הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אנו מתארים כאן שיטת ההעברה השתפרה הארת תהודת אנרגיה (LRET) שבו אנחנו מציגים את אתר מחשוף פרוטאז בין אתרי fluorophore תורם acceptor. שינוי זה מאפשר לנו להשיג אותות LRET ספציפיים הנובעים מחלבונים קרום של עניין, המאפשרים המחקר של חלבונים בממברנה ללא טיהור חלבון.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dolino, D. M., Ramaswamy, S. S., Jayaraman, V. Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (91), e51895, doi:10.3791/51895 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

העברת הארה תהודת אנרגיה, או LRET, היא טכניקה רבת עוצמה המשמשת למדידת מרחקים בין שני אתרים בחלבונים בטווח המרחק של 10-100 א. על ידי מדידת המרחקים בתנאי ligated שונים, שינויי קונפורמציה של החלבונים ניתן להעריך בקלות. עם LRET, lanthanide, terbium לרוב chelated, משמש כfluorophore התורם, מעניק יתרונות כגון חיים ארוכים יותר תורמות בלבד פליטה, את הגמישות להשתמש fluorophores acceptor מרובה, ואת ההזדמנות כדי לזהות פליטת acceptor רגיש כדרך קלה כדי למדוד העברת אנרגיה ללא הסיכון של גם איתור אות תורם בלבד. כאן, אנו מתארים שיטה לשימוש LRET על חלבוני קרום הביע וassayed על פני השטח של תאי יונקים ללא פגע. אנחנו מציגים את אתר מחשוף פרוטאז בין זוג fluorophore LRET. לאחר קבלת אות LRET המקורית, מחשוף באתר זה מסיר את אות LRET הספציפי מהחלבון שלעניין ומאפשר לנו להפחית את אות הרקע שנשארה לאחר מחשוף כמותית. שיטה זו מאפשרת ליותר מבחינה פיזיולוגית מדידות רלוונטיות להתבצע ללא הצורך בטיהור של חלבון.

Introduction

העברת הארה תהודת אנרגיה (LRET) היא נגזרת של טכניקת העברה ידועה פלואורסצנטי תהודת אנרגיה (סריג) 1. בדומה לסריג, LRET ניתן להשתמש כדי למדוד מרחקים ושינויי מרחק בין fluorophores תורם acceptor המצורף לאתרים ספציפיים על החלבון של עניין בטווח של 10-100 Å 1-3. העקרונות של LRET דומים גם הם לסריג שבהעברת אנרגיית התהודה מתרחש בין שני fluorophores הפרוקסימלי כאשר ספקטרום הפליטה של ​​fluorophore התורם חופף עם ספקטרום הספיגה של fluorophore acceptor. היעילות של העברה זו קשורה למרחק בין שני fluorophores על ידי המשוואה הבאה:

משוואת 1 משוואה. 1

כאשר R הוא המרחק בין שני fluorophores, E הוא את היעילות של enהעברת ergy, וR 0, שיידון להלן, הוא רדיוס פורסטר לזוג fluorophore, כלומר המרחק שבו יעילות של העברה היא חצי מקסימאלי. ממשוואה זו, ניתן לראות את היעילות הקשור לסדר הגודל של המרחק בחזקה השישית ההפוכה 1. זה תלות זו הפוכה שישי כוח המאפשרת לסריג ומדידות LRET להיות רגישים להפליא אפילו לשינויי מרחק קטנים כאשר ליד R 0 של זוג סריג. היכולת לתייג באופן ספציפי אתרים הרצויים בחלבונים או מקרומולקולות אחרות מאפשרת לאדם לנצל את רגישות זו כדי לעקוב אחר שינויי קונפורמציה.

בהשוואה לסריג, אשר עושה שימוש במולקולות צבען אורגניים קונבנציונליות, LRET מציע יתרונות נוספים. בLRET, במקום להשתמש בצבע אורגני כfluorophore התורם, קטיון סדרת lanthanide, בדרך כלל Tb 3 + או האיחוד האירופי 3 +, משמש 1,4-6. Fluorophores שנופל under קטגוריה זו, למשל, chelate terbium, הם גם מאוד תכליתיים בכך שהם יכולים להיות בשימוש עם מגוון רחב של fluorophores acceptor. גמישות זו מתאפשרת בגלל ספקטרום הפליטה של ​​lanthanides chelated להכיל פסגות פליטה חדות מרובות, המאפשר למין יחיד של fluorophore תורם לשימוש עם אחד ממגוון רחב של fluorophores acceptor. לפיכך, פליטת acceptor רגישה יכולה להיות מזוהה ללא כל חשש של זיהום לדמם דרך מפליטת תורם 5. הנסיין בוחר את acceptor הספציפי המבוסס על המרחק הצפוי בין שני fluorophores (איור 1 ולוח 1). בfluorophores lanthanide chelated אלה, יון מתכת chelated על ידי מולקולה המכילה קבוצת אנטנה שממגרת את lanthanide בדרך כלל גרוע, סופג לעירור, כמו גם קבוצה פונקציונלית bioreactive לקשור יון לקבוצה פונקציונלית ספציפית על מקרומולקולה 1, 5,6. Oncדואר נרגש, lanthanides להירגע למדינת הקרקע באמצעות שחרורו של פוטונים עם קצב דעיכה בטווח אלפית השנייה. בגלל הריקבון אינו הרפיה גופייה לגופייה ולא הרפיה שלישייה לגופייה, הפליטה של פוטונים לא יכולה כראוי להיקרא הקרינה או זרחני, אבל הוא יותר מכונה הארה 1 כראוי. הדעיכה של הארה lanthanide הארוכה מאוד עוזרת במדידות לכל החיים. מדידות חיים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לקבוע את יעילות באמצעות הקשר הבא:

