Bir

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Galyum (III) 'ün 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole ve serbest baz analog düşük mikromolar hücre sitotoksisite arzetmemiştir. Bu yazıda corroles transkripsiyon inhibisyonunu değerlendirmek için, UV-Vis spektroskopisi ile bir RNA transkripsiyon reaksiyonu, etidyum bromür ile boyanmış jel ile görüntüleme RNA ve RNA miktarının açıklar ve antikanser aday özelliklerin değerlendirilmesi için basit bir yöntem ortaya koymaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tang, G. Y., Pribisko, M. A., Henning, R. K., Lim, P., Termini, J., Gray, H. B., Grubbs, R. H. An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles. J. Vis. Exp. (97), e52355, doi:10.3791/52355 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kemoterapi genellikle birçok yan etkileri ve sınırlı hedefleme ile geniş spektrumlu sitotoksik ajanlar içerir. Corroles kenetlenmiş metal fonksiyonel gruplar kimlikleri bağlı olarak belirli bir hücre hatlarında farklı sitostatik ve sitotoksik özellikleri sergileyen tetrapyrrolic makrosikllerin sınıfıdır. Belirli hücre hatları yönelik fonksiyonlandırılmış corroles benzersiz davranışı hedeflenen kemoterapi olasılığını tanıttı.

Bir çok anti-kanser ilaçları, RNA transkripsiyonu inhibe edebilme özelliği ile değerlendirildi. Burada bilinen ve potansiyel inhibitörlerin varlığında RNA transkripsiyonu için adım adım protokol mevcut. jel elektroforezi ve UV-Vis spektroskopisi yoluyla transkripsiyon reaksiyonu RNA ürünlerin değerlendirilmesi, etki mekanizması ile ilgili daha fazla tahlil değişiklikler ile, potansiyel anti-kanser ilaç adaylarının önleyici özellikler hakkında bilgiler verir ve.

Küçükcorrole sitotoksisite etkilerinin moleküler mekanizması tam olarak bilinmemektedir. Galyum (III) '5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) ve serbest baz analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc): Bu deneyde, iki corrole bileşikleri göz önünde bulundurun. Bir RNA transkripsiyon tahlil corroles ve önleyici özelliklerini incelemek için kullanılmıştır. Beş transkripsiyon reaksiyonları hazırlanmıştır: sırasıyla 0.01, bir [şablon DNA baz] oranı ve tedavi edilmemiş kontrol: Bir [kompleks] at Aktinomisin D, Triptolide, Ga (tpfc), tpfc ile tedavi DNA.

transkripsiyon reaksiyonları, agaroz jel elektroforezi ve UV-Vis spektroskopisi kullanılarak 4 saat sonra analiz edilmiştir. Ga (tpfc), Aktinomisin D, ve Triptolide tarafından açık engelleme vardır.

Bu RNA transkripsiyon deneyi veya tamamlanıncaya ile DNA ya da polimeraz inkübe edilerek anti-kanser kompleksi, DNA, ya da polimeraz enziminin konsantrasyonları değiştirilerek daha mekanistik ayrıntı sağlamak için değiştirilebilirönce RNA transkripsiyonu için xes; Bu modifikasyonlar, DNA ya da enzim içeren bir inhibisyon mekanizması arasında ayrım olacaktır. RNA kopyalama komplekslerinin indirgeme olmadığını test ya da RNA'yı hidrolize etmek için kullanılabilir sonra kompleks ekleme. Bu deney aynı zamanda ek anti-kanser adaylar incelemek için kullanılabilir.

Introduction

Kemoterapi genellikle istenmeyen yan etkiler ve sınırlı hedefleme ile geniş spektrumlu sitotoksik ajanlar içerir, ancak kanser biyolojisi daha iyi anlaşılması ile, yüksek kanser hedefleme etkinlik ve daha az yan etki ile antikanser ajanlar için giderek artan bir talep var. 1 İnsan kanser hücreleri sıklıkla haline Hayatta kalmak için tek aktif olduğu veya aşın onkogen bağlıdır. Bu nedenle 2, birçok anti-kanser ilaçları, RNA transkripsiyonu inhibe edebilme özelliği ile değerlendirildi. Bu dönüştürme genlerin ekspresyonunu bloke tedaviler kanser hücrelerini giderilmesinde etkilidir ve hücre ölümüne yol açar., Normal hücrelere tekabül eden 3'ten Dönüştürülmüş hücreler, RNA transkripsiyonu ile bozulmalara karşı daha duyarlıdır. Selektif olarak inhibe eden beklenen transkripsiyonunu inhibe 4 Kansere karşı preparatlar kanser hücresi hayatta kalması için gerekli olan onkogenlerin tanım. 5 Sonuç olarak, RNA transkripsiyonunhibition potansiyel antikanser ilaç adayları belirlemek ve etki mekanizması hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanışlı bir yoldur. Bu protokol Ga (tpfc) kemoterapi ilaçları Aktinomisin D ve Triptolide aynı sipariş RNA transkripsiyonunu inhibe ettiğini göstermektedir; Benzer karşılaştırmalar için diğer anti-kanser ilaç adaylarının bu protokol kullanılarak yapılabilir. Aktinomisin D yaygın gestasyonel trofoblastik kanseri, testis kanseri, Wilm tümörü, rhabdomyosacoma tedavisinde kullanılan bir RNA transkripsiyon inhibitörüdür ve Ewing sarkomu 6. Ilk 1964.Triptolide FDA tarafından in vitro ve 30 yıldan beri çeşitli tümör taşıyan hayvan modellerinde incelenmiştir seçici transkripsiyon inhibitörü olan onaylanalı Aktinomisin D, yaklaşık elli yıl kanser terapisinde kullanılmaktadır. 7

