Luminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त झिल्ली प्रोटीन में गठनात्मक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए स्थानांतरण

Bioengineering

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Summary

हम यहाँ हम दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोफोरे साइटों के बीच एक प्रोटीज दरार साइट परिचय जहां एक बेहतर Luminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (LRET) विधि का वर्णन. इस संशोधन हमें प्रोटीन शुद्धि के बिना झिल्ली प्रोटीन के अध्ययन के लिए अनुमति ब्याज की झिल्ली प्रोटीन, से उत्पन्न होने वाली विशिष्ट LRET संकेतों को प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है.

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Dolino, D. M., Ramaswamy, S. S., Jayaraman, V. Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (91), e51895, doi:10.3791/51895 (2014).

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Abstract

Luminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण, या LRET, 10-100 ए की दूरी सीमा के भीतर प्रोटीन में दो साइटों के बीच दूरी को मापने के लिए इस्तेमाल किया एक शक्तिशाली तकनीक है. विभिन्न ligated परिस्थितियों में दूरी को मापने के द्वारा, प्रोटीन के गठनात्मक परिवर्तन आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता. LRET, एक lanthanide, सबसे अधिक बार chelated टर्बियम के साथ, इस तरह के एक लंबी दाता केवल उत्सर्जन जीवनकाल, कई स्वीकर्ता fluorophores उपयोग करने के लिए लचीलापन, और एक आसान तरीके के रूप में अवगत स्वीकर्ता उत्सर्जन का पता लगाने के लिए अवसर के रूप में लाभ affording, दाता फ्लोरोफोरे के रूप में प्रयोग किया जाता है भी दाता ही संकेत का पता लगाने के जोखिम के बिना ऊर्जा हस्तांतरण को मापने के लिए. यहाँ, हम झिल्ली प्रोटीन व्यक्त की और बरकरार स्तनधारी कोशिकाओं की सतह पर assayed पर LRET उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन. हम LRET फ्लोरोफोरे जोड़ी के बीच एक प्रोटीज दरार साइट परिचय. मूल LRET संकेत प्राप्त करने के बाद, उस साइट पर दरार के प्रोटीन से विशिष्ट LRET संकेत को हटाहमें मात्रात्मक दरार के बाद बनी हुई है कि पृष्ठभूमि संकेत घटाना करने की अनुमति ब्याज. इस विधि अधिक physiologically प्रासंगिक माप प्रोटीन की शुद्धि के लिए आवश्यकता के बिना किए जाने के लिए अनुमति देता है.

Introduction

Luminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (LRET) प्रसिद्ध प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) तकनीक 1 के व्युत्पन्न है. झल्लाहट के लिए इसी प्रकार, LRET 10-100 एक 1-3 की सीमा के भीतर ब्याज की प्रोटीन पर विशिष्ट साइटों से जुड़ी दाता और स्वीकर्ता fluorophores के बीच दूरी और दूरी परिवर्तनों को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. LRET के सिद्धांतों दाता फ्लोरोफोरे के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम स्वीकर्ता की fluorophore अवशोषण स्पेक्ट्रम के साथ ओवरलैप जब दो समीपस्थ fluorophores के बीच होता भी है कि प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण में झल्लाहट करने के लिए समान हैं. इस स्थानांतरण की दक्षता निम्नलिखित समीकरण द्वारा दो fluorophores के बीच की दूरी से संबंधित है:

समीकरण 1 Eq. 1

अनुसंधान दो fluorophores के बीच की दूरी है, जहां ई एन की दक्षता हैनीचे चर्चा ऊर्जा हस्तांतरण, और आर 0,, स्थानांतरण की दक्षता आधा अधिक से अधिक है, जिस पर दूरी यानी फ्लोरोफोरे जोड़ी के लिए फोर्स्टर त्रिज्या है. इस समीकरण से, एक कि दक्षता उलटा छठी शक्ति 1 के लिए उठाया दूरी की भयावहता से संबंधित है देख सकते हैं. यह जब झल्लाहट जोड़ी के आर 0 के पास भी छोटी दूरी परिवर्तन करने के लिए उत्कृष्ट संवेदनशील होने की झल्लाहट और LRET माप के लिए अनुमति देता है कि यह उलटा छठे सत्ता निर्भरता है. विशेष रूप से प्रोटीन या अन्य अणुओं पर वांछित साइटों लेबल करने की क्षमता एक गठनात्मक परिवर्तन की निगरानी करने के लिए इस संवेदनशीलता का लाभ लेने के लिए अनुमति देता है.

परंपरागत जैविक डाई अणुओं का उपयोग करता है जो झल्लाहट, की तुलना में, LRET अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है. LRET में, बजाय दाता फ्लोरोफोरे, एक lanthanide श्रृंखला कटियन, आमतौर पर टीबी 3 + या यूरोपीय संघ 3 + के रूप में एक कार्बनिक डाई का उपयोग कर के, 1,4-6 प्रयोग किया जाता है. यू गिर कि fluorophoresnder इस श्रेणी, जैसे, टर्बियम chelate, यह भी कहा कि वे स्वीकर्ता fluorophores की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ प्रयोग किया जा सकता है में बहुत बहुमुखी हैं. Chelated lanthanides का उत्सर्जन स्पेक्ट्रा कई तेज उत्सर्जन चोटियों होते हैं क्योंकि यह लचीलापन स्वीकर्ता fluorophores की एक विस्तृत विविधता का एक साथ इस्तेमाल किया जा दाता फ्लोरोफोरे की एक प्रजाति के लिए अनुमति देता है, संभव बनाया है. इस प्रकार, अवगत स्वीकर्ता उत्सर्जन दाता उत्सर्जन 5 से खून के माध्यम से contaminating के बिना किसी डर पाया जा सकता है. प्रयोगकर्ता दो fluorophores (चित्रा 1 और 1 टेबल) के बीच होने की उम्मीद दूरी के आधार पर विशिष्ट स्वीकर्ता का चयन करता है. इन chelated lanthanide fluorophores में, धातु आयन macromolecule 1 पर एक विशिष्ट कार्यात्मक समूह के लिए आयन तार को एक bioreactive कार्यात्मक समूह के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उत्तेजना के लिए सामान्य रूप से खराब अवशोषित lanthanide sensitizes कि एक एंटीना समूह है जिसमें एक अणु से chelated है, 5,6. ONCउत्साहित ई, lanthanides millisecond रेंज में एक क्षय दर के साथ फोटॉनों की रिहाई के माध्यम से जमीन राज्य के लिए आराम करो. क्षय एक स्वेटर करने वाली स्वेटर छूट न ही एक triplet करने वाली स्वेटर छूट जाता है, क्योंकि फोटॉनों का उत्सर्जन ठीक से प्रतिदीप्ति या स्फुरदीप्ति नहीं कहा जा सकता, लेकिन अधिक ठीक से luminescence 1 करार दिया है. lanthanide luminescence के लंबे क्षय बहुत जीवनकाल माप में मदद करता है. लाइफटाइम माप तो निम्नलिखित संबंध के माध्यम से दक्षता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है:

