Het benutten van de Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloadditiereacties voor Pretargeted PET Imaging

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. J. Vis. Exp. (96), e52335, doi:10.3791/52335 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

In de afgelopen dertig jaar heeft positron emissie tomografie (PET) uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in de klinische diagnostiek en behandeling van kanker. Antilichamen zijn lang beschouwd als veelbelovend vectoren voor het afgeven van positron emitterende radio-isotopen tumoren vanwege hun uitstekende affiniteit en specificiteit voor kanker biomarkers. 1,2 De relatief langzame in vivo farmacokinetiek van antilichamen draagt ​​het gebruik van radio-isotopen met meerdaagse de fysische halfwaardetijd. Deze combinatie kan een hoge stralingsdoses geven de niet-doelorganen patiënten, een belangrijke complicatie die van bijzonder klinisch belang omdat radioimmunoconjugaten intraveneus en daarom geïnjecteerd - in tegenstelling gedeeltelijke body CT scans - leiden tot geabsorbeerde doses in elk deel van het lichaam, ongeacht de ondervraagde weefsels.

Om dit probleem te omzeilen, heeft aanzienlijke inspanningen werden gewijd aan de ontwikpment van PET-imaging strategieën die de radio-isotoop en het richtende deel los te koppelen, waardoor gebruik te maken van de gunstige eigenschappen van antilichamen en tegelijkertijd plinten hun intrinsieke farmacokinetische beperkingen. Deze strategieën - het vaakst genoemd pretargeting of multistep targeting - typisch dienst vier stappen: (1) de toediening van een antilichaam kan binden zowel een antigeen en een radioligand; (2) de accumulatie van het antilichaam in het doelweefsel en de klaring uit het bloed; (3) de administratie van een klein molecuul radioligand; en (4) het in vivo ligatie van de radioligand aan het antilichaam, gevolgd door de snelle klaring van overmaat radioligand. 3-8 In sommige gevallen een extra klaringsmiddel wordt geïnjecteerd tussen stap 2 en 3 om de uitscheiding van antilichaam versnellen die straks de tumor binden en blijft in het bloed. 5

In grote lijnen, two soorten pretargeting strategieën meest voor in de literatuur. Hoewel beide succesvol zijn gebleken in preklinische modellen, ze bezitten ook belangrijke beperkingen die hun klinische toepasbaarheid hebben belemmerd. De eerste strategie is gebaseerd op de hoge affiniteit tussen streptavidine-geconjugeerde antilichamen en biotine gemodificeerde radiolabels; De immunogeniciteit van de met streptavidine gemodificeerde antilichamen heeft bewezen een zorgwekkende problemen betreffende de vertaling,. 5,6,9,10 De tweede strategie daarentegen stelt bispecifieke antilichamen die zijn genetisch gemanipuleerde zowel kanker binden biomarker antigeen en een klein molecuul radioactief hapteen. 3,11-14 Hoewel dit laatste route zeker creatief is de brede toepasbaarheid beperkt door de complexiteit, kosten en gebrek aan modulariteit van het systeem.

Onlangs hebben we ontwikkeld en publiceerde een pretargeted PET imaging methode op basis van de inverse elektron vraag Diels-Alder (IEDDA) cycloadditiereactie tussen trans -cyclooctene (TCO) en tetrazine (Tz;. Figuur 1) 11 Terwijl de reactie zelf is al decennia bekend, heeft IEDDA chemie een renaissance van de afgelopen jaren als een klik chemie bioconjugatie techniek, zoals geïllustreerd door het fascinerende werk van de groepen van Ralph Weissleder, Joseph Vos en Peter Conti onder anderen. 12-15 De IEDDA cycloadditiereactie heeft in een breed scala van instellingen werden toegepast, met inbegrip van fluorescentie beeldvorming met peptiden, antilichamen, en nanodeeltjes evenals nucleaire beeldvorming . met zowel radiohalogens en radiometals 16-26 De ligatie is een hoge opbrengst, schoon, snel (k 1> 30.000 M -1 sec -1), selectief, en - kritisch -. bioorthogonal 27 En terwijl een aantal soorten van click chemie - waaronder Cu gekatalyseerde azide-alkyn cycloaddities, stam bevorderde azide-alkyn cycloaddities en Staudinger ligaties -. zijn bioorthogonal als goed, het is de unieke combinatie van snelle reactie kinetiek en bioorthogonality dat maakt IEDDA chemie zo goed geschikt voor pretargeting toepassingen in hele organismen 28,29 Langs deze lijnen, is het belangrijk op te merken dat het recente rapport van onze laboratoria was niet de eerste die IEDDA chemie toepassing op pretargeting: het eerste verslag van pretargeted beeldvorming met IEDDA is ontstaan ​​uit het werk van Rossin, et al en werd gekenmerkt door een SPECT methode gebruik van een 111-gelabeld tetrazine 30..