corroles amfifilik makrosiklik doğası gibi küçük moleküller veya biyolojik olarak diğer ilaç sınıfları üzerinde önemli avantajlar kazandırırs. 8-14 makrosiklik karakter, büyük moleküller için beklenenden daha büyük olan hücre geçirgenliği sağlar ve bu tür proteinlerin, bu gibi makro-moleküler yüzeyler ile etkileşim için yeterince büyüktür. 8 Corroles biyomoleküller ile sıkı bir kovalent olmayan kompleksler oluşturdukları bilinmektedir ve uyuşturucu. corrole çerçevenin doğal sitotoksisiteye ilaveten, 10, gösterdiğimiz kemoterapötik maddeler için bir taşıyıcı moleküle, özellikle DNA-ara antrasiklin ilaç doksorubisin gibi sülfonatlı corrole vazifesi görür. Sülfonatlı corrole doksorubisin ile birlikte verilmesi, doksorubisin IC 50 olarak 3 misli bir artışı, DU-145 hücreleri için gözlenmiştir. 9 corrole çerçeve kararlıdır ve fonksiyonalize zaman, benzersiz bir absorbans değişimleri maruz doğal emme ve flüoresans özelliklerine sahip Bu tanımlama için kullanılabilir. skafoldun 10 işlevselleştirilmesi doğal affec değilseçici olarak esas itibarıyla biyolojik özelliklerini değiştirebilir corrole çerçevesini değiştirmeden, sülfonatlı corrole ile görüldüğü gibi, corrole, 9-15 fotofiziksel özelliklere t, ancak. 16: Daha önce yedi insan kanser hücresi türlerine karşı altı metallocorroles değerlendirildi. Sonuçlar, insan kanser hücrelerine karşı toksisitesi, belirli metal iyonu, hem de işlevsel grup ikamesine bağlı olduğunu göstermektedir. Örneğin, sülfonatlanmış galyum corroles yüksek hücre alımı deneyimli ve beyin, metastatik prostat kanseri hücrelerinin (DU-145), çekirdeği içine seçici bir şekilde nüfuz; için olandan başka hücre hatları çekirdek içine nüfuz etmez ama aynı corrole, meme için daha büyük bir sitotoksisite göstermektedir (MDA-MB-231), melanom (SK-MEL-28) ve yumurtalık (OVCAR-3) kanser hücreleri prostat kanseri. 9

Başlangıç ​​hücre bazlı deneyler, bu bileşiklerin bir anti-kanser terapötik maddeleri, hazırda esas olarak ümit göstermiştir göstermektediretki mekanizması içine er soruşturma. Deşifre inhibisyonu bazı organometalik kompleksler 17-27 ile gözlenen ve biz corrole ailenin sitotoksik davranışı için olası bir mekanizma olarak bu süreci incelemek için aranmaktadır. Bu transkripsiyon deneyi canlı hücrelerde bu moleküllerin etkileri hakkında daha detaylı bilgiye götürecek transkripsiyon engellenmesi, değerlendirmek için bir, basit, ucuz ve kolay bir yöntem sağlar.

Burada, galyum transkripsiyon inhibisyonu (III) '5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) ve serbest baz analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Şekil 1) test edilmiştir. Bazı geçiş metali komplekslerinin farklı olarak, galyum (III) 'ün bir redoks aktif olduğunu ve bu nedenle, redoks göre metabolik yolların redoks işlemi de söz konusu değildir. 28 Ne olursa olsun, galyum (III)' sitotoksik özellikler göstermektedir ve tedavi edici amaçlar için araştırılmıştır. Galyum platin sonra antikanser tedavi için ikinci en umut verici metal ve birçok çalışmalar ve araştırmalar uğramıştır; nitrat ve klor galyum tuzları hepatoma, lenfoma, mesane kanserleri, ve diğer hastalıklara karşı klinik çalışmalarda değerlendirilmiştir. 29-34 galyum (III) 'ün anti-kanser corrole çalışmalar için idealdir. İlk veriler (bakınız Şekil 2) Ga (tpfc) ve tpfc sahip olan çeşitli kanser hücresi çizgileri ile düşük Gl 50, maksimum hücre çoğalmasının% 50 inhibe etmek için gerekli ilaç konsantrasyonu olarak göstermektedir; Bu onların engelleyici özelliklerini belirlemek için bu iki bileşikler hakkında daha fazla deneyler geçerliliğini teyit eder. Biz ortak antikanser ilaçların Aktinomisin D ve Triptolide bu bileşikleri karşılaştırın. Aktinomisin D intercalates DNA, RNA uzamasını önler ve pikomolar konsantrasyonlarda belli hücre çizgisinde apoptoza neden 6,35-37 Triptolide tümör büyümesini inhibe ettiği gösterilmiştir.; insan XPB / ERCC3, bir alt-birim O bağlananf transkripsiyon faktörü TFIIH RNA polimeraz II aktivitesinin inhibisyonuna yol açar. 6-7,38-40

Yaygın corroles sitotoksik özellikler gösterdiği bilinir, işlevsellik kaynaklanan farklı mekanizmalar ile ilgili çok az bilgi mevcuttur. RNA transkripsiyonu Corrole engelleme biomacromolecules ile etkileşimlerine daha fazla fikir sunacak. Örneğin dirhodium DNA'ya bağlandığı bilinen diğer kompleksler (II, III) kompleksleri, krom (III) kompleksleri, rutenyum (II) 'polypyridyl kompleksleri, rodyum (III) kompleksleri ve çeşitli diğerleri, 18 RNA transkripsiyon tahlile tâbi tutuldu 27 biomacromolecules ile olan etkileşimleri daha iyi anlaşılması ile sonuçlanır. Bu basit ve yaygın olarak kullanılan deney aynı zamanda, belirli bir molekülün sitotoksisite özelliklerini değerlendirmek ve olmadığını bu yararları daha da biyolojik testler belirlemek için iyi bir başlangıç ​​testidir. RNA transkripsiyon deneyi, aynı zamanda, varyin gibi birçok modifikasyon, sağlargr kullanılan bileşiğin veya bir enzim miktarıdır; inkübasyon süresi, tepkime süresi ve numune zaman noktaları olarak değişiklik göstermesi; ve bu nedenle potansiyel olarak büyük bir veri miktarını sağlayarak, ilgi konusu diğer değişkenler arasında, DNA şablon uzunluğu ve sekansı değişmektedir. Parçalar alınıp ayrı ayrı hazırlanabilir, ancak bu transkripsiyon deneyi, aynı zamanda tüm gerekli reaksiyon bileşenleri ile, uygun kitleri kolayca kullanılabilir. Bu deneylerde, yüksek verim için bilinen, ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılır. 41

Agaroz jel elektroforezi ve UV-Vis spektroskopisi: transkripsiyon önlenmesini değerlendirmek için, biz iki yöntem kullanabilirsiniz. Agaroz jel elektroforezi, ayırma tanımlama ve arıtma 0.5- 25 kb'lik bir DNA ve RNA parçaları için basit ve etkili bir yöntemdir. 42. UV-Vis spektroskopisi konsantrasyonuna ve RNA'nın saflığı belirlemek için kullanılabilir. 43

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: RNA çalışırken DNA ve RNA aşağılamak DNaz ve RNaz enzimleri tarafından kirlenmeyi önlemek için temiz bir çalışma ortamı sağlamak. Bu pipet uçları ve tüpler DNaz ve RNazsız olduğundan emin olun. Böyle bir dekontaminasyon solüsyonu vb pipetler, tüp sahipleri, gibi laboratuvar yüzeyleri ve ekipmanı silin da yararlıdır.

Corrole Tedavi 1. RNA transkripsiyonu

  1. Corrole hazırlayın ve 0.01 inhibitör bileşikleri: [DNA]: [kompleksi] 1 mol oranında.
    NOT: 0.43 pmol DNA kullanılan DNA şablon E. liga geni ile APET-28c vektör oldu: Bizim durumumuzda, bu oran 4.3 finol karmaşık T7 promoterinin kontrolü altında E. coli. T7 promotörü ile diğer DNA aynı zamanda, transkripsiyon deneyi çalıştırmak için geçerli bir adaydır.
    1. Aktinomisin D, temiz, ayrı kaplar içinde Triptolide, tpfc ve dimetil sülfoksit içinde Ga (tpfc) (DMSO) içinde çözülür. [C: 1 molar oranında bir 0.01 nihai konsantrasyonu elde ediliromplex]: nükleaz içermeyen su ile seri dilüsyonları kullanılarak [DNA].
      1. 1.8 ml DMSO içindeki 1 mg Aktinomisin D çözündürülür. Kısım 10, ayrı bir kaba ul ve 1/100 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml'ye seyreltin. Kısım 1, ayrı bir kaba seyreltme ul 1 / 1,000 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml'ye seyreltin.
        NOT: Aktinomisin D nihai çözüm konsantrasyonu 4.3 finol olduğunu.
      2. 0.64 ml DMSO içindeki 1 mg Triptolide çözülür. Kısım 1, ayrı bir kaba ul 1 / 1,000 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml'ye seyreltin. Kısım 1, ayrı bir kaba seyreltme ul ve bir ikinci 1 / 1,000 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml'ye seyreltin.
        NOT: Triptolide nihai çözeltinin konsantrasyonu 4.3 finol olduğunu.
      3. 2.9 ml DMSO içindeki 1 mg tpfc çözülür. 10 ul ayrı bir kapta ve nükleaz içermeyen su ile 1 ml'ye seyreltin kısım 1/100 d oluşturmakilution. Kısım 1, ayrı bir kaba seyreltme ul 1 / 1,000 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml'ye seyreltin.
        NOT: tpfc nihai çözeltinin konsantrasyonu 4.3 finol olduğunu.
      4. 2.6 ml DMSO içindeki 1 mg Ga (tpfc) içinde çözülür. Kısım 10, ayrı bir kaba ul ve 1/100 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml'ye seyreltin. Kısım 1, ayrı bir kaba seyreltme ul 1 / 1,000 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml'ye seyreltin.
        NOT: Ga (tpfc) nihai çözeltinin konsantrasyonu 4.3 finol olduğunu.
        NOT: Bu corroles ve inhibitörler suda çözünür değildir ve daha önce DMSO içinde çözünmüş olmalıdır. (% 1) DMSO az miktarda hücreler (yayınlanmamış veri), sitotoksisiteye yol yoktur.
  2. Önceki transkripsiyon reaksiyonu başlamadan, ayrı ayrı gerekli reaktifleri hazırlamak veya ticari bir satıcıdan bunları satın.
    1. Buz tüm dondu üzerinde çözülmen reaktifler (dondurulmuş reaktif bir listesi için Tablo 1'e bakınız).
    2. Tamamen çözelti içinde çözülene kadar karıştırın 10x reaksiyon tamponu ve 4 ribonükleotid (ATP, CTP, GTP ve UTP) çözümleri bekleyin.
    3. Kısaca tüpün kenarına madde kaybını önlemek için tüm reaktifler santrifüj. Oda sıcaklığında 10x Reaksiyon Tamponu tutarken kez buz üzerinde, mağaza ribonükleotidleri çözülmüş.
    4. Oda sıcaklığında transkripsiyon reaksiyonu için reaktif birleştirin (reaktif bir listesi Tablo 2 ye bakınız).
      NOT: Reaksiyon buz ziyade oda sıcaklığında monte ise 10x Reaksiyon Tampon spermidin şablon DNA coprecipitatlardan edebilirsiniz.
    5. Tüp Flicking veya yukarı ve aşağı yavaşça karışımı pipetleme iyice karıştırın. Karıştırma işleminden sonra, kısaca santrifüj tüpünün tabanına bir reaksiyon karışımının toplanması için.
    6. 2-4 saatlik bir toplam 37 ° C'de, reaksiyon karışımı inkübe edin.
      NOT: Gerekli tepki süreleri değişirDNA şablonları, boyut ve dizi ile. Bu aşama, spesifik diziler için optimizasyon gerektirebilir. Kısa şablonları toplam RNA, yüksek verim için daha uzun reaksiyon süreleri gerekli olabilir.
    7. -20 ° C de, her saat depo edilmesinden sonra her bir reaksiyon 4 ul alikotları çıkarın. İstenilen timepoints için gerektiği gibi değiştirin.

2. RNA Spin kolon

  1. Transkripsiyon reaksiyonu takiben, bir mikrosantrifüj uyumlu kromatografi kolonları kullanarak, RNA yı temizler.
    Not:., RNA kolonlanyla kullanımı% 80'den fazla iyileşme 20'den fazla baz sonuçları ile RNA'yı saflaştırmak için 44
    Not: Kolon kromatografisi, RNA'yı saflaştırmak için, yaygın ve uygun bir yöntemdir. Kloroform ekstraksiyonu, izopropanol çökeltme gibi diğer ticari olarak temin edilebilen kitler: Diğer saflaştırma yöntemleri, aynı zamanda, lityum klorür çökelmesi, fenol olarak mevcutturlar.
    1. Eşit şiddetle tersini kolon tampon Sephadex matris tekrar süspansiyonKolon, üç ya da daha çok kez. Keskin sütunu hafifçe vurarak bu yapın.
    2. Sütununda üst kapağını çıkarın. Kap bazı kalıntı Sephadex matris olacaktır; kap matrisi ile dolu ise, kolona kapağını yerine takın ve matris çoğunluğu sütununda kadar önceki adımı tekrarlayın.
    3. Kolonun alt ucunu çekin.
      NOT: Bazı sıvı sütunundan çıkabilir.
    4. Sütun Paketi.
      1. Steril (RNaz'ın ve Dnase ücretsiz) 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içinde sütun yerleştirin.
      2. 1 dakika boyunca 1.000 xg'de bir masaüstü santrifüj tüp santrifüj.
    5. Kolondan taşınan tampon maddesi ile bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü atın.
    6. Hemen yeni bir 1.5 mL steril mikrosantrifüj tüpü içinde sütun yerleştirin ve kolon yatağın merkezine örnek pipetle. Sütun aşırı yüklenmesini önlemek için numune 20-50 ul kullanın.
    7. 1.000 xg'de bir masaüstü santrifüj tüp santrifüj1 dakika karıştırıldı.
      NOT: yıkama sıvısı saflaştırılmış RNA örnek.

3. Agaroz Jel Elektroforez (% 1 Agaroz Jel) 42

Not: Etidyum bromür, DNA ve RNA'ya bağlanma üzerine fluoresces, bu nedenle, bu biyomoleküllerin 0.5 ug / ml etidyum bromür çözeltisi ile inkübe edilerek UV ışığı ile görselleştirilebilir.

  1. Su, 5 mg, etidyum bromür 10 ml eritilmesi ile, etidyum bromür (0.5 mg / ml) 'in bir 1,000x stok çözelti hazırlayın.
  2. Jel elektroforezi için Tris Asetat EDTA (TAE) çalışan tampon hazırlayın. Bir 50x TAE tamponu, 2.0 M Tris-asetat, 0.05 M Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile birleştirmek ve pH değeri 8.5 olarak ayarlamak yapmak.
  3. Tampon 1L 1x TAE 10 gr UltraPure Agaroz çözülmesi ve geleneksel bir mikrodalga fırında agarozun eritilmesi ile bir% 1 (ağırlık / hacim) agaroz jel hazırlayın. 50 ° C'ye soğuduktan sonra,% 1 agaroz jel Solu için 1,000x etidyum bromid 1 ml ilaveyonu, yavaşça dönen ya da kapalı bir kap içinde baş aşağı çevirerek karıştırın, daha sonra, bir jel döküm platforma agaroz dökün ve jel oda sıcaklığında katılaşmaya sağlar.
    NOT: Etidyum bromür bir mutajen ve potansiyel kanserojendir. Eldiven giyin ve dikkatli çözümleri ele. Etidyum bromür uygun kullanım prosedürleri için, lütfen bkz: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 .
  4. Jel katılaşmış sonra, elektroforez tankı set jel yerleştirin. Kuyular batık kadar jel karşılamak için yeterli TAE tamponu ekleyin. TAE tampon seviyesi yaklaşık 1 mm jel seviyesinden olup olmadığını kontrol edin. Jel tarağı çıkarın.
    NOT: kuyular batık sonra tarak Çıkarma kuyularda hapsolmak hava cepleri önler.
  5. RNA örnekleri hazırlayın. 1 ul Jel Yükleme Tamponu ile arıtılan her bir örnek, tüm bölenin 1 ul birleştirme (ya da 1 ul 10x yükleme tamponu ve olduğu zaman dilüe olabilme ileed nükleaz içermeyen su ile 10 ul) ve bir mikropipet ile pipetleme ve aşağı iyice karıştırın.
    Not: 10x yükleme tamponu 20% Ficoll 400 0.1 M Na2EDTA, pH 8.0,% 1.0 SDS,% 0.25 bromofenol mavisi ihtiva eder. Mavi bromofenol kadar hızlı ~ 50 ila% ve çok uzun çalışır izlenmesi için yararlı olabilir,% 0.25 iksilen siyanol, aynı zamanda, yükleme tamponu ilave edilebilir. 42
  6. Dikkatle her bir dibine çözüm pipetleme her numune ile jel yükleyin. Herhangi bir hava kabarcıkları bırakın veya kuyuların arasındaki örnekleri karıştırmak için değil dikkat edin.
    NOT: RNA merdiveni de kopyasının büyüklüğünü tespit etmek için kullanılabilir.
  7. DNA pozitif kurşun doğru jel içine göç böylece potansiyel takın. Istenilen seviyeye genellikle 1 ila 10 V / jel cm gerilimini ayarlayın. Ancak uzun süre jel ayrılık ilerlemesini izlemek için boyaların göç kullanarak RNA fragmanları arasındaki önemli ayrılık, için yeterlidir çalıştırın.
    NOT: 150 V yaklaşık 20 dakika sürer 8 cm x 8 cm jel ise, 250 V A 23 cm x 25 cm jel, yaklaşık 1 saat sürecektir. Yüksek gerilimlerde çalıştırdığınızda küçük RNA parçaları daha iyi çözünürlüğe sahip.
  8. Yükleme tampon boya RNA fragmanları arasındaki ayırımı için yeterli karar mesafe göç zaman güç kaynağını kapatın.
  9. Etidyum bromür UV ışık altında floresan RNA olacaktır Görüntü.
  10. Görüntünün bir resim çekin ve her durumda saflaştırılmış RNA floresan yoğunluklarının karşılaştırılması.

UV-Vis Spektroskopisi aracılığıyla 4. RNA Niceleme

  1. Bir NanoDrop 2000 veya benzeri makinede 2 ul H 2 O yerleştirin ve Boş ölçün.
  2. Daha sonra, bir spektrometre ile reaksiyonu, saflaştırmanın ardından, her bir RNA örnek 2 ul, koyun ve 800 nm ila 200 nm arasında bir dalga uzunluğu aralığında UV-Vis ölçer.
    Not: 1.0 arasında bir bir 260 okuma RNA, yaklaşık 40 ug / ml 'ye eşit olan,ve saf RNA bir A 260 / 2.1 A 280 oranına sahiptir. 45
  3. Durumda, bu emme 1'den OD az elde etmek için nükleaz içermeyen su numuneleri, seyreltik 1 OD üzerindedir.
  4. Çeşitli örnekleri arsa ve 260 nm'de OD karşılaştırmak için grafik yazılımı kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Agaroz Jel Elektroforez ile Değerlendirilen RNA Transkripsiyon Nitelik

Agaroz jel elektroforez görüntüye transkribe RNA kullanılmıştır. Etidyum bromür RNA 46 sağlayan görüntüleme (λ em 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm =) bağlanması üzerine fluoresces. Jel koyu bantlar RNA'nın yüksek konsantrasyonlarda karşılık gelmektedir. Aktinomisin D Triptolide ya da corrole kompleks RNA transkripsiyonu inhibe ederse, RNA üretimi azalır ve bant daha açık görünecektir. Bu kavram kullanılarak, ilgili inhibisyonu tespit edilebilir.

0.01 [şablon DNA baz] oranı: Şekil 3, bir [kompleksi] RNA transkripsiyon reaksiyonları hiçbir karmaşık, Aktinomisin D, Triptolide, tpfc veya Ga (tpfc) ile ön-muamele edilmiş olan, etidyum bromür lekeli agaroz jeli (% 1) göstermektedir : 1 arasındadır. Beklendiği gibi Aktinomisin D ve Triptolide, kontrolünkine kıyasla RNA açık bir düşüşü gösterirBu uzun okudu inhibitörleri. Tpfc bandı hiç önleme göstermeyen ve kontrol ile aynı nispi yoğunluk sergileyen ise GA (tpfc) bandı, aynı zamanda, RNA çok düşük bir seviyeye sahiptir.

RNA Transkripsiyon UV-Vis Spektroskopisi tarafından nicel

UV-Vis ölçümleri 4 saat süre ile, RNA transkripsiyonu geçtikten sonra, her numune için alınmış ve RNA, spin kolon kromatografisi ile saflaştırılmıştır. dalga boyu spektrumu 350 nm ile 220 ​​nm λ maksimum RNA absorbsiyona denk gelen, 260 nm'de meydana gelen, Şekil 4'te gösterilmektedir, ve 0.025 (ug / ml) bir sönüm katsayısı 1 cm-1. 260 nm ve 280 nm 'de absorbans Bir A 1.0 260 okuma RNA, yaklaşık 40 ug / ml' ye denktir. Tablo 3'te belirtilmiş ve saf RNA niceliksel sağlayan bir A 260 / 2.1 bir 280 oranına sahiptir edilir Trans sırasında üretilen RNA,cription reaksiyonu ve RNA spin kolon kullandıktan sonra RNA saflık bir değerlendirme. Dört inhibitörü ile tedavi transkripsiyon reaksiyonları 44 Üç sadece 0.07 kat daha fazla RNA transkripsiyonu Ga (tpfc) enjekte DNA ile, kontrol daha az RNA vermiştir muamele edilmemiş DNA kullanılabilir. tpfc ile muamele edilmiş DNA, belirgin bir etki gösterdi. Bütün numuneler, nispeten saf örnekleri gösteren, yaklaşık 2.2 arasında bir bir 260 / A 280 oranına sahiptir. RNA kolonlanyla ile saflaştırma kısa RNA 20 veya daha az nükleotid uzunluğunda şeritler kaldırır. Kalıntı DNA ya da 20 nükleotitten daha uzun şeritler saflaştırılmış örnekler olarak kabul edilen mevcut olabilir. Bu hafif katışkılar 2.1 biraz daha büyük bir A 260 / A 280 oranı elde edilmesine neden olur.

Şekil 1,
(III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (t Galyum Şekil 1. Moleküler yapılarpfc)) ve serbest baz analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Sitotoksisitenin eğrileri ve GI prostat corroles 50 değerleri (DU-145) (gri), meme (MDA-MB-231) (mavi), cilt (SK-MEL-28) (turuncu) ve yumurtalık (OVCAR -3) (yeşil) kanser hücre çizgileri. Hücreler (A), Ga (tpfc) kullanılarak canlılığının belirlenmesi ve ardından (B) 'tpfc ile inkübe edildi, üreticinin protokolüne uygun olarak kolorimetrik hücre canlılığı deneyi MTS amaçlamaktadır. Burada tıklayın Bu büyük bir versiyonunu görmek içinrakam.

Şekil 3,
Inkübasyon 4 saat sonra transkripsiyon reaksiyonları Şekil 3. Etidyum bromür boyalı agaroz jeli (% 1). Şerit 1, standart olarak bir 1000 bp DNA merdiveni. Kontrol (şerit 2), Aktinomisin D (yol 3): kuşak 2-6 0.43 pmol DNA'dan transkribe ve her inhibitörün 4.3 mmol'ü ile muamele RNA (: 0.01 [şablon DNA baz] oranı [kompleksi]) gösterir Triptolide (kuşak 4), tpfc (hat 5) ve Ga (tpfc) (yol 6).

Şekil 4,
1 Şekil 4, UV-Vis spektrumu:. Inkübasyon 4 saat sonra, transkribe RNA 200 seyreltme transkripsiyon reaksiyonu için DNA şablonu herhangi bir kompleksi ile muamele edilmiş ya da Aktinomisin D, Triptolide, tpfc veya Ga (tpfc) de sahip olan Bir [kompleks]: [şablon DNA baz] 0.01 oranı: 1. RNA konsantrasyonu, 260 nm 'de OD ile ölçülür.

Buz üzerinde donmuş reaktifler çözülme:
Adenozin trifosfat, guanozin trifosfat, sitidin trifosfat ve uridin trifosfat 75 mM çözümleri (ATP, CTP, GTP, UTP)
Nükleazlar ücretsiz su
10x reaksiyon tamponu (1 x Reaksiyon Tamponu: 40 mM Tris-HCI, 6 mM MgCl2, 2 mM spermidin, 10 mM ditiotreitol, pH 7.9)
Doğrusallaştırılmış Şablon DNA (0.5 ug / ml, 1.85 kb),
RNA polimeraz enzimi (20 U / ul)

Dondurulmuş reaktifler Tablo 1. listesi.

Transkripsiyon reaksiyonlarını İlk olarak, 0.2 ml ince duvarlı PCR tüpleri her reaktif maddenin aşağıdaki miktarının eklenmesi:
2 ulATP çözeltisi (75 mM)
2 ul CTP solüsyonu (75 mM)
2 ul GTP çözeltisi (75 mM)
2 ul UTP solüsyonu (75 mM)
1 ul nükleaz ücretsiz su
2 ul 10x reaksiyon tamponu
0.5 ug / ml doğrusal şablon DNA 2 ul
5 ul kompleks (gibi çekirdek içermeyen su boş, D, Triptolide, tpfc aktinomisin, Ga (tpfc))
2 ul RNA Polimeraz (20 U / ul)

Transkripsiyon reaksiyonu için reaktif Tablo 2. listesi.

Zaman Noktası (saat) Kompleks Bir 260 Bir 280 </ Strong> A 260 / A 280 Seyreltme Faktörü [RNA]: A 260
(Ug / ml)
[RNA] (mg / ml)
4 Kontrol 7,583 3,516 2.16 200 40 60,67
4 Aktinomisin D 0.955 0.438 2.18 200 40 7,638
4 Triptolide 1,794 0.816 2.2 200 40 14.35
4 tpfc 7,858 3,631 2.16 200 40 62,87
4 Ga (tpfc) 0.554 0.232 2.39 200 40 4,434

Tablo 3. konsantre edilmesi ve transkribe edilmiş RNA saflık 4 saat UV-Vis spektroskopisi ile ölçüldü sonra., Tek-şeritli RNA söndürme katsayısının (ug / ml), 0.025 -1 cm-1, 1,0 A 260 okuma yaklaşık eşdeğerdir 40 ug / ml RNA, ve saf RNA A 260 / 2.1 A 280 oranına sahiptir. 45

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu deney, Ga (tpfc) eklenmesi bilinen DNA bağlayıcı antikanser kompleksleri Aktinomisin D ve Triptolide karşı kıyaslanabilir bir RNA transkripsiyonu inhibe ettiğini ortaya koymaktadır. Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1-154,7 iM) sitotoksik davranışı onun engelleyici özellikleri nedeniyle olabilir. Herhangi bir transkripsiyon inhibisyonu tpfc görüldüğü için, tpfc sitotoksisitesi RNA transkripsiyon inhibisyonuna bağlı değildir, ancak henüz incelenmemiş başka bir şekilde kaynaklanır.

Yapılan dört transkripsiyon reaksiyonları, DNA ile, Aktinomisin D, Triptolide, tpfc veya Ga (tpfc) ile muamele edildi, bir [kompleks]: [şablon DNA baz] tarafından, sırasıyla, 0.01, ya da edilmemiş bir kontrol oranı. transkripsiyon reaksiyon, tepkin maddeler bir araya getirilmiş ve transkripsiyon reaksiyonu, 37 ° C'de 4 saat devam etmesine izin verildi. transkribe RNA, RNA spin kolon UV-Vis ve jel elektroforezi ile analiz verim ile saflaştırılmıştır. transkripsiyon inhibisyonu doğası Furt edilebilironun çeşitli modifikasyonlar ile aynı teknik kullanılarak araştırıldı veya bileşiklerin in vitro ve in vivo çalışmalar, alternatif tabi tutulabilir. Inhibisyon moleküler yapısını belirlemeye yardımcı olabilecek ek deneyler olası corrole-DNA adüktlerinin veya transkripsiyon reaksiyonu sayısal modelleme X-ışını kristalografisi bulunmaktadır. Bu deneyin amacı bileşikleri potansiyel antikanser özellikleri hakkında bilgi toplamak için transkripsiyonu inhibe olmadığını belirlemektir. Bu amaç elde edildi: Ga (tpfc) net inhibisyon ve yararları daha fazla çalışma sergiledi ise tpfc, hiçbir inhibisyonu sergiledi.

RNA transkripsiyon deneyi daha mekanistik ayrıntı sağlamak için modifiye edilebilir. Transkripsiyon reaksiyonundan sonra anti-kanser ajanlar (örneğin, corrole kompleksleri) ilave kompleksleri indirgeme ya da RNA'yı hidrolize olmadığını gösterebilir tamamlanır. Başka tavsiye deney yapmaktırRNA polimeraz enzimi hariç tüm bileşenler ile transkripsiyon reaksiyonu DNA veya enzim içeren bir inhibisyon mekanizması arasında ayrım sağlamak için daha düşük 10-kat. Son olarak, DNA ya da kompleks engelleyici nitelikleri DNA ya da polimeraz sırasıyla bağlanmasında rol olup olmadığını belirleme artan karmaşık ve ilgili hedef arasındaki bağlanma için izin RNA transkripsiyonu önce kompleksleri ile polimeraz inkübasyonu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Biz içtenlikle jel elektroforezi ile yardım Dr. Cindy N. Chiu teşekkür ve DNA ve sınırlama enzimi onların cömert bağış için Andy Zhou ve Michael Grodick. Biz minnetle ekipman ve malzeme cömert erişim için Profesör J. Heath ve Profesör D. Prober kabul. Biz yararlı öneriler Dr. Karn Sorasaenee teşekkür ederim. Biz video şematik genel olarak kullanılan illüstrasyon oluşturmak için Mary H. Tang teşekkür ederim. Fon Johnson & Johnson ve BDT Y86786 tarafından sağlandı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actinomycin D Sigma-Aldrich A1410 Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide Sigma-Aldrich T3652 Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2 Life Technologies AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit Life Technologies AM1334 Store at –20 °C 
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate Sigma-Aldrich T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-100
mini Quick Spin RNA Columns Roche Life Science 11814427001 Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S Store at –20 °C 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Cancer Society. American Cancer Society. Atlanta. Available from: http://www.cancer.org (2014).
  2. Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
  3. Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41, (16), 2569-2576 (2005).
  4. Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17, (12), 7306-7316 (1997).
  5. Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3, (4), 4170-4190 (2011).
  6. Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2, (3), 103-108 (2011).
  7. Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11, (3), 377-383 (2011).
  8. Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15, (4), 738-746 (2004).
  9. Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25, (2), 400-409 (2012).
  10. Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39, (22), 4048-4051 (2000).
  11. Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16, (6), 1-6 (2011).
  12. Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (15), 6105-6110 (2009).
  13. Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163, (3), 368-373 (2012).
  14. Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17, (1), 11 (2012).
  15. Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8, (6), 2233-2243 (2011).
  16. Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124, (25), 7411-7420 (2002).
  17. Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46, (23), 4320-4324 (2007).
  18. Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42, (3), 878-884 (2003).
  19. Sorasaenee, K., Fu, P. K. -L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42, (4), 1267-1271 (2003).
  20. Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46, (18), 7494-7502 (2007).
  21. Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251, (1-3), 61-65 (2008).
  22. Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48, (13), 5599-5601 (2009).
  23. Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104, (5), 576-582 (2010).
  24. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378, (1), 140-147 (2011).
  25. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10, (3), 367-384 (2013).
  26. Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43, (3), 1175-1183 (2004).
  27. Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
  28. Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536, (1), 43-54 (2001).
  29. