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Técnicas de muestreo de sangre no terminal en los conejillos de Indias

Biology

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Summary

Aunque un modelo conocido, el conejillo de indias en la actualidad representa un nicho en las ciencias experimentales en animales y datos limitados está disponible en la ejecución de la mayoría de los procedimientos. Aquí presentamos cuatro enfoques diferentes para no terminal en las técnicas de muestreo de sangre in vivo, ya sea en cobayas conscientes o anestesiados.

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Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. J. Vis. Exp. (92), e51982, doi:10.3791/51982 (2014).

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Abstract

Los conejillos de indias poseen varias similitudes biológicas a los seres humanos y se validan los modelos animales experimentales 1-3. Sin embargo, el uso de conejillos de indias actualmente representa un área relativamente estrecha de datos de investigación y descriptivos sobre la metodología específica es correspondientemente escasa. Las características anatómicas de los conejillos de Indias son un poco diferente de otros modelos de roedores, por lo tanto, la modulación de las técnicas de muestreo para dar cabida a las diferencias específicas de cada especie, por ejemplo., En comparación con los ratones y las ratas, son necesarias para obtener muestras suficientes y de alta calidad. Como tanto a largo como a corto plazo en los estudios in vivo a menudo requieren repetir el muestreo de sangre la elección de la técnica debe ser bien considerado con el fin de reducir el estrés y el malestar en los animales, sino también para asegurar la supervivencia, así como el cumplimiento de los requisitos de tamaño de la muestra y la accesibilidad. Muestras de sangre venosa se ​​pueden obtener en un número de sitios en los conejillos de indias por ejemplo., La safena y yugularvenas, cada técnica que contiene tanto ventajas como desventajas 4,5. A continuación, presentamos cuatro técnicas de muestreo de sangre diferentes, ya sea para cobayas conscientes o anestesiados. Los procedimientos son los procedimientos no terminales siempre que los volúmenes de muestra y número de muestras no exceden las directrices para la recogida de sangre en animales de laboratorio 6. Todos los métodos descritos han sido probados y solicitado repetido en el muestreo de sangre in vivo en los estudios dentro de nuestro centro de investigación a fondo.

Introduction

La cobaya es un modelo animal experimental valiosa y validado debido a un número de similitudes biológicas a los seres humanos, tales como un requisito para un suministro dietético de la vitamina C, la lipoproteína de plasma comparables enzimas metabolizadoras y perfiles de lipoproteínas, así como similitudes compartidas con placentación humana y 1-3,7,8 desarrollo prenatal. Esto hace que el conejillo de indias un modelo atractivo y conveniente para efectos de las enfermedades asociadas a la dieta tales como la enfermedad no alcohólica del hígado graso, las enfermedades cardiovasculares y los efectos putativos de la deficiencia de vitamina C, sino también el efecto de, por ejemplo estudiando., Intervención dietética materna en el desarrollo descendencia.

Muestreo de sangre repetida a menudo se requiere tanto a largo como a corto plazo en los estudios in vivo. Debido a las diferencias anatómicas específicas de las especies es necesaria la modulación de la técnica de muestreo para obtener muestras de sangre en los conejillos de indias en comparación con otros modelos de roedores 3,9. Esta técnica permite que las muestras de pequeñas cantidades de sangre (100-400 l), por ejemplo repitió., Para determinar los marcadores bioquímicos en el plasma. Si un tamaño de muestra incluso más pequeño es suficiente (50-100 l), esto con bastante facilidad puede obtenerse por punción de la vena de la oreja. Esta técnica también se puede llevar a cabo en animales conscientes y es útil por ejemplo cuando se mide la glucosa en sangre 10,11. El muestreo de la vena yugular permite colección de grandes cantidades de sangre (1-2 ml), pero requiere anestesia.

A continuación, presentamos cuatro técnicas de muestreo de sangre diferentes, ya sea para cobayas conscientes o anestesiados. El procedures son todos los procedimientos no terminales siempre que los volúmenes de muestra y número de muestras no exceden las directrices para la recogida de sangre en animales de laboratorio 6. Es en interés de la buena ciencia, así como de bienestar de los animales que el estrés se debe mantener a un mínimo. En consecuencia, sólo bien entrenado y personal competente debe realizar los procedimientos con animales.

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Protocol

Los procedimientos que se muestran se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados por el danés Experimentación Animal Inspección, dependiente del Ministerio de Alimentación, Agricultura y Pesca.

1. Sangre de muestreo desde el lateral safena o tarsal Vein

  1. Lleve a cabo este procedimiento sin anestesia y la ayuda de un investigador, que maneja el conejillo de indias, y una recogida de la muestra.
  2. Afeitarse la región tarsal de la pata trasera con una rasuradora eléctrica hasta que las venas son visibles. Asegúrese de que el área es lo suficientemente grande para evitar la piel interferir con el sitio de punción.
  3. Coloque las patas traseras en un baño de agua tibia y frote suavemente la pierna, por lo que las venas más dilatada y evidente.
  4. Limpie la pierna con una toalla limpia y desinfecta la zona de punción con una gasa o un hisopo de algodón humedecido con alcohol al 70%.
  5. Prohibir al conejillo de Indias y extender la pierna trasera hacia abajo mientras se aplica una presión suave inmediatamente por encima de la rodilla t conjuntao proporcionar la estasis.
  6. La punción de la vena con una aguja 21 G o lanceta. Recoger la sangre por ejemplo., Mediante el uso de un tubo de recogida o capilar. Manipular suavemente la pierna para ayudar al flujo sanguíneo.
  7. Soltar la estasis, una vez que se ha obtenido la muestra. Aplicar un trozo de gasa o algodón lana con una suave presión sobre el área hasta que el sangrado se ha detenido.
  8. Volver al animal a su jaula y el monitor durante 5-10 minutos para asegurar la hemostasia.

2. de muestra de sangre de la vena de la oreja

  1. Realice este procedimiento sin anestesia ya sea solo o, preferiblemente, con la ayuda de un colega.
  2. Desinfectar la superficie dorsal de la oreja con una gasa o un hisopo de algodón humedecido con alcohol al 70%.
  3. Aplique una leve presión sobre la base de la oreja para proporcionar la estasis.
  4. La punción de la vena con una aguja 21 G o lanceta, y recoger la sangre.
  5. Suelte la estasis, una vez obtenida la muestra, Aplicar un trozo de gasa o un algodón con gepresión ntle al sitio de punción hasta que el sangrado se ha detenido.
  6. Volver al animal a su jaula y el monitor durante 5-10 minutos para asegurar la hemostasia.

3. Sangre de muestreo de la vena yugular

  1. Esta operación se realizará mediante la ayuda de un investigador adicional; que maneja el conejillo de indias y una recogida de la muestra.
  2. Anestesiar el conejillo de indias con un anestésico adecuado para toda la duración de este procedimiento. Una mezcla de tiletamina (0,93 mg / kg), zolazepam (0,93 mg / kg), xilazina (1,49 mg / kg) y butorfanol (0,06 mg / kg) puede ser utilizado.
  3. Coloque el conejillo de indias anestesiados en su parte posterior y retraer con suavidad las patas delanteras en sentido caudal.
  4. Afeitado y desinfectar (por ejemplo., Con 70% de alcohol) la parte ventral del cuello.
  5. Escudo la jeringa con heparina o EDTA antes del muestreo con el fin de reducir el riesgo de coagulación.
  6. Palpar la clavícula e inserte un 25 G (o 23 G) de aguja montada en una jeringa de 1 ml apmadamente 1 cm lateral a la línea media a nivel de la articulación del hombro. Conservar la jeringa en un ángulo ligeramente hacia arriba y medial mientras se aplica una ligera presión negativa. Evitar daños en las estructuras subyacentes como la vena yugular se encuentra bastante superficial. Incline el cuello del cuy ligeramente hacia atrás para proporcionar un aumento de la estasis de la vena.
  7. Suelte las patas delanteras cuando se obtiene la muestra de sangre, y aliviar la estasis antes se retrae la aguja. Use un pedazo seco de gasa o un algodón para aplicar una suave presión sobre el sitio de la punción.
  8. Volver al animal a una jaula de recuperación y seguimiento para asegurar la hemostasia y la recuperación de la anestesia.

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Representative Results

Se han presentado cuatro enfoques diferentes de técnicas in vivo no terminales en muestras de sangre, ya sea en cobayas conscientes o anestesiados. Figura 1 ilustra el curso de la safena y la vena lateral del tarso en el conejillo de indias y los posibles sitios de punción. Venas del oído visibles en la superficie dorsal de una oreja de cerdo de guinea se ilustran en la Figura 2 Estas venas pueden ser utilizados para tomar muestras de sangre cuando se requiere sólo un volumen muy pequeño. La posición del conejillo de Indias para tomar muestras de sangre yugular es muestra en la Figura 3. El curso de la vena yugular se ilustra por las flechas con la flecha que apunta hacia arriba en la zona de punción recomendada.

Figura 1
Figura 1 La vena safena y tarsal lateral en el conejillo de indias. La imagen ilustra el curso y lasitio de la punción para el muestreo de sangre de la safena lateral (flecha superior) o la vena tarsal (flecha inferior) en el conejillo de indias.

Figura 2
Figura 2. venas de la oreja. Esta imagen ilustra venas de la oreja (flechas) visibles en la superficie dorsal de una oreja de cerdo de guinea. Estas venas pueden ser utilizados para tomar muestras de sangre cuando se requiere sólo un volumen muy pequeño.

Figura 3
Figura 3 Posición del conejillo de Indias para tomar muestras de sangre de la vena yugular. Esto ilustra la posición del conejillo de Indias y el sitio de punción para la extracción de sangre de la vena yugular. Las flechas indican el curso de la vena yugular con la flecha apuntando hacia arriba hacia el sitio de la punción recomendado.

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Discussion

En comparación con los ratones y las ratas, conejillos de Indias son temerosos por naturaleza y deben ser abordados con calma y manejados correctamente para reducir el estrés. Desde el punto de vista del bienestar animal, actuando con cuidado es naturalmente una prioridad; Sin embargo, esto también reducirá el riesgo de efectos de ansiedad asociada a los datos recogidos por ej., aumento de los niveles sanguíneos de corticosteroides y glucosa 12. Del mismo modo, la manipulación diaria habituar a los animales a los procedimientos normales y puede servir para reducir aún más la tensión. Experiencia práctica en una técnica de muestreo de sangre en particular debe adquirirse teniendo en cuenta en primer lugar un operador experimentado y posteriormente la realización de la técnica bajo supervisión hasta que se logre la competencia. La técnica elegida debería reducir ideal tanto estrés y las molestias al mínimo, pero también para garantizar la supervivencia, así como el cumplimiento de los requisitos de tamaño de la muestra y la accesibilidad. Para todos los métodos de toma de muestras de sangre que se presentan las técnicas de asepsia deben serutilizado para reducir al mínimo el riesgo de infección y garantizar la recogida de muestras no contaminadas.

Los planteamientos ilustrados a tomar muestras de sangre garantizan la supervivencia del animal siempre que el volumen de la muestra y la frecuencia se consigue de acuerdo con las directrices y todo puede ser aplicado para el muestreo repetido en ambos estudios a corto y largo plazo 6. Esto permite el monitoreo constante de los animales individuales a través del tiempo presente, la reducción de la varianza y el número de animales incluidos en el cumplimiento de (reducción) de las 3R '13,14. Las técnicas presentadas aquí tienen diferentes rangos de volumen de la muestra que se puede obtener (unos l hasta 1.2 ml) que se debe considerar antes de iniciar un experimento. Aunque los procedimientos para la recogida de sangre de la vena yugular en los conejillos de indias de la ONU-anestesiado se han descrito 12, se recomienda encarecidamente el uso de la anestesia para reducir el estrés y la incomodidad tanto como sea posible. Al hacer esto, la elección de la anestesia debe ser cuidadoy dirigida, señalando que los conejillos de Indias son notoriamente difíciles de anestesiar y mostrar una considerable variación de la eficacia anestésica, así como una alta sensibilidad a la depresión respiratoria inducida por 15,16. Como la vena yugular en los conejillos de indias no es visible ni palpable cualquier reducción de estasis dilatación / venosa puede aumentar las dificultades de muestreo, por lo que en general se recomienda evitar los agentes vaso-constricción en anestesia-mezclas. . Además, los efectos conocidos de los agentes anestesiar específicas que pueden interferir con la recogida de datos deseado, por ejemplo, efectos cardiovasculares y / o aumento de los niveles de glucosa en sangre después de 2 - α acciones agonistas en los roedores se deben evaluar 16,17. El uso de la anestesia por inhalación, como el isoflurano también puede ser una opción, sin embargo, como la intubación en los conejillos de indias es una tarea muy difícil el cuidado se debe tomar para evitar la interferencia por la inhalación-máscara con la posición de la cabeza / cuello ya que esto puede compliccomió el procedimiento innecesariamente. Por ejemplo, la anestesia generalizada., Por inhalación también se requiere para punción cardiaca que puede proporcionar un volumen de muestra más grande. Sin embargo, punción cardíaca es un procedimiento terminal y por lo tanto no es aplicable para el muestreo repetido y no se describirá más.

Los posibles efectos adversos como hemorragia, hematomas, trombosis, infecciones y cicatrices pueden ocurrir después de la punción de una vena. En nuestra experiencia, el conejillo de indias no presenta un aumento del riesgo de tales complicaciones no deseadas en comparación con otros modelos de roedores, siempre que el procedimiento se realiza como se describe en el manuscrito actual. Como la vena yugular no puede visualizarse desde la superficie exterior, que es muy importante para aliviar la estasis antes de retirar la aguja y para proporcionar una hemostasia adecuada con el fin de minimizar el riesgo de hemorragia peri-venosas y hematomas. En el caso de efectos adversos, el tratamiento se debe buscar siempre de la Veteri responsablecanaria. Por razones de bienestar animal y de la ciencia, las consideraciones serias deben ser entregados al efecto combinado del volumen de la muestra y la frecuencia y la elección de la técnica de muestreo. Todas las técnicas de muestreo de sangre descritos han sido probados y solicitado repetido en el muestreo de sangre in vivo en estudios en nuestras instalaciones de investigación a fondo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar. Todos los procedimientos fueron aprobados por la Ley de Experimentación Animal de Dinamarca, que está de acuerdo con el Consejo de Europa del Convenio ETS 123.

Acknowledgments

Reconocemos la asistencia en un crack de Annie B. Kristensen, Elisabeth V. Andersen, Belinda B. Bringtoft y los cuidadores de animales en el Departamento de Medicina Experimental, Frederiksberg Campus de la Facultad de Salud y Ciencias Médicas de la Universidad de Copenhague, Dinamarca. Jacob Lønholdt se dio las gracias por su excelente asistencia técnica en la filmación de los procedimientos. Este estudio fue apoyado en parte por el Centro LifePharm en vivo y Farmacología de la Universidad de Copenhague.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Electric shaver Wella (Contura), Denmark 273207 Alternative product may be used. Multiple suppliers
Syringes  B.Braun-Omnifix-F, Germany 9161406V Alternative product may be used. Multiple suppliers
Needles BD Microlance, Spain 301156 Alternative product may be used. Multiple suppliers
Microvette collection tube  Sarstedt, D-51588Nümbrecht, Germany 201,288,100 Alternative product may be used. Multiple suppliers
Accu-Check analyzer Roche A/S Diagnostics, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Heparin 5000 IE/ml LEO Pharma, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Anesthesia Zoletil 50, Chemvet, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Anesthesia Narcoxyl vet 20 mg/ml, Intervet, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Anesthesia Torbugesic vet 10 mg/ml, Scanvet, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Neutral eye ointment Alternative product may be used. Multiple suppliers
Gauze or a cotton swab  Alternative product may be used. Multiple suppliers
Disinfectant (70% alcohol) Alternative product may be used. Multiple suppliers

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