משוואה 2 משוואה. 2

שם, E היא את היעילות של העברה, τ D הוא את חייו של התורם (lanthanide chelated) כאשר אינם משתתף בהעברת אנרגיה, וτ DA הוא את חייו של התורם בעת ההשתתפות בהעברת אנרגיה עם acceptor. עם LRET, DA τ יכול אלכך יימדד כחייו של פליטת acceptor רגיש משום שחייו של terbium הוא כל כך הרבה יותר גדול מfluorophore acceptor אורגני. Acceptor פולט עם אותו החיים כעירור (lanthanide התורם) ההסתה שלה, וכל תרומה לכל החיים מחי הקרינה הפנימית של acceptor עצמו היא יחסית זניחה. על ידי מדידת הפליטה רגישה ולא פליטת תורם, אנחנו גם מבטלים את הצורך להבטיח תיוג ב1 בדיוק: 1 יחס של תורם לacceptor. חלבון במקום יכול להיות מתויג בו זמנית עם שני acceptor וfluorophores תורם. אוכלוסיית שכותרת הטרוגני תגרום, אבל חלבוני שכותרתו כפול של תורם לא פולטים באורך גל acceptor וחלבוני שכותרתו הכפול acceptor לא יהיו נרגשים. יתר על כן, המרחק בין fluorophores צריך להיות זהה, ללא קשר לציסטאין אתר fluorophore ניתנו מתחבר ל, במיוחד בעת השימוש בlanthanides איזוטרופיים כתורם, כך לביתד כדי לציין אתר נתון לקבל גם התורם או acceptor הוא מיותר. עוצמת עשויה להיות מושפעת עם אוכלוסייה הטרוגנית, אבל עדיין צריכה להיות יותר מהדרוש כדי להתגלות.

בעת תכנון ניסויים, הבחירה של fluorophores צריכה להיות מוכתבת על ידי ערך R 0 של הזוג, כמו גם את טווח המרחק הצפוי נמדדים. ערך R 0 מוגדר על ידי המשוואה הבאה:

משוואה 3 משוואה. 3

שבו, R 0 הוא הרדיוס פורסטר באנגסטרם, κ 2 הוא גורם האורינטציה בין שני הצבעים (בדרך כלל ההנחה היא להיות 2/3), φ D הוא התשואה הקוונטי של התורם, J היא החפיפה ספקטרלית נפרד בין התורם של ספקטרום פליטה וספקטרום הספיגה של acceptor בM - 1-1 סנטימטר 4 ננומטר, וn הוא מקדמת השבירה של המדיום 1.

המעבדה שלנו הוסיפה שינוי לטכניקת LRET הקונבנציונלית על ידי החדרת אתר הכרת פרוטאז בין אתרי תווית תורם ונוטל על החלבון שנחקר. שינוי זה מאפשר לחקירה במערכות מטוהרת שאינן כגון תאי יונקים כל 7. טכניקה זו שימושית במיוחד בעת שימוש בcysteines כאתרים לתיוג, שכן בתהליך של תיוג עם צבעי maleimide מצומדות- אשר נקלטים על ידי קבוצות sulfhydryl ציסטאין, חלבונים אחרים בתאים שיש לי cysteines גם מסומנים. עם זאת, על ידי הכללת אתרי מחשוף פרוטאז על החלבון של עניין ומדידת תקופות חיים לפני ואחרי המחשוף, הנסיין יכול כמותית להחסיר אות הרקע לאחר מחשוף פרוטאז מאות הגלם. חיסור זה מבודד את האות הספציפית הנובעת מהחלבון של עניין (איוריור 2). באמצעות השינוי שתואר לעיל, LRET ניתן להשתמש כדי למדוד את מרחק שינויים בין תורם chelate terbium והבדיקה נוטלים על חלבון, וכך לעקוב אחר שינויי קונפורמציה במצב הפיזיולוגי הקרוב של החלבון ללא הדרישה לטיהור.

איור 1
איור 1.The קליטה וספקטרום פליטה של terbium chelated בשחור, כמו גם acceptor נציג, Alexa 488, באדום. שים לב פסגות פליטה מרובות ומגוון החד, צר פליטה עבור כל שיא של chelate terbium. דפוס זה מאפשר לterbium לשימוש עם מגוון רחב של fluorophores acceptor ומאפשר המדידה של פליטה רגיש בתוך אלה טווחים בי terbium לא מראה פליטה. שיא הפליטה של ​​Terbium ב486 ננומטר חופף היטב עם שיא bsorption של Alexa 488, המאפשר העברת אנרגיית התהודה להתרחש בין שני fluorophores. אורך גל של 515 ננומטר הוא בחירה מצוינת לגילוי פליטה רגיש לזוג הזה כפי שהוא בעמק שבין פסגות פליטת terbium, ודי קרוב של Alexa 488 שיא פליטה של ​​520 ננומטר. שים לב כי ננומטר להיות ליד שיא acceptor, אם כי רצוי, אינו נדרש-565 הוא עדיין מסוגל לזהות פליטת Alexa 488 בלי גם גילוי פליטת terbium.

3px; "> 508 Cy3
Acceptor Fluorophore R 0 (א) פליטת גל (ננומטר)
Atto 465 36
והעמסת 45 515
Alexa 488 46 515
Alexa 680 52 700
Alexa 594 53 630
Alexa 555 65 565
65 575

טבלת 1 רשימה של fluorophores acceptor הנפוץ לLRET באמצעות chelate terbium כתורם 11. 0 ערכי R נמדדו כאשר התורם acceptor צורפו לתחום מחייב אגוניסט המסיס של קולטני AMPA. הוא אידיאלי כדי למדוד את ערך R 0 שוב לנחקרת כל מערכת חדשה.

איור 2
איור 2 סקירה כללית של שיטת LRET הציגה. () קולטן AMPA הוא חלבון קרום שעובר שינויי קונפורמציה על הכריכה ליגנד. ליגנד דו בצורת הצדפהתחום nding הוא הקיף כאן באדום. (ב) תחום מחייב ליגנד של AMPA כאשר אינם מחויבת לחלבון קיים בקונפורמציה פתוחה (משמאל). כאשר חייב יגנד גלוטמט, החלבון סוגר סביב יגנד (מימין). על ידי הצבת fluorophores באתרים הראייתית על LBD, טיבו של שינוי קונפורמציה זו ניתן לראות את המרחק בין שינויי fluorophores, אז שישפיעו על כל החיים הקרינה. (ג) כאשר כל תאי תיוג, תיוג של שני החלבון של עניין, כמו גם חלבוני קרום רקע עלול להתרחש (משמאל). לאחר מחשוף פרוטאז, אות LRET מהחלבון של עניין תיעלם עקב השחרור של בר מסיס, עוזב אות רקע שלם (מימין). אות רקע אז זה יכול להיות מופחתים אות הגלם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

.1 צור Construct המכיל את החלבון של ריבית

לשכפל את הגן המבטא את החלבון של עניין לתוך וקטור מתאים. וקטורי שימוש כגון סדרת pcDNA או pRK5 כפי שהם מתאימים גם לביטוי במערכות יונקים כמו תאי HEK293 וCHO.

.2 בחרו את האתרים בחלבון שתויג עם fluorophores

  1. בחרו אתרי תיוג כי הם מסוגלים לשקף את שינויי קונפורמציה אפשריים בתוך החלבון. במידת האפשר, להשתמש במבנה הגבישי של החלבון או של חלבון הומולוגי כדי לסייע להפוך קביעה זו. אם אין מבנה הגבישי זמין, להשתמש בתוכנה באינטרנט כדי לחזות את המבנה האפשרי של החלבון ולכן תקבל תובנה האתרים מתאימים.
  2. בחר שאריות כך שהרשתות בצד של השאריות שנבחרו הן משטח חשוף ונגיש לfluorophores כך שיכול להיות שכותרתו החלבון.
    1. בחר שאריות שאינם קריטיים לתפקוד חלבון, לאתרים לדוגמה, שאינם מעורבים ביגנד המחייב.
    2. בהחדרת המוטציה ציסטאין, לתת העדפה לאתרים הדומים, למשל סרין, שיגרמו הפרעה מינימאלית למבנה החלבון.
    3. לאחר בחירת אתרי התיוג, לעשות מוטציות על מנת להבטיח כי החלבון נותן רק LRET מאתרים המיועדים אלה. להשתמש בפרוטוקולים מכוונים mutagenesis אתר סטנדרטיים להשתנות משם cysteines אינו מלוכדות דיסולפיד שעלול להיקשר לmaleimide מצומדות- תגי ניאון. אל להשתנות משם cysteines מלוכדות דיסולפיד ו, cysteines החופשי קבר שכן הם לא צריכים להגיב בצבעי ניאון בצורה המקופלת של החלבון.
  3. להציג את שאריות ציסטאין באתרים הרצויים על ידי ביצוע מוטציות נקודה תוך שימוש בפרוטוקולים מכוון mutagenesis אתר סטנדרטיים.
  4. כולל אתר מחשוף פרוטאז שיכול דווקא לדבוק את אחד cysteines מהחלבון. אםרצף חלבון מאפשר את זה, להציג את האתר על ידי שמרני מוטציה החלבון יש תרומבין (רצף הכרת LVPRGS) או פקטור Xa (IDGR רצף הכרה או IEGR) רצף ליד ציסטאין הציג ונגיש לפרוטאז מחשוף; אחרת רצף tetra- או Hexa-peptide עשוי להיות מוכנס בכללותה. בחר האתר באופן שעם מחשוף אחד cysteines הציג מנתק משאר החלבונים במקרים מסוימים, זה עשוי לדרוש שני אתרי מחשוף איגוף ציסטאין מוטציה.

.3 מבחן הביטוי ופונקציונאלי של החלבון

  1. לבצע כתם מערבי כדי לאשר ביטוי של החלבון שעבר מוטציה.
  2. בצע assay פונקציונלי של החלבון על מנת להבטיח כי המוטציות שינו את תפקוד החלבון אך במידה מועטת, אם בכלל, כדי להימנע מלימוד שינויי קונפורמציה של חלבונים לא מתפקדים.
    הערה: מאחר שיש לי כל החלבונים פונקציות שונות, אין f אחת assay unctional המשמש במיוחד עבור LRET; עם זאת, כמה דוגמאות של מבחני תפקודיים כוללות מבחני אנזים פעילות אנזימים, מבחני מחייב ליגנד לקולטנים, ומחקרי אלקטרופיזיולוגיה לתעלות יונים.

.4 בחר fluorophores כדי לשמש

fluorophores בחר, על בסיס מגוון המרחק הצפוי הנמדד כך שהטווח הוא בין 0.5-1x R 0 של זוג fluorophore.
הערה: זה מאפשר לחיסור קל יותר של הרקע, שבו יש בדרך כלל חיים ארוכים הרבה יותר. לדוגמא, אם טווח המרחק הצפוי נמדדים הוא סביב 35 Å, זוג fluorophore מתאים לשימוש יהיה chelate terbium כתורם וAlexa 594 כacceptor, כי R 0 לזוג הזה הוא 53 A (טבלת 1).

.5 הגעה החלבון על ידי זמני transfecting הסכום הנדרש של תאי יונקים

ntent "> זמני transfect החלבון של עניין לתוך תאי יונקים בחרו משתמשים באחת מריאגנטים transfection הנפוצים בדרך כלל, להשתמש בארבע מנות 10 ס"מ לכל ניסוי LRET לשורות תאי HEK וCHO;. עם זאת, סכום זה עשוי להשתנות בהתאם לביטוי חלבון , יציבות, וכו '. אפשר התאים לבטא החלבון ל36-48 שעות לפני הקציר.

.6 לייבל החלבונים

  1. ניתוק תאים מצלחת התרבות. ניתוק תאי HEK פשוט על ידי pipetting חיץ נגד תחתית הצלחת. ניתוק תאי CHO עם מגרד תא, שטף את התקשורת עם חיץ תאי.
  2. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב1,100 XG במשך 3 דקות. השתמש באותן הגדרות צנטריפוגות אלה לאיסוף תאים לאחר תיוג, כמו גם לאחר שטיפות שלאחר מכן.
  3. להשעות תאי 3 מ"ל של חיץ תאי, ולאחר מכן להוסיף fluorophores תורם acceptor בכמויות equimolar עד לריכוז סופי של 100-300 ננומטר. דגירה על f מסובביאו שעה 1 בRT.
  4. שטוף תאים אלה שכותרת 3-4x עם חיץ תאי כדי להסיר fluorophores מאוגד, אז להשעות את התאים האלה במאגר תאי (בדרך כלל 2 מ"ל) למדידות LRET.
  5. כביקורת, תווית קבוצה של תאים עם fluorophore רק תורם (chelate terbium) נפרדת ללא תוספת של כל fluorophore acceptor.
    הערה: נתונים מניסויי תורם בלבד אלה הוא הכרחיים כדי להשלים את הניתוח. ניתן לעשות ניסויים אלה על זהים או שונים ימים.
  6. שוב, מבצע אימות פונקציונלית, הפעם עם חלבון שעבר מוטציה שכותרתו, כתהליך התיוג יכול גם להפריע לתפקוד בהתאם לאתר המשמש לתיוג.
    הערה: ניתן לעשות ניסויים אלה על זהים או שונים ימים.

.7 הגדרת ניסוי LRET

  1. מניחים את תאי resuspended בקובט קוורץ עם נפח מינימאלי של 1 מ"ל.
  2. הפעל את המחשב ואת המכשיר ולהתאים את הפרמטרים של datתכנית רכישה בהתאם.
    1. קבע את אורך גל העירור לטווח הספיגה של fluorophore התורם (330-340 ננומטר עובד היטב עבור chelate terbium).
    2. קבע את אורך גל הפליטה כראוי, תוך התחשבות כי פליטת acceptor משתנה על בסיס acceptor משמש. חשוב לציין, בחר באורך גל זיהוי המודד רק פליטת acceptor ואינו כולל כל לדמם דרך מהפליטה של ​​התורם. לדוגמא, השתמש באורך גל של 565 ננומטר עבור Alexa 555 כלוח acceptor 1. עבור מדידות תורם בלבד, שבו חלבון שכותרתו רק עם תורם אך ללא acceptor, להשתמש באורך גל של 545 ננומטר למדידת פליטת chelate terbium.
    3. הגדר את האורך של גילוי פליטה להיות לפחות שלוש פעמים בחייו LRET הצפויים להבטיח שרכיב ארוך חיים לא יחסר.
  3. לבצע הסריקה. האם לפחות שלוש סריקות של 99 מטאטא כדי להבטיח עקביות של תוצאות. להציל את התוצאות דואר כקובץ טקסט (* txt).
  4. כדי למדוד שינויי קונפורמציה של חלבונים בכל קשורים לתנאים שונים (כגון תוספת של ליגנד), לשנות את התנאים האלה ושוב לבצע לפחות שלוש סריקות של 99 מטאטא כל על אותו המדגם תחת מצב חדש זה. אם בוחנים את ההשפעות של גלוטמט בקונפורמציה של קולטני גלוטמט, למשל, להוסיף גלוטמט עד 1 מ"מ לאותו המדגם שנסרק בשלב 7.3, ולאחר מכן לסרוק שוב.
  5. להוסיף עד חמש יחידות של פרוטאז המתאים ולקחת סריקות ללא הרף עד המחשוף הוא מלא ולא חלה שינוי נוסף הוא לראות את החיים במשך שלוש סריקות רצופות. בדרך כלל, מחשוף יושלם בתוך שנים עד 3 שעות. אם אתר מחשוף פקטור Xa משמש למחשוף פרוטאז, למשל, להוסיף 3 μl של פקטור Xa למדגם, ולסרוק כל 30 דקות ל3 שעות.

.8 לנתח נתונים המתקבלים

  1. פתח את התוכנה לניתוח נתונים.
  2. טען את החיים הקרינהנתונים באמצעות ASCII היבוא כדי לפתוח את קבצי טקסט. לטעון את כל משכפל כמו גם מדידות רקע הסופיות, לתוך קובץ אחד.
  3. ממוצע הנתונים מכל הסריקות לכל תנאי ניסוי כדי לקבל את הנתונים הסופיים. לשם כך, סמן את העמודות המכילות מחקרים הבודדים, לאחר מכן, תחת תפריט נתונים בשורת התפריטים, לחץ על סטטיסטיקה על שורות כדי להציג את העוצמות ממוצעת הקרינה מהניסויים, כמו גם סטיית התקן ושגיאה סטנדרטית.
  4. עלילה הערכים הממוצע כגרף קו עם עוצמת הקרינה על ציר Y והחיים בהמייקר על ציר X כדי ליצור עקומה שמייצגת את חייו של הפליטה רגישה של acceptor. לשנות את ציר Y של המזימה בקנה מידה יומן, כדי לאפשר הדמיה טובה יותר של נתונים.
  5. חזור על שלב 8.3 על נתוני מדידת רקע, עם ממוצע של הסריקות הסופיות שמראות חפיפה המציין מחשוף מלא.
  6. להציג את נתוני רקע הממוצעים עלאותה חלקה שמכילה את הנתונים גולמיים בממוצע. לשם כך, פתח את תיבת הדו שיח בקרת השכבה נמצאה תחת תפריט מגרש. לאחר מכן, להעביר את הנתונים המכילים את הרקע מתכוונים לרשימה של תוכן שכבה.
  7. יישר את נתוני רקע הממוצעים לנתונים הגולמיים הממוצעים. לשם כך, השתמש בפונקציה מתמטית פשוטה תחת תפריט המתמטיקה להכפיל או לחלק את נתוני רקע כנדרש עד סוף הזנב של הרקע חופף עם הזנב של נתונים הגולמיים.
    הערה: בסופו של דבר זנב זה, כל החיים מהחלבון של עניין צריך כבר נרקבה משם לגמרי; מה מיושר הוא פשוט הווה אות הרקע הן לפני והן אחרי מחשוף פרוטאז.
  8. להחסיר אות הרקע מיושרת מאות LRET הגלם הראשונית, שוב באמצעות הפונקציה מתמטית פשוטה.
  9. להתאים את הנתונים לדעיכה מעריכית (Exponentials בודד או מרובה, בהתאם לאתרים ועיצוב ניסיוני).
    1. הגדר את גבול ההתחלה להתקנה להתחיל לאחר תוםשל דופק הלייזר. השתמש באותו startpoint זה עבור כל אביזרים העקום שלאחר מכן.
    2. בתיבת הדו שיח בחר התאמת הפונקציה, בחר דעיכה מעריכית כדי להתאים לכל החיים למשוואה לדעיכה מעריכית יחידה הבאה:
      משוואה 4 משוואה. 4
      שם, y מייצג את עוצמת הקרינה, y 0 מייצג את עוצמת הרקע בשל רעש מהמערכת, 1 היא עוצמת האות, t הוא לכל החיים הקרינה, x הוא הזמן, וx 0 הוא הזמן לקזז.
    3. תקן x 0 עד 0, להתחיל פונקצית ההתאמה, ולהתאים את הנתונים.
      הערה: אם הניסוי נועד לי אות רק מזוג אחד של אתרים, את הנתונים המתקבלים בקלות צריכים להיות בכושר על ידי דעיכה מעריכית יחידה 8. השייר של הכושר הוא שיטה טובה כדי לקבוע את הטוב בכושר ואם חיים ריקבון נוספים הם required.
  10. השתמש בתקופות החיים המתקבלים מנתונים כדי לחשב את המרחק בין fluorophores באמצעות משוואת פורסטר (סידור מחדש של משוואות 1 ו -2 לעיל):
    משוואה 5 משוואה. 5
    הערה: כל המשתנים הם כאמור לעיל עם τ DA לאחר שנמדד כחי פליטת acceptor רגישים. ניתן למצוא פרטים נוספים ודוגמאות על מדידות של R 0 ו R במקום אחר 7,9,10.
  11. חזור על ניתוח הניסוי ונתונים לפחות שלוש פעמים כדי להבטיח שחזור. חוסר עקביות בין חזרות בודדות באותה המדידה מעמידה בסימן שאל את תוקפו של נתונים; להשתמש ניסויי שליטה נוספים או חזרות. לחשב טעויות במדידה באמצעות המחשבון החופשי גוסטב ניתוח שגיאה (שפותח על ידי ד"ר תומס הובר) או מערכת דומה שמפיץ את השגיאה בהמתאים של הפעם בחיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מדידה LRET מוצלחת עם תורם lanthanide צריכה תורם חיים רק בטווח הזמן אלפית השנייה. חיים שלמים של פליטת LRET רגיש לחלבון שכותרתו עם התורם וacceptor יהיו בעיקר קצרים יותר, עם חיים בטווח המיקרו לאחר חיסור רקע איור 3. פרוטאז תוצאות מחשוף בגידול בחיים שצריכות להיות יציבים לאורך זמן ( כלומר שינוי כבר לא), שהראה כי מחשוף פרוטאז הוא איור שלם 4. אם אות LRET מגיע מרק סט אחד של אתרים, לכל החיים וכתוצאה מכך הפליטה לאחר הפחתת הרקע צריכים לתת לכל החיים מעריכית יחידים.

כאשר מודד שינויי קונפורמציה, אות LRET הספציפית צריכה להראות שינוי בחיים מחוץ לשגיאה של איור המדידה 3. השגיאה של המדידה יכולה להיות מחושבת על ידי ההתפשטות של השגיאהs הקשורים בכושר של החיים. אחרי שצרפתי את הנתונים למספר המינימאלי של פונקציות דעיכה מעריכית מתוארות במשוואת 4, החיים, τ, ניתן לקבוע. שימוש במשוואה 5, acceptor התורם וגלגולים תורמים בלבד יכולים לשמש יחד עם ערך R 0 לזוג LRET כדי לחשב את המרחק בין שני fluorophores בתנאים שנבדקו. הנוגע לשינוי המרחק וכתוצאה משינויים בתנאים אלה למבנה והתפקוד הכלליים של החלבון הוא כעת העבודה של הנסיין.

איור 3
איור 3 מדידות LRET של 1a חומצה חישה יון הערוץ (ASIC1a). עוצמת הקרינה כבר זממה על סולם לוגריתמים כדי לשפר את הקלות של פרשנות חזותית. (א) דגימות התורמות רק להראות חד exponentiaריקבון l שאינו משתנה עם pH. (ב) בדגימות שכותרתו acceptor התורם, ירידה בחיים של פליטה רגיש נתפסת על ירידה ברמת חומציות 8-6 (שחור לאדום). ירידת חיים זה מצביעה על ירידה במרחק בין תחומים האצבע ואגודל של ASIC1a. נתון זה שונה מראמאסוואמי, et al, 2013 8.

איור 4
איור 4 ההשפעה של רקע חיסור על מדידות LRET נעשו על 1a חומצת חישה יון הערוץ (ASIC1a). האתרים כדי להיות מתויגים באופן ספציפי על ידי fluorophores מופרדים על ידי אתר מחשוף פרוטאז. לאחר מדידות LRET נעשות, פרוטאז הוא הציג למדגם החלבון והמחשוף הבא של החלבון של תוצאות ריבית באובדן של אות מסוימת. כל LRET שנותרהוא הקרינה רקע מfluorophores חייב cysteines אחר הנמצא על חלבוני קרום אחרים. הפחתת רקע זה מבודד את נתוני LRET האמיתיים לחלבון של עניין. נתון זה שונה מראמאסוואמי, et al, 2013 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LRET היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת למדענים למדוד מרחקים בין תחומים בתוך חלבון יחיד, כמו גם בין תת יחידות בחלבון Multimeric. ככזה, LRET הוא מתאים היטב לבחינת השינויים ודינמיקת קונפורמציה של חלבונים או מקרומולקולות אחרות. הפרוטוקול הנ"ל צריך לאפשר מעבדה מצוידת כראוי כדי לבחון ההשערות שלהם בקלות; עם זאת, יש הרבה מקורות נפוצים של שגיאה שעלולה להטריד את החוקר החדש. אם אות LRET קטנה או לא נראית, יש לבדוק תחילה את הגדרות אורך הגל המשמשות. עירור צריך להיות בטווח הספיגה של terbium (330-340 ננומטר). לתורם מדידות רק, שבמדגם היה שכותרתו רק עם fluorophore תורם וללא fluorophore acceptor, פליטת הגל צריך להיות באחד מהשיאים שמוצגים באיור 1, ואילו עבור מדידות acceptor התורם, פליטת הגל צריך להתאים את fluorophore acceptor בשימוש טבלה 1. אם waveleהגדרות ngth נכונות, לבדוק את התאימות של מאגרים. fluorophores מסוים עשוי שלא להיות תואם למאגרים מסוימים או בטווחי pH מסוימים. בשלב הבא, להבטיח כי הבחירה של שאריות וfluorophores תואמות. אם עיצוב ניסיוני הוא נכון לחלוטין, אז הבעיה סבירה טמונה גם עם fluorophores או החלבון עצמו. לאורך זמן, פתרונות מניות של fluorophores עשויים להשפיל ועלולות לגרום לתיוג לקוי. לבסוף, לבדוק ביטוי ופונקציונליות של החלבון. מוטציות רבות נוספו, כולל ההקדמה של cysteines, הסרת cysteines ילידים, וכניסתה של אתר מחשוף פרוטאז אחד לפחות. לפיכך, יתכן כי, גם בתנאי transfection רגילים, המוטציות הציגו לערער את יציבות החלבון והסיבה תחת הביטוי של החלבון של עניין, הפחתת האות ראתה. אם הביע, המוטציות או תיוג עלולות לגרום denaturation של החלבון, גורמות לשאריות כדי להיות ממוקמות באופן שונהמהמרחקים הצפויים לראות בחלבון wild-type. כתמים מערביים יכולים לשמש כדי לאמת את הביטוי של החלבון. אם יש שאלה לגבי הסחר של חלבון קרום פני השטח, biotinylation של השטח פני התא ולמשוך כלפי מטה של ​​חלבוני משטח חשוף, ואחריו כתם מערבי לחלבון של עניין, יהיה דווקא להפגין סחר פני השטח. עבור בדיקות פונקציונליות, אין assay יחיד להמליץ ​​לשימוש במיוחד עם LRET, מאז LRET ניתן להשתמש במגוון רחב של סוגי חלבון. שוב אם כי, דוגמאות אפשריות של מבחני תפקודיים כוללות מבחני אנזים פעילות, מבחני מחייב ליגנד, ומחקרי אלקטרופיזיולוגיה. אם ביטוי חלבון או פונקציה הושפע גם לרעה על ידי המוטציות הציגו, אז יש לבחור באתרי תיוג חדשים.

אם אות LRET נראית, אבל לא יכולה להיות מצויד על ידי מעריכי אחד כאשר תוצאה זו צפויה, בדוק תחילה כי הרקע הופחת בצורה נכונה. אם, afחיסור ter, ריקבון רב מעריכי נראה, אות זה יכול להיות אינדיקציה לLRET שנצפתה מאינטראקציות מרובות אחרות ממה שהיה אמור. בדוק כדי לוודא שכל cysteines הנגיש האחר הוסר מהחלבון. אם מבנה הגבישי זמין, זה יהיה כלי מאוד שימושי כדי לבדוק cysteines אלה. שוב, מלוכדות דיסולפיד ונקבר, cysteines נגיש לא צריך להיות מוטציה משם. כדי לבדוק את הנגישות של cysteines אלה אם יש סיבה משכנעת לא להשתנות אותם משם, להציג ציסטאין שאינו ילידי הארץ אחת בחלבון ולהבטיח שאין אות LRET במדגם שכותרתו acceptor התורם. אם כל cysteines הנגיש לי אכן עבר מוטציה משם, ואם יש לו את החלבון יחידות משנה מרובה או הוא חלק ממכלול, אז ייתכן שיש אות LRET בלבול בשל לצבוע מצרפים לאלה חלבונים או תת יחידות סמוכים. בחירת אתר מחשוף פרוטאז שונה עשויים לעזור עם בעיות אלה; אחרת, אתר תיוג אחרs ייתכן שתהיה הצורך שנבחרה. לבסוף, אם הבעיה עם הולם היא פשוט עניין של אות לרעש, סביר להניח הבעיה היא עקב ביטוי נמוך של החלבון. אז ביטוי צריך להיות מותאם באמצעות תנאים שונים transfection, וקטור שונה, וכו '.

אם מדידות LRET לייצר תוצאה חריגה או לכאורה חסרת משמעות מבחינה פיזית, ייתכן שיש בעיות חלבון ספציפי שלא יכול להיות ברור בקלות. לדוגמא, עם תעלות יונים חישת חומצה, אפילו בנוסף זהיר של חומצה כדי לשנות את רמת החומציות עלולה לגרום לכמה denaturation מוות של תאים והחלבונים. לפיכך, דוגמאות רבות צריכים להיות מוכנות, אחד לכל pH להיבדק. כמו כן, בנוסף להעברת אנרגיית תהודה, שינויים בסביבה מקומיות יכולים להשפיע על אותות הקרינה. שינוי כזה, אם משמעותי, היה לציין במדידת תורם בלבד כריקבון כפול או רב מעריכי. במקרים אלה, אתרי התיוג צריכים להיות עברו לעמדות שונות למ 'האייק בטוח השינוי בתנאים לא משנה את התכונות ספקטרליות של fluorophores.

אפילו תוך שמירה על המקורות של בעיות במוח אלה, יש כמה אזהרות ולמגבלות של LRET שהנסיין חייב להיות מודע. טכניקת התיוג ראשונה, קונבנציונלית מסתמכת על שאריות ציסטאין התיוג. כדי להפחית את התיוג של שאריות שאינן ספציפיות, cysteines אחר מוטציה החוצה בדרך כלל; עם זאת, שיטה זו היא לא תמיד מעשית. לדוגמא, אם יש לו חלבון cysteines יליד המבנה שלה שהם קריטיים למבנה של החלבון או פונקציה רב שאינם מלוכדות דיסולפיד, אז מוטציה אותם יהיה בלתי אפשרי, מאוד להגדיל את המגבלה של הטכניקה והפרשנות של נתונים. כמו כן, טכניקת LRET מתאימה יותר לאיתור שינויים במרחק, ולא מרחקים מוחלטים, כמו כל שגיאות במרחק מוחלט בשל ההשפעה של גורם הנטייה κ 2 על ערך R 0 צפויותלהיות מופחת בשינוי מרחק ניתוח בגלל שגיאות אלה משפיעות מדידות בכל התנאים באותה מידה. ניתן לעשות זאת בטכניקות אלטרנטיביות כדי להתגבר על כמה ממגבלות אלה. לדוגמה, כדי להימנע מהוספת cysteines רב מדי, אפשר להדביקו תג ולתייג אותו עם fluorophore חייב ניקל נ.ת. ע. כמו כן, ניתן להשתמש בtryptophans יליד כאחד fluorophores מתוך ההבנה שאם משתמש בו כתורם, יש לי tryptophans חיים קטנים בהרבה מterbium, וכך מדידות עוצמת מבוססות עשויות להיות מתאימות יותר מאשר מדידות חיים. אם יותר אטום מדויק למרחקים אטום נדרשים, טכניקות כגון קריסטלוגרפיה רנטגן, דינמיקה מולקולרית, או NMR עדיין טכניקות מתאימות יותר כדי לקבל מרחקים מוחלטים אלה.

בשל הרגישות המעודנת שלה להרחיק את השינויים, LRET יכול למדוד מרחק שינויים עם רזולוציה ברמת אנגסטרום לחלבוני פתרון שלב ויכול לספק נתונים ניסיוניים ללא הצורך גבוה פורהty, תוויות איזוטופים או הגבלת הגודל שפוגעת בשניהם תמ"ג ודינמיקה מולקולרית. לאחר הלימוד ושליטה בטכניקה, ניתן לעשות בדיקות לשינויים קונפורמציה של חלבונים הרבה יותר מהר ועם יותר בקלות מאשר בטכניקות קונבנציונליות כבר זמינות. LRET גם מספק בסיס מצוין לטכניקות מיוחדות נוסף תהודת העברת אנרגיה כגון סריג מולקולה בודד (smFRET), אשר יכול לבחון את התפלגות האוכלוסייה של מדינות קונפורמציה של מולקולות בודדות, ולא ממוצעת ההרכב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לי המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט GM094246, איגוד לב האמריקאי גרנט 11GRNT7890004, והקרן הלאומי למדע גרנט MCB-1,110,501.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate Life Technologies PV3579
Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide Life Technologies  F-150 Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide Life Technologies  A-10254 Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide Life Technologies  A-20346 Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide Life Technologies  A-10256 Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide Life Technologies  A-20344 Choice of acceptor depends on the specific experiment
QuantaMaster 3-SS Photon Technology International Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the millisecond range
FluoreScan 2.0 Photon Technology International Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument
Origin 8.6 OriginLab Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software
Quartz cuvette Starna Cells, Inc 3-Q-10
Stir bar  Bel-Art Products F37119-0007 Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Selvin, P. R. Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).
  2. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).
  3. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  4. Selvin, P. R., Hearst, J. E. Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).
  5. Chen, J., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium. Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).
  6. Ge, P., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2. Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).
  7. Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor. Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).
  8. Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel. J. Bio. Chem. 288, (2013).
  9. Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor. The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).
  10. Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).
  11. Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors. Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics