В пробирке функциональные характеристики мыши колоректального афферентных окончаний

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J. Vis. Exp. (95), e52310, doi:10.3791/52310 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Это видео демонстрирует подробно об одноволоконного электрофизиологические протокол записи в пробирке с использованием препарата мыши colorectum нерва. Подход позволяет объективную идентификацию функциональная характеристика отдельных колоректального афферентов. Внеклеточные записи, распространяющихся потенциалов действия (AP), которые происходят из одного или нескольких афферентных (то есть, один-волокно) рецептивные поля (RFS) в colorectum изготавливаются из дразнили пучков нервных волокон. Colorectum удаляется либо малого таза (PN) или поясничного висцеральный (LSN) нерва прилагается и открыл в продольном направлении. Ткань помещают в камеру записи, закреплен плоский и перфузию кислородом раствором Кребса. Фокусное электрическая стимуляция используется для поиска колоректального афферентные окончания, которые затем были три различных механических раздражителей (тупой зондирования, поглаживание слизистой оболочки и окружающей Stretch) функционально классифицировать афферентные волокна на пять mechanosensiтивные занятия. Окончания отвечая ни на один из этих механических раздражителей классифицируются как механически, нечувствительных афферентов (ММАС). И механочувствительных и пропавших без вести может быть оценена для сенсибилизации (т.е. увеличенная реакция, снижение порога, и / или приобретения механоре-) локализованной воздействия ФР химических веществ (например, воспалительные суп (IS), капсаицин, аденозинтрифосфата (АТФ)). Мы описываем оборудование и colorectum нерва подготовку записи, урожай colorectum с прикрепленным PN или LSN, выявление ФР в colorectum, записи одноволоконного от нервных пучков, а также локализованных применение химических препаратов в РФ. Кроме того, также обсуждаются проблемы, связанные с подготовкой и применением стандартного механического раздражения.

Introduction

Боль и гиперчувствительность являются преобладающими жалобы больных, страдающих от функциональных желудочно-кишечных расстройств, в том числе синдром раздраженного кишечника (IBS), которые существуют в отсутствие видимых pathobiological причины или повреждение ткани. Например, пациенты с СРК проявляют гиперчувствительность, в том числе повышенная ответов на прямой воздушный шар живота и повышенной чувствительности при нормальной функции кишечника, а также гиперчувствительность соматической направления (т.е., болезненность при пальпации брюшной области) 1. Потому что таргетинг колоректального афференты уже доказали свою эффективность в борьбе с болью и повышенной чувствительности у пациентов с СРК (например, внутри прямой кишки введение местных анестетиков 2,3; перорального приема в гуанилатциклазы-C агониста linaclotide 4-6), улучшение понимания афферентные иннервации colorectum важно.

Visceral афференты, в том числе колоректального афферентов, Способны реагировать с химическими / питательными веществами и тепловых условий (например, 7-9). Тем не менее, висцеральные афферентные отвечая на механических раздражителей (то есть, механочувствительных афферентов) были наиболее тщательно изучены, поскольку механические раздражители (например, просвета живота, растяжки) являются те, которые обычно приводят к сознательным ощущений, в том числе дискомфорта и боли 10-16. Кроме того, внутренние органы также иннервируются механически нечувствительных афферентов (ММАС), обычно называют молчание или спящих ноцицепторов 17. В нормальных физиологических условиях, без вести пропавших не реагируют на механическое раздражение или очень высокий отклик пороги 18, но может стать активным и приобрести механоре- в патофизиологических условиях и способствовать гиперчувствительности.

Использование препарата в пробирке и описанные здесь протокол, мы разработали и использовали электрический стратегию стимулирования к морю RCH для восприимчивых окончаний, позволяющих объективную идентификацию как механочувствительных и МВД окончаний в colorectum 19. Колоректальный иннервации происходит от поясничного Висцеральные (LSN) и органов малого таза нерва (PN) путей, и включает в себя колоректального афференты, которые могут быть разделены на пять механочувствительных классов (серозный, слизистой, мышечной, опорно-слизистой оболочки, брыжейки) и одной МВД класса 20. Использование этого препарата в пробирке, мы обнаружили, что колоректальный пропавшим без вести приобрел механоре- (информирования) после кратковременного воздействия их рецептивных полей воспалительной суп (IS), которая сенсибилизированной 71% пропавших без вести в пути PN и 23% пропавших без вести в пути LSN 19. Мы также документально долговременной сенситизации (до 28 дней) пропавших без вести в контексте длительной поведенческой висцеральной гиперчувствительности (т.е., у мышей, получавших внутритолстокишечным лечения зимозаном 21 или 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS) 22) ,