Zoals hierboven besproken, de pretargeting methode vier relatief eenvoudige stappen (figuur 2). In het protocol bij de hand, een pretargeted strategie voor PET beeldvorming van colorectale kanker die een 64 Cu-NOTA gelabelde tetrazine radioligand en een TCO-gemodificeerde conjugaat van antilichaam huA33 werken worden beschreven. Echter, uiteindelijk de modulariteit van deze methode is een van de grdaarvan eet activa, trans -cyclooctene groep kan worden toegevoegd aan een niet-internaliserende antilichamen en de tetrazine kan worden aan diverse radioactieve reporters.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ETHIEK STATEMENT: Alle van de in vivo dierproeven beschreven werden uitgevoerd volgens een goedgekeurd protocol en onder de ethische richtlijnen van het Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).

1. Synthese van Tz-Bn-NOTA

  1. In een klein reactievat, ontbinden 7 mg NH 2 -BN-NOTA (1,25 x 10 -2 mmol) in 600 ul NaHCO3 buffer (0,1 M, pH 8,1). Controleer de pH van de oplossing. Indien nodig, de pH van de oplossing tot 8,1 met kleine hoeveelheden van 0,1 M Na 2 CO 3.
  2. Voeg de NH2 -BN-NOTA oplossing 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 -3 mmol) in een 1,7 ml microcentrifugebuis.
    OPMERKING: De Tz-NHS kan ofwel worden afgewogen droog of toegevoegd vanuit een stockoplossing van droge DMF of DMSO (<50 pi).
  3. Laat de verkregen reactieoplossing reageren gedurende 30 min bij KTonder zacht roeren.
  4. Na 30 min, zuivert het product met omgekeerde fase C18 HPLC chromatografie gereageerde NH2 -BN-NOTA verwijderen. De NH2 -BN-NOTA kunnen worden gevolgd bij een golflengte van 254 nm, terwijl de Tz-NHS en Tz-Bn-NOTA best gevolgd bij een golflengte van 525 nm.
    OPMERKING: De retentietijden zijn uiteraard sterk afhankelijk van de HPLC-uitrusting opstart van elk laboratorium (pompen, kolommen, buizen, enz.). Echter, om een voorbeeld te presenteren, als een gradiënt van 0: 100 MeCN / H2O (beide met 0,1% TFA) tot 100: 0 MeCN / H2O gedurende 25 min en een analytisch 4,6 x 250 mm C 18 kolom gebruikt , de retentietijden van Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, en NH 2 -BN-NOTA zal ongeveer 15 min, 16,5 min en 10 min, respectievelijk. Het product kan worden gezuiverd van de andere reactiecomponenten in een enkele run of meerdere runs met een semi-preparatieve of preparatieve C 18 HPLC-kolom. 1H-NMR, analeytical HPLC, en ESI-MS zijn alle methoden die kunnen worden gebruikt om de zuiverheid van de voltooide Tz-Bn-NOTA precursor controleren. 11
  5. Bevries de verzamelde HPLC eluens met behulp van vloeibare stikstof.
  6. Wikkel de collectie buis in ondoorzichtige aluminiumfolie.
  7. Leg de bevroren collectie buis in een vriesdrogen vat O / N om het HPLC mobiele fase te verwijderen.
  8. Bewaar het gezuiverde product (heldere roze vaste stof) in het donker bij -80 ° C.
    Opmerking: Dit is een aanvaardbare stopplaats in de procedure. De voltooide Tz-Bn-NOTA precursor is stabiel gedurende tenminste 1 jaar onder deze omstandigheden.

