Pretargeted पीईटी इमेजिंग के लिए Bioorthogonal उलटा इलेक्ट्रॉन मांग Diels-Alder Cycloaddition दोहन

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Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. J. Vis. Exp. (96), e52335, doi:10.3791/52335 (2015).

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Abstract

Introduction

पिछले तीस वर्षों में, पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) के कैंसर के निदान और प्रबंधन में एक अपरिहार्य नैदानिक ​​उपकरण बन गया है। एंटीबॉडी लंबे समय से कैंसर बायोमार्कर के लिए उनके उत्तम आत्मीयता और विशिष्टता की वजह से ट्यूमर को पोजीट्रान उत्सर्जन radioisotopes की डिलीवरी के लिए होनहार वैक्टर विचार किया गया है। एंटीबॉडी के 1,2 हालांकि, अपेक्षाकृत धीमी गति में विवो फार्माकोकाइनेटिक्स बहु दिन के साथ radioisotopes के उपयोग को अनिवार्य शारीरिक आधा जीवन। आंशिक शरीर सीटी स्कैन के विपरीत - - इस संयोजन मरीजों की गैर लक्ष्य अंगों, radioimmunoconjugates नसों और इसलिए इंजेक्ट कर रहे हैं के बाद से विशेष रूप से नैदानिक ​​महत्व का है कि एक महत्वपूर्ण जटिलता को उच्च विकिरण खुराक उपज कर सकते हैं परिणाम अवशोषित मात्रा में शरीर के हर हिस्से में, पूछताछ के ऊतकों की परवाह किए बगैर।

इस मुद्दे को बायपास करने के लिए आदेश में, महत्वपूर्ण प्रयास विकास के लिए समर्पित कर दिया गया हैएक साथ उनके आंतरिक फार्माकोकाइनेटिक सीमाओं झालर, जबकि जिससे एंटीबॉडी के लाभप्रद गुणों का लाभ, रेडियो आइसोटोप और लक्षित कर आधा भाग दसगुणा कि पीईटी इमेजिंग रणनीतियों के pment। इन रणनीतियों - सबसे अक्सर pretargeting या multistep लक्ष्य-निर्धारण में कहा - आम तौर पर चार चरणों को रोजगार: (1) एक प्रतिजन और एक radioligand दोनों बाध्यकारी में सक्षम एक एंटीबॉडी के प्रशासन; (2) लक्ष्य ऊतक और रक्त से इसकी निकासी में एंटीबॉडी का संचय; (3) एक छोटा सा अणु radioligand के प्रशासन; और (4) अतिरिक्त radioligand के तेजी से निकासी के द्वारा। कुछ मामलों में 3-8 पीछा एंटीबॉडी को radioligand के vivo बंधाव, एक अतिरिक्त समाशोधन एजेंट किसी भी एंटीबॉडी के उत्सर्जन में तेजी लाने के क्रम में चरण 2 और 3 के बीच इंजेक्शन है कि ट्यूमर बाध्य करने के लिए अभी तक है और रक्त में रहता है। 5

मोटे तौर पर, TW बोल रहा हूँpretargeting रणनीतियों के ओ प्रकार के साहित्य में सबसे अधिक प्रचलित हैं। दोनों मॉडल preclinical में सफल साबित हुए हैं, वे भी उनके नैदानिक ​​प्रयोज्यता बाधा है कि कुंजी सीमाओं के पास है। पहली रणनीति streptavidin संयुग्मित एंटीबॉडी और बायोटिन संशोधित radiolabels के बीच उच्च आत्मीयता पर निर्भर करता है; हालांकि, streptavidin संशोधित एंटीबॉडी के प्रतिरक्षाजनकता अनुवाद के संबंध में एक चिंताजनक समस्या साबित हो गया है। 5,6,9,10 दूसरी रणनीति, इसके विपरीत, एक कैंसर दोनों बाध्य करने के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर किया गया है कि bispecific एंटीबॉडी को रोजगार इस बाद मार्ग निश्चित रूप से रचनात्मक है जबकि बायोमार्कर प्रतिजन और एक छोटा सा अणु radiolabeled hapten। 3,11-14, इसकी व्यापक प्रयोज्यता प्रणाली की प्रतिरूपकता की जटिलता, व्यय, और कमी के द्वारा सीमित है।

हाल ही में, हम विकसित किया है और (उलटा इलेक्ट्रॉन मांग Diels-Alder के आधार पर मैं एक pretargeted पीईटी इमेजिंग कार्यप्रणाली प्रकाशितEDDA) ट्रांस -cyclooctene (TCO) और tetrazine (Tz के बीच cycloaddition प्रतिक्रिया;। द्वारा सचित्र के रूप में चित्रा 1) 11 प्रतिक्रिया में ही दशकों के लिए जाना जाता रहा है, वहीं IEDDA रसायन विज्ञान, एक क्लिक के रसायन शास्त्र bioconjugation तकनीक के रूप में हाल के वर्षों में एक पुनर्जागरण का अनुभव किया है राल्फ Weissleder, यूसुफ फॉक्स, और पेप्टाइड्स, एंटीबॉडी, और नैनोकणों के साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग सहित 12-15 IEDDA cycloaddition सेटिंग्स की एक विस्तृत श्रृंखला में लागू किया गया है। दूसरों के बीच में पीटर Conti के समूहों के आकर्षक काम करने के साथ ही परमाणु इमेजिंग ।। 27 bioorthogonal और क्लिक रसायन शास्त्र के प्रकार की एक संख्या है, जबकि - समीक्षकों - radiohalogens और radiometals दोनों के साथ 16-26 बंधाव, उपज उच्च स्वच्छ, तेजी से (कश्मीर 1> 30,000 एम -1 सेकंड -1), चयनात्मक, और है - घन उत्प्रेरित azide-alkyne cycloadditions, तनाव-पदोन्नत azide-alkyne cycloadditions, और Staudinger निम्न आय वर्ग सहितations -। यह पूरे जीवों में आवेदन pretargeting को इतनी अच्छी तरह से अनुकूल IEDDA रसायन शास्त्र में आता है कि तेजी से प्रतिक्रिया कैनेटीक्स और bioorthogonality के अद्वितीय संयोजन है, साथ ही bioorthogonal हैं इन पंक्तियों के साथ 28,29, यह से हाल ही में रिपोर्ट है कि नोट करना महत्वपूर्ण है हमारे प्रयोगशालाओं pretargeting को IEDDA रसायन शास्त्र लागू करने के लिए पहली बार नहीं था:। IEDDA साथ pretargeted इमेजिंग की पहली रिपोर्ट Rossin का काम करते हैं, एट अल से उठी और एक 111 में लेबल tetrazine रोजगार को SPECT- कार्यप्रणाली विशेष रुप से 30।