jove_content "> Среди механочувствительных афферентов, мышечной и опорно-слизистых афферентов являются единственными классы, которые монотонно кодируют по окружности участке colorectum (то есть, являются стретч-чувствительный) и subserve кодировку вредных колоректального растяжения 23,24. Использование компьютерным управлением сила привода, мы применили стандартный однородную и воспроизводимые увеличили напряжение в окружном направлении уплощенной колоректального ткани и далее подразделяются стретч-чувствительный афферентов как низкий порог и высокое пороговое значение 23. Кроме того, временной ход сенсибилизации участке чувствительными к афференты после внутритолстокишечным зимозан 21 или TNBS 22 обработки соответствует началу, настойчивость и / или восстановления поведенческой висцеральной гиперчувствительности, что указывает на роль стретч-чувствительный колоректального афферентов в висцеральной боли и повышенной чувствительности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был рассмотрен и утвержден в университете Питтсбурга Институциональные животных уходу и использованию комитета.

1. Подготовка модифицированный раствор Кребса и тест на наркотики Аликвотные

  1. Сделать 6 л модифицированным раствором Кребса, содержащий (в мМ): NaCl 117,9, KCl 4,7, 25 NaHCO 3, 1,3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO 4, 2,5 CaCl 2, 11,1 D-глюкозы, бутират 2 натрия, ацетат натрия 20 , 0,004 нифедипин (блокировать спонтанные сокращения мышц), и 0,003 индометацин (блокировать синтез эндогенных простагландинов). Используйте лед холодные и теплые растворы Krebs для рассечения тканей и записи одного волокна, соответственно.
  2. Подготовка любые химические растворы (например, IS, капсаицин, АТФ) в аликвотах при требуемых концентрациях.

2. Рассечение Colorectum-нервной ткани

  1. Обезболить и усыпить самцов мышей (6 - 8 недель, 20 - 30 г) вСО 2 камеры, при скорости потока, что перемещает 10 - 30% от объема камеры в минуту до мышей полностью остановить дыхание, как показано отсутствие движения грудной клетки.
  2. Сразу же после эвтаназии обескровить резанием открытой грудной камеру, перфорации в правое предсердие, и погружение тушку мыши в достаточно объема (~ 500 мл) охлажденного льдом Кребса (4 ° С) раствор барботировали карбогена (95% O 2 , 5% СО 2).
  3. Тщательно удалите все внутренности, но толстой и органов малого таза. Трансекта мышь в половине через T12 сегмента позвоночника чуть выше грудной диафрагмы и передать хвостовой половину рассечение камере, содержащей ледяной холод, пропускают раствор Кребса.
  4. Под стереомикроскопа, удалить мочевой пузырь и половые органы по пересекающих на их стыках в мочеиспускательном канале, а удалить нисходящую / брюшной аорты, пока он не раздваивается общих подвздошных артерий. Освободите PN или LSN от их surroundinг тканей тупым и следовать нерва из-за пределов гребня подвздошной кости до ее брюшной точки входа в L6 и S1 позвоночника (для PN) или Т13 и L1 позвоночника (для LSN).
  5. Вырезать лобкового симфиза и правой и левой вертлужной впадины суставов, и снимите подвздошной кости. Тщательно бесплатно либо PN или LSN из прилагаемого мышечной и соединительной ткани от близко к colorectum до где нерв входит в позвоночный столб.
  6. Тщательно резекцию подвздошной кости, чтобы разоблачить дистального colorectum. Проанализируйте из дистального colorectum с прилагаемой PN или LSN в континууме.
  7. Передача colorectum с нерва, прикрепленной к ванне отсеке ткани камеры. Удалить излишки соединительной ткани путем дальнейшего вскрытия и откройте colorectum в продольном направлении вдоль анти-брыжеечной границе.
  8. С стороны слизистой оболочки вверх, прикрепить брыжеечной края colorectum, прилегающей к записи купе в силиконовой базе Chambeг и прикрепить antimesenteric длину colorectum к рейка крючков, подключенных к силовой цилиндр (показано на фиг.1 и фотографировали на фиг.2А).
  9. Расширение PN или LSN в записи отсеке, который соединен с ванной отсек с отверстием мыши и ворот. Осторожно заложить нервного ствола на небольшой стекла зеркала в записи отсеке, который обеспечивает гидрофильную поверхность дл нерва придерживаться. Superfuse баня отсек с теплой (30 - 32 ° C), насыщенным кислородом раствором Кребса и заполнить записи отсек с минеральным маслом.

3. одноволоконного Запись и Локализация рецептивного поля

  1. Осторожно отогните эпиневрии (оболочки нервов) от PN или LSN под стереоскопическим при большом увеличении (50 - 60X). Использование тонких щипцов, дразнить нервного ствола в 5 - 8 нервных пучков ~ 100 мкм толщины.
  2. Поставьте ссылку платины иридийэлектрод в контакте с раствором Кребса в ткани камеры. Последовательно разместить отдельные нервные пучки на электрод записи, сделанной из того же материала.
  3. Используйте мягкую кисть, чтобы вызвать ТД от колоректального афферентов, осторожно поглаживая вверх и вниз колоректального поверхности. Найдите файл (ы) нерва, иннервирующих толстую кишку через обнаруживаемого AP (потенциал действия) записей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PN и LSN также иннервируют мочевой пузырь и другие органы малого таза.
  4. Используйте пару 30 г Советы иглы для дальнейшего разделения нервного пучка в тонких брошюр нитей ~ толщиной 10 мкм и оформить индивидуальный нить на записи электрода.
  5. Поместите круглую наконечником концентрический электрод перпендикулярно к поверхности слизистой оболочки с электрически возбуждают афферентные окончаний при интенсивности сверхпороговой стимула (10 мА величины, 0,5 мсек @ 0,3 Гц), который производит мм радиус текущего распространения ~ 2. Перемещение электрода систематически (~ 1,5 шаги мм) По длине и ширине уплощенной colorectum локализовать восприимчивы окончаний.
  6. Когда афферентные окончание возбуждается, отрегулируйте положение электрода, чтобы точно определить место срабатывания (рецептивного поля, РФ), который требует минимальную интенсивность стимула (пороговое стимул). Отменить окончаний, с порога стимула> 3 мА 19.
  7. Вычислить скорость проводимости (CV) с 1) расстояние между раздражающего электрода на рецептивного поля (РФ) и на сайте записи и 2) задержки проводимости (например, 2В) между стимулом артефакта и начала потенциала действия ,
    CV (м / сек) = расстояние (мм) / задержка проводимости (мс).

4. Функциональная классификация механочувствительных колоректального афферентов

  1. После определения РФ по электрической стимуляции, применяются следующие три механические раздражители в РФ:
    1. Проведение зондирования стимул, нажав на кончик CalibraТед фон Фрея, как нейлон мононити (0,4 и 1 г силы) перпендикулярно к РФ на уплощенной colorectum.
    2. Проведение гладит стимул, осторожно поглаживая толстой слизистой оболочки с тонкой нити нейлона накаливания (10 мг силы) для создания небольшой напряжение сдвига поверхности в РФ.
    3. Проведение окружной участок с помощью управляемой компьютером силу привод, который поставляет косыми стрейч силу (0 - 170 минут при 5 мН / сек) в окружном направлении вдоль анти-брыжеечной края colorectum через грабли крючков, описанных в пункте 2.8 ,
  2. Оцените афференты как серозный (реагируют только на тупой зондирования), слизистой оболочки (ответить на слизистые поглаживания и тупой зондирования), мышечная (реагировать на окружном участке и тупой зондирования) мышечной / слизистой оболочки (реагировать на окружном участке, слизистой оболочки поглаживания и тупой зондирования), или МИА (не реагирует на любой из трех механических стимулов).
  3. Для брыжейки афферентов (только виннервация LSN), которые трудно, чтобы активировать выборочно электрической стимуляции, найдите их восприимчивыми окончания механической поглаживания / зондирования брыжейки.
  4. Для натяжных чувствительных афферентных (мышечной и опорно-слизистых), определяют порог срабатывания, что определяется как сила, которая вызывает первый ЗС в наклонной участке.
  5. Для серозных афферентов, запишите свои ответы на возрастанию уровня пунктата зондирования рецептивного поля, приводимого в действие силовой цилиндр, с компьютерным управлением.

5. Химическая Применение / Модуляция восприимчивы окончаний

  1. Запись исходных ответ на механический стимул (то есть, ответ на наклонной участке, пунктата проверка или слизистой оболочки поглаживания).
  2. Пальто нижний край кусок трубы (из латуни или нержавеющей стали, высотой 10 мм и 4 х 4 мм 2 квадратные или 4 - диаметром 5 мм) с вазелином и поместить его на рецептивного поля на colorectum.
  3. Удалятьраствор Кребса внутри трубы, и подвергнуть восприимчивой концовки 3 - 5 мин до 170 мкл раствора, содержащего химиката (ов), подлежащих испытанию.
  4. Следить за реакцией афферентных во время применения химикатов (некоторые афферентные являются chemosensitive).
  5. Извлеките химического раствора и трубку, чтобы прекратить действие химиката. В 4 - 6 мин, проверить реакцию афферентный к тому же механический стимул, как в базовом ответ.
  6. Повторно механического стимула снова после достаточного периода вымывания (> 15 мин).