2. Voorbereiding van huA33-TCO immuunconjugaat

  1. In een 1,7 ml microcentrifugebuis, stelt een 1 mg / ml (2,7 mM) oplossing van TCO-NHS in droge DMF.
  2. In een 1,7 ml microcentrifugebuis, stelt een 2 mg / ml (13,3 uM) oplossing van huA33 in 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 (0,01 M PO 4 3-
  3. Gebruik van kleine hoeveelheden (<5 ui) 0,1 M Na 2 CO 3, de pH van het antilichaam oplossing 8,8-9,0. Gebruik ofwel pH-papier of een pH-meter met een micro-elektrode om de pH te controleren, en wees voorzichtig niet om de pH boven pH 9,0 te stijgen.
  4. Zodra het antilichaam oplossing de juiste pH, voeg een volume van de TCO-NHS die overeenkomt met 8 molaire equivalenten van de geactiveerde ester. Voeg bijvoorbeeld 7.9 ul van de 1 mg / ml TCO-NHS oplossing (1,07 x 10 -7 mol TCO-NHS) tot 1 ml 2 mg / ml huA33 antilichaam oplossing (1,33 x 10 -8 mol huA33). Niet meer dan 5% DMF per volume in de oplossing.
  5. Meng de oplossing door het omkeren van de microcentrifugebuisje meerdere malen.
  6. Wikkel de microcentrifugebuisje in ondoorzichtige aluminiumfolie.
  7. Laat de oplossing geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht roeren.
  8. Na 1 uur bij KT, zuiveren de resulterende immunoconjugaat met een voorverpakte wegwerp SIZe uitsluiting ontzoutingskolom. Ten eerste spoel de grootte-uitsluiting beschreven door de leverancier conserveringsmiddelen aanwezig op de kolom tijdens opslag te verwijderen. Voeg vervolgens het reactiemengsel om de grootte-uitsluiting, spoel de kolom met 1,5 ml 0,9% steriele zoutoplossing, en vervolgens het product met 2 ml 0,9% steriele zoutoplossing als elutiemiddel verzamelen.
    OPMERKING: Deze stap zal het ingevulde huA33-TCO opleveren als een 2 ml oplossing.
  9. Meet de concentratie van de verkregen huA33-TCO op een UV-Vis spectrofotometer.
  10. Als een hogere concentratie gewenst, concentreren de huA33 TCO-oplossing met behulp van een centrifugale filtereenheid met een 50.000 molecuulgewicht cut-off.
    Opmerking: Het is belangrijk op te merken dat terwijl huA33 en diverse andere bekende antilichamen (bijvoorbeeld bevacizumab, trastuzumab, cetuximab en J591) zijn zeer tolerant geconcentreerd, aggregatie en precipitatie kan optreden bij concentraties in andere gevallen. Onderzoekers wordt geprobeerd dit procedure een nieuw antilichaam moet vertrouwen op de literatuur en hun eigen kennis van het antilichaam in kwestie met betrekking tot of het antilichaam concentreren.
  11. Bewaar de ingevulde huA33-TCO immuunconjugaat bij 4 ° C in het donker.
    Opmerking: Dit is een aanvaardbare stopplaats in de procedure. De voltooide mAb-TCO conjugaat moet stabiel zijn gedurende ten minste 3 maanden onder deze opslagomstandigheden.

3. 64 Cu Radioactief merken van Tz-Bn-NOTA

Opmerking: deze stap van het protocol omvat de behandeling en manipulatie van radioactiviteit. Voordat u deze stappen - of het uitvoeren van enig ander werk met radioactiviteit - onderzoekers moeten overleggen met Radiation Safety Department hun eigen instelling. Neem alle mogelijke stappen om de blootstelling aan ioniserende straling te minimaliseren.

  1. In een 1,7 ml microcentrifugebuis Bereid een 0,5 mg / ml (723 pM) oplossing van Tz-Bn-NOTA.
  2. In een 1,7 ml MicroCentrifuge buis, voeg 10 ul van de Tz-Bn-NOTA oplossing (5 ug) 400 gl 0,2 M NH4 OAc pH 5,5 buffer.
  3. In het belang van een goede radiochemische nota boekhouding, meten en registreren van de hoeveelheid radioactiviteit in het monster met een dosiskalibrator vóór en na de daaropvolgende stappen in de onderstaande protocol (3,4-3,8). Dit zal helpen bij de nauwkeurige bepaling van radiochemische opbrengsten.
  4. Voeg 2,000 uCi (74 MBq) van 64 Cu de Tz-Bn-NOTA oplossing.
    OPMERKING: Typisch [64 Cu] CuCl2 wordt in een klein volume (<30 pi) 0,1 N HCl, en aldus slechts kleine hoeveelheden (<10 pi) van deze voorraadoplossing nodig voor radiolabeling reactie. Als grotere volumes van de [64 Cu] CuCl2 voorraad nodig zijn, de radiomerking reactie is tolerant ten opzichte van het totale volume reactie verhogen. Toch moet de pH van de radioactief reactieoplossing zorgvuldig worden gecontroleerd om te waarborgendat niet onder pH 4,0 valt.
  5. Laat de oplossing geïncubeerd gedurende 10 min bij kamertemperatuur onder zacht roeren.
  6. Na 10 min incubatie, zuivert het product middels tegenfase-C18-HPLC chromatografie. De retentietijden zijn uiteraard sterk afhankelijk van de HPLC-uitrusting opstart van elk laboratorium (pompen, kolommen, buizen, enz.). Echter, om een voorbeeld te presenteren, als een gradiënt van 5:95 MeCN / H2O (beide met 0,1% TFA) tot 95: 5 MeCN / H2O gedurende 15 min wordt gebruikt, de retentietijd van 64 Cu-Tz- Bn-NOTA moet ongeveer 9,8 min, terwijl vrij, ongecomplexeerde 64 Cu elueren met het oplosmiddel voorzijde rond 2-4 min.
  7. Met een roterende verdamper, verwijder de HPLC eluent.
  8. Los het 64 Cu-Tz-Bn-NOTA product in 0,9% steriele zoutoplossing.
    OPMERKING: Aangezien 12.7 hr fysische halveringstijd van 64 Cu, is dit niet aanvaardbaar stopplaats in de procedure. Voer de synthese van 64 Cu-Tz-Bn-NOTEen onmiddellijk voorafgaand aan de injectie van de radioactieve, en volg stap 3.7 onmiddellijk voor stap 4.5.

4. In Vivo Pretargeted PET Imaging

OPMERKING: Net als in Protocol afdeling 3, deze stap van het protocol heeft betrekking op de behandeling en manipulatie van radioactiviteit. Voordat u deze stappen onderzoekers moeten overleggen met Radiation Safety Department hun eigen instelling. Neem alle mogelijke stappen om de blootstelling aan ioniserende straling te minimaliseren.

  1. In een vrouwelijke athymische naakt muis, subcutaan implantaat 1 x 10 6 SW1222 colorectale kanker cellen en laat deze uit te groeien tot een 100-150 mm 3 xenogreffe (9-12 dagen na inenting). 11
  2. Verdun een aliquot van de huA33 TCO-oplossing van protocol van 2 tot een concentratie van 0,5 mg / ml in 0,9% steriele zoutoplossing.
  3. Injecteer 200 ui van het huA33-TCO (100 ug) in de staartader van de xenograft-dragende muis.
  4. Wacht 24 uur voor de accumulatie van de huA33-TCO in de tumor van de muis.
  5. Verdun de 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radioligand tot een concentratie van 1,5 mCi / ml in 0,9% steriele zoutoplossing.
  6. Injecteer 200 ui van de 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radioligand oplossing (300 uCi, 11,1 MBq 1,6 nmol 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, uitgaande van een specifieke activiteit van 6,7 MBq / nmol) in de staartader van de xenograft-dragende muizen.
  7. Op het gewenste beeldvormende tijdstip (bijvoorbeeld 2, 6, 12 of 24 uur na injectie), verdoven de muis met een 2% isofluraan: zuurstof gasmengsel.
  8. Plaats de muis op het bed van de kleine dieren PET-scanner. Handhaaf anesthesie tijdens de scan met behulp van een 1% isofluraan: zuurstof gasmengsel. Voorafgaand aan het plaatsen van het dier op de scanner bed, controleren verdoving met behulp van de teen-snuifje methode en veterinaire zalf voor de ogen van de muis om te drogen tijdens anesthesie te voorkomen.
  9. Verwerven van de PET-gegevens voor de muis via een statischescannen met een minimum van 20 miljoen samenvallende gebeurtenissen met behulp van een energie raam van 350-700 keV en een toeval timing raam van 6 nanoseconden. Na het voltooien van de overname van het beeld, hoeft de muis niet onbeheerd achter en plaats het niet in een kooi met andere muizen tot hij weer bij bewustzijn is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De eerste drie stappen van het experiment - de synthese van Tz-Bn-NOTA, de conjugatie van TCO huA33 en de radiolabeling van het Tz-Bn-NOTA construct (figuren 3 en 4) - zeer betrouwbaar. Bij de bovenstaande procedure werd Tz-Bn-NOTA construct gesynthetiseerd in hoge opbrengst en zuiverheid. De huA33 antilichaam werd gemodificeerd met 4,2 ± 0,6 TCO / mAb en Tz-Bn-NOTA werd radioactief gemerkt met 64 Cu tot het gezuiverde radioligand op in> 99% radiochemische zuiverheid> 85% verval gecorrigeerde opbrengst en een specifieke activiteit van ~ 6,7 MBq / nmol (figuur 5). De reactiviteit van de huA33 TCO-conjugaat en tetrazine radioligand kan worden getest met behulp van radioactieve onmiddellijke dunnelaagchromatografie (ITLC). Dit gebeurt door het mengen van het radioactief gemerkte tetrazine (100 uCi, 0,55 nmol, uitgaande van een specifieke activiteit van 6,7 MBq / nmol) met een lichte overmaat huA33-TCO (50 ug; 0,66 nmol) in phosphate-gebufferde zoutoplossing (pH 7,4) bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Vervolgens ongeveer 1 uCi de oplossing gespot op een omgekeerde fase C 18 TLC-plaat en drogen. De TLC wordt uitgevoerd in 9: 1 MeCN: H2O en de plaat geanalyseerd met een radioactieve TLC plaatlezer. Als de klik reactie werkt zoals gepland, moet de geligeerd 64 Cu-NOTA-A33 op de basislijn blijven; Als, aan de andere kant, de reactie niet wordt vrij 64 Cu-Tz-Bn-NOTA verschijnen op of nabij het ​​vloeistoffront.