2 समीकरण Eq. 2

जहां, ई स्थानांतरण की क्षमता है, τ डी ऊर्जा हस्तांतरण में भाग नहीं जब दाता (chelated lanthanide) के जीवनकाल है, और स्वीकर्ता के साथ ऊर्जा हस्तांतरण में भाग लेने जब ​​τ डीए दाता के जीवनकाल है. LRET साथ, τ डीए अल कर सकते हैंटर्बियम के जीवन इतना अधिक से अधिक एक कार्बनिक स्वीकर्ता फ्लोरोफोरे से है क्योंकि इतनी अवगत स्वीकर्ता उत्सर्जन के जीवनकाल के रूप में मापा जाना. स्वीकर्ता अपनी उकसाने उत्तेजना (दाता lanthanide) के रूप में ही जीवन भर के साथ उत्सर्जन करता है, और स्वीकर्ता की अपनी आंतरिक प्रतिदीप्ति जीवनकाल से जीवन भर के लिए कोई योगदान अपेक्षाकृत नगण्य है. स्वीकर्ता को दाता की: 1 के अनुपात बल्कि दाता उत्सर्जन से अवगत उत्सर्जन को मापने के द्वारा, हम भी बिल्कुल एक 1 पर लेबलिंग सुनिश्चित करने की आवश्यकता को समाप्त. प्रोटीन के बजाय स्वीकर्ता और दाता fluorophores दोनों के साथ एक साथ लेबल किया जा सकता. एक विभिन्नतापूर्वक लेबल आबादी परिणाम होगा, लेकिन डबल दाता लेबल प्रोटीन स्वीकर्ता तरंग दैर्ध्य में उत्सर्जन नहीं होगा और डबल स्वीकर्ता लेबल प्रोटीन उत्साहित नहीं होगा. इसके अलावा, fluorophores के बीच की दूरी की परवाह किए बिना एक दाता के रूप में isotropic lanthanides का उपयोग विशेष रूप से जब एक दिया फ्लोरोफोरे, करने के लिए देता है, जो सिस्टीन साइट की, एक ही हो, तो nee चाहिएडी दाता या स्वीकर्ता या तो अनावश्यक है प्राप्त करने के लिए किसी साइट को निर्दिष्ट करने के लिए. तीव्रता एक विषम आबादी के साथ प्रभावित हो सकता है, लेकिन अभी भी पता लगाया जा करने के लिए पर्याप्त से अधिक होना चाहिए.

प्रयोगों की योजना बना, fluorophores के चुनाव जोड़ी के आर 0 मूल्य के साथ ही उम्मीद दूरी रेंज से तय किया जाना चाहिए मापा जा रहा है. आर 0 मान निम्न समीकरण द्वारा परिभाषित किया गया है:

3 समीकरण Eq. 3

जहां, आर 0 Angstroms में फोर्स्टर त्रिज्या है, 2 κ (आमतौर पर 2/3 माना) दो रंगों के बीच अभिविन्यास कारक है, φ डी दाता की मात्रा उपज है, जम्मू दाता के बीच अभिन्न वर्णक्रमीय ओवरलैप है एम में उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और स्वीकर्ता के absorbance स्पेक्ट्रम - 1सेमी -1 एनएम 4, और एन मध्यम 1 का अपवर्तनांक है.

हमारी प्रयोगशाला की जांच की जा रही प्रोटीन पर दाता और स्वीकर्ता लेबल साइटों के बीच एक प्रोटीज मान्यता साइट शुरू करने से पारंपरिक LRET तकनीक के लिए एक संशोधन जोड़ा गया है. यह संशोधन ऐसे पूरे स्तनधारी कोशिकाओं के रूप में 7 गैर शुद्ध सिस्टम में जांच के लिए अनुमति देता है. Cysteines भी चिह्नित कर रहे है कि कोशिकाओं पर सिस्टीन sulfhydryl समूहों, अन्य प्रोटीन के लिए बाध्य है कि maleimide संयुग्मित रंगों के साथ लेबलिंग की प्रक्रिया में है, क्योंकि लेबलिंग के लिए साइटों के रूप में cysteines का उपयोग करते समय इस तकनीक को विशेष रूप से उपयोगी है. हालांकि, ब्याज की प्रोटीन पर प्रोटीज दरार साइटों सहित और पहले और दरार के बाद जन्मों को मापने के द्वारा, प्रयोगकर्ता मात्रात्मक कच्चे संकेत से प्रोटीज दरार के बाद पृष्ठभूमि संकेत घटाना कर सकते हैं. इस घटाव (छवि ब्याज की प्रोटीन से उत्पन्न होने वाली विशिष्ट संकेत आइसोलेट्सure 2). ऊपर वर्णित संशोधन का प्रयोग, LRET टर्बियम chelate दाता और एक प्रोटीन पर स्वीकर्ता जांच के बीच दूरी बदलाव को मापने, और इस प्रकार शोधन के लिए आवश्यकता के बिना प्रोटीन के पास शारीरिक स्थिति में गठनात्मक परिवर्तन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1.The अवशोषण और काले रंग में chelated टर्बियम, साथ ही लाल रंग में एक प्रतिनिधि स्वीकर्ता, एलेक्सा 488, के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा. कई उत्सर्जन चोटियों और टर्बियम chelate की प्रत्येक चोटी के लिए तेज, संकीर्ण उत्सर्जन सीमा पर ध्यान दें. यह पैटर्न टर्बियम स्वीकर्ता fluorophores की एक किस्म के साथ प्रयोग किया जा करने के लिए अनुमति देता है और टर्बियम कोई उत्सर्जन से पता चलता है जहां उन सीमाओं के भीतर अवगत उत्सर्जन की माप की सुविधा. एक साथ बहुत अच्छी तरह से ओवरलैप एनएम 486 पर टर्बियम के उत्सर्जन शिखर दो fluorophores के बीच होने की प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण के लिए अनुमति एलेक्सा 488 के bsorption शिखर,. 515 एनएम के तरंग दैर्ध्य यह टर्बियम उत्सर्जन चोटियों के बीच घाटी में है, और काफी 520 एनएम का एलेक्सा 488 के उत्सर्जन चोटी के पास के रूप में इस जोड़ी के लिए अवगत उत्सर्जन का पता लगाने के लिए एक शानदार विकल्प है. स्वीकर्ता चोटी के पास जा रहा है, वांछनीय है, हालांकि नहीं है आवश्यक-565 एनएम अभी भी टर्बियम उत्सर्जन का पता लगाने के बिना एलेक्सा 488 उत्सर्जन का पता लगाने में सक्षम है कि ध्यान दें.

3px, "> 508 Cy3
अपनाने Fluorophore आर 0 (क) उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (एनएम)
ATTO 465 36
Fluorescein 45 515
एलेक्सा 488 46 515
एलेक्सा 680 52 700
एलेक्सा 594 53 630
एलेक्सा 555 65 565
65 575

तालिका 1 LRET दाता के रूप में 11 टर्बियम chelate प्रयोग करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया स्वीकर्ता fluorophores की एक सूची. दाता और स्वीकर्ता AMPA रिसेप्टर्स के घुलनशील एगोनिस्ट बाध्यकारी डोमेन से जुड़े थे जब आर 0 मूल्यों मापा गया. यह हर नई प्रणाली का अध्ययन किया जा रहा है के लिए फिर से आर 0 मूल्य को मापने के लिए आदर्श है.

चित्रा 2
चित्रा 2 प्रस्तुत LRET विधि का अवलोकन. (ए) AMPA रिसेप्टर ligand बाध्यकारी पर गठनात्मक परिवर्तन आए जो एक झिल्ली प्रोटीन है. सीपी के आकार ligand बीआईnding डोमेन लाल में यहां की परिक्रमा कर रहा है. (बी) प्रोटीन के लिए बाध्य नहीं है जब AMPA की ligand बाध्यकारी डोमेन एक खुली रचना (बाएं) में मौजूद है. ग्लूटामेट ligand करने के लिए बाध्य करते हैं, तो प्रोटीन अपने ligand (दाएं) के आसपास बंद कर देता है. LBD पर प्रमाण स्थलों पर fluorophores रखने से, इस गठनात्मक परिवर्तन की प्रकृति तो प्रतिदीप्ति जीवनकाल को प्रभावित करेगा जो fluorophores परिवर्तन, के बीच की दूरी के रूप में देखा जा सकता है. (सी) लेबलिंग पूरे कोशिकाओं, ब्याज की प्रोटीन के साथ ही पृष्ठभूमि झिल्ली प्रोटीन दोनों की लेबलिंग (बाएं) हो सकता है. प्रोटीज दरार के बाद, ब्याज की प्रोटीन से LRET संकेत पृष्ठभूमि संकेत बरकरार (दाएं) छोड़ने की वजह से एक घुलनशील टुकड़ा की रिहाई के लिए गायब हो जाएगा. इस पृष्ठभूमि संकेत तो कच्चे संकेत से घटाया जा सकता है.

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Protocol

1 ब्याज की प्रोटीन युक्त कंस्ट्रक्शन बनाएँ

एक उपयुक्त वेक्टर में ब्याज की प्रोटीन व्यक्त जीन क्लोन. ऐसे pcDNA श्रृंखला या pRK5 के रूप में प्रयोग करें वैक्टर वे HEK293 और चो कोशिकाओं की तरह स्तनधारी प्रणाली में अभिव्यक्ति के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं.

Fluorophores साथ टैग किया जाना प्रोटीन पर साइटों का चयन 2

  1. प्रोटीन के भीतर संभव गठनात्मक परिवर्तन को प्रतिबिंबित करने में सक्षम हैं कि लेबलिंग साइटों चुनें. यदि संभव हो तो, यह दृढ़ संकल्प बनाने में मदद करने के लिए प्रोटीन की या एक मुताबिक़ प्रोटीन की एक क्रिस्टल संरचना का उपयोग करें. कोई क्रिस्टल संरचना उपलब्ध नहीं है, तो प्रोटीन के संभावित संरचना भविष्यवाणी और इसलिए उचित साइटों में जानकारी प्राप्त करने के लिए ऑनलाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें.
  2. प्रोटीन लेबल किया जा सकता है, ताकि चयनित अवशेषों के पक्ष श्रृंखला सतह उजागर और fluorophores के लिए पहुंच रहे हैं कि इस तरह के अवशेषों चुनें.
    1. अवशेष चुनें किबाध्यकारी ligand में शामिल नहीं कर रहे हैं कि उदाहरण साइटों के लिए, प्रोटीन समारोह के लिए महत्वपूर्ण नहीं हैं.
    2. सिस्टीन उत्परिवर्तन शुरू में, प्रोटीन संरचना के लिए कम से कम गड़बड़ी का कारण होगा कि उदाहरण सेरीन के लिए, इसी तरह के हैं कि साइटों, को वरीयता देते हैं.
    3. लेबलिंग साइटों को चुनने के बाद, प्रोटीन केवल इन इरादा साइटों से LRET देता है कि यह सुनिश्चित करने के म्यूटेशन बनाने. दूर संभावित फ्लोरोसेंट टैग संयुग्मित maleimide करने के लिए बाध्य कर सकता है कि गैर डाइसल्फ़ाइड बंधुआ cysteines रूप बदलना मानक साइट निर्देशित mutagenesis के प्रोटोकॉल का प्रयोग करें. वे प्रोटीन की तह रूप में फ्लोरोसेंट रंगों के साथ प्रतिक्रिया नहीं करनी चाहिए क्योंकि दूर डाइसल्फ़ाइड बंधुआ cysteines और दफन, मुफ्त cysteines रूप बदलना न करें.
  3. मानक साइट निर्देशित mutagenesis के प्रोटोकॉल का उपयोग बिंदु उत्परिवर्तन बनाकर वांछित साइटों में सिस्टीन अवशेषों का परिचय.
  4. विशेष रूप से प्रोटीन से cysteines से एक बंद फोड़ना कर सकते हैं कि एक प्रोटीज दरार साइट को शामिल करें. यदियह परंपरागत ढंग (मान्यता अनुक्रम LVPRGS) या एक थ्रोम्बिन है करने के लिए प्रोटीन परिवर्तनशील द्वारा साइट परिचय के लिए प्रोटीन अनुक्रम अनुमति देता कारक Xa (मान्यता अनुक्रम IDGR या IEGR) शुरू की सिस्टीन पास अनुक्रम और दरार प्रोटीज को सुलभ; अन्यथा tetra- या hexa पेप्टाइड अनुक्रम एक पूरे के रूप में सम्मिलित किया जा सकता है. दरार पर पेश cysteines में से एक के बाकी हिस्सों से विघटित कि इस तरह की साइट चुनें प्रोटीन में कुछ मामलों में, यह एक उत्परिवर्तित सिस्टीन flanking दो दरार साइटों आवश्यकता हो सकती है.

3 टेस्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति और कार्यक्षमता

  1. उत्परिवर्तित प्रोटीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि के लिए एक पश्चिमी धब्बा प्रदर्शन करना.
  2. सभी में, एक बेकार प्रोटीन के गठनात्मक परिवर्तन का अध्ययन कर से बचने के लिए अगर, म्यूटेशन केवल न्यूनतम प्रोटीन समारोह बदल दिया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रोटीन की एक कार्यात्मक परख प्रदर्शन.
    नोट: सभी प्रोटीन विभिन्न कार्यों है, कोई भी च है LRET के लिए विशेष रूप से प्रयोग किया जाता है कि unctional परख; हालांकि, कार्यात्मक assays के कुछ उदाहरण आयन चैनल के लिए एंजाइमों के लिए एंजाइम गतिविधि assays, रिसेप्टर्स के लिए ligand बाध्यकारी assays, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन में शामिल हैं.

4 इस्तेमाल किया जा fluorophores का चयन करें

उम्मीद की दूरी रेंज के आधार पर चयन fluorophores रेंज 0.5-1x बीच फ्लोरोफोरे जोड़ी के आर 0 है कि ऐसे मापा जा रहा है.
नोट: यह आम तौर पर बहुत लंबे समय तक जीवन काल है जो पृष्ठभूमि, का एक आसान घटाव के लिए अनुमति देता है. इस जोड़ी के लिए आर 0 53 ए (1 टेबल) है क्योंकि उदाहरण के लिए, उम्मीद दूरी रेंज मापा जा रहा है तो लगभग 35 ए, दाता और स्वीकर्ता के रूप में एलेक्सा 594 के रूप में टर्बियम chelate होगा उपयोग करने के लिए एक उपयुक्त फ्लोरोफोरे जोड़ी है.

क्षणिक स्तनधारी कोशिकाओं के लिए आवश्यक राशि transfecting द्वारा प्रोटीन व्यक्त 5

ntent "> क्षणिक आम अभिकर्मक अभिकर्मकों के किसी भी उपयोग के लिए चुना स्तनधारी कोशिकाओं में ब्याज की प्रोटीन transfect आमतौर पर, HEK और चो सेल लाइनों के लिए LRET प्रयोग प्रति चार 10 सेमी बर्तन का उपयोग करें;. हालांकि, इस राशि प्रोटीन अभिव्यक्ति के आधार पर भिन्न हो सकते हैं , स्थिरता, आदि. कोशिकाओं कटाई से पहले 36-48 घंटे के लिए प्रोटीन व्यक्त करने की अनुमति दें.

6 प्रोटीन लेबल

  1. संस्कृति पकवान से कोशिकाओं को अलग. बस डिश के नीचे के खिलाफ बफर pipetting द्वारा HEK कोशिकाओं को अलग करें. कोशिकी बफर के साथ मीडिया से दूर धोने, एक सेल खुरचनी के साथ चो कोशिकाओं को अलग करें.
  2. 3 मिनट के लिए 1100 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा. बाद washes के बाद, साथ ही लेबलिंग के बाद कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ही इन अपकेंद्रित्र सेटिंग्स का उपयोग करें.
  3. तो 100-300 एनएम के अंतिम एकाग्रता के लिए ऊपर equimolar मात्रा में दाता और स्वीकर्ता fluorophores जोड़ने, कोशिकी बफर के 3 मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित. एक रोटेटर च पर सेतेया आरटी पर 1 घंटा.
  4. तो, अबाध fluorophores हटाने LRET माप के लिए बाह्य बफर (आमतौर पर 2 मिलीलीटर) में इन कोशिकाओं को निलंबित करने कोशिकी बफर साथ 3-4x इन लेबल की कोशिकाओं को धो लें.
  5. एक नियंत्रण के रूप में, किसी भी स्वीकर्ता फ्लोरोफोरे के अलावा बिना ही दाता फ्लोरोफोरे (टर्बियम chelate) के साथ कोशिकाओं का एक अलग सेट लेबल.
    नोट: ये दाता ही प्रयोगों से डेटा विश्लेषण पूरा करने के लिए आवश्यक है. इन प्रयोगों में एक ही या अलग अलग दिनों पर किया जा सकता है.
  6. लेबलिंग प्रक्रिया भी समारोह लेबलिंग के लिए इस्तेमाल की साइट पर निर्भर करता है के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के रूप में फिर, कार्यात्मक सत्यापन, लेबल उत्परिवर्ती प्रोटीन के साथ इस बार प्रदर्शन करते हैं.
    नोट: इन प्रयोगों में एक ही या अलग अलग दिनों पर किया जा सकता है.

7 LRET प्रयोग सेट

  1. 1 मिलीलीटर की एक न्यूनतम मात्रा के साथ एक क्वार्ट्ज क्युवेट में resuspended कोशिकाओं रखें.
  2. कंप्यूटर और साधन पर मुड़ें और डैट के मापदंडों को समायोजिततदनुसार एक अधिग्रहण कार्यक्रम.
    1. (टर्बियम chelate के लिए अच्छी तरह से काम करता है एनएम 330-340) दाता फ्लोरोफोरे के absorbance श्रृंखला के लिए उत्तेजना तरंगदैर्ध्य निर्धारित करें.
    2. स्वीकर्ता उत्सर्जन इस्तेमाल किया स्वीकर्ता के आधार पर भिन्न होता है कि ध्यान में रखते हुए उचित उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य निर्धारित करें. महत्वपूर्ण बात है, केवल स्वीकर्ता उत्सर्जन उपायों और किसी भी खून के माध्यम से दाता के उत्सर्जन से शामिल नहीं है कि एक का पता लगाने के तरंगदैर्ध्य चयन करें. उदाहरण के लिए, एक स्वीकर्ता 1 टेबल के रूप में एलेक्सा 555 के लिए 565 एनएम के तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें. प्रोटीन ही दाता के साथ लेकिन स्वीकर्ता बिना चिह्नित किया गया जिसमें दाता ही माप के लिए, टर्बियम chelate उत्सर्जन को मापने के लिए 545 एनएम के तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें.
    3. उत्सर्जन का पता लगाने की लंबाई एक लंबे जीवनकाल घटक याद नहीं किया जाएगा कि यह सुनिश्चित करने के लिए कम से कम तीन बार उम्मीद की LRET जीवन भर होने को तैयार.
  3. स्कैन प्रदर्शन. 99 sweeps के कम से कम तीन स्कैन के परिणाम की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए करते हैं. वें सहेजेंएक पाठ फ़ाइल (* txt) के रूप में ई का परिणाम है.
  4. (जैसे एक ligand के अतिरिक्त के रूप में) अलग अलग परिस्थितियों के संबंध में एक प्रोटीन के गठनात्मक परिवर्तन को मापने के लिए, उन स्थितियों को बदलने और फिर से इस नई शर्त के तहत एक ही नमूना पर 99 sweeps प्रत्येक के कम से कम तीन स्कैन प्रदर्शन. ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की रचना पर ग्लूटामेट के प्रभावों का अध्ययन करते हैं, उदाहरण के लिए, कदम 7.3 में स्कैन एक ही नमूना के लिए 1 मिमी ग्लूटामेट जोड़ने, और उसके बाद फिर से स्कैन.
  5. उचित प्रोटीज की पाँच इकाइयों को जोड़ें और दरार पूरा हो गया है और आगे कोई परिवर्तन लगातार तीन स्कैन के लिए जीवन भर में देखा जाता है जब तक लगातार स्कैन ले. आमतौर पर, दरार दो से 3 घंटे में पूरा हो गया है. एक कारक Xa दरार साइट प्रोटीज दरार के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, उदाहरण के लिए, नमूना कारक Xa के 3 μl जोड़ने के लिए, और 3 घंटे के लिए हर 30 मिनट स्कैन.

8 प्राप्त आंकड़ों का विश्लेषण करें

  1. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें.
  2. प्रतिदीप्ति जीवनकाल लोडपाठ फ़ाइलों को खोलने के लिए आयात ASCII का उपयोग करके डेटा. एक फ़ाइल में सभी प्रतिकृति के साथ ही अंतिम पृष्ठभूमि माप, लोड.
  3. अंतिम डेटा प्राप्त करने के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए सभी स्कैन से डेटा औसत. व्यक्तिगत परीक्षणों को शामिल स्तंभों पर प्रकाश डाला, ऐसा करने के लिए, तो मेनू पट्टी में डेटा मेनू के तहत, परीक्षणों से औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता, साथ ही मानक विचलन और मानक त्रुटि प्रदर्शित करने के लिए पंक्तियों पर सांख्यिकी पर क्लिक करें.
  4. स्वीकर्ता के अवगत उत्सर्जन के जीवनकाल का प्रतिनिधित्व करता है कि एक वक्र बनाने के लिए एक्स अक्ष पर microseconds में शाफ़्ट और जीवनकाल पर प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ एक लाइन ग्राफ के रूप में औसत मूल्यों प्लॉट. डेटा के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए, एक लॉग पैमाने पर करने की साजिश का शाफ़्ट बदलें.
  5. पूरा दरार का संकेत ओवरलैप बताते हैं कि अंतिम स्कैन औसतन पृष्ठभूमि माप डेटा पर दोहराएँ कदम 8.3,.
  6. पर इसका मतलब पृष्ठभूमि डेटा प्रदर्शितऔसतन कच्चे डेटा है कि एक ही साजिश है. ऐसा करने के लिए, प्लॉट मेनू के नीचे पाया परत नियंत्रण संवाद बॉक्स खोलें. तो, इसका मतलब यह परत सामग्री की सूची में पृष्ठभूमि वाले डाटा हस्तांतरण.
  7. मतलब कच्चे डेटा मतलब पृष्ठभूमि डेटा संरेखित करें. ऐसा करने के लिए, गुणा या पृष्ठभूमि की पूंछ अंत कच्चे डेटा की पूंछ अंत के साथ ओवरलैप जब तक जरूरत के रूप में पृष्ठभूमि डेटा को विभाजित करने के लिए गणित मेनू के तहत सरल गणित समारोह का उपयोग करें.
    नोट: इस पूंछ के अंत में, ब्याज की प्रोटीन से जीवन भर पहले से ही पूरी तरह से दूर सड़ा हुआ होना चाहिए था; क्या गठबंधन किया है और इससे पहले प्रोटीज दरार के बाद दोनों बस पृष्ठभूमि संकेत मौजूद है.
  8. फिर सरल गणित समारोह का उपयोग कर, प्रारंभिक कच्चे LRET संकेत से गठबंधन पृष्ठभूमि संकेत घटाना.
  9. एक घातीय क्षय करने के लिए डेटा फिट (एक या कई exponentials, साइटों और प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है).
    1. अंत के बाद शुरू करने के लिए फिटिंग के लिए शुरू सीमा निर्धारितलेजर पल्स की. बाद के सभी वक्र फिटिंग के लिए यह एक ही startpoint का प्रयोग करें.
    2. एक एकल घातीय क्षय के लिए निम्नलिखित समीकरण को जीवन भर के लिए फिट करने के लिए इतनी के रूप में चयन फिटिंग समारोह संवाद बॉक्स में, घातीय क्षय का चयन करें:
      समीकरण 4 Eq. 4
      , वाई प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है, जहां वाई 0 एक्स समय है, टी प्रतिदीप्ति जीवनकाल है, एक 1 संकेत तीव्रता है, कारण प्रणाली से शोर करने के लिए पृष्ठभूमि तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है, और एक्स 0 ऑफसेट समय है.
    3. , एक्स 0-0 फिक्स फिटिंग समारोह शुरू, और डेटा फिट.
      नोट: प्रयोग केवल उन साइटों में से एक जोड़ी से संकेत करने के लिए बनाया गया है, तो परिणामी डेटा को आसानी से एक घातीय क्षय 8 से फिट होना चाहिए. फिट के अवशिष्ट फिट की अच्छाई निर्धारित करने के लिए एक अच्छा तरीका है और अतिरिक्त क्षय जन्मों requir रहे हैंएड.
  10. फोर्स्टर समीकरण (समीकरण 1 और 2 से ऊपर के एक पुनर्व्यवस्था) का उपयोग fluorophores के बीच दूरी की गणना करने के लिए डेटा से प्राप्त जन्मों का उपयोग करें:
    5 समीकरण Eq. 5
    नोट: τ डीए अवगत स्वीकर्ता उत्सर्जन जीवनकाल के रूप में मापा गया होने के साथ के रूप में उपरोक्त सभी चर रहे हैं. आर 0 और आर के माप पर अधिक जानकारी और उदाहरण कहीं और 7,9,10 पाया जा सकता है.
  11. Reproducibility सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग और डेटा विश्लेषण कम से कम तीन बार दोहराएँ. एक ही माप की व्यक्तिगत repetitions के बीच असंगति प्रश्न में डेटा की वैधता कॉल; अतिरिक्त नियंत्रण प्रयोगों या repetitions का उपयोग करें. में त्रुटि प्रसारित कि (डॉ थॉमस ह्यूबर द्वारा विकसित) मुक्त गुस्तावस त्रुटि विश्लेषण कैलकुलेटर या इसी तरह की एक प्रणाली का उपयोग माप में त्रुटियों की गणनाजीवन भर के फिट बैठता है.

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Representative Results

एक lanthanide दाता के साथ एक सफल LRET माप मिलीसेकंड समय सीमा में ही जीवन भर एक दाता होना चाहिए. दाता और स्वीकर्ता दोनों के साथ लेबल प्रोटीन के लिए अवगत LRET उत्सर्जन के जीवनकाल. पृष्ठभूमि घटाव चित्रा 3 के बाद microsecond रेंज में एक जीवन भर के साथ, विशेष रूप से कम हो (समय पर स्थिर हो जाना चाहिए कि जीवन में वृद्धि में दरार परिणाम प्रोटीज जाएगा यानी अब कोई प्रोटीज दरार पूरा चित्रा 4 दिखा रहा है कि,) बदल रहा है. LRET संकेत साइटों का केवल एक सेट से आता है, पृष्ठभूमि के घटाव के बाद परिणामस्वरूप उत्सर्जन जीवन भर एक एकल घातीय जीवन भर देना चाहिए.

गठनात्मक परिवर्तन को मापने जब, विशिष्ट LRET संकेत माप चित्रा 3 की त्रुटि के बाहर जीवन में एक परिवर्तन दिखाना चाहिए. माप की त्रुटि त्रुटि के प्रसार से गणना की जा सकतीजन्मों के फिट के साथ जुड़ा हुआ है. समीकरण 4, जीवन भर, τ में वर्णित घातीय क्षय कार्यों की न्यूनतम संख्या के लिए डेटा ढाले के बाद, निर्धारित किया जा सकता है. LRET जोड़ी परीक्षण परिस्थितियों में दो fluorophores के बीच दूरी की गणना करने के लिए 5 समीकरण का उपयोग करना, दाता स्वीकर्ता और दाता ही जन्मों आर 0 मूल्य के साथ प्रयोग किया जा सकता है. प्रोटीन के समग्र संरचना और कार्य करने के लिए इन स्थितियों को बदलने से उत्पन्न दूरी परिवर्तन से संबंधित अब प्रयोगकर्ता का काम है.

चित्रा 3
एसिड संवेदन आयन चैनल 1 ए (ASIC1a) की चित्रा 3 LRET माप. प्रतिदीप्ति तीव्रता दृश्य व्याख्या की आसानी सुधार करने के लिए एक लघुगणकीय पैमाने पर साजिश रची गई है. (क) दाता केवल नमूने एक एकल exponentia दिखानेपीएच के साथ नहीं बदलता है कि एल क्षय. दाता स्वीकर्ता लेबल नमूने (ख), अवगत उत्सर्जन के जीवनकाल में कमी (लाल को काला) 8-6 पीएच में कमी पर देखा जाता है. इस जीवन कमी ASIC1a की उंगली और अंगूठे डोमेन के बीच की दूरी में कमी को दर्शाता है. यह आंकड़ा रामास्वामी, एट अल, 2013 8 से संशोधित किया गया है.

चित्रा 4
चित्रा 4 एसिड सेंसिंग आयन चैनल 1 ए (ASIC1a) पर बनाया LRET माप पर पृष्ठभूमि घटाव का प्रभाव. साइटों विशेष रूप से एक प्रोटीज दरार साइट से अलग हो रहे हैं fluorophores द्वारा चिह्नित किया जाना है. LRET माप बना रहे हैं, के बाद प्रोटीज विशिष्ट संकेत का नुकसान में प्रोटीन नमूना और ब्याज परिणामों की प्रोटीन के बाद दरार को पेश किया है. रहता है कि किसी भी LRETअन्य झिल्ली प्रोटीन पर मौजूद अन्य cysteines के लिए बाध्य fluorophores से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति है. इस पृष्ठभूमि घटाकर ब्याज की प्रोटीन के लिए सच LRET डेटा आइसोलेट्स. यह आंकड़ा रामास्वामी, एट अल, 2013 8 से संशोधित किया गया है.

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Discussion

LRET वैज्ञानिकों ने एक ही प्रोटीन के भीतर और साथ ही एक multimeric प्रोटीन में सब यूनिटों के बीच डोमेन के बीच दूरी को मापने के लिए अनुमति देता है कि एक शक्तिशाली तकनीक है. जैसे, LRET प्रोटीन या अन्य अणुओं के गठनात्मक परिवर्तन और गतिशीलता की जांच करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है. ऊपर प्रोटोकॉल आसानी से उनकी परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए ठीक से सुसज्जित प्रयोगशाला की अनुमति चाहिए; हालांकि, नई अन्वेषक प्लेग हो सकता है कि त्रुटि के कई आम स्रोत हैं. कम या कोई LRET संकेत देखा जाता है, तो पहली बार इस्तेमाल किया तरंगदैर्ध्य सेटिंग्स की जाँच करें. उत्तेजना टर्बियम (330-340 एनएम) के absorbance सीमा में होना चाहिए. दाता स्वीकर्ता माप के लिए, उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य स्वीकर्ता फ्लोरोफोरे मैच चाहिए जबकि नमूना ही दाता फ्लोरोफोरे साथ और स्वीकर्ता fluorophore बिना चिह्नित किया गया है, जिसमें दाता ही माप के लिए, उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य, चित्र 1 में दिखाया चोटियों में से एक में होना चाहिए तालिका 1 में इस्तेमाल किया जा रहा है. wavele हैंngth सेटिंग्स सही हैं, बफ़र्स की अनुकूलता की जांच. कुछ fluorophores कुछ buffers के साथ या कुछ पीएच पर्वतमाला में संगत नहीं हो सकता है. इसके बाद, अवशेष और fluorophores के चुनाव संगत कर रहे हैं कि सुनिश्चित करते हैं. प्रयोगात्मक डिजाइन पूरी तरह से सही है, तो फिर समस्या होने की संभावना fluorophores या प्रोटीन के साथ ही या तो निहित है. समय के साथ, fluorophores के शेयर समाधान नीचा हो सकता है और अपर्याप्त लेबलिंग में हो सकता है. अंत में, प्रोटीन की अभिव्यक्ति और कार्यक्षमता की जाँच करें. कई परिवर्तन cysteines की शुरूआत, देशी cysteines को हटाने, और कम से कम एक प्रोटीज दरार साइट की शुरूआत सहित जोड़ दिया गया है. इस प्रकार, यह भी सामान्य अभिकर्मक शर्तों के तहत शुरू की म्यूटेशन देखा संकेत को कम करने, के तहत अभिव्यक्ति ब्याज की प्रोटीन की प्रोटीन और कारण को अस्थिर, कि संभव है. व्यक्त करते हैं, तो म्यूटेशन या लेबलिंग अलग ढंग से रखा जाना अवशेष है, जिससे प्रोटीन का विकृतीकरण कारण हो सकता हैजंगली प्रकार के प्रोटीन में देखा की उम्मीद है और दूरी से. पश्चिमी blots प्रोटीन की अभिव्यक्ति को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विशेष रूप से सतह तस्करी प्रदर्शन करेंगे ब्याज की प्रोटीन के लिए एक पश्चिमी धब्बा द्वारा पीछा एक सतह झिल्ली प्रोटीन की तस्करी, कोशिका की सतह के biotinylation और सतह उजागर प्रोटीन के पुल से नीचे, के बारे में कोई सवाल ही नहीं है. LRET प्रोटीन प्रकार की एक विस्तृत विविधता पर इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद से कार्यात्मक परीक्षण के लिए, विशेष रूप से LRET साथ उपयोग के लिए सिफारिश करने के लिए कोई भी परख होती है. फिर हालांकि, कार्यात्मक assays के संभव उदाहरण एंजाइम गतिविधि assays, ligand बाध्यकारी assays, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन में शामिल हैं. प्रोटीन अभिव्यक्ति या समारोह भी प्रतिकूल पेश म्यूटेशनों से प्रभावित किया गया है, तो नए लेबलिंग साइटों चुना जाना चाहिए.

एक LRET संकेत देखा जाता है, लेकिन इस तरह के परिणाम की उम्मीद है, जब एक एकल घातीय द्वारा पृष्ठभूमि सही ढंग से घटाया गया था कि पहले की जांच फिट नहीं किया जा सकता है. वायुसेना, तोआतंकवाद घटाव, एक बहु घातीय क्षय देखा जाता है, यह संकेत क्या इरादा था की तुलना में अन्य कई मुलाकातों से मनाया जा रहा है LRET का एक संकेत हो सकता है. अन्य सभी सुलभ cysteines प्रोटीन से हटा दिया गया है सुनिश्चित करने के लिए जाँच करें. एक क्रिस्टल संरचना उपलब्ध है, तो यह इन cysteines के लिए जाँच करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण हो जाएगा. फिर, डाइसल्फ़ाइड बंधुआ और दफन, दुर्गम cysteines दूर उत्परिवर्तित होने की जरूरत नहीं है. , उन्हें दूर बदलना प्रोटीन में एक गैर देशी सिस्टीन शुरू करने और एक दाता स्वीकर्ता लेबल नमूने में कोई LRET संकेत है कि यह सुनिश्चित करने के लिए नहीं एक सम्मोहक कारण नहीं है कि अगर इन cysteines की पहुंच का परीक्षण करने के लिए. सभी सुलभ cysteines वास्तव में दूर उत्परिवर्तित गया है प्रोटीन कई यूनिटों है या एक परिसर का हिस्सा है, और, फिर उन पास प्रोटीन या सब यूनिटों के लिए संलग्न डाई के कारण confounding LRET संकेत हो सकता है. इन समस्याओं के साथ मदद मिल सकती है एक अलग प्रोटीज दरार साइट का चयन; अन्यथा, अन्य लेबलिंग साइटएस चुना जाना पड़ सकता है. फिटिंग के साथ इस मुद्दे बस संकेत करने वाली शोर की बात है तो अंत में, संभावित समस्या के कारण प्रोटीन की कम अभिव्यक्ति है. अभिव्यक्ति तो आदि विभिन्न अभिकर्मक शर्तों, एक अलग वेक्टर, के माध्यम से अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी.

LRET माप एक विषम या उचित रूप में शारीरिक रूप से व्यर्थ परिणाम का उत्पादन करते हैं, तो तत्काल स्पष्ट नहीं हो सकता है कि प्रोटीन विशिष्ट मुद्दों हो सकता है. उदाहरण के लिए, एसिड संवेदन आयन चैनल, कुछ कोशिका मृत्यु और प्रोटीन विकृतीकरण में परिणाम हो सकता है पीएच बदलने के लिए एक अम्ल का भी सावधान अलावा के साथ. इस प्रकार, कई नमूने प्रत्येक पीएच के लिए एक परीक्षण किया जाना, तैयार रहना चाहिए. इसके अलावा, प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण के अलावा, स्थानीय पर्यावरण परिवर्तन एक प्रतिदीप्ति संकेत को प्रभावित कर सकते हैं. इस तरह के एक परिवर्तन, महत्वपूर्ण हैं, एक डबल या बहु घातीय क्षय के रूप में दाता ही माप में ध्यान दिया जाना होगा. इन मामलों में, लेबलिंग साइटों मीटर करने के लिए विभिन्न पदों के लिए ले जाया जा करने की जरूरत हैAKE यकीन शर्तों में परिवर्तन fluorophores के वर्णक्रम गुण नहीं बदलता है.

मन में समस्याओं के इन स्रोतों रखते हुए भी, एक प्रयोगकर्ता बारे में पता होना चाहिए जो की LRET से कुछ के लिए निरंतर और सीमाएं हैं. सबसे पहले, पारंपरिक लेबलिंग तकनीक लेबलिंग सिस्टीन अवशेषों पर निर्भर करता है. गैर विशिष्ट अवशेषों की लेबलिंग को कम करने के लिए, अन्य cysteines आम तौर पर बाहर उत्परिवर्तित कर रहे हैं; हालांकि, इस पद्धति हमेशा व्यावहारिक नहीं है. एक प्रोटीन प्रोटीन की संरचना या समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं कि इसकी संरचना के मूल निवासी कई गैर डाइसल्फ़ाइड बंधुआ cysteines है अगर उदाहरण के लिए, तो बहुत तकनीक की सीमा और डेटा की व्याख्या में वृद्धि, असंभव हो जाएगा उन्हें बाहर परिवर्तनशील. आर 0 मूल्य पर 2 κ अभिविन्यास कारक के प्रभाव की वजह से निरपेक्ष दूरी पर किसी भी त्रुटि की संभावना है के रूप में इसके अलावा, LRET तकनीक, बल्कि निरपेक्ष दूरी से दूरी में परिवर्तन का पता लगाने के लिए अनुकूल हैइन त्रुटियों को समान रूप से सभी परिस्थितियों में माप को प्रभावित क्योंकि दूरी परिवर्तन विश्लेषण में कम किया जा सके. वैकल्पिक तकनीक इन सीमाओं से कुछ दूर करने के लिए किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, बहुत सारे cysteines जोड़ने से बचने के लिए, एक एक उनकी टैग प्रत्यय और निकल NTA के लिए बाध्य एक फ्लोरोफोरे साथ लेबल सकता है. इसके अलावा, देशी tryptophans इस प्रकार, एक दाता के रूप में इस्तेमाल करते हैं, तो tryptophans टर्बियम से एक बहुत छोटे जीवनकाल है कि समझ के साथ fluorophores के एक एक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता तीव्रता आधारित माप जीवनकाल माप से अधिक उपयुक्त हो सकता है. परमाणु दूरी के लिए अधिक सटीक परमाणु आवश्यक हैं, तो इस तरह के एक्स रे क्रिस्टलोग्राफी, आणविक गतिशीलता, या एनएमआर के रूप में तकनीक अभी भी इन निरपेक्ष दूरी प्राप्त करने के लिए अधिक उपयुक्त तकनीक हैं.

अपने उत्तम संवेदनशीलता परिवर्तन को दूर रखने की वजह से, LRET समाधान चरण प्रोटीन के लिए Angstrom स्तर के संकल्प के साथ दूरी परिवर्तन उपाय कर सकते हैं और उच्च पुरी के लिए आवश्यकता के बिना प्रयोगात्मक डेटा प्रदान कर सकते हैंTy, समस्थानिक लेबल या एनएमआर और आणविक गतिशीलता दोनों impairs कि आकार प्रतिबंध. तकनीक सीखने और माहिर के बाद, प्रोटीन के गठनात्मक परिवर्तन में परीक्षाओं बहुत तेजी से और पहले से ही उपलब्ध परम्परागत तकनीकों की तुलना में अधिक आसानी से किया जा सकता है. LRET भी व्यक्तिगत अणुओं के गठनात्मक राज्यों, बजाय पहनावा औसत की जनसंख्या वितरण की जांच कर सकते हैं, जो इस तरह के एक अणु झल्लाहट (smFRET) के रूप में आगे विशेष प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण तकनीक, के लिए एक उत्कृष्ट आधार प्रदान करता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

इस काम के स्वास्थ्य अनुदान GM094246, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान 11GRNT7890004, और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान एमसीबी-1110501 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate Life Technologies PV3579
Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide Life Technologies  F-150 Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide Life Technologies  A-10254 Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide Life Technologies  A-20346 Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide Life Technologies  A-10256 Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide Life Technologies  A-20344 Choice of acceptor depends on the specific experiment
QuantaMaster 3-SS Photon Technology International Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the millisecond range
FluoreScan 2.0 Photon Technology International Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument
Origin 8.6 OriginLab Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software
Quartz cuvette Starna Cells, Inc 3-Q-10
Stir bar  Bel-Art Products F37119-0007 Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette

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References

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