हम ऊपर चर्चा की, pretargeting कार्यप्रणाली चार काफी सरल चरणों (चित्रा 2) है। हाथ में प्रोटोकॉल में, एक 64 घन नोट लेबल tetrazine radioligand और huA33 एंटीबॉडी के एक TCO के संशोधित रूप साधना कि रोजगार कोलोरेक्टल कैंसर की पीईटी इमेजिंग के लिए एक pretargeted रणनीति वर्णित किया जाएगा। हालांकि, इस पद्धति का अंततः प्रतिरूपकता अपने जीआर में से एक हैट्रांस -cyclooctene आधा भाग के रूप में eatest संपत्ति है, किसी भी गैर internalizing एंटीबॉडी के साथ संलग्न किया जा सकता है, और tetrazine रेडियोधर्मी पत्रकारों की एक विस्तृत विविधता के लिए संलग्न किया जा सकता है।

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Protocol

नैतिकता वक्तव्य: वर्णित vivo में पशु प्रयोगों के सब एक अनुमोदित प्रोटोकॉल के लिए और मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के नैतिक दिशा निर्देशों के तहत अनुसार प्रदर्शन किया गया।

Tz-BN-नोट के 1. संश्लेषण

  1. एक छोटे से प्रतिक्रिया पोत में 600 μl 3 NaHCO बफर (0.1 एम, पीएच 8.1) में 7 मिलीग्राम एनएच 2 -Bn-नोट (1.25 एक्स 10 -2 mmol) भंग। समाधान के पीएच की जाँच करें। यदि आवश्यक हो, सीओ 3 0.1 एम ना 2 के छोटे aliquots का उपयोग कर 8.1 करने के लिए समाधान के पीएच को समायोजित करें।
  2. एक 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 0.5 मिलीग्राम Tz एनएचएस (1.25 एक्स 10 -3 mmol) को राष्ट्रीय राजमार्ग 2 -Bn-नोट समाधान जोड़ें।
    नोट: Tz एनएचएस या तो सूख बाहर तौला या सूखी DMF या DMSO के (<50 μl) के एक शेयर के समाधान से जोड़ा जा सकता है।
  3. जिसके परिणामस्वरूप प्रतिक्रिया समाधान आरटी पर 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करने की अनुमति देंहल्के आंदोलन के साथ।
  4. 30 मिनट के बाद, unreacted एनएच 2 -Bn-नोट निकालने के लिए उलट-चरण सी 18 एचपीएलसी क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर उत्पाद शुद्ध। Tz एनएचएस और Tz-BN-नोट सर्वोत्तम 525 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर निगरानी कर रहे हैं, जबकि राष्ट्रीय राजमार्ग 2 -Bn-नोट, 254 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर नजर रखी जा सकती है।
    नोट: प्रतिधारण समय स्पष्ट रूप से प्रत्येक प्रयोगशाला (पंप, कॉलम, ट्यूबिंग, आदि) के HPLC उपकरण सेटअप पर अत्यधिक निर्भर हैं। हालांकि, एक उदाहरण पेश करने के लिए अगर शून्य की एक ढाल: 100 MeCN / एच 2 ओ से 100 (दोनों 0.1% TFA के साथ): 0 MeCN / एच 2 ओ से अधिक 25 मिनट और एक विश्लेषणात्मक 4.6 x 250 मिमी सी 18 कॉलम प्रयोग किया जाता है , TZ-BN-नोट, TZ-एन एच एस, और एनएच दो की अवधारण टाइम्स -Bn-नोट क्रमश: लगभग 15 मिनट, 16.5 मिनट और 10 मिनट, हो जाएगा। उत्पाद एक भी रन या एक अर्द्ध प्रारंभिक या प्रारंभिक सी 18 एचपीएलसी स्तंभ का उपयोग कर एकाधिक रन में या तो अन्य प्रतिक्रिया घटकों से शुद्ध किया जा सकता है। एक एच एनएमआर, गुदाytical एचपीएलसी, और ईएसआई एमएस पूरा Tz-BN-नोट अग्रदूत की शुद्धता को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सभी तरीके हैं। 11
  5. तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर एकत्र एचपीएलसी eluent रुक।
  6. अपारदर्शी एल्यूमीनियम पन्नी में जमी संग्रह ट्यूब लपेटें।
  7. एक lyophilizing पोत हे में जमे हुए संग्रह ट्यूब प्लेस / एन एचपीएलसी मोबाइल चरण हटाने के लिए।
  8. -80 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में शुद्ध उत्पाद (ठोस एक उज्ज्वल गुलाबी) की दुकान।
    नोट: इस प्रक्रिया में एक स्वीकार्य रोक बिंदु है। पूरा Tz-BN-नोट अग्रदूत इन शर्तों के तहत कम से कम एक साल के लिए स्थिर है।

HuA33-TCO Immunoconjugate 2. तैयारी

  1. एक 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, एक 1 मिलीग्राम / एमएल शुष्क DMF में TCO एनएचएस की (2.7 मिमी) समाधान तैयार है।
  2. एक 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, एक 2 मिलीग्राम / एमएल फॉस्फेट बफर खारा के 1 मिलीलीटर में huA33 की (13.3 माइक्रोन) समाधान, 7.4 पीएच (0.01 एम पीओ 4 3- को तैयार
  3. छोटे aliquots 0.1 एम ना 2 3 सीओ की (<5 μl) का उपयोग करना, 8.8-9.0 के लिए एंटीबॉडी समाधान के पीएच को समायोजित करें। पीएच की निगरानी के लिए एक microelectrode साथ पीएच पेपर या एक पीएच मीटर या तो प्रयोग करें, और पीएच पीएच 9.0 से ऊपर उठकर करने की अनुमति नहीं करने के लिए सावधान रहना होगा।
  4. एंटीबॉडी समाधान सही पीएच पर है एक बार, सक्रिय एस्टर के 8 दाढ़ समकक्ष करने के लिए इसी TCO एनएचएस समाधान की एक मात्रा जोड़ें। उदाहरण के लिए, 2 मिलीग्राम / एमएल huA33 एंटीबॉडी समाधान (1.33 एक्स 10 -8 मोल huA33) के 1 मिलीलीटर के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल TCO एनएचएस समाधान (1.07 एक्स 10 -7 मोल TCO एनएचएस) के 7.9 μl जोड़ें। समाधान में मात्रा से 5% DMF से अधिक नहीं है।
  5. धीरे microcentrifuge ट्यूब कई बार inverting द्वारा समाधान मिश्रण।
  6. अपारदर्शी एल्यूमीनियम पन्नी में microcentrifuge ट्यूब लपेटें।
  7. समाधान हल्के आंदोलन के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते दें।
  8. आरटी पर 1 घंटे के बाद, एक पूर्व पैक डिस्पोजेबल siz का उपयोग करते हुए, जिसके परिणामस्वरूप immunoconjugate शुद्धई बहिष्कार desalting स्तंभ। भंडारण के दौरान स्तंभ पर मौजूद किसी भी परिरक्षकों दूर करने के लिए सप्लायर द्वारा वर्णित के रूप में सबसे पहले, आकार अपवर्जन स्तंभ कुल्ला। फिर, आकार अपवर्जन स्तंभ के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ने 1.5 मिलीलीटर 0.9% बाँझ खारा के साथ स्तंभ कुल्ला, और बाद में eluent के रूप में 0.9% बाँझ खारा के 2 मिलीलीटर का उपयोग कर उत्पाद इकट्ठा।
    नोट: इस कदम के लिए एक 2 मिलीलीटर समाधान के रूप में पूरा huA33-TCO निकलेगा।
  9. एक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर परिणामी huA33-TCO की एकाग्रता उपाय।
  10. एक उच्च एकाग्रता वांछित है, एक 50,000 आणविक वजन कट ऑफ के साथ एक केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट का उपयोग कर huA33-TCO के समाधान ध्यान केंद्रित।
    नोट: यह huA33 और अन्य प्रसिद्ध एंटीबॉडी (जैसे, bevacizumab, त्रास्तुज़ुमाब, सेटुक्सीमब, और J591) की एक किस्म केंद्रित किया जा रहा है की बहुत सहिष्णु हैं, जबकि एकत्रीकरण और तेज़ी अन्य मामलों में एकाग्रता पर हो सकता है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है। शोधकर्ताओं ने इस proced का प्रयासएक नई एंटीबॉडी के साथ ure साहित्य या एंटीबॉडी ध्यान केंद्रित करने के लिए किया जाए या नहीं करने के संबंध में प्रश्न में एंटीबॉडी के लिए अपने स्वयं के ज्ञान पर भरोसा करना चाहिए।
  11. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरा huA33-TCO immunoconjugate स्टोर।
    नोट: इस प्रक्रिया में एक स्वीकार्य रोक बिंदु है। पूरा mAb-TCO के रूप साधना इन भंडारण की स्थिति के तहत कम से कम तीन महीने के लिए स्थिर होना चाहिए।

Tz-BN-नोट के 3. 64 घन Radiolabeling

नोट: प्रोटोकॉल के इस कदम से निपटने और रेडियोधर्मिता का हेरफेर शामिल है। या रेडियोधर्मिता के साथ किसी भी अन्य कार्य प्रदर्शन - - इन चरणों का प्रदर्शन से पहले शोधकर्ताओं ने उनके घर संस्था के विकिरण सुरक्षा विभाग के साथ परामर्श करना चाहिए। विकिरण के लिए जोखिम कम करने के लिए सभी संभव कदम उठाए।

  1. एक 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, एक 0.5 मिलीग्राम / एमएल (723 माइक्रोन) Tz-BN-नोट के समाधान तैयार है।
  2. एक 1.7 मिलीलीटर microc मेंentrifuge ट्यूब, 0.2 एम एनएच 4 OAC 5.5 पीएच बफर के 400 μl को Tz-BN-नोट समाधान (5 माइक्रोग्राम प्रति) के 10 μl जोड़ें।
  3. उचित radiochemical नोट रखने के हित में, मापने के लिए और पहले और नीचे प्रोटोकॉल (3.4-3.8) में आगामी कदम के बाद एक खुराक अंशशोधक का उपयोग कर नमूने में रेडियोधर्मिता की मात्रा को रिकॉर्ड है। इस radiochemical पैदावार का सही निर्धारण के साथ मदद मिलेगी।
  4. Tz-BN-नोट के समाधान के लिए 64 घन मीटर के 2000 μCi (74 MBq) जोड़ें।
    नोट: आमतौर पर, [64 घन मीटर] CuCl 2 0.1 एन एचसीएल की एक छोटी मात्रा (<30 μl) में आपूर्ति की है, और इस प्रकार केवल छोटे संस्करणों (<10 μl) इस शेयर समाधान के radiolabeling प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं। [64 घन मीटर] CuCl दो शेयर की बड़ी मात्रा की जरूरत है, radiolabeling प्रतिक्रिया समग्र प्रतिक्रिया की मात्रा में वृद्धि के सहिष्णु है। हालांकि, radiolabeling प्रतिक्रिया समाधान के पीएच सुनिश्चित करने के लिए सावधानी से निगरानी की जानी चाहिएयह पीएच 4.0 से नीचे गिर नहीं करता है।
  5. समाधान हल्के आंदोलन के साथ आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते दें।
  6. ऊष्मायन के 10 मिनट के बाद, उलट चरण सी 18 एचपीएलसी क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर उत्पाद शुद्ध। प्रतिधारण समय स्पष्ट रूप से प्रत्येक प्रयोगशाला (पंप, कॉलम, ट्यूबिंग, आदि) के HPLC उपकरण सेटअप पर अत्यधिक निर्भर हैं। हालांकि, एक उदाहरण पेश करने के लिए अगर की एक ढाल 5:95 MeCN / एच 2 ओ 95 (दोनों 0.1% TFA के साथ): 5 MeCN / एच 2 ओ मिनट 15 से अधिक प्रयोग किया जाता है, 64 घन Tz- की अवधारण समय मुक्त, uncomplexed 64 घन मीटर के आसपास 2-4 मिनट में विलायक सामने के साथ elute जाएगा, जबकि बटालियन-नोट के आसपास 9.8 मिनट होना चाहिए।
  7. एक रोटरी बाष्पीकरण का प्रयोग, एचपीएलसी eluent हटा दें।
  8. 0.9% बाँझ खारा में 64 घन Tz-BN-नोट उत्पाद Redissolve।
    नोट: 64 घन मीटर की 12.7 घंटा शारीरिक आधा जीवन दिया है, इस प्रक्रिया में एक स्वीकार्य रोक बिंदु नहीं है। 64 के संश्लेषण घन Tz-बटालियन न सम्पन्नएक radioligand के इंजेक्शन के लिए तुरंत पहले, और कदम 4.5 से तुरंत 3.7 कदम का पालन करें।

विवो Pretargeted पीईटी इमेजिंग में 4.

नोट: प्रोटोकॉल धारा 3 के रूप में, प्रोटोकॉल के इस कदम से निपटने और रेडियोधर्मिता का हेरफेर शामिल है। इन चरणों का प्रदर्शन से पहले शोधकर्ताओं ने उनके घर संस्था के विकिरण सुरक्षा विभाग के साथ परामर्श करना चाहिए। विकिरण के लिए जोखिम कम करने के लिए सभी संभव कदम उठाए।

  1. और एक महिला athymic नग्न माउस, subcutaneously प्रत्यारोपण 1 एक्स 10 6 SW1222 कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं में इन (9-12 दिनों टीका के बाद) एक 100-150 मिमी 3 xenograft के रूप में विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं। 11
  2. 0.9% बाँझ खारा में 0.5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए प्रोटोकॉल धारा 2 से huA33-TCO के समाधान के एक विभाज्य पतला।
  3. Xenograft असर माउस की पूंछ नस में huA33-TCO के समाधान के 200 μl (100 माइक्रोग्राम प्रति) इंजेक्षन।
  4. माउस के ट्यूमर में huA33-TCO के संचय के लिए 24 घंटे की अनुमति दें।
  5. 0.9% बाँझ खारा में 1.5 एमसीआई / एमएल के एक एकाग्रता के लिए 64 घन Tz-BN-नोट radioligand पतला।
  6. की पूंछ नस में (6.7 MBq / nmol की एक विशिष्ट गतिविधि मानते हुए, 64 घन Tz-BN-नोट के 1.6 nmol; 11.1 MBq 300 μCi) 64 घन Tz-BN-नोट radioligand समाधान के 200 μl इंजेक्षन xenograft असर चूहों।
  7. वांछित इमेजिंग समय बिंदु पर (जैसे, 2, 6, 12, या 24 घंटे के बाद इंजेक्शन), एक दो isoflurane% के साथ माउस anesthetize: ऑक्सीजन गैस मिश्रण।
  8. छोटे जानवर पीईटी स्कैनर के बिस्तर पर माउस रखें। ऑक्सीजन गैस मिश्रण: एक एक isoflurane% का उपयोग कर स्कैन के दौरान संज्ञाहरण बनाए रखें। स्कैनर बिस्तर पर पशु रखने से पहले, पैर के अंगूठे चुटकी विधि का उपयोग संज्ञाहरण को सत्यापित करने और संज्ञाहरण के दौरान सुखाने को रोकने के लिए माउस की आँखों के लिए पशु चिकित्सा मरहम लागू होते हैं।
  9. एक स्थिर के माध्यम से माउस के लिए पीईटी डेटा मोल350-700 कीव के एक ऊर्जा खिड़की और 6 NSEC की एक संयोग समय खिड़की का उपयोग कर 20 लाख संपाती घटनाओं की एक न्यूनतम के साथ स्कैन। छवि का अधिग्रहण पूरा करने के बाद, नायाब माउस छोड़ नहीं है और इसे होश आ गया है जब तक अन्य चूहों के साथ एक पिंजरे में जगह नहीं है।

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Representative Results

प्रयोग के शुरुआती तीन चरणों - Tz-BN-नोट, huA33 को TCO के विकार के संश्लेषण, और Tz-BN-नोट के radiolabeling (आंकड़े 3 और 4) का निर्माण - अत्यधिक विश्वसनीय हैं। उपरोक्त प्रक्रिया के मामले में, TZ-BN-नोट का निर्माण उच्च उपज और पवित्रता में संश्लेषित किया गया था। ~ huA33 एंटीबॉडी 4.2 ± 0.6 TCO / mAb साथ संशोधित किया गया था, और Tz-BN-नोट,> 85% क्षय को सही उपज है, और एक विशिष्ट गतिविधि> 99% radiochemical पवित्रता में शुद्ध radioligand उपज के लिए 64 घन के साथ radiolabeled था 6.7 MBq / nmol (चित्रा 5)। huA33-TCO के रूप साधना की जेट और tetrazine radioligand रेडियोधर्मी तत्काल पतली परत क्रोमैटोग्राफी (iTLC) का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है। HuA33-TCO के एक मामूली अतिरिक्त के साथ; (6.7 MBq / nmol की एक विशिष्ट गतिविधि मानते हुए, 0.55 nmol 100 μCi) इस radiolabeled tetrazine मिश्रण द्वारा किया जाता है (50 माइक्रोग्राम प्रति; 0.66 nmol) पीएच मेंosphate बफर खारा 5 मिनट के लिए आरटी पर (7.4 पीएच)। फिर, समाधान के लगभग 1 μCi एक रिवर्स चरण सी 18 टीएलसी थाली पर देखा और सूखे की अनुमति दी जाती है। एच 2 हे, और थाली एक रेडियोधर्मी टीएलसी प्लेट रीडर का उपयोग विश्लेषण: 1 MeCN: टीएलसी 9 में चलाया जाता है। क्लिक प्रतिक्रिया योजना के रूप में काम करता है, ligated 64 घन नोट-A33 आधारभूत में रहना चाहिए; अगर, दूसरे हाथ पर, प्रतिक्रिया में विफल रहता है, नि: शुल्क 64 घन Tz-BN-नोट पर या विलायक सामने के पास दिखाई देगा।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल में, vivo इमेजिंग प्रयोगों के लिए आगे बढ़ते, A33 प्रतिजन व्यक्त SW1222 कोलोरेक्टल कैंसर xenografts असर athymic नग्न चूहों कार्यरत थे। तीव्र biodistribution (एन = 5 समय बिंदु प्रति) और पीईटी इमेजिंग दोनों (एन = 12) प्रयोगों pretargeting रणनीति उत्कृष्ट छवि के विपरीत और उच्च ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि गतिविधि अनुपात (चित्रा 6 के साथ कोलोरेक्टल ट्यूमर के विकास की रूपरेखा के लिए सक्षम है कि पता चलता है)। ट्यूमर में 64 घन Tz-BN-नोट के तेज जल्दी समय बिंदुओं पर स्पष्ट है: 3.5% 0.6 ±% आईडी / जी और क्रमश: एक घंटा और चार घंटे बाद इंजेक्शन, पर 0.6% आईडी / जी ± 4.1%। हालांकि, इन प्रारंभिक बिंदुओं पर, यह आसानी से माउस (के आंत्र पथ के माध्यम से रेडियोधर्मिता समाशोधन की राशि से छिप जाता है 11.9% 4.4% आईडी / जी और मल में 3.4% आईडी / जी ± 8.8% एक घंटा और 4 पर ± घंटा गड़बड़ी, क्रमशः)। कई घंटे के दौरान, अतिरिक्त radioligand (1.4% 0.5% ± आईडी / जी 24 घंटा गड़बड़ी पर) मल के माध्यम से साफ करता है, और ट्यूमर छवि (4.0% ± 0.9% आईडी / जी में सबसे प्रमुख विशेषता पर हो जाता है 24 घंटा पीआई)। इन बाद में समय अंक, ट्यूमर अच्छी तरह से छवि में चित्रित, और ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि गतिविधि अनुपात काफी अधिक हैं जाता है; 12 घंटा गड़बड़ी और 27.0 ± 7.4 से कम 24 घंटा गड़बड़ी आश्चर्य की बात नहीं है, केवल 64 घन Tz-BN-नोट, गैर विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग नियंत्रण प्रयोगों, ओ पर 26.6 ± 6.6 की मांसपेशी अनुपात: उदाहरण के लिए, रणनीति ट्यूमर पैदावारआर huA33 संयुग्मित TCO moieties के बिना सभी ट्यूमर में न्यूनतम तेज में हुई।

आगे नीचे चर्चा की जाएगी के रूप में, इस pretargeting रणनीति - सभी pretargeting रणनीतियों की तरह - नई एंटीबॉडी / प्रतिजन सिस्टम को लागू किया जब अनुकूलन की आवश्यकता होगी कि चर की एक बड़ी संख्या है। सबसे महत्वपूर्ण के दो इंजेक्शन के mAb-TCO के निर्माण के लिए बड़े पैमाने पर और mAb-TCO के निर्माण के इंजेक्शन और radioligand के इंजेक्शन के बीच अंतराल की लंबाई हैं। MAb-TCO के रूप साधना की राशि बहुत अधिक है या इंजेक्शन के बीच अंतराल समय बहुत छोटा है, तो रक्त में मुक्त mAb-TCO की राशि ऊपर चला जाता है और क्लिक प्रतिक्रियाओं की संभावना को रक्त में करने के बजाय ट्यूमर बढ़ता है पर होने वाली। उदाहरण के लिए, 64 घन मीटर / huA33 प्रणाली में huA33 (बजाय 100 माइक्रोग्राम प्रति) या एक 12 घंटा के अंतराल समय (के बजाय 24 घंटा) के उपयोग की माइक्रोग्राम प्रति टी में ध्यान देने योग्य बढ़ जाती है के परिणामस्वरूप 300 के प्रशासन दोनों, यहाँ पर चर्चामाउस के दिल (क्रमशः चित्रा 7A और चित्रा 7B) में दिख रेडियोधर्मिता की वह राशि। जल्दी समय बिंदुओं पर tumoral तेज की राशि से सचित्र के रूप में इन दोनों मामलों में, क्लिक प्रतिक्रिया अभी भी स्पष्ट रूप से, ट्यूमर में उत्पन्न हो रही है; हालांकि, रक्त में radiolabeled एंटीबॉडी का गठन भी स्पष्ट है। यह रक्त में गठित radiolabeled एंटीबॉडी अभी भी अंत में ट्यूमर के लिए अपना रास्ता मिल जाएगा क्योंकि खारिज करने के लिए आकर्षक है, यह कुछ हद तक यह ट्यूमर तक पहुँच जाता है और इस तरह बढ़ा पहले radiolabeled एंटीबॉडी धीरे से प्रसारित होगा, के रूप में एक pretargeting पद्धति का उपयोग करने के उद्देश्य धरा गैर लक्ष्य अंगों को दरों खुराक। बहुत कम एंटीबॉडी प्रयोग किया जाता है इसके विपरीत, यदि, ट्यूमर में तेज की राशि स्वाभाविक रूप से भुगतना होगा। पीढ़ी तक अंतराल बार भी धीमी गति से एंटीबॉडी internalization, transcyclooctene isomerization, या एंटीबॉडी / प्रतिजन बहा का एक परिणाम के रूप में ट्यूमर तेज के स्तर को कम कर सकते हैं। वें का निदानESE समस्याओं को और अधिक चुनौतीपूर्ण है और पीईटी डेटा की परीक्षा के माध्यम से आसानी से पूरा नहीं किया जा सकता है। जाहिर है, एक नाजुक संतुलन बनाए रखा जाना चाहिए। इसलिए, यह एक नई एंटीबॉडी / प्रतिजन प्रणाली के लिए इस रणनीति को लागू करने का प्रयास किसी भी जांचकर्ताओं के शुरुआती बिंदु के रूप में mAb-TCO के निर्माण (≥ 200 माइक्रोग्राम प्रति) और कम अंतराल बार (≤ 24 घंटा) की बड़ी मात्रा का उपयोग करें और वहाँ से अनुकूलन की सिफारिश की है।

चित्र 1
चित्रा 1. उलटा इलेक्ट्रॉन मांग Diels-Alder tetrazine और transcyclooctene के बीच [4 + 2] cycloaddition क्लिक बंधाव।

चित्र 2
चित्रा 2. pretargeting कार्यप्रणाली के चार चरणों का एक उदाहरण है। यह आंकड़ा मूल JNM में प्रकाशित शोध पर आधारित है। Zeglis, बीएम एट अल। ए pretargeted पीईटी इमेजिंग रणनीति बसन्यूक्लियर मेडिसिन के एड bioorthgonal Diels-Alder क्लिक रसायन विज्ञान पर। जर्नल। 54, 1389-1396 (2013)। © 2013 न्यूक्लियर मेडिसिन और आण्विक इमेजिंग की सोसायटी द्वारा, इंक इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3. TCO एनएचएस के साथ huA33 के संशोधन के लिए एक योजना।

चित्रा 4
चित्रा 4. संश्लेषण और Tz-BN-नोट के 64 घन radiolabeling के लिए एक योजना है। यह आंकड़ा मूल JNM में प्रकाशित शोध पर आधारित है। Zeglis, बीएम एट अल। Bioorthgonal Diels-Alder पर आधारित एक pretargeted पीईटी इमेजिंग रणनीति रसायन शास्त्र क्लिक करें। जर्नल न्यूक्लियर मेडिसिन। 54, 1389-1396 के (2013)। और# 169; 2013 न्यूक्लियर मेडिसिन और आण्विक इमेजिंग की सोसायटी द्वारा, इंक इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5 शुद्ध के लिए 64 घन Tz-BN-नोट के एक रेडियो एचपीएलसी ट्रेस।

चित्रा 6
64 घन Tz-BN-नोट के 6 चित्रा पीईटी छवियों / A33-TCO रणनीति pretargeting। चूहे चमड़े के नीचे SW1222 xenografts पूंछ नस में इंजेक्शन के माध्यम से huA33-TCO (100 माइक्रोग्राम प्रति) दिलाई गई (100-150 मिमी 3) असर। 24 घंटे के बाद, एक ही चूहों 64 घन Tz-BN-नोट पूंछ नस में इंजेक्शन के माध्यम से (10.2-12.0 MBq [275-325 μCi]) दिलाई गई और बाद के प्रशासन के बाद 2, 6, 12, और 18 घंटा imaged radiopharmaceutical। Transverse (ऊपर) और राज्याभिषेक (नीचे) तलीय छवियों ट्यूमर का केंद्र एक दूसरे को काटना। स्पष्ट रूप से 12 और 18 घंटा के बाद इंजेक्शन द्वारा सभी गैर लक्ष्य ऊतकों से चित्रित ट्यूमर (सफेद तीर) छोड़ने के 12 घंटे से काफी हद तक स्पष्ट जल्दी समय अंक (यानी, 2 और 6 घंटा) पर पेट में तेज के उच्च स्तर,। यह आंकड़ा मूल JNM में प्रकाशित शोध पर आधारित है। Zeglis, बीएम एट अल। Bioorthgonal Diels-Alder पर आधारित एक pretargeted पीईटी इमेजिंग रणनीति रसायन शास्त्र क्लिक करें। जर्नल न्यूक्लियर मेडिसिन। 54, 1389-1396 के (2013)। © 2013 न्यूक्लियर मेडिसिन और आण्विक इमेजिंग की सोसायटी द्वारा, इंक इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा उपअनुकूलित pretargeting प्रयोगों की 7. पीईटी छवियों। (ए) चूहे BEAअंगूठी चमड़े के नीचे SW1222 xenografts (100-150 मिमी 3, तीर) पूंछ नस में इंजेक्शन के माध्यम से huA33-TCO (100 माइक्रोग्राम प्रति) दिलाई गई। 12 घंटा बाद, एक ही चूहों 64 घन Tz-BN-नोट (10.2-12.0 MBq [275-325 μCi]) पूंछ नस इंजेक्शन दिलाई गई। (बी) के चमड़े के नीचे SW1222 xenografts (100-150 मिमी 3, तीर) असर चूहों की पूंछ नस में इंजेक्शन के माध्यम से A33-TCO (300 माइक्रोग्राम प्रति) दिलाई गई। 24 घंटे के बाद, एक ही चूहों 64 घन Tz-BN-नोट (10.2-12.0 MBq [275-325 μCi]) पूंछ नस इंजेक्शन दिलाई गई। दोनों ही मामलों में, चूहों 64 घन Tz-BN-नोट के इंजेक्शन के बाद 12 घंटा imaged थे। दोनों पैनलों, अनुप्रस्थ (ऊपर) और राज्याभिषेक (नीचे) में तलीय छवियों ट्यूमर का केंद्र एक दूसरे को काटना। Pretargeting रणनीति स्पष्ट रूप से दोनों ही मामलों में ट्यूमर रूपरेखा बनाती है, वहीं इन चित्रों में से दोनों में परिणाम चित्रा 6 में प्रदर्शित उन लोगों की तुलना उप मानक हैं। दोनों 7A और 7B में, वहाँ एक हैदिल में पृष्ठभूमि गतिविधि तेज की महत्वपूर्ण राशि। चित्रा 7A की शर्तों के तहत, यह सबसे अधिक संभावना ट्यूमर में स्थानीय बनाना huA33-TCO का निर्माण नहीं दी जा रही पर्याप्त समय का परिणाम है। चित्रा 7B की शर्तों के तहत, इस संभावना बहुत ज्यादा huA33-TCO के इंजेक्शन लगाने और इंजेक्शन के बाद रक्त में भी 24 घंटा परिसंचारी अभी भी अतिरिक्त immunoconjugate होने का परिणाम है। यह आंकड़ा मूल JNM में प्रकाशित शोध पर आधारित है। Zeglis, बीएम एट अल। Bioorthgonal Diels-Alder पर आधारित एक pretargeted पीईटी इमेजिंग रणनीति रसायन शास्त्र क्लिक करें। जर्नल न्यूक्लियर मेडिसिन। 54, 1389-1396 के (2013)। 2013 न्यूक्लियर मेडिसिन और आण्विक इमेजिंग की सोसायटी द्वारा, इंक इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस pretargeted पीईटी इमेजिंग रणनीति के प्रमुख लाभ यह है कि सीधे लेबल वाले एंटीबॉडी द्वारा उत्पादित पृष्ठभूमि विकिरण खुराक का केवल एक अंश पर लक्ष्य करने के लिए पृष्ठभूमि छवि के विपरीत के साथ ट्यूमर का वर्णन करने में सक्षम है। उदाहरण के लिए, यहाँ वर्णित कोलोरेक्टल कैंसर इमेजिंग प्रणाली में, तीव्र biodistribution के प्रयोगों से डेटा सीधे लेबल 64 घन नोट-huA33 और 89 ZR-डीएफओ-huA33 के साथ 64 घन आधारित pretargeting रणनीति के लिए dosimetry गणना प्रदर्शन करने के लिए नियोजित किया गया था। अधिक नैदानिक ​​प्रासंगिक 89 ZR-लेबल एंटीबॉडी की तुलना में जब इन गणनाओं को स्पष्ट रूप से विशेष रूप से, pretargeting प्रणाली के dosimetric लाभ दर्शाते। 0.4162 mSv / MBq: 89 ZR-डीएफओ-huA33 की है कि 30 से अधिक गुना अधिक है, जबकि pretargeting रणनीति के प्रभावी खुराक, 0.0124 mSv / MBq है। 64 की तुलना में जब pretargeting की dosimetric लाभ कम स्पष्ट है घन लेबलntibody (0.0359 mSv / MBq), हालांकि लाभप्रद प्रभाव अभी भी मौजूद है।

कार्यप्रणाली pretargeting इस IEDDA का सबसे महत्वपूर्ण शक्तियों में से एक अपनी प्रतिरूपकता है: ट्रांस -cyclooctene internalizing नहीं है कि किसी भी एंटीबॉडी के साथ संलग्न किया जा सकता है, और cargos के एक विस्तृत विविधता tetrazine से जुड़ा जा सकता है। दरअसल, इस प्रोटोकॉल लिखने के लिए हमारे प्रिंसिपल प्रेरणा अलग एंटीबॉडी / प्रतिजन / रेडियो आइसोटोप सिस्टम के साथ इस विधि को रोजगार के लिए अन्य अनुसंधान समूहों को सक्षम करने के लिए है। उन पंक्तियों के साथ, हम इसे अन्य प्रणालियों के लिए इस पद्धति आदत डाल जब शोधकर्ताओं विचार करना चाहिए कि मुद्दों का एक नंबर का पता करने के लिए महत्वपूर्ण है विश्वास करते हैं।

सबसे पहले, एंटीबॉडी के चयन काफी महत्वपूर्ण है। सीधे शब्दों में कहें, एंटीबॉडी गैर internalizing या एक बहुत ही धीमी दर से भली भाँति होना चाहिए। आदर्श गतिज मापदंडों अभी तक निर्धारित किया है जबकि, एंटीबॉडी और प्रतिक्रियाशील ट्रांस -cyclooctene उस पर ही रहना चाहिए वहन करती हैपूर्व radioligand के इंजेक्शन के लिए एंटीबॉडी के internalization और ज़ब्ती के लिए सेल के बाहर, नाटकीय रूप से इन विवो क्लिक करें प्रतिक्रियाओं की संख्या में कमी होगी। यहाँ वर्णित प्रणाली में, huA33 एंटीबॉडी लक्ष्य और A33 प्रतिजन, सभी कोलोरेक्टल कैंसर के> 95% में व्यक्त एक transmembrane ग्लाइकोप्रोटीन को बांधता है। महत्वपूर्ण बात है, तो यह और भी अपने लक्ष्य बाध्यकारी के बाद, huA33 एंटीबॉडी / प्रतिजन जटिल दिनों के लिए सेल की सतह पर बनी हुई है कि दिखाया गया है। 31-33 एक गैर internalizing एंटीबॉडी की आवश्यकता रणनीति के लिए एक सीमा मानते है, वहीं एक गैर internalizing एंटीबॉडी की व्यापक विविधता, Rossin, एट अल। उनके उत्कृष्ट pretargeting काम में पता लगाया है कि शायद सबसे विशेष रूप से TAG72-लक्ष्य CC49 एंटीबॉडी जाना जाता है। 30,34,35

दूसरा, इस pretargeting रणनीति - किसी भी अन्य की तरह - महत्वपूर्ण अनुकूलन की आवश्यकता है। एक की पहचान करने के अलावाntibody और tetrazine radioligand, दो महत्वपूर्ण चर पर विचार किया जाना चाहिए: इंजेक्ट एंटीबॉडी की राशि और एंटीबॉडी और radioligand का इंजेक्शन के बीच अंतराल समय। हम ऊपर प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में इन दोनों चर को संबोधित किया, लेकिन या तो बहुत अधिक एंटीबॉडी या बहुत कम एक अंतराल समय इंजेक्शन के समय पर रक्त में रहेगा, mAb-TCO के रूप साधना के महत्वपूर्ण मात्रा में कार्यरत है, तो संक्षेप में दोहराना radioligand की। यह, बारी में, इन विवो क्लिक बंधाव ही धीरे-धीरे समय के साथ ट्यूमर में जमा करेंगे कि परिसंचारी, radiolabeled एंटीबॉडी बनाने, रक्त में करने के बजाय ट्यूमर पर होने वाली में परिणाम होगा। बहुत कम एंटीबॉडी या बहुत लंबे समय के लिए एक अंतराल समय या तो कार्यरत है इसके विपरीत, यदि, ट्यूमर में रेडियोधर्मिता की अंतिम राशि उपअनुकूलित किया जाएगा। हमारी राय में, सीधे लेबल एंटीबॉडी itse साथ, अधिमानतः तीव्र biodistribution के प्रयोगों के कठोर इमेजिंग प्रदर्शन, यावाम मोर्चे के किसी भी pretargeting प्रयोगों के लिए पहले की जरूरत एंटीबॉडी की राशि और एंटीबॉडी के निर्माण के प्रारंभिक इंजेक्शन के बाद आदर्श अंतराल समय के बारे में जानने के लिए सबसे विश्वसनीय तरीका है। Radiolabeled mAb के विभिन्न इंजेक्ट जनता के लिए, इन प्रयोगों pretargeting प्रयोगों के लिए सबसे होनहार शर्तों के चयन के लिए अनुमति देता है, खून से radioimmunoconjugate की निकासी और ट्यूमर में अपनी संचय दोनों पर ठोस डेटा प्रदान करेगा।

एक उपयुक्त रेडियो आइसोटोप चुनने अंत में, जब tetrazine आधारित radioligand की फार्माकोकाइनेटिक्स विचार किया जाना चाहिए। यहाँ वर्णित प्रणाली में, radiolabeled Tz-BN-नोट आधा भाग सबसे पूरक शारीरिक आधा साथ 64 घन पोजीट्रान उत्सर्जन रेडियो आइसोटोप है, जिससे लगभग 3-4 घंटे की एक जैविक आधा जीवन के साथ आंत के माध्यम से शरीर से उत्सर्जित किया जाता है जीवन। यह वें के साथ संगत होना करने के लिए दुर्भाग्य से, tetrazine आधा भाग के जैविक आधा जीवन बहुत लंबा हैई अधिक तेजी radiometal 68 गा (टी 1/2 = 68 मिनट) खस्ताहाल। अतिरिक्त radioligand शरीर से समाशोधन के समाप्त होने से पहले इस मामले में, ट्यूमर में किसी भी रेडियोधर्मिता कई आधे जीवन के माध्यम से क्षय होता है। नतीजतन, छवियों ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि गतिविधि अनुपात कम रहेगा जब जल्दी समय बिंदुओं को अधिग्रहीत करना होगा 36 आदर्श रूप में, tetrazine radioligands के भविष्य की पीढ़ियों के लिए इंजीनियर की जाएगी। - शायद PEGylation, ग्लिकेशन, या अन्य साधनों के माध्यम से - उगलना और अधिक तेजी से शरीर से। यह बदले में आगे pretargeted इमेजिंग रणनीति के dosimetric लाभ में वृद्धि होगी, जो इस तरह के 68 गा और 18 एफ के रूप में और अधिक तेजी से खस्ताहाल radioisotopes, साथ radiolabeling के लिए अनुमति होगी। अंत में, शोधकर्ताओं इमेजिंग के लिए अन्य radioisotopes के साथ प्रयोग के लिए इस तकनीक का अनुकूलन के रूप में (जैसे, 124 मैं, 111, आदि में 18 एफ, 89 ZR, 68 गा,) जैसे या थेरेपी (, 177 लू, 225 एसी, 125 मैं, आदि), नई tetrazine आधारित ligands के विभिन्न chelators या radiolabeling कृत्रिम समूहों को शामिल करने के लिए विकसित करने की आवश्यकता होगी। इन उपन्यास निर्माणों की फार्माकोकाइनेटिक्स की पूरी तरह से जांच ligands के निकासी गुण और radionuclides के भौतिक आधा जीवन के बीच लाभप्रद मैचों सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा।

अंत में, हम बहुत ज्यादा अन्य जांचकर्ताओं इस pretargeting प्रौद्योगिकी का वादा देख सकते हैं और नई एंटीबॉडी / प्रतिजन प्रणाली के साथ यह है कि रोजगार की उम्मीद है। पूर्ववर्ती पैराग्राफ इस अनुकूलन की प्रक्रिया हमेशा आसान नहीं हो सकता है कि उदाहरण देकर स्पष्ट करना है, यह इस पद्धति से परे एक और परमाणु इमेजिंग पर महत्वपूर्ण प्रभाव, लक्षित रेडियोन्यूक्लाइड चिकित्सा, और हो सकता है कि हमारा विश्वास है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrazine NHS Ester Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA Macrocyclics B-601 Store at -80 °C

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