Verplaatsen naar de in vivo imaging experimenten in de hierboven beschreven protocol, werden athymische naakt muizen met A33-antigeen tot expressie, SW1222 colorectale kanker xenotransplantaten gebruikt. Zowel acute biodistributie (n = 5 per tijdstip) en PET-beeldvorming (n = 12) experimenten blijkt dat de pretargeting strategie kan afbakening van de colorectale tumorgroei met uitstekende beeldcontrast en hoge tumor-tot-achtergrond verhouding activiteit (Figuur 6). Opname van de 64 Cu-Tz-Bn-NOTA in de tumor blijkt op vroege tijdstippen: 3,5% ± 0,6% ID / g en 4,1% ± 0,6% ID / g bij 1 uur en 4 uur na injectie, respectievelijk. Echter, op deze eerste punten, het gemakkelijk gestoord door de hoeveelheid radioactiviteit clearing via het darmkanaal van de muis (11,9% ± 4,4% ID / g en 8,8% ± 3,4% ID / g in de feces 1 uur en 4 hr pi, respectievelijk). In de loop van enkele uren, de overmaat radioligand wist via de feces (1,4% ± 0,5% ID / g bij 24 uur pi), en de tumor wordt het meest opvallende kenmerk van de afbeelding (4,0% ± 0,9% ID / g bij 24 uur pi). In deze latere tijdstippen is de tumor goed afgebakend in het beeld en de tumor-tot-achtergrond activiteit verhoudingen vrij hoog; bijvoorbeeld de strategie levert tumor: spier verhoudingen van 26,6 ± 6,6 bij 12 uur pi en 27,0 ± 7,4 bij 24 uur pi Vanzelfsprekend, controle-experimenten met alleen 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, niet-specifieke antilichamen, or huA33 zonder geconjugeerd TCO resten alle geleid tot minimale opname in de tumor.

Zoals verder hieronder zal worden besproken, deze pretargeting strategie - zoals alle pretargeting strategie - een aantal variabelen die optimalisatie vereisen wanneer toegepast op nieuwe antilichaam / antigeen systemen. Twee van de belangrijkste zijn de massa van mAb-TCO construct geïnjecteerd en de lengte van het interval tussen de injectie van het mAb-TCO construct en de injectie van het radioligand. Als de hoeveelheid mAb-TCO conjugaat te hoog of de intervaltijd tussen de injecties te kort, de hoeveelheid vrije mAb-TCO in het bloed stijgt en de kans click reacties die in bloed in plaats van op de tumor verhoogt. Bijvoorbeeld, in de 64 Cu / huA33 systeem besproken, zowel de toediening van 300 ug huA33 (in plaats van 100 ug) of het gebruik van een 12 uur interval (in plaats van 24 uur) leidde tot een merkbare groei tHij hoeveelheid radioactiviteit zichtbaar in het hart van de muis (Figuur 7A en Figuur 7B, respectievelijk). In beide gevallen wordt de click reactie nog duidelijk optreedt bij de tumor, zoals geïllustreerd door de hoeveelheid tumorale opname op vroege tijdstippen; De vorming van radiogelabelde antilichamen in het bloed ook duidelijk. Hoewel dit verleidelijk te verwerpen omdat het radioactief gemerkte antilichaam gevormd in het bloed uiteindelijk toch zijn weg naar de tumor vinden, deze enigszins in tegen het doel van het gebruik van een pretargeting methode, zoals het radioactief gemerkte antilichaam langzaam circuleren voordat het de tumor bereikt en daardoor kunnen de dosistempi naar non-target organen. Omgekeerd, indien te weinig antilichaam wordt toegepast, de hoeveelheid van opname in de tumor onder lijden. Te lange interval tijden kunnen ook het niveau van de tumor opname te verminderen als gevolg van trage antilichaam internalisatie, transcyclooctene isomerisatie, of antilichaam / antigeen vergieten. De diagnose van these problemen is een grotere uitdaging en kan niet eenvoudig worden bereikt door het onderzoek van de PET-data. Het is duidelijk dat een delicaat evenwicht worden gehandhaafd. Derhalve wordt aanbevolen dat alle onderzoekers geprobeerd om deze strategie toepassen op een nieuw antilichaam / antigen systeem grote hoeveelheden mAb-TCO construct (≥ 200 pg) en korte tussentijden (≤ 24 uur) als uitgangspunt en optimaliseren van daaruit.

Figuur 1
Figuur 1. De inverse elektron-demand Diels-Alder [4 + 2] cycloadditiereacties klik ligatie tussen tetrazine en transcyclooctene.

Figuur 2
Figuur 2. Een illustratie van de vier stappen van de pretargeting methodiek. Is dit cijfer gebaseerd op onderzoek oorspronkelijk gepubliceerd in JNM. Zeglis, BM et al. Een pretargeted PET imaging strategie based op bioorthgonal Diels-Alder klik chemie. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 door de Vereniging van Nucleaire Geneeskunde en Moleculaire Beeldvorming, Inc. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Een regeling voor de wijziging van huA33 met TCO-NHS.

Figuur 4
Figuur 4. Een regeling voor de synthese en 64 Cu radiomerking van Tz-Bn-NOTA. Is dit cijfer gebaseerd op onderzoek oorspronkelijk gepubliceerd in JNM. Zeglis, BM et al. Een pretargeted PET imaging strategie gebaseerd op bioorthgonal Diels-Alder-click chemie. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). &# 169; 2013 door de Vereniging van Nucleaire Geneeskunde en Moleculaire Beeldvorming, Inc. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. Een radio-HPLC-spoor van gezuiverd 64 Cu-Tz-Bn-NOTA.

Figuur 6
Figuur 6. PET-beelden van 64 Cu-Tz-Bn-NOTA / A33-TCO pretargeting strategie. De muizen die subcutane SW1222 xenograften (100-150 mm 3) werden toegediend huA33-TCO (100 ug) via staartaderinjectie. Na 24 uur werden dezelfde muizen toegediend 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 gCi]) via staartaderinjectie en vervolgens afgebeeld 2, 6, 12, en 18 uur na de toediening van de radiofarmaceutische. Transverse (boven) en coronale (onderste) planaire beelden kruisen het midden van de tumoren. Hoge niveaus van opname in de darm op vroege tijdstippen (bijvoorbeeld, 2 en 6 uur) grotendeels vrij van 12 uur, waarbij de tumor (witte pijl) duidelijk afgebakend uit alle niet-doelweefsel met 12 en 18 uur na injectie. Dit cijfer is gebaseerd op onderzoek oorspronkelijk gepubliceerd in JNM. Zeglis, BM et al. Een pretargeted PET imaging strategie gebaseerd op bioorthgonal Diels-Alder-click chemie. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 door de Vereniging van Nucleaire Geneeskunde en Moleculaire Beeldvorming, Inc. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7
Figuur 7. PET beelden van suboptimale pretargeting experimenten. (A) Muizen bearing subcutane SW1222 xenograften (100-150 mm 3, pijl) werden toegediend huA33-TCO (100 ug) via staartaderinjectie. Na 12 uur werden dezelfde muizen waaraan 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 uCi]) staartader injectie. (B) Muizen die subcutane SW1222 xenograften (100-150 mm 3, pijl) werden toegediend A33-TCO (300 ug) via staartaderinjectie. Na 24 uur werden dezelfde muizen waaraan 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 uCi]) staartader injectie. In beide gevallen werden de muizen afgebeeld 12 uur na de injectie van 64 Cu-Tz-Bn-NOTA. In beide panelen, dwars (boven) en coronale (onderste) planaire beelden kruisen het midden van de tumoren. Terwijl de pretargeting strategie stelt een duidelijke tumor in beide gevallen, de resultaten in beide beelden zijn sub-standaard vergeleken met die weergegeven in figuur 6. Zowel 7A en 7B, is eenaanzienlijke hoeveelheid achtergrond activiteit opname in het hart. Onder de omstandigheden van figuur 7A is dit waarschijnlijk het gevolg van de huA33 TCO-construct niet genoeg tijd om te lokaliseren in de tumor. Onder de omstandigheden van figuur 7B, is waarschijnlijk een gevolg van het injecteren teveel huA33-TCO en met overmaat immunoconjugaat nog circuleren in het bloed zelfs 24 uur na injectie. Dit cijfer is gebaseerd op onderzoek oorspronkelijk gepubliceerd in JNM. Zeglis, BM et al. Een pretargeted PET imaging strategie gebaseerd op bioorthgonal Diels-Alder-click chemie. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). 2013 door de Vereniging van Nucleaire Geneeskunde en Moleculaire Beeldvorming, Inc. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het belangrijkste voordeel van deze pretargeted PET strategie is dat het in staat is afbakenen tumoren met target-to-background beeldcontrast slechts een fractie van de achtergrondstraling dosis geproduceerd door direct gemerkte antilichamen. Bijvoorbeeld, in de colorectale kanker beeldvormingssysteem beschreven, gegevens van acute experimenten van biologische verdeling werden toegepast voor dosimetrische berekeningen voor de 64 Cu gebaseerde pretargeting strategie voeren met direct gelabelde 64 Cu-NOTA-huA33 en 89 Zr-DFO-huA33. Deze berekeningen duidelijk de dosimetrische voordelen van de pretargeting systeem, vooral in vergelijking met de meer klinisch relevante 89 Zr-gemerkt antilichaam. De effectieve dosis van de pretargeting strategie is 0,0124 mSv / MBq, terwijl die van 89 Zr-DFO-huA33 is meer dan 30 keer hoger: 0,4162 mSv / MBq. De dosimetrische voordeel pretargeting minder uitgesproken bij het ​​vergelijken van de 64 Cu gemerkte antibody (0,0359 mSv / MBq), al is het voordelige effect bestaat nog steeds.

Een van de belangrijkste punten van deze IEDDA pretargeting methode is de modulariteit: trans -cyclooctene kan worden toegevoegd aan een antilichaam dat niet internaliseren en diverse ladingen kan worden bevestigd aan de tetrazine. Inderdaad, onze belangrijkste motivatie voor het schrijven van dit protocol is om andere onderzoeksgroepen in staat stellen om deze methode met verschillende antilichaam / antigeen / radio-isotopen systemen in dienst. Volgens die lijnen, zijn wij van mening is het essentieel om een ​​aantal zaken die de onderzoekers moet overwegen bij de aanpassing van deze methodiek voor andere systemen aan te pakken.

Ten eerste, de keuze van het antilichaam enorm belangrijk. Simpel gezegd, moet het antilichaam niet-internaliserende of geïnternaliseerde op een zeer lage tarief. Hoewel de ideale kinetische parameters nader te bepalen, het antilichaam en het reactieve trans -cyclooctene zij werkzaam moet aanblijvende buitenkant van de cel, de internalisatie en vastlegging van het antilichaam voorafgaand aan de injectie van de radioactieve ligand zal drastisch het aantal in vivo op reacties verlagen. In het hier beschreven systeem, huA33 antilichaamdoelen en bindt aan het A33-antigeen, een transmembraan glycoproteïne tot expressie gebracht in> 95% van de colorectale kankers. Belangrijk is aangetoond dat zelfs na binding zijn doel, de huA33 antilichaam / antigen complex blijft op het oppervlak van de cel dagen. 31-33 Hoewel de noodzaak van een niet-internaliserend antilichaam is weliswaar een beperking van de strategie, een grote verscheidenheid van niet-internaliserende antilichamen zijn bekend, wellicht met name de TAG72 targeting CC49 antilichaam dat Rossin, et al. onderzocht hun uitstekende pretargeting werk. 30,34,35

Ten tweede, dit pretargeting strategie - net als alle andere - vergt aanzienlijke optimalisatie. Naast de identiteit van de eenntibody en de tetrazine radioligand, moeten er twee kritische variabelen worden beschouwd: de hoeveelheid antilichaam geïnjecteerd en het interval tussen de injecties van het antilichaam en het radioligand. We hebben deze beide variabelen in het Representatieve resultaten boven gericht, maar kort herhalen indien een teveel antilichaam of te korte intervaltijd wordt toegepast, significante hoeveelheden mAb-TCO conjugaat in het bloed blijven op het tijdstip van de injectie van het radioligand. Dit op zijn beurt zal leiden tot het in vivo klik ligatie voorkomen in het bloed in plaats van op de tumor vormen circuleren, radioactief gemerkt antilichaam dat slechts langzaam ophopen in de tumor tijd. Omgekeerd, als een van beide te weinig antilichaam of te lang een interval tijd in dienst is, de uiteindelijke hoeveelheid radioactiviteit in de tumor zal suboptimaal zijn. Naar onze mening, het uitvoeren van strenge beeldvorming, of bij voorkeur, acute biologische verdeling experimenten met de direct gemerkt antilichaam itself voorafgaand aan elke pretargeting experimenten is de meest betrouwbare manier om te leren over de hoeveelheid antilichaam die nodig is en de ideale interval tijd na de eerste injectie van antilichaamconstruct. Voor verschillende geïnjecteerde massa radioactief gemerkt mAb zullen deze experimenten concrete gegevens verstrekken over zowel de goedkeuring van de radioimmunoconjugaat uit het bloed en accumulatie in de tumor, waardoor de selectie van de meest veelbelovende voorwaarden voor pretargeting experimenten.

Tenslotte moet de farmacokinetiek van de tetrazine gebaseerde radioligand worden overwogen bij het kiezen van een geschikte radio-isotoop. In het hier beschreven systeem wordt het radioactief gemerkte Tz-Bn-NOTA groep uitgescheiden uit het lichaam via de darm met een biologische halfwaardetijd van ongeveer 3-4 uur, waardoor 64 de Cu-positron emitterende radio-isotopen met de complementaire fysieke half- het leven. Helaas, de biologische halfwaardetijd van de tetrazine rest is te lang voor het verenigbaar is met th zijne sneller rottende radiometaal 68 Ga (t 1/2 = 68 min). In dit geval zou elke radioactiviteit in de tumor verval door verschillende halfwaardetijden voordat de overmaat radioligand klaar opruimen uit het lichaam. Daardoor zou beelden ten vroege tijdstippen, waarop tumor te achtergrondactiviteit ratio laag nog worden verkregen 36 Idealiter toekomstige generaties tetrazine radioliganden worden gemanipuleerd -. Misschien via PEGylatie, glycosylering, of andere middelen - uitscheiden van het lichaam sneller. Dit zou voor radioactief merken met snellere rottend radioisotopen zoals 68Ga en 18F, wat weer verder zou verbeteren de dosimetrische voordelen van de pretargeted imaging strategie. Uiteindelijk onderzoekers passen deze technologie voor gebruik met andere radio-isotopen voor beeldvorming (bijvoorbeeld 124 I, 111 In, 18F, 89 Zr, 68Ga, etc.) of therapie (bv 177 Lu, 225 Ac, 125I, etc.), nieuwe tetrazine gebaseerde liganden moeten worden ontwikkeld om verschillende chelatoren of radiolabeling prosthetische groepen bevatten. Het grondig onderzoek van de farmacokinetiek van deze nieuwe constructies zal van essentieel belang om ervoor te zorgen voordelige wedstrijden tussen de klaring eigenschappen van de liganden en de fysische halveringstijd van de radionucliden zijn.

Op het einde, we hopen van harte dat andere onderzoekers zien de belofte van deze pretargeting technologie en in dienst met nieuwe antilichaam / antigeen-systemen. Terwijl de voorgaande paragrafen illustreren dat dit aanpassingsproces niet altijd eenvoudig zijn, geloven we dat deze methode een aanzienlijke invloed op nucleaire beeldvorming, doelgerichte radionuclide therapie, en verder kan hebben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrazine NHS Ester Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA Macrocyclics B-601 Store at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50, 2-5 (2009).
  2. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40, 6168-6195 (2011).
  3. Hollander, N. Bispecific antibodies for cancer therapy. Immunotherapy. 1, 211-222 (2009).
  4. Liu, G., et al. Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino, a DNA analog. Journal of Nuclear Medicine. 43, 384-391 (2002).
  5. Boerman, O. C., van Schaijk, F. G., Oyen, W. J. G., Corstens, F. H. M. Pretargeted radioimmunotherapy of cancer: Progress step by step. Journal of Nuclear Medicine. 44, 400-411 (2003).
  6. Goldenberg, D. M., Sharkey, R. M., Paganelli, G., Barbet, J., Chatal, J. F. Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy. Journal of Clinical Oncology. 24, 823-834 (2006).
  7. Sharkey, R. M., Chang, C. H., Rossi, E. A., McBride, W. J., Goldenberg, D. M. Pretargeting: taking an alternate route for localizing radionuclides. Tumor Biology. 33, 591-600 (2012).
  8. Sharkey, R. M., et al. Improving the delivery of radionuclides for imaging and therapy of cancer using pretargeting methods. Clinical Cancer Research. 11, 7109-7121 (2005).
  9. Schultz, J., et al. A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy. Cancer Research. 60, 6663-6669 (2000).
  10. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. Journal of Nuclear Medicine. 44, 1284-1292 (2003).
  11. Zeglis, B. M., et al. A pretargeted PET imaging strategy based on bioorthgonal Diels-Alder click chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013).
  12. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130, 13518-13519 (2008).
  13. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Hatin, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angewandte Chemie-International Edition. 48, 7013-7016 (2009).
  14. Devaraj, N. K., Weissleder, R. Biomedical applications of tetrazine cycloadditions. Accounts of Chemical Research. 44, 816-827 (2011).
  15. Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-based cycloadditions: application to pretargeted live cell imaging. Bioconjugate Chemistry. 19, 2297-2299 (2008).
  16. Keliher, E. J., Reiner, T., Turetsky, A., Hilderbrand, S., Weinberg, R. A. High-yielding, two-step 18F labeling strategy for 18F-PARP1 inhibitors. ChemMedChem. 6, 424-427 (2011).
  17. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. ChemBioChem. 11, 2375-2377 (2010).
  18. Reiner, T., Keliher, E. J., Earley, S., Marinelli, B., Weissleder, R. Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger-assisted high-performance method. Angewandte Chemie International Edition. 50, 1922-1925 (2011).
  19. Taylor, M. T., Blackman, M., Dmitrenko, O., Fox, J. M. Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Journal of the American Chemical Society. 133, 9646-9649 (2011).
  20. Selvaraj, R., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of integrin alpha(v)beta(3) targeted PET tracer based on a cyclic RGD peptide. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 21, (3), 5011-5014 (2011).
  21. Liu, S., et al. Efficient 18F labeling of cysteine-containing peptides and proteins using tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Molecular Imaging. 12, 121-128 (2013).
  22. Han, H. S., et al. Development of a bioorthogonal and highly efficient conjugation method for quantum dots using tetrazine-norbornene cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132, 7838-7839 (2010).
  23. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22, 2048-2059 (2011).
  24. Zeng, D., Zeglis, B. M., Lewis, J. S., Anderson, C. J. The growing impact of bioorthogonal click chemistry on the development of radiopharmaceuticals. Journal of Nuclear Medicine. 54, 829-832 (2013).
  25. Reiner, T., Zeglis, B. M. The inverse electron demand Diels-Alder reaction in radiochemistry. Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals. 57, 285-290 (2014).
  26. Li, Z., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes. Chemical Communications. 46, 8043-8045 (2010).
  27. Karver, M. R., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Synthesis and evaluation of a series of 1,2,4,5-tetrazines for bioorthogonal conjugation. Bioconjugate Chemistry. 22, 2263-2270 (2011).
  28. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48, 6973-6998 (2009).
  29. Bosch, S. M., et al. Evaluation of strained alkynes for Cu-free click reaction in live mice. Nuclear Medicine and Biology. 40, 415-423 (2013).
  30. Rossin, R., et al. In vivo chemisry for pretargeted tumor imaging in live mice. Angewandte Chemie International Edition. 49, 3375-3378 (2010).
  31. Ackerman, M. E., et al. A33 antigen displays persistent surface expression. Cancer Immunology and Immunotherapy. 57, 1017-1027 (2008).
  32. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).
  33. Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).
  34. Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).
  35. Rossin, R., et al. Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems. Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).
  36. Emmetiere, F., et al. 18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting. Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics