Induzida pela quimioterapia Vascular Toxicidade - em tempo real

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Bar-Joseph, H., Stemmer, S. M., Tsarfaty, I., Shalgi, R., Ben-Aharon, I. Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment. J. Vis. Exp. (95), e51650, doi:10.3791/51650 (2015).

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Abstract

Certas classes de quimioterapias podem exercer alterações vasculares agudas que podem evoluir em condições de longo prazo que podem predispor o paciente a um risco aumentado de morbidade vascular. No entanto, embora a evidência clínica de montagem, há uma escassez de estudos claros de toxicidade vascular e, portanto, a etiologia de um grupo heterogêneo de distúrbios cardiovasculares vasculares / continua a ser elucidado. Além disso, o mecanismo que pode ser a base toxicidade vascular pode completamente diferentes dos princípios da cardiotoxicidade induzida por quimioterapia, a qual está relacionada a lesão directa dos miócitos. Nós estabelecemos um tempo real, in vivo plataforma de imagem molecular para avaliar a toxicidade vascular aguda potencial de terapias anti-cancerígenas.

Criámos uma plataforma de in vivo, imagiologia molecular de alta resolução em camundongos, adequado para a visualização de vasos dentro de órgãos confinados e blo de referênciavasos od dentro dos mesmos indivíduos, enquanto que cada indivíduo servir como seu próprio controle. Paredes dos vasos sanguíneos foram prejudicadas após a administração de doxorrubicina, o que representa um único mecanismo de toxicidade vascular que pode ser o evento no início de lesão de órgãos-alvo. Aqui, o método de microscopia de fluorescência (FCFM) imagiologia confocal baseado fibered é descrito, o qual fornece um modo inovador para compreender os fenómenos fisiológicos nos níveis celulares e subcelulares nos sujeitos animais.

Introduction

A evidência clínica indica que várias classes de quimioterapias provocar uma variedade de patologias vasculares manifestadas por fenômeno de Raynaud, hipertensão, infarto do miocárdio, ataque cerebrovascular, e veno-occlusivedisease hepática 1,2. "As drogas anti-angiogênicos" acidental "" é um termo relativamente novo, que descreve agentes quimioterápicos convencionais que atuam como inibidores da angiogénese possíveis, embora não originalmente desenvolvido para este fim de 3-5, mas projetado para eliminar as células tumorais através da imposição de tão pouco "colateral danos "para as células normais quanto possível 3. Vários quimioterapias têm sido implicados como vasculo-tóxicos como observado em estudos clínicos utilizando biomarcadores séricos. Entre estes estão os agentes (tais como ciclofosfamida), compostos de platina, tais como cisplatina () e antraciclinas 1,2,5-7 alquilação.

Complicações cardiovasculares agudos podem ocorrer como result de toxicidade vascular induzida por quimioterapia. Eles podem evoluir para doenças crónicas como a aterosclerose e conta para o aumento do risco de morbidade vascular tarde. No entanto, apesar de montagem evidência clínica, há uma escassez de estudos designados enfatizando o mecanismo de toxicidade vascular e, portanto, maior elucidação da patogênese exata que infligem se justifica.

Um grande desafio para revelar o mecanismo de toxicidade vascular induzida por quimioterapia resulta da complexidade de investigar a função vascular in vivo. Descrevemos aqui uma plataforma de alta resolução em imagem molecular in vivo em ratinhos que permite capturar características dos navios, o fluxo de sangue e. Esta plataforma facilita a detecção de efeitos directos vasculares induzidas pelo tratamento: em tempo real, bem como a segui-los durante um período de tempo dentro dos mesmos indivíduos.

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Protocol

Declaração de Ética: Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional. Cuidados com os animais foi de acordo com as diretrizes institucionais. Camundongos ICR feminino (7-8 semanas de idade; 25 - 30 g) foram alojados em ar condicionado, luz controlada biotério da Faculdade de Medicina Sackler na Universidade de Tel-Aviv. Pelo termo, os animais foram sacrificados com overdose de anestesia.

1. Fibred microscopia de fluorescência confocal (FCFM) Calibração

  1. Ligar o dispositivo.
  2. Ligue a microssonda (mini0 / 30).
  3. Calibrar o dispositivo de acordo com as instruções do fabricante.

2. Ratos Preparação for Imaging

  1. Anestesiar por uma injecção subcutânea de ambas Ketaset (100 mg / kg) e XYL-M2 (6 mg / kg). Confirme anesthetization adequada por falta de resposta aos toe-pinch.
  2. Faça uma incisão na pele abaixo da virilha, a fim de revelar os vasos arteriais femorais. Manter o local da incisão úmido com solução salina após a incisão.
  3. Aqueça a cauda, ​​usando um saco (ou uma luva) cheia de água quente (não muito quente ao toque) durante aproximadamente 30 segundos. Prepara-se uma (IV) para a administração intravenosa de derivação de FITC dextrano (um agente de contraste) e de um ou outro agente quimioterapêutico ou de solução salina, por inserção de uma agulha (30 L, 1/2 polegada) na veia da cauda e ligando uma seringa de 1 ml a ele . Garantir a veia está aberto ao injetar soro fisiológico.
    NOTA: Uma administração IV de FITC dextrano (peso molecular elevado; 100 ul; 10 mg / ml; 2,000 kDa) facilita a visualização da microvasculatura femoral por FCFM. Doxorrubicina (100 ul; 8 mg / kg, adriamicina) ou solução salina também será mais tarde administrados IV na veia da cauda de pré-aquecida.
  4. Posicione o mouse supinely em um palco de poliestireno. Prenda o mouse para a almofada e manter a posição usando fita adesiva cirúrgica.
title "> 3. Imagens de fêmur vasos sanguíneos, FCFM Durante e após a administração de doxorrubicina ou Saline

NOTA: O microscópio confocal desfibrado utilizado neste estudo é composto por duas unidades: (1) microssonda (mini0 / 30). (2) unidade de digitalização a laser (LSU-488; 488 nm de comprimento de onda).

  1. Executar todas as datas-voltas análises utilizando o laser de comprimento de onda nm LSU 488.
    NOTA: O principal detector unidade detecta o filtrado (500-650 nm) fluorescência emitida. As imagens obtidas são reconstruídos depois e exibido a uma taxa de 12 frames / seg.
  2. Desligue cuidadosamente a seringa da agulha e anexar uma nova seringa contendo FITC dextrano. Administrar (IV) 100 uL de FITC dextrano.
  3. Deslocar a microssonda (mini0 / 30) para um campo de vista apropriado e fixar-lo, após um ajuste para o eixo z, a fim de se obter a imagem correspondente. Aguarde até que o sinal inicial a desvanecer-se, até que um sinal claro e focado é visible.
  4. Grave um fluxo de sangue linha de base para um curto período de estabilização (~ 30 segundos). Em seguida, conectar-se a agulha outra seringa, contendo doxorrubicina ou soro fisiológico. IV administrar doxorrubicina a 100 ul de solução salina ou.
  5. Monitorar o fluxo de FITC-dextrano injectado continuamente durante 20 min. No software associado-FCFM, use o botão de diâmetro na régua superior, a fim de medir os vasos sanguíneos e categorizá-los como pequenos (<15 mm) ou grande (> 15 mm).
  6. Eutanásia do animal com anestesia overdose.

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Representative Results

Em imagiologia contínua in vivo em tempo real

O aparelho de imagem usada aqui é uma alta definição, microscópio confocal fibered, equipado com uma sonda que permite a visualização da vascularização e a sua resposta a vários estímulos como a quimioterapia. Este método é minimamente invasivo, uma vez que, embora possa facilitar a imagiologia de vasos profundos ou órgão, que exige uma pequena incisão para a sonda. Os feixes de sonda consistem em dezenas de milhares de fibras ópticas, microscópio e um conector de precisão proprietária. Uma representação esquemática é apresentada na Figura 1.

Imagem de microvasculature femoral

Classificamos a rede de vascularização de sangue femoral acordo com o diâmetro navios (de pequeno <15 mm; grande> 15 mm) por FCFM em camundongos injetados com FITC-dextrano. A vasoconstrição rápida (2-5 min) de pequenos vasos foi induzida por doxorrubicina. A disappearan completace do fluorescente FITC-dextrano, 8 min tratamento pós doxorrubicina (Figura 2A por exemplo, setas; Video 1). Em vários ratos, redução do sinal fluorescente no vaso sanguíneo e aumentar o sinal da sua envolvente foi observada na região perivascular, poucos segundos após a administração de doxorrubicina (Figura 2B g, setas). Estes resultados indicam que o aumento da permeabilidade dos vasos e vazamento do dextrano de elevado peso molecular a partir do vaso sanguíneo para os tecidos circundantes. Não há sinal de fluorescência era evidente após a administração de doxorrubicina em ratos que não foram previamente injectados com FITC-dextrano. Ratinhos tratados com paclitaxel demonstraram estrutura semelhante vasos de sangue e taxa de fluxo para as observadas em ratinhos injectados com soro fisiológico (não mostrado), durante o período de medição.

Figura 1
Figura 1. A FCFM O microscópio confocal usado aqui é composto por duas unidades: a microssonda (mini0 / 30) e a unidade de varrimento laser (LSU-488; 488 nm de comprimento de onda)..

Figura 2
Figura 2. Imagens de sinal de fluorescência FITC-dextrano em microvasculature femoral. Os vasos foram dichotomously classificadas para menor (<15 mm) ou maior (> 15 mm) de acordo com sua categoria. Microvasculatura femoral de FITC dextrano (100 uL; 10 mg / ml). Injectado ratinhos foi representada por imagem antes e durante a administração intravenosa de solução salina ou doxorrubicina ou (A) Os vasos menores, fotografada por FCFM, começou vasoconstritora agudamente 2 min após a administração de doxorrubicina (f , seta), que mostra um estreitamento contínua do sinal de fluorescência até que o seu desaparecimento completo, com nenhuma recuperação recuperação aparente do sinal durante o next oito minutos de a imagem em tempo real (g, seta). (B) Aparência, em alguns instantâneos, de uma área de "nebuloso" em torno das paredes dos vasos sanguíneos de ratos injectados com quimioterapia (g seta) imediatamente após a injeção, indica potencial Dextran-FITC vazamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1. Femoral imaging microvasculature. Um representante fotografado filme de menor fluorescente FITC-dextrano (<15 m de diâmetro) vasos sanguíneos. Tempo microvasculature ovário e femoral voltas fotografia: camundongos injetados com 100 l FITC-dextrano (10 mg / ml) foram fotografadas e fotografado a partir do momento da administração IV da doxorrubicina. 2-5 minutos após a injecção de doxorrubicina, vasos menores mostraram vasoconstrição dramático seguido por uma eliminação completa do sinal fluorescente, já após 8 min tratamentt. (AVI) Por favor, clique aqui para ver este vídeo.

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Discussion

Avaliar a toxicidade vascular induzida por quimioterapia é um desafio devido à dificuldade em visualizar a dinâmica da vasculatura em resposta a um estímulo em tempo real. Numerosos estudos clínicos têm implicado que várias quimioterapias causar lesão vascular direta, mas o mecanismo e as características desta toxicidade ainda não foi esclarecido. Nós estabelecemos um tempo real, in vivo plataforma de imagem molecular para avaliar a toxicidade vascular potencial de quimioterapia em ratos que compreendem de microscopia de fluorescência confocal fibered como aqui descrito 8-10. Esta imagem molecular de alta resolução de ratos é adequado para visualizar o fluxo sanguíneo arterial e arquitetura dos navios. Ele permite a detecção em tempo real de complicações induzidas pelo tratamento no mesmo animal durante um período prolongado de tempo. Foram avaliados dois tipos de quimioterapias: doxorrubicina, que é conhecido por ser tóxico para as células endoteliais in vitro, bem como em tecidoss obtidos a partir de animais tratados com doxorrubicina 10-15, e do paclitaxel como uma quimioterapia de controlo para o que é muito limitado o ex evidência de qualquer efeito vascular.

A tecnologia de escaneamento a laser confocal de FCFM facilita o rastreamento profundas tecidos tingidos de fluorescência em tempo real e produz imagens de vídeo time-lapse de vasos sanguíneos in vivo 9. No nosso estudo FCFM foi utilizada para observar o efeito vascular aguda de doxorubicina, como um agente de protótipo vasculotoxic. Este efeito, que começou pouco depois da administração de doxorrubicina, era dependente de tamanho dos vasos sanguíneos: o menor diâmetro dos vasos, o mais proeminente dos danos. O sinal de fluorescência de pequeno diâmetro (<15 mm) navios diminuiu gradualmente como resultado da constante constrição vasos provocada pela doxorrubicina. Nenhuma recuperação aparente foi detectado durante os próximos 8 min de imagens em tempo real. De grande diâmetro (> 15 um) Os navios foram menos danificados; a integridadede sua parede foi comprometida, apresentando uma superfície irregular. Estes efeitos foram exclusivas à doxorrubicina e não eram evidentes quando paclitaxel foi utilizado, indicando que esta metodologia delineia meticulosamente o efeito específico da droga.

Modificações e solução de problemas

Durante todo o protocolo, a potência do laser pode ser alterada durante a gravação da linha de base, a fim de ilustrar os vasos. No entanto, a potência do laser não deve ser alterado durante o experimento. Além disso, um laser de alta potência pode branquear o agente durante o tempo de fluorescência. Além disso, uma vez terminada a gravação, é possível alterar o contraste do filme e para editar o seu comprimento e velocidade. As medições dos navios pode, então, ser feito e as mudanças que ocorrem podem ser seguidos.

Limitações da técnica e passos críticos

O dispositivo FCMF tem algumas limitações. A região de interesse (ROI) podem mudar no decorrero tempo de imagem. Além disso, a área visualizada, poderão secar; deve-se manter a área hidratada. O agente de fluorescência pode branquear eo sinal será perdido. Um passo crítico deve-se prestar atenção é para manter o animal e a sonda bem fixado para evitar alterações do ROI.

Aplicações de significância e futuras

A plataforma experimental estabelecido, pode servir como uma prova de imediato para a resposta à quimioterapia ou, alternativamente, como um potencial marcador biológico para caracterizar o potencial perfil de toxicidade vascular. Com base no mecanismo estudado de insuficiência vascular, o método também pode ser útil no futuro, para a avaliação de potenciais agentes especificado para reduzir a toxicidade vascular induzida por quimioterapia. A necessidade de diminuir as potenciais complicações vasculares de longo prazo em sobreviventes de câncer nos leva a explorar o mecanismo por trás toxicidade vascular induzida por quimioterapia.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
general anesthesia Fort Dodge Animal Health, IA, USA and Biove Laboratories, France 100 mg/kg ketaset and 6 mg/kg XYL-M2
depilatory cream (Veet) ReckittBenckiser, Bristol, UK
30 G, 1/2 inch needle attached to 1 ml syringe
FITC dextran (10 mg/ml; MW 2,000 kDa) Sigma FD2000S 100 μl volume
Doxorubicin Teva, Israel 8 mg/kg, Adriamycin
paclitaxel Taro, Israel 1.2 mg/kg, Medexel
saline

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