sie sie vorsichtig aus dem Embryo. Falls erforderlich, ziehen die Embryos aus dem Dotterhaut durch Greifen des Umfangsrands der Keimscheibe in der Zone der Kreuzung.
    3. Entsorgen Sie die Dotterhaut in ein Biohazard Abfall (Sicherheitsstufe 1) nach der Entfernung.
  7. Bei der Durchführung eines ISH-Test auf junge embryonalen Stadien, folgen Standard ganze Berg ISH Protokolle für Hühnerembryonen 24, 25, aber die folgenden Vorschläge. Um Schäden an den Embryonen während der ISH Verfahren zu reduzieren, mit einer einzigen 5-ml-Glasfläschchen mit Schraubverschluss für jeden Embryo. Nur Fläschchen füllen mit 2 - 3 ml Lösung, um sicherzustellen, dass die Embryonen vollständig untergetaucht. Nutieren Fläschchen vertikal, indem 5 ml-Fläschchen in einem Styropor-Rack (oder einem Rack, das die Fläschchen sicher halten wird), die zu einer Nutator gesichert ist. Anmerkung: Diese Vorsichtsmaßnahme verhindert, dass der Embryo aus Zerreißen, was auftreten kann, wenn es in Kontakt mit dem Deckel der Ampulle während der horizontalen Nutation kommt.
  8. Für Embryonen Stufe 0-6 22, Behandlung mit 5 ug / ml Proteinase K in 1X PTW für 5 min bei Raumtemperatur. Behandeln Embryonen statt 7-12 22 mit 10 &mgr; g / ml Proteinase K in 1X PTW 10 min bei 37 ° C bis die Hintergrundfärbung zu reduzieren.
  9. Um eine ausreichende Farbreaktion zu erzeugen niedrigen Niveaus der Genexpression in den Stufen 1 zu erkennen - 10 22, Inkubation mit 10 &mgr; g / ml Konzentration der Sonde für 12 Stunden. Für ältere Stadien, Inkubation mit 1 & #956; g / ml Sondenkonzentration bei 60 ° C.
  • Auf der Petrischale 3 ml 1X PBS folgenden Dissektion und neigen Sie den Petrischale, um den Embryo aus den Dotterkörnchen trennen - Wenn Flash-Einfrieren des Embryos, schnell hinzufügen 2. Flüssigkeit entfernen und wiederholen Sie 2 - 3 mal, alle Eigelb entfernen. Mit feinen Spitzen Pinzette Transfer-Embryo zu einem vor-markierten Mikrozentrifugenröhrchen und Flash-Freeze in flüssigem Stickstoff vor der Lagerung bei -80 ° C
  • 4. EdU Cell Proliferation Assay. Satzung und dem Nachweis von EdU in Zebra Finch Embryonen.

    1. Candle das Ei mit einem faseroptischen Beleuchtungslampe, um den Embryo oder Eigelb zu finden.
    2. Markieren Sie die Seite des Eis gegenüber der Position des Embryos oder des Eigelbs innerhalb des Eies um sicherzustellen, dass der Embryo während der Mikroinjektion beschädigt.
    3. Linie eine 60 mm-Kunststoffschale mit Modelliermasse und Schimmel in der Form einer Schale, um das Ei in der gewünschten Ausrichtung zu halten. Die markierte Stelle sollteorientiert, um das Einführen des Mikroinjektionsnadel mit dem Mikromanipulator ermöglicht. Hinweis: Der Ton wird das Ei während die Mikroinjektion und während der Inkubation von Schritt 4.11 stabilisieren.
    4. Ziehen Sie zwei Glaskapillare Mikroinjektion Nadeln. Blunt eine Nadel, ein Loch in das Ei an der markierten Stelle stecken. Bereiten Sie den zweiten Mikroinjektionsnadel zum Einspritzen von backloading es mit Mineralöl und Einsetzen in die Mikroinjektor.
    5. Stellen Sie das Volumen der Lösung pro Injektion auf 59,8 nl auf der Mikroinjektor veröffentlicht.
    6. Laden Sie die Mikroinjektionsnadel mit der 10 mM Stamm EdU Lösung.
    7. Erstellen Sie ein Loch in die Schale auf der markierten Stelle mit dem abgestumpften Glaskapillare, kümmert sich um die Schale nicht zerbrechen oder fallen Stücke der Schale in das Ei Höhle. Ausrichten des Ei so dass das Loch in einem 45 ° Winkel, so dass der Mikroinjektionsnadel direkt durch den Hohlraum zu dem Eigelb oder Embryo eingeführt werden.
    8. Mit dem Mikromanipulator, legen Sie diegeladen Nadel etwa 1,0 cm in den Hohlraum.
    9. Spritzen Sie die gewünschte Menge des EdU Lösung direkt auf den sich entwickelnden Embryo oder Eigelb. Hinweis: Es können maximal 478 nl EdU können, ohne dass es in der embryonalen Tod injiziert werden.
    10. Unmittelbar wickeln Sie das Ei und den Ton Halter mit mehreren Schichten von Plastikfolie, um das Ei und die Schale, um ein Austrocknen des Embryos während der Inkubation zu verhindern abzudecken. Band die Ränder der Plastikfolie an den Boden der Schale, um den Kunststoff vor dem Entfernen während der Inkubation zu verhindern. Hinweis: Die Plastikfolie sollte erst unmittelbar vor der Präparation entfernt werden.
    11. Ermöglichen, dass die neu proliferierende Zellen, die EdU durch Inkubieren des Eis bei 37 ° C übernehmen, bis die gewünschte Stufe erreicht ist. Nach der Injektion nicht Ei zum Kippen Regale im Inkubator zurück. Setzen Sie den Kunststoffmantel Ton ausgekleidet Gericht auf stabile Oberfläche im Inkubator.
    12. Entfernen Sie die Plastikverpackung und sezieren den Embryo nach dem oben genannten Protokoll.Befestigen des Embryos in 4% PFA und Inkubation 12 h bei 4 º C wie oben beschrieben. Nach der Fixierung, wäscht mit 100% Ethanol (EtOH) für 5 min und im frischen 100% EtOH bei -20 ° C bis zur weiteren Analyse.

    5. EdU "Click"-Protokoll für

    Die folgenden Schritte sind alle in Glasflaschen durchgeführt.

    1. Rehydrate Embryonen mit aufeinanderfolgenden 5 Minuten wäscht der folgenden:
    2. EtOH, 75% EtOH und 25% sterilem entionisiertem destilliertem (SDD) Wasser, 50% und 50% EtOH sdd Wasser, 25% und 75% EtOH 1X PTW, 100% 1X Ptw
    3. Drei Mal Waschen in 100% 1X PTW 10 min je.
    4. Verdünnen Sie die Reaktionspuffer Additiv (Kit Komponente F) durch die Kombination von 1 Teil des 10X Lager Pufferlösung (10 ul) auf 9 Teile sdd Wasser (90 ul).
    5. Bereiten Sie die Reaktionsmischung in einem separaten Röhrchen durch Vermischen der folgenden: 875 ul 1X PBS, 20 &mgr; l CuSO 4, 5 &mgr; l Azid, 100 ul Reaktionspuffer verdünnt Additiv.Hinweis: Volumen des Reaktionsgemisches kann verkleinert werden. Die Reaktion wird funktionieren, wenn der Embryo ist vollständig in der Reaktionsmischung bedeckt. In der verdünnten Reaktionspuffer Additiv (Schritt 5.3) unmittelbar vor der Verwendung. Alle nachfolgenden Schritte werden in der Dunkelheit durchgeführt. Decken Sie die Embryonen mit Folie aus dem Licht zu schützen.
    6. Decken Sie die Röhrchen mit Aluminiumfolie und inkubieren sie vertikal bei Raumtemperatur für zwei Stunden, indem sie in einem Styropor-Rack zu einem Kolbenpendel angebracht.
    7. 3-mal Waschen der Embryonen in frischem 1X PBS für jeweils 10 Minuten.
    8. Die Embryonen in 4% PFA frisch über Nacht bei 4 ° C inkubieren
    9. 3-mal Waschen in 1X PBS für jeweils 10 Minuten und im frischen 1X PBS bei 4 ° C Decken Sie die Embryonen mit Folie bis zur weiteren Analyse.

    Representative Results

    Die in Fig. 1 schematisch Schritte zeigen das Aussehen des Embryos während im Dottermembran (A) angebracht und zeigen die richtige Methode, um die Embryos aus dem Eigelb (B) zu trennen. Der Embryo kann durch die Zone der Kreuzung, die viel leichter als die Dotterhaut ist identifiziert werden. Der Embryo selbst ist oft schwer zu unterscheiden, bis das Eigelb weggeschnitten. Nachdem der Embryo aus dem Ei seziert kann fest sein oder Blitz für die zukünftige Verwendung eingefroren. Wenn eine in situ-Hybridisierung für die Embryo zerlegt geplant ist, ist es notwendig, die Dottermembran, die über der Zone der Kreuzung des Embryos eingehalten wird, zu entfernen. Fig. 2 zeigt die verbesserte Sichtbarkeit des Embryos, sobald diese Membran wird entfernt (C), und der richtige Weg, um die Dotterhaut (A, B) schälen. Nach Präparation und Fixierung whole mount in situ-Hybridisierung wurde wie in Fig. 3 (A, A ', B, B gesehen geführt') Und Fig. 4 (A, A', B, B ') und 5 (A, B, C), um Unterschiede in orthodenticle Homeobox 2 (Otx2) Expression in Embryonen entwicklungs niedrigen Dosen ausgesetzt Methyl erfassen. 5 zeigt Sense-Sonde Ergebnisse demonstrieren Mangel an Hintergrund. In Abbildung 4, obwohl sie aus dem Ei in der gleichen Zeit Punkt seziert, der Embryo entwicklungsMethylQuecksilber (MeHg) ausgesetzt fortgeschritten bis Stufe 5 22 (B, B '), während die Kontroll Embryo entwickelt zu Stufe 6 22 (A, A "). Die Gruppe von Embryonen herausgeschnitten und in 4 gezeigt sind, wurden aus dem Nest gesammelt und aus dem Inkubator zu der gleichen Zeit aufgenommen. Obwohl einige natürliche Variation in der Entwicklung vorhanden ist, auf der Grundlage früherer Dissektion Daten ist es unwahrscheinlich, dass die Temperaturschwankungen im Inkubator verursachen würde nur die 2,4 ppm Methylquecksilber Embryonen entwi seinpmentally verzögert. Die Unterschiede in den Stadien zeigen Veränderungen in der Zellproliferation in Embryonen entwicklungsMethylQuecksilber ausgesetzt.

    Vor der Präparation wurde EdU in eine Eizelle injiziert Tag 2 und über Nacht inkubiert. Nach Präparation und Fixierung der Stufe 16 22 Embryos wurde EdU mit "Klick"-Chemie, die den Nachweis von proliferierenden Zellen wie in Fig. 6 (A, B, C) ​​gesehen, sichtbar gemacht. Es ist wichtig zu Zeitpunkten beim Platzieren Eier im Inkubator und während Dissektionen, wie Methylquecksilber oder Durchführung der EdU Test kann Entwicklungsfortschritt stören sorgfältig überwachen. Die früheste Injektion wurde am Tag 0, die der Tag der Sammlung, wie in Schritt 1.3 angegeben wurde durchgeführt. Dieser Embryo wurde etwa 38 Stunden später (Stufe 7 22) seziert. Die Überlebensrate wurde zu etwa 90% (mit derselben Geschwindigkeit wie Steuer Embryonen), solange der Einspritzmenge wurde unter 478 nl liegen.

    22 Embryonen, wurde eine RNA-Extraktion gemß dem Protokoll des Herstellers ohne Optimierung erforderlich durchgeführt, wie in 7 zu sehen. Die Entfernung des Dotterhaut unnötig für die RNA-Extraktion und später qRT-PCR-Anwendungen.

    Anmerkung: Alle Embryos Figuren sind so orientiert, dass die vorderen und hinteren Bereiche sind an der Ober-und Unterseite der Bilder sind.

    Figur 1
    Abbildung 1. Verfahren zur Lokalisierung und sezieren Zebrafinken Embryonen Stufen 1-10 22. Suchen Embryo von sanften das Eigelb, bis die schwache weiße Scheibe ist offensichtlich, (A). Sobald derEmbryo wird in der Mitte des Eigelbs befindet, wird das Eigelb in einer schrittweisen Art (B), wobei der erste Schnitt entlastet der Dottermembran (1) und nachfolgende Schnitte (2) begrenzen den Bereich der Verbindungsstelle (zj) das ist, präpariert auf die Dotterhaut geklebt. Skalenbalken stellen 1 mm.

    Figur 2
    Abbildung 2. Entfernung der Dotterhaut und die Sichtbarkeit der embryonalen Strukturen. Nach Entfernung des Embryos aus dem Eigelb, Ort Embryo in eine Petrischale mit 4% PFA. Wenn eine in situ Hybridisierung durchgeführt werden muss, ist die Sichtbarkeit der embryonalen Strukturen erforderlich und kann durch Entfernen der Dottermembran (A) erreicht werden. Fassen Sie die Dotterhaut mit extra feinen Spitzen Pinzette und ziehen Sie es vorsichtig aus dem Embryo durch direkte Umgang mit dem Embryo am äußersten Rand, falls erforderlich(B). Dottermembranentfernung erhöht die Übersichtlichkeit von embryonalen Strukturen und erlaubt Embryonen in-situ-Hybridisierung (C) abgebildet oder mit verarbeitet werden. Maßstabsbalken repräsentieren 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Fig. 3
    Abbildung 3. Whole mount in situ Hybridisierung auf Zebrafinken Embryonen entwicklungs zu Expressionsmuster von orthodenticle Homöobox 2 (Otx2) Methylquecksilber. Ausgesetzt geführt wurden Embryonen auf 0,0 ppm Methylquecksilber (A, A ') und 2,4 ppm Methylquecksilber (B, B ausgesetzt wird ') über elterliche Ernährung. Die dorsal (A) und ventralen (A ') Ausdruck der Otx2 ist sichtbar, während der Mittelhirn-und Augenblasen während der Stufe 12 22. Die Behandlungsgruppe Embryonen wurden in der gleichen Zeit Punkt seziert, sondern wurden als entwicklungspolitisch in der dorsalen gesehen (B) verzögert und ventralen (B ') Sicht der Kopfstrukturen, die charakteristisch für Stufe 11 22 Abkürzungen sind:. mb, Mittelhirn; op, Augenblase. Skalenbalken stellen 1 mm.

    Fig. 4
    Abbildung 4. Ganze Berg   in situ   Hybridisierung auf Zebrafinken Embryonen entwicklungs zu Expressionsmuster von orthodenticle Homöobox 2 (Otx2) Methylquecksilber. ausgesetzt durchgeführt wurden, in der Stufe 6 22 embry gekennzeichnet os auf 0,0 ppm Methylquecksilber (A, A ') und der Stufe 5 22 Embryonen bis 2,4 ppm Methylquecksilber (B, B ausgesetzt') über die elterliche Ernährung ausgesetzt. Abkürzungen: Uhr, Vorderrand des Mesoderm; nein, Chorda Chorda Mesoderm; po, proamnion, vordere Urmund; ps, Primitivstreifen 22. Skalenbalken stellen 1 mm.

    Figur 5
    Abbildung 5. Whole mount in situ   Hybridisierung durchgeführt auf Zebrafink Embryonen mit Sense-Sonde. (A) Stufe 5 22 Embryos. (B) Early stage 6 22 Embryos. (C) Stufe 11 22 Embryos. Skalenbalken stellen 1 mm.

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    Abbildung 6. EdU Gründung und de Schutz in Zebrafinken Embryonen. EdU "Klick"-Chemie wurde verwendet, um wuchernde Zellen in einem Stadium zu erkennen 16 22 Embryos (A, B, C). EdU wird in die DNA an die Stelle von Thymidin 26, 27 aufgenommen und wird mit Klick-Chemie 27 erfasst. Proliferation deutlich in den Seitenkanten der Somiten und der Schwanzknospen sichtbar. Panel A zeigt die Proliferation ausschließlich in dem hinteren Teil des Embryos vorkommen und zeigt einzelne proliferativen Zellen auch. Panel B zeigt die proliferative Orten im ganzen Embryo. Panel C zeigt die Frontzahnbereich, und zeigt die hoch proliferative Telen (te) im Detail. Abkürzungen: af, Frucht fach; FLB, forelimb Knospe; hlb, Hinterlauf Knospe; le, Linsenbläschen; ms, Hirn; mt, Metencephalon; OPC, Augenbecher; pa, Schlundbogen; sm, Somiten Mesoderm; tb, Schwanzknospen; te, Telen. Maßstabsbalken repräsentieren 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Fig. 7
    Abbildung 7. Qualität von RNA aus seziert Zebrafinken Embryonen. Control (0,0 ppm) und 1,2 ppm Methylquecksilber Embryonen gewonnen wurden seziert und schockgefroren, wie in Schritt 3.8 beschrieben. Jede Spur zeigt RNA aus zwei homogenisierten Embryonen aus jeder Behandlungsgruppe extrahiert.

    Discussion

    Neueste Entwicklung eines embryologischen Staging Führung 22 und Genom-Annotation machen die Zebrafinken eine wünschenswerte Modellorganismus für Entwicklungsstudien. Doch die geringe Größe und Zerbrechlichkeit der Zebrafinken Embryonen, die von 3 bis 7 mm in den Stufen 1 reichen - können 10 22, Dissektionen schwierig machen 11, 14. Lokalisieren und sauberen Entfernen Embryonen von der Oberfläche des Eigelbs kann schwierig sein. Dieses Protokoll bietet ausreichend detailliert, das Verfahren mit Leichtigkeit auszuführen. Dieses Protokoll zeigt die kritischen Schritte, die nicht in der Regel bekannt, aber notwendig sind, um eine erfolgreiche Präparation zu gewährleisten. Zum Beispiel ist es wichtig, eine kleine Schicht von Eigelb zwischen dem Embryo und Blatt Papier wiegen auszuschließen kleben lassen.

    Sowohl die Identifizierung und Entfernung des Embryos kann schwierig sein. Zu beheben Identifizierung des Embryos auf der Oberfläche des Dotters, strahlen Licht direkt über dem Dotter nach hat eswurde aus dem Ei entfernt, und schauen Sie sich das Eigelb in einem 45 °-Winkel, um den Embryo zu finden. Sobald der Embryo befindet, schneiden Sie das Eigelb auf einem Papiergewicht kümmert, um den Embryo nicht zu reißen.

    Wenn weitere Anwendungen sind für Abbildungs ​​anatomischen Unterschiede, in situ Hybridisierung oder Zellproliferationsassays, ist es wichtig, die Dotterhaut in Stufe 1 zu entfernen - 8 22 zur besseren Veranschaulichung der Strukturen. Wenn Schwierigkeiten beim Entfernen der Eigelb oder die Dotterhaut in frühen Stadien, fix den Embryo in 4% PFA vor dem Waschen in 1X PBS zu embryonalen Anfälligkeit zu verringern. Durch die ersten Dotterhaut Entfernen bei der Präparation, wie beschrieben, sind die Strukturen deutlich sichtbar und unversehrt in Zebrafinken Embryonen nach der Durchführung einer in-situ-Hybridisierung.

    Eine Einschränkung der EdU ist, dass die Verabreichung von Dosierungsmengen über 478 nl führt zu embryonalen Todesfall. Allerdings erlaubt die große Dosierungsbereich varying Ebenen der proliferativen Zell Tagging.

    Die "Klick"-Reaktion in diesem Kit verwendet wird, ist die Kupfer (I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition-(Cu (I)-AAC). In dieser spezifischen Reaktion wird ein Alkin-haltigen Thymidin-Analogon-Molekül (EDU) von aktiv teilenden Zellen eingebaut. Das Alkin-Gruppe in der EDU ragt aus der helikalen Struktur der DNA und wird durch Belichtung mit einem Azid-Molekül zu einem grünen, fluoreszierenden Molekül, das an dem freien Alkin-Gruppe bindet, konjugiert. Die grüne Fluoreszenz zeigt die neu proliferierende Zellen im Embryo. Die Bio-Orthogonalität der Azid-Alkin-Gruppen und die verhindert, dass nicht-spezifische Färbung, weil diese reaktiven Spezies sind nicht natürlich in Organismen vor. Auch, weil die DNA nicht benötigen, um die Reaktion stattfinden denaturiert werden, können weitere DNA-abhängige Analyse leicht durchgeführt 27.

    Eine inhärente Einschränkung dieser Methode ist die geringe Größe und fragility von Zebrafinken Embryonen. Entfernen der Dotterhaut von Embryonen Stufen 1-15 22 in schädlichen embryonalen Strukturen führen, wenn nicht mit Vorsicht durchgeführt. Dieses Protokoll vereinfacht jedoch die Dissektion Verfahren, so dass die Ermittler zu frühen embryonalen Stadien nutzen, um strukturelle Anomalien und der Genexpression, die nicht vorher eingehend untersucht haben, zu untersuchen. Dieses Protokoll öffnet den Weg für eine Vielzahl von zellulären Assays, welche Molekular die Ermittler, um die Entwicklungs Ursprünge der Erwachsenen Phänotypen bestimmen werden. Zum Beispiel wird es möglich sein zu prüfen, Genexpression unter verschiedenen Umweltbedingungen in Verbindung gebracht oder Gesangslern folgenden pharmakologischen Behandlungen in den frühesten Entwicklungsstadien 28, 29,30,31. Obwohl in dieser Arbeit nicht gezeigt hat, erlaubt dieses Verfahren möglicherweise für andere Verfahren wie radioaktive in situ Hybridisierung auf Gewebeschnitten Zebrafinken und Elektroporation / in ovo Chirurgie 32, 33,34. Da der Zebrafink wurde als ein wichtiger Modellorganismus in einem riesigen Körper der Literatur etabliert, wie Studien ungenutzte Möglichkeiten zur Entwicklungsmechanismen mit erwachsenen Physiologie und Verhalten zu verknüpfen, insbesondere die Entwicklung der Sprache 7, 9.

    Disclosures

    Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

    Acknowledgments

    Die Autoren danken ihren Finanzierungsquellen, Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Science Education-Programm, um das College of William and Mary; Zuschuss Sponsor: NIH (MSS); Förderkennzeichen: R15NS067566. Sie Unterstützung vom College of William and Mary, Fachbereich Biologie und der Hochschule für Künste und der Wissenschaften für die Unterstützung bei der Tierpflege auch anerkennen.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Chicken egg incubator We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model   
    Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit Invitrogen C10337 Detection of cell proliferation. 
    Dissection microscope  We use Olympus SZ61
    7'' Drummond capillary for Nanoject II injector Drummond 3-00-203-G/X
    Drummond Nanoject II microinjector Drummond
    Dumont Tweezers #55 World Precision Instruments 14099
    Ethanol (EtOH)
    50 ml Falcon tube (polypropylene) Fisher Scientific 06-443-18 
    FastPrep Lysis Matrix H tubes MP biomedicals 6917-100 Used for RNA extraction, used to homogenize embryos
    Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) Dolan-Jenner Industries  Fiber-Lite MI-150 
    Glass vials with screw cap (DEPC treated) Fisher Scientific 03-338A
    Microcentrifuge eppe tube (1.5 ml) Fisher Scientific 05-408-129
    Mineral oil Sigma-Aldrich M-8410
    Modeling Clay Any brand
    Narshige PB-7 needle puller Narshige
    Omni Bead Ruptor Homogenizer OMNI International 19-010 Used for RNA extraction
    4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g paraformaldehyde, 350 ml sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x PBS Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. 
    Phosphate buffered saline (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1,800 ml Barnstead H2O, adjust pH to 7.4
    Phosphate buffered saline (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2.013 g KCL, 80.063 g NaCl, 2.722 g KH2PO4 monobasic, 14.196 g Na2HPO4 dibasic, 200 ml Barnstead H2O, adjust pH to 6.5
    Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1x PTw): 1,800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, adjust pH to 7.4, 2 ml Tween-20
    35 ml Plastic Petri dish  Fisher Scientific 08-757-100A
    plastic wrap Any brand
    Prepease RNA Spin Kit PrepEase, Affymetrix 78766 1 KT Used for RNA extraction, used to homogenize embryos
    Reaction Mix: 875 μl 1xPBS, 100 mM 20 μl CuSO4 (Kit Component E), 5 μl Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100 μl diluted reaction buffer additive (Kit Component F) Invitrogen C10337 Detection of cell proliferation. 
    sdd H2O
    Seed cup  We use it as a container when incubating eggs
    Stainless steel scalpel 
    Standard nest box We use Abba Plastic Finch Nestboxes
    4 ml, Teflon Lined Cap, Glass Vials Fisher Scientific 02-912-352
    Transfer pipettes (polyethylene) Fisher Scientific 13-711-7M 
    4 x 4 weigh paper Fisher Scientific 09-898-12B

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    References

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