6. Запись и Отличительной AP шипы

  1. Оцифровка электрические сигналы, записанные с аксонов на частоте 20 кГц и сохранить данные на компьютер. Мониторинг сигнала на линии с помощью аудио монитора.
  2. Анализ шипы AP офф-лайн и дискриминации отдельные единицы, основанные на анализе основных компонентов отдельных шип сигналов 25.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одна запись должна содержать не более йсроком на два легко discriminable активных блоков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Установки приведена на рисунке 1. Она включает в себя заказ камеру ткани, где находится colorectum в силиконовой подкладкой отсека ванны и прилагаемый к нему нерва в маслонаполненных отсека смежными полезных ископаемых. Двухкамерный камера изготовлены из твердого блока акрилового пластика с помощью станка с ЧПУ; Дно обоих отсеках впоследствии выложены фирмы силикона, что позволяет легко придавить от колоректального ткани. Внеклеточные точки доступа из дразнили нервных пучков записываются с использованием низкого шума, на батарейках дифференциальный усилитель с высоким коэффициентом ослабления синфазного (КОСС ~ 60 дБ). Коэффициент усиления усилителя установлен в x10,000 и диапазона полосовой фильтр на 0,3 до 10 кГц. Электрическая стимуляция colorectum доставляется оптически соединенный стимулятора в режиме постоянного тока с помощью концентрического электрода в контакте с толстой слизистой оболочки. Механическое раздражение (колоректальный стрейч и точечный зондирования) поставляется от сети переменного токаomputer-регулируемым усилием привода. АЦП и соответствующее программное обеспечение надзора за обе меры поощрения и записи процессов, отправив команду напряжение выходов инициировать механические и электрические стимулы, а также запись и оцифровка внеклеточные сигналы AP из дифференциального усилителя. Чтобы изолировать от механических и электрических источников шума, ткань камеры, микроскопа и дифференциальный усилитель размещены внутри клетки Фарадея, установленного на пневматической таблице воздуха.

Как показано на фиг.2А, colorectum с присоединенным нерва вырезали из мыши, разрезать вдоль анти-брыжеечной края, и закреплен с плоским в камере ткани силиконовой подкладкой; нерв помещают на стекл зеркала в соседней камере записи. Показано на рисунке 2B это представитель записи потенциала действия (AP) в ответ на электрическую стимуляцию РФ на пороге. AP в этой записи отстает от стимула искусстваifact (•) 49 мс из-за задержки проводимости из РФ в записи электрода, в результате расчетной скорости проводимости 0,43 м / сек, а в диапазоне с немиелинизированные C-волокна. Показано на рисунке 2C являются типичными ответы афферентного на раздражители, поставляемых стороны (зондирования РФ с фон Фрей-как мононити, 1 г, и тонкой слизистой поглаживания РФ, 10 мг). Эта запись содержит два легко discriminable афференты; только большая амплитуда афферентных реагирует на поглаживание. Как показано на рисунке 2D, афферентные ответы на зондирование оценивали также по компьютерным управлением силовой цилиндр, который обеспечивает на тот же сайт на colorectum серию точной временной и воспроизводимых механических сил (5, 10, 20, 40 и 80 млн, 5 Продолжительность сек). Кроме того, окружная протяжение colorectum (0 - 170 минут при 5 мН / сек) поставляется одним и тем же приводом с представителем ответ показано на рисунке 2Е

Как показано на рисунке 3, колоректальный афферентов могут быть функционально разделены на шесть классов, основанных на их профили отклика на трех различных механических стимулов (см шаг 4,2 выше). Все афферентные окончания для брыжейки афферентов кроме находились электрической стимуляции (е-стим; левом столбце, стрелки указывают стимулирования артефакт). Механически нечувствительные афференты (ММАС) не отвечает ни на один из трех механических раздражителей. В отличие от этого, все механочувствительных окончаний реагировать на зондировании (0,4 - 1,4 г). Среди них, мышечные и мышечно-слизистых окончаний также активируется окружности участка (0 - 170 млн), и, таким образом, называются растяжек чувствительных афферентов; мышечно-слизистых окончаний также активируется нажатием по (10 мг). Слизистые окончаний также активируется гладить (10 мг), но не растягиваться и серозную окончаний не активируется либо участке или поглаживания. Брыжеечные окончания идентифицированы путем механического ббросаясь брыжейки.

Показано на рисунке 4а представительства ответы стрейч-чувствительных афферентных вызванной трех последовательных круговых участков, разделенных на 5 мин. Цифры шипованные равномерно Binned на три бункеров и отображается в виде функций стимул-реакция на рисунке 4В, показывая высокую воспроизводимость как по величине, ответ (число шип) и порога срабатывания.

Это, в пробирке подготовка colorectum нерв также позволяет местного применения химикатов афферентных восприимчивы окончаний. Воздействие химических веществ ограничено регионах по всему афферентной РФ путем размещения латуни или трубки из нержавеющей стали на вершине толстой слизистой оболочки физически изолировать РФ от остальной части colorectum. Типичные результаты следующих химических приложения включают в себя: прямой активации афферентов при применении кислотного гипертонического раствора (AHS 26; фиг.5А), не активации, но приобретение механоре- с помощью МВД после применения воспалительной суп (IS 19; 5В), увеличение ответа (т.е. сенсибилизация) к механическим участке после применения IS (5С), а также снижение ответ на механическом растяжении после применения цГМФ (рис 5D).

Рисунок 1
Рисунок 1. Схематическое изображение экспериментальной установки. Colorectum нерв находится в двухкамерной камеры ткани и выделяют наряду с этапом дифференциального усилителя голову от другого электронного оборудования по клетке Фарадея. Каждый афферентных РФ определяется электрической стимуляции (электронная стим) на colorectum и проходят проверку трех механических раздражителей: нейлон мононити зондирования, слизистой оболочки поглаживание, и окружной участок. ТПД: //www.jove.com/files/ftp_upload/52310/52310fig1highres.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. Изображение через стереомикроскопа рассеченной colorectum с прикрепленным таза нерва (A) B -. E показать представительства записей. (B) Потенциал действия (AP), вызванный электрической стимуляцией (стимул артефакт, •). (C) Типичные ответы на ручных мононити зондирования и слизистой оболочки поглаживание. (D, E) Ответы на зондирование и окружности участка поставляемого силового привода с компьютерным управлением, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

jove_content "FO: Keep-together.within-страницу =" всегда "> Рисунок 3
Рисунок 3. Функциональная характеристика колоректального афферентных классов. Афферентов находятся электрической стимуляцией (E-стим, ↑) в colorectum и разделить на пять механочувствительных классов и один механически нечувствительной афферентных класс (MIA) на основе соответствующих профилей реагирования до трех механические раздражители:. зондирование, поглаживание, и растянуть Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Афферентные ответы на воспроизводимой, с компьютерным управлением механической стимуляции. (A) Отзывы в мышечно-слизистой Аразличны х до трех подряд увеличили участки (0 - 170 минут при 5 мН / сек; 5-минутного интервала между стимул). (B) Ответы (потенциала действия шипы) были равномерно Binned на три бункеров (0 - 57, 57 - 113 и 113 - 170 млн) и отображается в виде функций стимул-реакция; Порог срабатывания отображается на вставке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5
Рисунок 5. афферентные ответы на локализованного химического приложения восприимчивы окончаний. (A) Пример химиочувствительность в серозной афферентных к применению гипертонического раствора кислого (AHS). (B) пример приобретения механоре- (сенсибилизации) на МВД к концу. Это МВД не ответил прямовоспалительной суп (IS), но ответил на 1,4 г мононити зондирования впоследствии. (C) сенсибилизация (повышение величины отклика и снижению порога чувствительности), чтобы растянуть мышечной афферентных после воздействия ее окончание IS. (D) Ослабление ответ растягиваться в мышечно-слизистых оболочек афферентных после воздействия его окончания циклической гуанозин монофосфата (цГМФ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Пробирке подготовка colorectum нерва в описанной здесь оказался мощным подход к изучению нейронных функции кодирования отдельных колоректального афферентов, которые прекрасно дополняет другие нефункциональные подходы (например, клеточном, молекулярном и гистологические исследования) на висцеральных сенсорных нейронов ( ГЭЭ 27 для более подробной информации). Нервные механизмы, способствующие ноцицепции и долгосрочной колоректального гиперчувствительности были выявлены и фармакологические манипуляции были выполнены, что выявили цели, которые могли бы облегчить висцеральной боли. Следующие ключевые моменты, связанные с успешной реализации этого препарата приведены ниже: 1) уменьшение электрических помех, 2) увеличение детектирования сигнала, и 3) отбор стандартизированного стимула для оценки изменений кодирования афферентных. Кроме того, обсуждаются некоторые ограничения этого метода.

Потенциалы действия (AP) propagatiнг внутриклеточно вместе аксонов, как правило, трансмембранный потенциал 100 - 130 мВ. Тем не менее, из-за малой удельной емкости мембраны аксона, этот сравнительно большой деполяризации приводит только к небольшой электрический заряд перемещения через клеточную мембрану, которая может легко рассеивать в окружающую внеклеточную ткани / интерстициальной жидкости (который имеет электрический импеданс значительно более низкую чем липидной мембраны). Для внеклеточного записи из нервных волокон / аксонов, электрический сигнал, как правило, в диапазоне от микровольт, близких к величине тепловой / белого шума, связанного с типичной установки биоэлектрической записи, что делает уменьшение шума первый приоритет для успешного записи. Для наиболее эффективного изолировать от окружающей среды электрических помех, это может быть полезно, чтобы поместить ткань в камере, записи и заземляющих электродов, дифференциальный усилитель (DC питанием от батареи) и стереомикроскопом в клетке Фарадея. Если движение артефактс возникнуть, помещая клетку Фарадея на пневматической таблице воздуха, чтобы ослабить механическая вибрация является полезным. В идеале, записи и электроды, которые входят в "+" и "-" порты дифференциального усилителя, соответственно, должны иметь сравнимую импеданса по отношению к их общей земле и быть расположены близко друг к другу. Таким образом, любой внешний шум будет записан примерно в равной степени обеими электродами и подвергается строгому отклонения общего режима по дифференциального усилителя.

В нашей установке (2А), электрод погружают в перфузии раствором Кребса в ткани камеры в то время как записи электрод находится в контакте с тонкой нервной нити значительного сопротивления. Эта конфигурация одного электрода с нетривиальной несоответствия импеданса обычно не подходит для снижения уровня шума. Тем не менее, эта конфигурация обеспечивает удобство размещения мелкий нервное волокно на только одной электрода, которая особенно привлекательна при записи с мышью колоректального нервных волокон ограниченной длины (10 - 15 мм). Основываясь на нашем опыте, конфигурации с одним электродом является приемлемым, когда фоновый шум от пика до пика ниже 20 мкВ в записи. В противном случае, снижение шума в дальнейшем будет требовать конфигурацию записи двух электродов, в котором тонкая нерва нити должен быть в контакте с обеими записи и эталонных электродов, расположенных параллельно друг другу. Все крупные металлические детали внутри клетки Фарадея должны быть заземлены в звездной манере к одному общему земле, медный блок, в нашей установке. Уход должен быть приняты, чтобы избежать образования контуров заземления.

Для обеспечения внеклеточный обнаружения точек доступа, первым шагом является успешным рассечение colorectum-нервной ткани. Сжатие или вытягивание нерва во время вскрытия следует избегать, которые могут необратимо повредить нерв и влияют на AP проводимости. Стволовых расчлененный нерва также нуждается в тО быть свободным от любого подключенного мышечной ткани, которая просачивается калий при повреждении и может блокировать нервную проводимость деполяризацией. Это рассечение умение, как правило, приобрела через усердной практики в течение нескольких недель до нескольких месяцев и требует высокого уровня координации глаз-рука и ловкости в обращении и с помощью хирургических инструментов. Кроме того, чтобы избежать повреждения колоректального ткани, электрические стратегия поиска используется концентрический электрод, который имеет тупой, закругленный кончик и относительно большой диаметр (внешний Φ0.55 мм, внутренний Φ0.125 мм) и подключен к микроманипулятора по совместимый мост, в результате чего скромной механической силы, приложенной к поверхности слизистой оболочки (~ 100 мг). Для того чтобы получить большую сигнала в записи следа, AP-индуцированный ток трансмембранный должно быть направлено и "ловушке" на электроде путем создания небольшого импеданса мост между аксона нерва (ов) и поверхности электрода. Таким образом, Эпиневрий и Периневрий, что изолироватьнерв должны быть отсекали в процессе разделения нерва в тонких нитей толщиной ~ 10 мкм. Потому что AP-индуцированный ток трансмембранный значительно рассеивается в нескольких минутах ходьбы от мембране аксона, тоньше нервное волокно, как правило, приводит к лучшим соотношением сигнал-шум из-за большей близости аксоны "на поверхности электрода. В масляной камере минеральной, зеркало, что нерв накладывают на часто привлекает тонкий слой раствора Кребса (поверхность стекла является гидрофильным). Таким образом, необходимо, чтобы электрод записи и нервных волокон не находятся в контакте с поверхностью зеркала во время записи. Любые остаточные капли раствора Кребса, которые обеспечивают низкое сопротивление моста между электродом и поверхностью зеркала (то есть, шунтирование) позволит значительно снизить амплитуду сигнала в записи.

