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Técnicas de coleta de sangue não terminal em cobaias

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Biology

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Summary

Apesar de ser um modelo conhecido, a cobaia representa atualmente um nicho em ciências experimentais em animais e dados limitada disponível sobre a execução da maioria dos procedimentos. Apresentamos aqui quatro abordagens diferentes para não-terminal em técnicas de amostragem de sangue vivo em qualquer cobaias conscientes ou anestesiados.

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Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. J. Vis. Exp. (92), e51982, doi:10.3791/51982 (2014).

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Abstract

As cobaias possuem várias semelhanças biológicas para os seres humanos e são validados modelos animais experimentais 1-3. No entanto, o uso de cobaias representa atualmente uma área relativamente estreita de dados de pesquisa e descritivos sobre metodologia específica é correspondentemente escasso. As características anatômicas de cobaias são um pouco diferentes de outros modelos de roedores, daí modulação de técnicas de amostragem para acomodar as diferenças espécie-específicos, por exemplo., Em comparação com camundongos e ratos, são necessários para obter amostras suficientes e de alta qualidade. Como tanto a longo e curto prazo em estudos in vivo, muitas vezes requerem repetidas sangue amostragem a escolha da técnica deve ser bem considerado, a fim de reduzir o estresse e desconforto nos animais, mas também para garantir a sobrevivência, bem como o cumprimento dos requisitos de tamanho da amostra e acessibilidade. Amostras de sangue venoso pode ser obtido em uma série de sites em cobaias por exemplo., A safena e jugularveias, cada uma das técnicas que contém tanto vantagens como desvantagens 4,5. Aqui, apresentamos quatro técnicas de amostragem de sangue diferentes para ambos cobaias conscientes ou anestesiados. Os procedimentos são todos os procedimentos não-terminal na condição de os volumes de amostra e número de amostras não exceder as diretrizes para coleta de sangue em animais de laboratório 6. Todos os métodos descritos têm sido exaustivamente testado e aplicado para repetido em amostras de sangue vivo em estudos dentro do nosso centro de pesquisa.

Introduction

A cobaia um modelo experimental animal valioso e validado devido a um número de semelhanças biológicos para os seres humanos, tais como a exigência de uma fonte dietética de vitamina C, a lipoproteína plasmática comparável enzimas que metabolizam e perfis de lipoproteína, bem como semelhanças compartilhadas com placentação humana e desenvolvimento pré-natal 1-3,7,8. Isso faz com que a cobaia um modelo atraente e adequado para estudar os efeitos de doenças associadas à dieta, como a doença não alcoólica do fígado gorduroso, doenças cardiovasculares e efeitos putativos de deficiência de vitamina C, mas também o efeito de, por exemplo., A intervenção dietética materna sobre o desenvolvimento prole.

Coleta de sangue repetida muitas vezes é necessária tanto em curto e longo prazo em estudos in vivo. Devido às diferenças anatómicas específicas de espécies é necessário modulação da técnica de amostragem, a fim de obter amostras de sangue em cobaias, em comparação com outros modelos de roedores 3,9. Esta técnica permite que as amostras de pequenas quantidades de sangue (100-400 ul), por exemplo, repetido., Para determinar os marcadores bioquímicos no plasma. Se um tamanho ainda mais pequeno da amostra é suficiente (50-100 ul), este pode facilmente ser obtido por punção da veia da orelha. Esta técnica também pode ser levada a cabo em animais conscientes e é útil, por exemplo, quando a medição da glucose no sangue 10,11. A amostragem a partir da veia jugular permite a recolha de maiores quantidades de sangue (1-2 ml), mas requer anestesia.

Aqui, apresentamos quatro técnicas de amostragem de sangue diferentes para ambos cobaias conscientes ou anestesiados. O procedures são todos os procedimentos não-terminal na condição de os volumes de amostra e número de amostras não exceder as diretrizes para coleta de sangue em animais de laboratório 6. É no interesse da boa ciência, bem como de bem-estar animal que o estresse deve ser reduzido ao mínimo. Consequentemente, apenas bem treinados e pessoal competente deve executar os procedimentos com animais.

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Protocol

Os procedimentos mostrados foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo animal dinamarquês Experimentação Inspecção no âmbito do Ministério da Alimentação, Agricultura e Pescas.

1. Sangue Amostragem do lateral safena ou Tarsal Veia

  1. Execute este procedimento sem anestesia e com a ajuda de um investigador, uma manipulação a cobaia, e uma coleta de amostra.
  2. Raspar a região tarsal da perna com um barbeador elétrico até que as veias são visíveis. Certifique-se de que a área é grande o suficiente para evitar interferir com a pele no local de punção.
  3. Coloque a perna em um banho de água morna e esfregue suavemente a perna, fazendo com que as veias mais dilatada e evidente.
  4. Limpe a perna com uma toalha limpa e desinfectar o local da punção com gaze ou um chumaço de algodão umedecido com álcool 70%.
  5. Contenha a cobaia e estender a perna para baixo, aplicando pressão suave imediatamente acima do joelho to fornecer estase.
  6. Por punção da veia com uma agulha de 21 G ou lanceta. Recolha de sangue, por exemplo., Usando um tubo de recolha ou capilar. Gentilmente manipular a perna para ajudar o fluxo de sangue.
  7. Solte estase, uma vez que a amostra foi obtida. Aplique um pedaço de gaze ou algodão, com uma leve pressão ao local da punção até que o sangramento parou.
  8. Retorne o animal para sua gaiola e monitor por 5-10 min para assegurar a hemostasia.

2. coleta de sangue da veia da orelha

  1. Executar este procedimento, sem anestesia, quer isoladamente ou, de preferência com a ajuda de um colega.
  2. Desinfetar a superfície dorsal da orelha com gaze ou um chumaço de algodão umedecido com álcool 70%.
  3. Aplicar uma leve pressão para a base da orelha para proporcionar estase.
  4. Por punção da veia com uma agulha de 21 G ou lanceta, e coleta de sangue.
  5. Solte estase, uma vez que a amostra foi obtida, aplique um pedaço de gaze ou algodão com gepressão ntle ao local da punção até que o sangramento parou.
  6. Retorne o animal para sua gaiola e monitor por 5-10 min para assegurar a hemostasia.

3. Sangue Amostragem da veia jugular

  1. Realizar este procedimento com a ajuda de um investigador adicional; uma manipulação da cobaia e uma coleta de amostra.
  2. Anestesiar a cobaia com um anestésico adequado durante toda a duração deste procedimento. Uma mistura de tiletamina (0,93 mg / kg), zolazepam (0,93 mg / kg), xilazina (1,49 mg / kg) e butorfanol (0,06 mg / kg) pode ser usado.
  3. Coloque a cobaia anestesiada em suas costas e retirar delicadamente as pernas dianteiras caudal.
  4. Raspar e desinfectar (por ex., Com 70% de álcool) a parte ventral do pescoço.
  5. Cubra a seringa com heparina ou EDTA antes da amostragem, a fim de reduzir o risco de coagulação.
  6. Palpar a clavícula e inserir um 25 G (ou 23 G) agulha montada em um 1 ml ap seringaximadamente 1 cm lateral à linha média ao nível da articulação do ombro. Manter a seringa em um pequeno ângulo para cima e medial enquanto aplica uma pressão ligeiramente negativa. Evite danificar as estruturas subjacentes como a veia jugular está situado muito superficial. Inclinação do gargalo da cobaia ligeiramente para trás, para proporcionar o aumento da estase venosa.
  7. Libertar as pernas da frente, quando a amostra de sangue é obtida, e aliviar a estase antes de a agulha é retraída. Use um pedaço de gaze seca ou algodão para aplicar pressão suave para o local da punção.
  8. Retorne o animal para uma gaiola de recuperação e monitoramento para garantir a hemostasia e recuperação da anestesia.

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Representative Results

Quatro abordagens diferentes para in vivo de técnicas de amostragem de sangue não-terminal, nem em cobaias conscientes ou anestesiados foram apresentados. Figura 1 ilustra o curso da safena lateral e veia tarsal na cobaia e possíveis locais de punção. Veias da orelha visíveis na superfície dorsal de uma orelha da cobaia são ilustrados na Figura 2 Estas veias pode ser utilizado para a amostragem de sangue, quando apenas um volume muito pequeno, é necessária. A posição do porquinho da índia para a amostragem de sangue da jugular é mostrado na Figura 3. O curso da veia jugular é ilustrado pelas setas com a seta a apontar mais elevada no local de punção recomendado.

Figura 1
Figura 1 A veia safena e tarsal lateral no cobaia. A imagem ilustra o curso ealocal de punção para amostragem de sangue a partir da safena lateral (seta superior), ou a veia do tarso (seta inferior) na cobaia.

Figura 2
Figura 2. veias da orelha. Esta imagem ilustra veias da orelha (setas) visíveis na superfície dorsal de uma orelha da cobaia. Estas veias pode ser utilizado para a amostragem de sangue, quando apenas um volume muito pequeno, é necessária.

Figura 3
Figura 3 Posição do cobaia para coleta de sangue da veia jugular. Isto ilustra a posição da cobaia e do local da punção para coleta de sangue da veia jugular. As setas indicam o curso da veia jugular com a seta a apontar para a mais elevada no local de punção recomendado.

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Discussion

Em comparação com camundongos e ratos, cobaias estão com medo, por natureza e deve ser abordada com calma e tratada corretamente, a fim de reduzir o estresse. Do ponto de vista do bem-estar animal, agindo com cuidado é naturalmente uma prioridade; no entanto, este também irá reduzir o risco de efeitos associados a ansiedade sobre o por exemplo, dados coletados., aumento dos níveis sanguíneos de corticosteróides e glicose 12. Da mesma forma, a movimentação diária irá habituar os animais com os procedimentos normais e pode servir para reduzir o stress ainda mais. Experiência prática em uma técnica de coleta de sangue especial deve ser adquirida pela primeira observação de um operador experiente e, posteriormente, a realização da técnica sob supervisão até que a competência seja alcançado. A técnica escolhida deve reduzir idealmente tanto estresse e desconforto ao mínimo, mas também para garantir a sobrevivência, bem como o cumprimento dos requisitos de tamanho da amostra e acessibilidade. Para todos os métodos de amostragem de sangue apresentaram técnicas de assepsia deve serutilizado para minimizar o risco de infecção e assegurar a recolha de amostras não contaminadas.

As abordagens ilustradas para coleta de sangue garantir a sobrevivência do animal, desde que o volume da amostra ea frequência é obtida de acordo com as orientações e podem ser aplicados para a amostragem repetida em ambos os estudos de curto e longo prazo 6. Isto permite o monitoramento consistente de animais individuais ao longo do tempo por meio deste reduzindo variância e número de animais incluídos em conformidade com (redução) dos 3Rs 13,14. As técnicas aqui apresentadas têm diferentes intervalos de volume de amostra obtida (alguns mL até 1-2 ml), que devem ser consideradas antes de se iniciar um ensaio. Embora os procedimentos de coleta de sangue da veia jugular em cobaias anestesiadas-un foram descritas 12, recomendamos o uso de anestesia para reduzir o estresse e desconforto, tanto quanto possível. Ao fazer isso, a escolha de anestesia deve ser cuidadosay abordada, observando que as cobaias são notoriamente difíceis de anestesiar e apresentar considerável variação eficácia do anestésico, bem como uma elevada sensibilidade para a depressão respiratória induzida 15,16. Como a veia jugular em cobaias não é visível nem palpável qualquer redução em estase / dilatação venosa pode aumentar as dificuldades de amostragem, assim, recomenda-se geralmente a evitar agentes vaso-constrição em anestesia-misturas. . Além disso, os efeitos conhecidos dos agentes anestesiar específicos que podem interferir com a coleta de dados, por exemplo desejado, efeitos cardiovasculares e / ou aumento dos níveis de glicose no sangue após α 2 - ações agonistas em roedores deve ser avaliada 16,17. O uso de anestesia por inalação, como o isoflurano pode também ser uma opção, no entanto, como intubação em cobaias é deve ser tomado um cuidado tarefa muito difícil para evitar a interferência pela máscara de inalação com a posição da cabeça / pescoço, pois isso pode compliccomeu o procedimento desnecessariamente. Generalized por exemplo anestesia., Por inalação, também é necessário para a punção cardíaca que pode proporcionar um maior volume de amostra. No entanto, de punção cardíaca é um processo de terminal e, por conseguinte, não é aplicável para a amostragem repetido e não serão mais descritas.

Os potenciais efeitos adversos como hemorragia, hematoma, trombose, infecção e cicatrização pode ocorrer após a punção de uma veia. Na nossa experiência, a cobaia não apresentam um aumento do risco de complicações tais indesejadas em comparação com outros modelos de roedores, desde que o procedimento é realizado como descrito no manuscrito actual. À medida que a veia jugular não pode ser visualizada a partir da superfície exterior, que é muito importante para aliviar a estase antes de retirar a agulha e para proporcionar hemostase adequada, a fim de minimizar o risco de hemorragia e de contusão peri-venosas. Em caso de efeitos adversos, o tratamento deve sempre ser procurado a partir da Veteri responsávelrinário. Por razões de bem-estar animal e da ciência, considerações sérias deve ser dada ao efeito combinado do volume da amostra e frequência e escolha da técnica de amostragem. Todas as técnicas de amostragem de sangue descritos foram exaustivamente testados e aplicados para repetido em amostras de sangue vivo em estudos dentro do nosso centro de pesquisa.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar. Todos os procedimentos foram aprovados pela Lei de Experimentação Animal da Dinamarca, que está de acordo com o Conselho da Europa Convenção ETS 123.

Acknowledgments

Reconhecemos a assistência hábil de Annie B. Kristensen, Elisabeth V. Andersen, Belinda B. Bringtoft e os cuidadores de animais no Departamento de Medicina Experimental, Frederiksberg Campus da Faculdade de Saúde e Ciências Médicas da Universidade de Copenhague, na Dinamarca. Jacob Lønholdt está agradeceu por sua assistência técnica excelente em filmar os procedimentos. Este estudo foi financiado em parte pelo Centro LIFEPHARM de farmacologia in vivo e da Universidade de Copenhagen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Electric shaver Wella (Contura), Denmark 273207 Alternative product may be used. Multiple suppliers
Syringes  B.Braun-Omnifix-F, Germany 9161406V Alternative product may be used. Multiple suppliers
Needles BD Microlance, Spain 301156 Alternative product may be used. Multiple suppliers
Microvette collection tube  Sarstedt, D-51588Nümbrecht, Germany 201,288,100 Alternative product may be used. Multiple suppliers
Accu-Check analyzer Roche A/S Diagnostics, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Heparin 5000 IE/ml LEO Pharma, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Anesthesia Zoletil 50, Chemvet, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Anesthesia Narcoxyl vet 20 mg/ml, Intervet, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Anesthesia Torbugesic vet 10 mg/ml, Scanvet, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Neutral eye ointment Alternative product may be used. Multiple suppliers
Gauze or a cotton swab  Alternative product may be used. Multiple suppliers
Disinfectant (70% alcohol) Alternative product may be used. Multiple suppliers

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