La disección y análisis de aguas abajo de Zebra Finch embriones en etapas tempranas del desarrollo

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Murray, J. R., Stanciauskas, M. E., Aralere, T. S., Saha, M. S. Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development. J. Vis. Exp. (88), e51596, doi:10.3791/51596 (2014).

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Abstract

El pinzón cebra (Taeniopygia guttata) se ha convertido en un organismo modelo cada vez más importante en muchas áreas de investigación que incluyen toxicología 1, 2, 3 el comportamiento, y la memoria y el aprendizaje 4,5,6. Como el único pájaro cantor con un genoma secuenciado, el pinzón cebra tiene un gran potencial para su uso en estudios de desarrollo; Sin embargo, las primeras etapas de desarrollo del pinzón cebra no han sido bien estudiados. La falta de investigación en el desarrollo pinzón cebra se puede atribuir a la dificultad de la disección de la pequeña huevo y embrión. El siguiente método de disección minimiza el daño del tejido embrionario, que posibilite la investigación de la morfología y la expresión génica en todas las etapas del desarrollo embrionario. Esto permite tanto de campo brillante y de formación de imágenes de fluorescencia calidad de los embriones, su uso en procedimientos moleculares, tales como la hibridación in situ (ISH), ensayos de proliferación celular, y la extracción de RNA para ensayos cuantitativos tales como REA cuantitatival-PCR en tiempo (qtRT-PCR). Esta técnica permite a los investigadores estudiar las primeras etapas de desarrollo que antes eran de difícil acceso.

Introduction

El objetivo general de esta técnica es la obtención de pinzón cebra (guttata) Taeniopygia embriones desde las primeras etapas de la embriogénesis para su uso en una amplia gama de estudios de desarrollo. Pinzón cebra se han convertido en el modelo predominante songbird organismo y se han utilizado ampliamente en una variedad de campos, incluyendo toxicología 1,2, el comportamiento 3, la memoria y el aprendizaje 4,5,6, neuroanatomía comparativa 7,8, y el desarrollo del lenguaje de 9,10 . Como el único pájaro cantor con un genoma secuenciado, el pinzón cebra permite el estudio genético y molecular del orden Passeriformes, que representa más del 50% de las especies de aves conocidas 11, 12,13.

A pesar del uso de adultos y pinzón cebra juvenil en una amplia gama de campos, se han realizado pocos estudios sobre los embriones pinzón cebra, especialmente durante las primeras etapas de desarrollo. Esto se puede atribuir al pequeño tamaño de sus huevos, unand embriones, así como su estado más reciente como 14,15,16 organismo modelo para estudios en los que el pollo (Gallus gallus domesticus) se utilizó anteriormente como un 17.18.19.20.21 sistema modelo predominante. Sin embargo, como estudiantes no vocales, los pollos no son un sistema modelo adecuado para el estudio de las bases genéticas de aprendizaje vocal, el desarrollo del aprendizaje vocal, heredabilidad, el comportamiento y los circuitos de los ganglios basales-cortical involucrada en el aprendizaje motor 10.

Es importante tener en cuenta que los embriones pinzón cebra son mucho más delicado y más fácil de dañar a los embriones de pollo durante la disección y procedimientos moleculares. En particular, se requiere un mayor cuidado al realizar los pasos de permeabilización en embriones pinzón cebra. Detergentes fuertes y enzimas que no perjudicaría a un embrión de pollo pueden dañar embriones pinzón cebra. En términos de cuidados generales, es necesario poner huevos pinzón cebra en pequeñas tazas antes de la colocación en una incubadorapara evitar que se rompan al rodar durante la incubación.

Pinzón cebra son susceptibles de estudios de comportamiento, fácil y prolíficamente se reproducen durante todo el año en cautiverio, y son aprendices vocales. Estas características permiten el uso de pinzón cebra para abordar la necesidad de un organismo modelo que integre el desarrollo, la genética y los aspectos de comportamiento del lenguaje. Los métodos disecciones se detallan a continuación, junto con una guía de puesta en escena recientemente desarrollado específica para pinzón cebra 22, hacen que el pinzón cebra un modelo de desarrollo estandarizado cada vez más útil organismo. Sin embargo, la obtención de embriones en las primeras etapas puede ser desalentador. Este protocolo permite a los investigadores obtener fácilmente embriones en etapa temprana. Los estudios que investigan el desarrollo temprano y la base del desarrollo molecular de comportamientos complejos en el pinzón cebra, o los efectos toxicológicos sobre el desarrollo en otros pequeños, aves paseriformes encontrarán esta metodología disección útil.

Protocol

Declaración de Ética: Los métodos se llevaron a cabo con los pinzones cebra domesticados de la colonia de cría en el College of William and Mary. Todos los procedimientos que se siguen las pautas RSPCA 23 y fueron aprobados por el Colegio de William y Mary OLAW (Office of Laboratory Animal Welfare) Animal Welfare Assurance (# A3713-01) y tenía Comité Institucional Cuidado de Animales y Uso (IACUC) aprobación (# 2013-06 -02-8721-dacris).

1. Recolección de huevos e incubación

  1. Establecer pares de pinzones cebra en una luz 14:10: oscuridad ciclo. Suministro de alimentos, agua, heno, y una ad libitum caja nido. Nota: La atención de rutina y de cultivo para los pinzones cebra ha sido bien descrita 23.
  2. Prepare una incubadora de pollo estándar con estantes inclinables. Nota: Mantener la incubadora artificial a 37,5 (+ / - 1) ° C con el 80 - 95% de humedad mediante la adición de agua a la parte inferior de la incubadora sobre una base diaria. Deje que la incubadora se equilibre durante dos díasantes de usar.
    1. Seleccione tazas pequeñas de alimentación (5 x 7,6 cm) de al menos 2,5 cm de profundidad para mantener los huevos en la incubadora. Línea de la parte inferior y los bordes inferiores de la taza con dos capas de toallas de papel de modo que la copa se rellena, mientras que todavía permite que los huevos rueden fácilmente. Coloque estos vasos en los estantes de inclinación de la incubadora. Nota: El exceso de relleno puede inhibir la rodadura, lo que evitará la incubación exitosa debido a la adhesión de embriones al interior shell.
  3. Recoge los huevos a las dos horas después del inicio del ciclo de luz. Nota: Esto minimiza las discrepancias en fase de desarrollo para un tiempo de incubación dado debido a la incubación de los padres.
    1. Recoge los huevos suavemente con el pulgar y el dedo índice en la punta y la base a lo largo de la longitud del huevo. Utilice un aburrido, suave 4B grafito lápiz para marcar la fecha prevista y el tiempo de recogida de la jerarquía. Nota: El lápiz 4B más suave reduce el riesgo de que el lápiz romper la cáscara del huevo frágil.
    2. 1.3.2) Colocar 1-5 huevos etiquetados en cada cen la incubadora de modo que los huevos pueden rodar libremente para evitar la adhesión embrionaria al interior de la concha. Nota: La colocación de más de 5 huevos en una taza puede impida la rodadura de los huevos individuales y reducir la viabilidad de los embriones.

2. La eliminación del embrión a partir de huevo

  1. Para prepararse para la disección, juntad a los siguientes materiales: un bisturí limpio, fórceps de punta fina, y dos de punta fina fórceps extra. Coloque 10 x 10 cm pesan documento sobre la base del microscopio de disección para proporcionar una superficie limpia, no absorbente para la disección. Nota: El papel sopesar es crucial porque permite la fácil manipulación de la yema de huevo y es la mejor superficie para cortar las delicadas membranas con un bisturí.
  2. Preparar una parte alícuota de solución salina tampón de fosfato (1X PBS) en un tubo de polipropileno de 50 ml, y adquirir al menos tres pipetas de transferencia y un pequeño cubo de residuos. Si la fijación de los embriones, prepare una alícuota del 4% de paraformaldehído (PFA) Precaución:. Vapores PFA son tóxicos, und todos los pasos que involucran PFA se debe hacer dentro de una campana de extracción para minimizar la exposición. Si el flash se congelan los embriones, obtener nitrógeno líquido y mantenerlo cerca del microscopio de disección. La esterilidad no es un problema para este protocolo de disección, pero asegúrese de que todos los materiales están limpios.
  3. Retire el huevo de la incubadora en el punto de tiempo necesario para la etapa deseada como se describe en la guía de puesta en escena pinzón cebra 22. Nota: Retire los huevos después de 36 horas de incubación para diseccionar etapa 6 embriones (Figura 4A) 22 y retirar los huevos después de 56 horas de incubación para diseccionar etapa 12 embriones (Figura 3) 22.
  4. El uso de una lámpara de iluminación de fibra óptica, vela del huevo sosteniéndolo sobre su eje y el brillo de luz vertical a través del huevo para iluminar el interior. Coloque la punta de la luz detrás del huevo y localizar la yema y el embrión en desarrollo.
    1. Coloque el bisturí en el lado opuesto de la yema y el huevo cortado a lo largo de punta abase con presión leve.
  5. Extraiga el contenido del huevo aplicando cuidadosamente la presión en la punta y la base del huevo con el pulgar y el dedo índice, o haciendo palanca suavemente aparte la cáscara del huevo a lo largo del corte con una pinza. Abra el huevo directamente sobre el papel sopesar de manera que la yema avanza suavemente hacia fuera.
  6. Examinar la yema de la zona blanca de unión, que es visible como un anillo blanco débil que rodea el desarrollo embrionario y orientar la yema utilizando extra fino con punta de unas pinzas de modo que el embrión se encuentra en el centro.
    Nota: Si no se observa un círculo blanco débil en la superficie de la yema de huevo, tomar las pinzas finas y suavemente tirar la yema otra vez hasta que el embrión se encuentra en la parte superior de la yema. Nota: Para las etapas 1 - 9 22, el disco embrionario es de menos de 6 mm de diámetro y es visible como un disco débil, ligeramente opaca en la superficie de la yema - véase la figura 1 para referencia. Para las etapas 10 y mayores de 22, la sangre se acumula permiten mejorar visibilidad del embrión, pero tenga cuidado de no perforar el saco vitelino, ya que esto hace que la localización del embrión difícil.

3. Separación de embriones a partir de tejido extra-embrionarias

  1. Perforar los bordes de la yema para aliviar la presión (Figura 1B), y hacer cortes individuales a través de la longitud de la yema de diámetro junto con el disco embrionario. Repita hacer estas líneas diagonales hasta que la sección de la yema de huevo que contiene el embrión ha sido separado con éxito (Figura 1B). Nota: Este paso permite que la masa de yema permanezca intacto, pero la presión reducida en la superficie de la yema permite una mayor precisión en el corte alrededor del embrión, la prevención de daños a estructuras embrionarias.
  2. Quitar los bordes de la yema con una pipeta de transferencia. Nota: Retire la mayor cantidad de yema de lo posible, pero deja una pequeña cantidad para que el embrión no se adhiere a la superficie seca del papel sopesar y desgaste.
  3. Lave el disco embrionario por dispensacióning 1X PBS a un ángulo de 45 ° hacia la parte inferior del embrión. Coloque la punta de la pipeta de transferencia siguiente-a no más arriba-el disco embrionario. Si las necesidades de yema adicionales a ser removidos, separar cualquier yema con el bisturí en el papel pesan antes de transferir el embrión a la placa de Petri. Nota: Este método elimina el embrión a partir de la superficie del papel de pesar.
  4. Transferir el embrión utilizando una pipeta de transferencia junto con un volumen mínimo de 1X PBS a una pequeña, de plástico placa de Petri. Lavar el embrión mediante la adición de más de 1X PBS en la placa de Petri y el goteo de 1X PBS cerca de, pero no directamente sobre, el embrión. Agitar la placa de Petri para lavar y quitar la yema residual, incline la placa de Petri, y eliminar los desechos 1X PBS con la pipeta de transferencia.
    NOTA: Cuando se retira el PBS 1X, el embrión típicamente no se adhiere a la parte inferior de la placa de Petri porque la superficie de plástico es resbaladiza con 1X PBS residual. Sin embargo, más 1X PBS se puede añadir si el embrión se pega al plato.
    Si fijación tél embrión, siga los pasos 3.5 y 3.6. Si el flash congelar el embrión, vaya al paso 3.8 inmediatamente.
  5. Si la fijación del embrión para la hibridación in situ, añadir inmediatamente PFA al 4% a la placa de Petri para sumergir el embrión. Goteo 4% de PFA directamente sobre la parte superior del embrión con el fin de aplanarlo; esto evita que el embrión se curve. Fijar el embrión en el 4% PFA a 4 º C durante 12 h.
    1. Después de la fijación, deshidratación embriones en metanol clasificado soluciones (MeOH) y almacenarlos a -20 ° C en el 100% de MeOH.
  6. Si el embrión es entre las etapas 1 - 8 22, quitar la membrana vitelina adherido al embrión. Nota: Este paso puede realizarse durante o después de la fijación. Los embriones de menos de la etapa 8 22 no son fáciles de visualizar porque se adhieren a la membrana vitelina, oscureciendo las estructuras clave, como se ve en la Figura 2A.
    1. Agarre el borde de la membrana que se extiende más allá de la zona de cruce con unas pinzas finas adicionales. Carefully voltear el embrión durante varias veces para lavar gránulos de yema de residuales y para aflojar la adherencia del disco embrionario a la membrana vitelina. Nota: No toque el centro del embrión, ya que podría dañar las estructuras embrionarias.
    2. Si hay un espacio no aparece entre la zona de la unión y la membrana vitelina, arañar suavemente la zona de unión con el extra fino con punta de pinzas para aflojarlo de la membrana vitelina. Agarre la membrana vitelina con el extra fino con punta de unas pinzas y suavemente tire de él lejos del embrión. Si es necesario, tire suavemente el embrión lejos de la membrana vitelina agarrando el borde periférico del disco embrionario en la zona de unión.
    3. Deseche la membrana vitelina en riesgo biológico 1 residuos (nivel de bioseguridad 1) después de la eliminación.
  7. Al llevar a cabo un ensayo de ISH en etapas embrionarias jóvenes, seguir los protocolos integrales estándar mount ISH de embriones de pollo de 24, 25, pero tenga en cuenta las siguientes sugerencias. Para reducir el daño a los embriones durante el procedimiento de ISH, utilizar un único vial de vidrio de 5 ml con un tapón de rosca para cada embrión. Llenar los frascos con 2-3 ml de solución, lo que garantiza que los embriones están completamente sumergidos. Viales inclinar la cabeza verticalmente mediante la colocación de viales de 5 ml en un bastidor de espuma de poliestireno (o cualquier rack que mantendrá los viales seguro) que está fijado a un nutator. Nota: Esta precaución evita que el embrión a partir de medio de corte, que puede ocurrir cuando entra en contacto con la tapa del vial durante nutación horizontal.
  8. Para los embriones etapa 0 - 6 22, el tratamiento con 5 mg / ml de proteinasa K en 1X PTW durante 5 minutos a temperatura ambiente. Treat embriones realizaron 7 - 12 22 10 con proteinasa g / ml en 1X PTW K durante 10 min a 37 ° C para reducir la tinción de fondo.
  9. Para producir una reacción de color suficiente para detectar bajos niveles de expresión génica en las etapas 1 - 10 22, incubar con una concentración de sonda de 10 g / ml durante 12 horas. Para las etapas de mayor edad, se incuban con 1 & #956, g / ml concentración de la sonda a 60 ° C.
  • Si el flash-congelación del embrión, agregar rápidamente 2 - 3 ml de PBS 1X a la cápsula de Petri después de la disección y la inclinación de la placa de Petri para separar el embrión a partir de los gránulos de yema. Retire el líquido y repetir 2-3 veces para eliminar toda la yema. Usando fino con punta de pinzas, la transferencia de embriones a un tubo de microcentrífuga de pre-marcado y congelación ultrarrápida en nitrógeno líquido antes de almacenar a -80 ° C.
  • 4. EdU Ensayo de proliferación celular. Incorporación y Detección de EdU en Zebra Finch embriones.

    1. Candle el huevo utilizando una lámpara de iluminación de fibra óptica para localizar el embrión o yema.
    2. Marcar el lado del huevo opuesta a la ubicación del embrión o yema dentro del huevo para asegurar que el embrión no se dañe durante el proceso de microinyección.
    3. Línea de un plato de plástico de 60 mm con plastilina y moldearlo en la forma de un recipiente para contener el huevo en la orientación deseada. El punto marcado debe serorientada para permitir la inserción de la aguja de microinyección usando el micromanipulador. Nota: La arcilla se estabilizará el óvulo durante la microinyección y durante la incubación en el paso 4.11.
    4. Tire de dos agujas de microinyección capilares de vidrio. Blunt una aguja para hacer un agujero en el huevo en el punto marcado. Preparar la segunda aguja de microinyección para inyección por backloading con aceite mineral y de insertarlo en la microinyector.
    5. Ajuste el volumen de la solución liberada por inyección a 59,8 nl en la microinyector.
    6. Cargue la aguja de microinyección con la solución madre EdU 10 mM.
    7. Crear un agujero en la cáscara en el punto marcado con el capilar de vidrio roma, teniendo cuidado de no romper la cáscara ni deje caer pedazos de la cáscara de huevo en la cavidad. Oriente el huevo de modo que el orificio está en un ángulo de 45 °, permitiendo que la aguja de microinyección que se inserta directamente a través de la cavidad para la yema de huevo o embrión.
    8. Usando el micromanipulador, inserte elcargado aguja de aproximadamente 1,0 cm en la cavidad.
    9. Se inyecta la cantidad deseada de la solución EdU directamente sobre el embrión en desarrollo o yema de huevo. Nota: Un máximo de 478 nl de EdU puede inyectarse sin resultado de muerte embrionaria.
    10. Inmediatamente envolver el huevo y el titular de la arcilla con múltiples capas de envoltura de plástico para cubrir el huevo y el plato para evitar la desecación del embrión durante la incubación. Tape los bordes de la envoltura de plástico en el fondo del plato para evitar que el plástico se desenvuelva durante la incubación. Nota: El papel de plástico sólo se debe quitar inmediatamente antes de la disección.
    11. Permitir que las células proliferantes recién para incorporar la UDE incubando el huevo a 37 ° C hasta que se alcanza la etapa deseada. Después de la inyección, no regrese huevo para inclinar estantes en incubadora. Coloque el plato de barro revestida de plástico envuelto en una superficie estable dentro de la incubadora.
    12. Quite la envoltura de plástico y diseccionar el embrión siguiendo el protocolo mencionado.Fijar el embrión en PFA al 4% y se incuba 12 horas a 4 ° C como se describe anteriormente. Después de la fijación, se lava con etanol al 100% (EtOH) durante 5 minutos y guardar en fresco 100% de EtOH a -20 ° C hasta su posterior análisis.

    5. EdU "clic" Protocolo de Reacción

    Los pasos siguientes son todas realizadas en viales de vidrio.

    1. Rehidratar embriones con sucesivos lavados de 5 min de los siguientes:
    2. EtOH, EtOH al 75% y el 25% desionizada destilada estéril (SDD) de agua, 50% de EtOH y 50% de agua sdd, EtOH al 25% y el 75% 1X PTW, 100% 1X Ptw
    3. Lavar tres veces en 100% 1X PTW durante 10 min cada uno.
    4. Diluir el aditivo tampón de reacción (Kit de componentes F) mediante la combinación de 1 parte de la solución tampón madre 10X (10 l) y 9 partes de SDD agua (90 l).
    5. Preparar la mezcla de reacción en un tubo separado mezclando los siguientes: 875 l de PBS 1X, 20 l de CuSO 4, 5 l de azida, 100 l diluida aditivo tampón de reacción.Nota: El volumen de la mezcla de reacción puede ser reducido. La reacción funcionará si el embrión está completamente cubierto en la mezcla de reacción. Añadir el aditivo tampón de reacción diluida (paso 5.3) inmediatamente antes de su uso. Todas las etapas subsiguientes se llevan a cabo en la oscuridad. Cubra los embriones con papel de aluminio para protegerlo de la luz.
    6. Cubrir los viales con papel de aluminio, y se incuba verticalmente a temperatura ambiente durante dos horas, colocándolos en un bastidor de espuma de poliestireno unido a un nutator.
    7. Lave los embriones 3 veces en 1X PBS fresco durante 10 min cada uno.
    8. Incubar los embriones en fresco 4% PFA durante la noche a 4 ° C.
    9. Lavar 3 veces en 1X PBS durante 10 minutos cada uno y guardar en 1X PBS fresco a 4 ° C. Cubra los embriones con papel de aluminio hasta su posterior análisis.

    Representative Results

    Los pasos esquematiza en la Figura 1 indican la aparición del embrión mientras que está unido a la membrana vitelina (A) y demostrar el método adecuado para separar el embrión a partir de la yema de huevo (B). El embrión puede ser identificado por la zona de unión, que es mucho más ligero que la membrana vitelina. El embrión en sí es a menudo difícil de distinguir hasta que la yema se corta distancia. Una vez que el embrión se diseca del huevo, que puede ser fijo o de destello congelado para uso futuro. Si una hibridación in situ se ha previsto para el embrión diseccionado, es necesario para eliminar la membrana vitelina que se adhiere al embrión a través de la zona de unión. Figura 2 ilustra la mejora de la visibilidad del embrión una vez que se retira esta membrana (C), y la forma correcta de pelar la membrana vitelina (A, B). Después de la disección y fijación, montar toda la hibridación in situ se realizó como se ve en la Figura 3 (A, A ', B, B') Y la Figura 4 (A, A', B, B ') y la Figura 5 (A, B, C) ​​para detectar diferencias en orthodenticle homeobox 2 (Otx2 expresión) en embriones de desarrollo expuestas a dosis bajas de metilmercurio. Figura 5 muestra resultados de la sonda sentido, lo que demuestra la falta de fondo. En la Figura 4, a pesar de ser diseccionado desde el huevo al mismo punto en el tiempo, el embrión del desarrollo expuesto al metilmercurio (MeHg) alcanzó el estadio 5 22 (B, B '), mientras que el embrión de control desarrollado para escenificar 6 22 (A, A '). El grupo de embriones disecados y se muestra en la Figura 4 se obtuvieron de la jerarquía y tomada de la incubadora a las mismas horas. Aunque algunos variación natural está presente en el desarrollo, sobre la base de datos de disección anteriores, es poco probable que las fluctuaciones de temperatura en la incubadora causarían sólo los 2,4 ppm de metilmercurio embriones sean desarropmentally retrasado. Las diferencias en las etapas indican cambios en la proliferación celular en embriones de desarrollo expuestos a metilmercurio.

    Antes de la disección, EdU se inyecta en un huevo día 2 y se dejó incubar durante la noche. Después de la disección y la fijación de la etapa 16 22 embrión, EdU se visualizó usando "clic" química, permitiendo la detección de células que proliferan como se ve en la Figura 6 (A, B, C). Es importante controlar cuidadosamente los puntos de tiempo al colocar los huevos en la incubadora y durante disecciones, como la exposición a metilmercurio o realizar el ensayo EdU puede interrumpir la progresión del desarrollo. La inyección se realizó temprano en el día 0, que era el día de la recolección como se especifica en el paso 1.3. Este embrión se disecó aproximadamente 38 horas después (etapa 7 22). Se encontró que la tasa de supervivencia es de aproximadamente 90% (misma velocidad que los embriones de control), siempre y cuando la cantidad de inyección estaba bajo 478 nl.

    22 embriones, una extracción de ARN se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante sin optimización requerida, como se ve en la Figura 7. La eliminación de la membrana vitelina era innecesario para la extracción de ARN y posteriores aplicaciones de QRT-PCR.

    Nota: Todas las cifras de embriones están orientados de manera que las regiones anterior y posterior se encuentran en la parte superior e inferior de las imágenes, respectivamente.

    Figura 1
    Figura 1. Procedimiento para la localización y la disección de embriones pinzón cebra, etapas 1-10 22. Localizar embrión rodando suavemente la yema hasta que el disco blanco débil es evidente (A). Una vez que elembrión se encuentra en el centro de la yema de huevo, la yema de huevo se diseca en una forma escalonada (B) en el que el primer corte alivia la presión de la membrana vitelina (1) y los cortes posteriores (2) bordear la zona de unión (zj) que es adherido a la membrana vitelina. Las barras de escala representan 1 mm.

    Figura 2
    Figura 2. La eliminación de la membrana vitelina y la visibilidad de las estructuras embrionarias. Después de la eliminación del embrión a partir de la yema de huevo, embrión lugar en una placa de Petri que contiene 4% de PFA. Si una hibridación in situ necesita ser realizada, la visibilidad de las estructuras embrionarias es esencial y se puede lograr mediante la eliminación de la membrana vitelina (A). Agarre la membrana vitelina con extra fino con punta de unas pinzas y retírela con cuidado lejos del embrión mediante la manipulación del embrión directamente en el borde más externo, si es necesario(B). Extracción de la membrana vitelina aumenta la claridad de las estructuras embrionarias, y permite que los embriones para obtener imágenes o procesados ​​con la hibridación in situ (C). Las barras de escala representan 1 mm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 3
    Figura 3. Todo el montaje hibridación in situ realizado en embriones pinzón cebra desarrollo expuestos al metilmercurio. Los patrones de expresión de orthodenticle homeobox 2 (Otx2) se caracterizaron en los embriones expuestos a 0.0 ppm de metilmercurio (A, A ') y 2,4 ppm de metilmercurio (B, B ') a través de la dieta de los padres. El hacerRsaI (A) y ventral (A ') expresión de Otx2 es visible a través de las vesículas del cerebro medio y óptica durante la etapa 12 22. Los embriones del grupo de tratamiento fueron disecados en el mismo punto de tiempo, pero se retraso en el desarrollo como se ve en la parte dorsal (B) y vista ventral (B ') de las estructuras de la cabeza, que son característicos de la etapa 11 22 Abreviaturas:. mb, cerebro medio; op, vesícula óptica. Las barras de escala representan 1 mm.

    Figura 4
    Figura 4. Todo el montaje   in situ   hibridación a cabo en embriones pinzón cebra desarrollo expuestos al metilmercurio. Los patrones de expresión de orthodenticle homeobox 2 (Otx2) fueron caracterizados en la etapa 6 22 embry os expuestos a 0.0 ppm de metilmercurio (A, A ') y la etapa 5 22 embriones expuestos a 2.4 ppm de metilmercurio (B, B') a través de la dieta de los padres. Abreviaturas: am, margen anterior del mesodermo; No, notocorda, mesodermo notocorda; po, proamnion, blastoporo anterior; ps, línea primitiva 22. Las barras de escala representan 1 mm.

    La figura 5
    Figura 5. Todo el montaje in situ   hibridación a cabo en embriones pinzón cebra con la sonda sentido. (A) Etapa 5 22 embriones. (B) Etapa temprana 6 22 embriones. (C) Etapa 11 22 embriones. Las barras de escala representan 1 mm.

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    Figura 6. Incorporación Edu y de protección en los embriones pinzón cebra. EdU "clic" química se utilizó para detectar células que proliferan en una etapa embrionaria 16 22 (A, B, C). EdU se incorpora en el ADN en el lugar de timidina 26, 27 y se detecta usando química, haga clic 27. Proliferación es claramente visible en los bordes laterales de los somitas, y la tailbud. El panel A muestra la proliferación ocurre exclusivamente en la parte posterior del embrión y también muestra las células proliferativas individuales. El panel B muestra los lugares de proliferación en todo el embrión. El panel C muestra la región anterior, y muestra el telencéfalo altamente proliferativa (TE) con mayor detalle. Abreviaturas: af, pliegue amniótico; FLB, esbozo de ala; hlb, miembro posterior brote; le, vesícula del cristalino; ms, mesencéfalo; mt, Metencephalon; opc, copa óptica; pa, arco faríngeo; sm, mesodermo somito; tb, tailbud; te, telencéfalo. Las barras de escala representan 1 mm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    La figura 7
    Figura 7. Calidad del ARN extraído de embriones disecados pinzón cebra. Control (0,0 ppm) y 1,2 ppm de metilmercurio embriones fueron disecados y flash congelado como se describe en el paso 3.8. Cada carril muestra el ARN extraído a partir de dos embriones homogeneizados de cada grupo de tratamiento.

    Discussion

    El reciente desarrollo de una guía de puesta en escena embriológico 22 y anotación del genoma del pinzón cebra hacen un organismo modelo deseable para los estudios del desarrollo. Sin embargo, el pequeño tamaño y la fragilidad de los embriones pinzón cebra, que van de 3 a 7 mm en los pasos 1 - 10 22, pueden hacer disecciones difícil 11, 14. Localizar y eliminar limpiamente embriones a partir de la superficie de la yema puede ser un reto. Este protocolo proporciona detalles suficientes para realizar el procedimiento con facilidad. Este protocolo demuestra los pasos críticos que no son normalmente conocidos, pero que son necesarias para asegurar una disección éxito. Por ejemplo, es esencial dejar una pequeña capa de yema de entre el embrión y la hoja de peso de papel para evitar que se pegue.

    Tanto la identificación y eliminación del embrión puede ser difícil. Para solucionar problemas de identificación del embrión en la superficie de la yema, brillará la luz directamente sobre la yema después de tenerha retirado del huevo, y mirar a la yema en un ángulo de 45 ° para encontrar el embrión. Una vez que el embrión se encuentra, corte la yema de huevo en sopesar el papel con cuidado de no rasgar el embrión.

    Si otras aplicaciones incluyen imágenes de las diferencias anatómicas, hibridación in situ, o ensayos de proliferación celular, es importante para eliminar la membrana vitelina en la etapa 1 - 8 22 para una mejor visualización de las estructuras. Si experimenta dificultades al retirar la yema o la membrana vitelina en las primeras etapas, fijar el embrión en el 4% PFA antes de lavarlo en 1X PBS para reducir la fragilidad embrionario. Al eliminar primero la membrana vitelina durante la disección como se ha descrito, las estructuras son claramente visibles e intacto en embriones pinzón cebra después de realizar una hibridación in situ.

    Una limitación de edu es que la administración de volúmenes de dosis más de 478 conductores de la Liga Nacional en mortalidad embrionaria. Sin embargo, el intervalo de dosificación amplio permite varyinniveles g de etiquetado de células proliferativas.

    La reacción de "clic" que se utiliza en este kit es la de cobre (I) catalizado-alquino-azida-cicloadición (Cu (I) AAC). En esta reacción específica, una molécula que contiene análogos de la timidina-alquino (UDE) se incorpora activamente dividir celdas. El grupo alquino en la UDE sobresale de la estructura helicoidal del ADN, y se detecta por la exposición a una molécula de azida conjugado con una molécula de verde, fluorescente que se une al grupo alquino libre. La fluorescencia verde muestra las células recién proliferantes en el embrión. El bio-ortogonalidad de la azida y los grupos alquino evita la tinción no específica debido a que estas especies reactivas no están naturalmente presentes en los organismos. También, debido a que el ADN no tiene que ser desnaturalizado para que se produzca la reacción, un análisis más detallado dependiente de ADN se puede realizar fácilmente 27.

    Una limitación inherente de este método es el tamaño pequeño y fragmentosilidad de embriones pinzón cebra. Extracción de la membrana vitelina de embriones etapas 1 - 15 22 puede dar lugar a estructuras embrionarias perjudiciales si no se realiza con precaución. Sin embargo, este protocolo simplifica el método de disección, permitiendo a los investigadores utilizan etapas embrionarias tempranas para examinar anomalías estructurales y la expresión de genes que no se han estudiado previamente en profundidad. Este protocolo se abre el camino para una gran cantidad de ensayos celulares moleculares que permitirán a los investigadores a determinar los orígenes del desarrollo de fenotipos adultos. Por ejemplo, será posible examinar la expresión del gen implicado en el aprendizaje vocal en diversas condiciones ambientales o después de los tratamientos farmacológicos en las primeras etapas de desarrollo 28, 29,30,31. Aunque no se ha demostrado en este trabajo, este método permite potencialmente a otros procedimientos como radiactivo hibridación in situ sobre zebra finch secciones de tejido y electroporación / in ovo la cirugía 32, 33,34. Dado que el diamante mandarín se ha establecido como un organismo modelo importante en un vasto cuerpo de literatura, tales estudios ofrecen oportunidades sin explotar para vincular los mecanismos de desarrollo de la fisiología y el comportamiento de los adultos, en particular, el desarrollo del lenguaje 7, 9.

    Disclosures

    Los autores no tienen nada que revelar.

    Acknowledgments

    Los autores agradecen a sus fuentes de financiación, el Programa de Educación del Instituto Médico Howard Hughes Pregrado Ciencias de la Universidad de William y Mary; Patrocinador de la donación: NIH (SMS); Grant número: R15NS067566. También reconocen el apoyo del Colegio de William y Mary, Departamento de Biología y la Facultad de Artes y Ciencias de la ayuda con el cuidado de animales.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Chicken egg incubator We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model   
    Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit Invitrogen C10337 Detection of cell proliferation. 
    Dissection microscope  We use Olympus SZ61
    7'' Drummond capillary for Nanoject II injector Drummond 3-00-203-G/X
    Drummond Nanoject II microinjector Drummond
    Dumont Tweezers #55 World Precision Instruments 14099
    Ethanol (EtOH)
    50 ml Falcon tube (polypropylene) Fisher Scientific 06-443-18 
    FastPrep Lysis Matrix H tubes MP biomedicals 6917-100 Used for RNA extraction, used to homogenize embryos
    Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) Dolan-Jenner Industries  Fiber-Lite MI-150 
    Glass vials with screw cap (DEPC treated) Fisher Scientific 03-338A
    Microcentrifuge eppe tube (1.5 ml) Fisher Scientific 05-408-129
    Mineral oil Sigma-Aldrich M-8410
    Modeling Clay Any brand
    Narshige PB-7 needle puller Narshige
    Omni Bead Ruptor Homogenizer OMNI International 19-010 Used for RNA extraction
    4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g paraformaldehyde, 350 ml sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x PBS Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. 
    Phosphate buffered saline (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1,800 ml Barnstead H2O, adjust pH to 7.4
    Phosphate buffered saline (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2.013 g KCL, 80.063 g NaCl, 2.722 g KH2PO4 monobasic, 14.196 g Na2HPO4 dibasic, 200 ml Barnstead H2O, adjust pH to 6.5
    Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1x PTw): 1,800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, adjust pH to 7.4, 2 ml Tween-20
    35 ml Plastic Petri dish  Fisher Scientific 08-757-100A
    plastic wrap Any brand
    Prepease RNA Spin Kit PrepEase, Affymetrix 78766 1 KT Used for RNA extraction, used to homogenize embryos
    Reaction Mix: 875 μl 1xPBS, 100 mM 20 μl CuSO4 (Kit Component E), 5 μl Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100 μl diluted reaction buffer additive (Kit Component F) Invitrogen C10337 Detection of cell proliferation. 
    sdd H2O
    Seed cup  We use it as a container when incubating eggs
    Stainless steel scalpel 
    Standard nest box We use Abba Plastic Finch Nestboxes
    4 ml, Teflon Lined Cap, Glass Vials Fisher Scientific 02-912-352
    Transfer pipettes (polyethylene) Fisher Scientific 13-711-7M 
    4 x 4 weigh paper Fisher Scientific 09-898-12B

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    References

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