Этот препарат colorectum нерва позволяет изучать функциональные изменения афферентов после экспонированияФР в различных химических медиаторов и оскорблений в пробирке, а также в контексте долгосрочных патофизиологических условиях (например, colorectums, взятые из ранее обработанных мышей). Объективным показателем функциональных изменений афферентов зависит от следующего: 1) стандартизированного раздражителя с высокой точностью и воспроизводимостью и 2) афферентные ответы, которые надежным и воспроизводимым. Из трех механических раздражителей в colorectum, зондирования и гладил стимулы РФ зачастую предоставляются ручных фон Фрей-как мононити. Для зондирования, леска обычно калибруется, чтобы доставить воспроизводимый перпендикулярно силу при изгибе. Тем не менее, фон Фрея-подобные моноволокна (0,4 и 1 г) и имеют маленькие различные диаметров поперечных сечений (0,2 и 0,3 мм соответственно), что приводит к высокой номинальной стресса, когда применяется перпендикулярно поверхности ободочной (124,8 кПа в течение 0,4 г и 138,7 кПа 1 г), интенсивный, точечный механический стимул beyond нормального физиологического диапазона. Кроме того, острый край нити вероятно, вызывает неравномерное распределение напряжений с фокусным пике нагрузки значительно выше, чем номинальное напряжения (концентрации напряжений). Учитывая, что типичный размер РЧ (1 мм 2) существенно больше, чем в поперечном сечении моноволокна, а также невозможности воспроизводимо стимулировать идентичный сайт с ручным моноволокна, он является общим для наблюдения реакции на повторных раздражителей, которые отличаются значительно частоты и продолжительности AP. В качестве примера, ответы на зондирование показано на рисунке 2C той же ручной мононити (1 г), значительно различается который, вероятно, будут предоставлены в неспособностью воспроизводимо исследовать идентичные сайт и разную длительность и интервал между следующими стимулами. Слизистой поглаживая доставлены ручной нити аналогично сложным, а также, как правило, вызывают переменные ответов из того же афферентных. Стимул воспроизводимость может бытьулучшено с помощью силы исполнительного механизма, управляемого компьютером, чтобы доставить точные зондирования (и растяжения) силы. Для зондирования, используется мононить с большим диаметром (например, # 6,45, 1 мм), что более полно охватывает типичный афферентный RF 24,28. Компьютерным управлением по окружности растяжение, в отличие от других тканей растяжение подходов, направленных на РФ, позволяет однородную деформацию по всей длине colorectum, что делает возможным связь с колоректальным растяжения в его первоначальной цилиндрической конфигурации основаны на сопоставимой окружности механического напряжения (то есть, 0 - 170 мН растяжение эквивалентно 0 - 45 мм рт.ст. внутрипросветного давления 23). С натяжкой сила равномерно наносят на анти-брыжеечной края, а не непосредственно в РФ, вызвало локальное механическое напряжение в афферентной РФ является воспроизводимым между последовательными применения натяжкой. Кроме того, L-типа Ca 2+ канала блокатор нифедипин добавляют в ванну с Inhibit спонтанное сокращение гладкой мускулатуры, способствует поддержанию колоректального соответствии между наклонной стрейч испытаний 23. Наконец, в ответ на афферентные протокола наклонной растяжения, оказались воспроизводимыми с небольшой изменчивостью как в функции стимула-отклика, и отклика порога (например, рисунок 4). Таким образом, в ответ на афферентные наклонной участке были широко использованы в качестве объективной оценки изменений функции афферентных нейронов при изучении механизмов висцеральной боли и гиперчувствительности (например, 19-22,24,26,28-31).

Подготовка colorectum нерв является мощным инструментом для изучения толстой кишки висцеральных афферентов. Тем не менее, он также имеет некоторые ограничения. Во-первых, аксоны клеток органов сенсорных нейронов в спинном ганглия пересекаются в подготовке, исключающее изучение молекулярных идентичностей тех клеточных тел (например, отдельных клеток RT-PCR или TRanscriptome анализ различных классов колоректального афферентов). Во-вторых, низкий коэффициент сигнал-шум записи одноволоконного требует оптимального хирургического рассечение нерва / навыки расщепления и запись с низким уровнем шума, что значительно ограничивает широкое применение этого протокола в других лабораториях. В-третьих, этот препарат в пробирке, не могут быть применимы к исследованию системных факторов, которые модулируют висцерального ощущение, такие как вегетативной нервной системы, циркулирующей гормоны и цитокины, кишечной микробиоты и нисходящей модуляции от центральной нервной системы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica MZ16 stereo microscope Leica Microsystems Inc.
Leica IC D camera Leica Microsystems Inc.
Amplifier World Precision instruments, Inc. SYS-DAM80 Low-noise differential amplifier
Two-compartment tissue chamber Custom made
Power1401 Cambridge Electronic Design Limited Power1401 Data acquisition, analog signal input/out
Spike2 v5.02 Cambridge Electronic Design Limited Software package that works with the Power1401
Audio monitor Natus Am 8
Square pulse stimulator Natus S48 To deliver electrical stimuli
Photoelectric isolation unit Natus PSIU6 Stimulus isolation to reduce noise
Concentric bipolar microelectrode FHC Inc. CBFFG75 To deliver electrical stimuli
Dual-mode lever system Aurora Scientific Inc. Series 300C To deliver mechanical stimuli
Forceps Fine Science Tools 11252-00 Forceps with fine tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naliboff, B. D., et al. Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome. Gut. 41, 505-512 (1997).
  2. Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia by local rectal anesthesia in irritable bowel syndrome (IBS) patients. Pain. 105, 223-230 (2003).
  3. Verne, G. N., Sen, A., Price, D. D. Intrarectal lidocaine is an effective treatment for abdominal pain associated with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. Journal of Pain. 6, 493-496 (2005).
  4. Chey, W. D., et al. Linaclotide for irritable bowel syndrome with constipation: a 26-week, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate efficacy and safety. Am J Gastroenterol. 107, 1702-1712 (2012).
  5. Rao, S., et al. A 12-week, randomized, controlled trial with a 4-week randomized withdrawal period to evaluate the efficacy and safety of linaclotide in irritable bowel syndrome with constipation. Am J Gastroenterol. 107, 1714-1724 (2012).
  6. Busby, R. W., et al. Pharmacologic properties, metabolism, and disposition of linaclotide, a novel therapeutic peptide approved for the treatment of irritable bowel syndrome with constipation and chronic idiopathic constipation. J Pharmacol Exp Ther. 344, 196-206 (2013).
  7. Mei, N. Intestinal chemosensitivity. Physiol Rev. 65, 211-237 (1985).
  8. Mei, N., Lucchini, S. Current data and ideas on digestive sensitivity. J Auton Nerv Syst. 41, 15-18 (1992).
  9. Su, X., Gebhart, G. F. Mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat are polymodal in character. J Neurophysiol. 80, 2632-2644 (1998).
  10. McMahon, S. B., Morrison, J. F. Spinal neurones with long projections activated from the abdominal viscera of the cat. J Physiol. 322, 1-20 (1982).
  11. Cervero, F., Sann, H. Mechanically evoked responses of afferent fibres innervating the guinea-pig's ureter: an in vitro study. J Physiol. 412, 245-266 (1989).
  12. Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Mechanosensitive properties of pelvic nerve afferent fibers innervating the urinary bladder of the rat. J Neurophysiol. 72, 2420-2430 (1994).
  13. Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71, 2046-2060 (1994).
  14. Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. Activation of unmyelinated afferent fibres by mechanical stimuli and inflammation of the urinary bladder in the cat. J Physiol. 425, 545-562 (1990).
  15. Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. A novel type of unmyelinated chemosensitive nociceptor in the acutely inflamed urinary bladder. Agents Actions. 25, 219-221 (1988).
  16. Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127, 166-178 (2004).
  17. Meyer, R. A., Davis, K. D., Cohen, R. H., Treede, R. D., Campbell, J. N. Mechanically insensitive afferents (MIAs) in cutaneous nerves of monkey. Brain Res. 561, 252-261 (1991).
  18. Handwerker, H. O., Kilo, S., Reeh, P. W. Unresponsive afferent nerve fibres in the sural nerve of the rat. J Physiol. 435, 229-242 (1991).
  19. Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G170-G180 (2011).
  20. Feng, B., La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G1085-G1098 (2012).
  21. Feng, B., et al. Long-term sensitization of mechanosensitive and -insensitive afferents in mice with persistent colorectal hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G676-G683 (2012).
  22. Feng, B., et al. Altered colorectal afferent function associated with TNBS-induced visceral hypersensitivity in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G817-G824 (2012).
  23. Feng, B., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Differential roles of stretch-sensitive pelvic nerve afferents innervating mouse distal colon and rectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298, G402-G409 (2010).
  24. Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33, 9831-9839 (2013).
  25. Jolliffe, I. T. Principal component analysis. 2nd, Springer. New York, NY. (2002).
  26. La, J. H., Feng, B., Schwartz, E. S., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Luminal hypertonicity and acidity modulate colorectal afferents and induce persistent visceral hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G802-G809 (2012).
  27. Christianson, J. A., et al. plasticity and modulation of visceral afferents. Brain Research Reviews. 60, 171-186 (2009).
  28. Kiyatkin, M. E., Feng, B., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Combined genetic and pharmacological inhibition of TRPV1 and P2X3 attenuates colorectal hypersensitivity and afferent sensitization. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G638-G648 (2013).
  29. Brumovsky, P. R., Feng, B., Xu, L., McCarthy, C. J., Gebhart, G. F. Cystitis increases colorectal afferent sensitivity in the mouse. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297, G1250-G1258 (2009).
  30. Shinoda, M., Feng, B., Gebhart, G. F. Peripheral and central P2X receptor contributions to colon mechanosensitivity and hypersensitivity in the mouse. Gastroenterology. 137, 2096-2104 (2009).
  31. Tanaka, T., Shinoda, M., Feng, B., Albers, K. M., Gebhart, G. F. Modulation of visceral hypersensitivity by glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α-3 in colorectal afferents. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G418-G424 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics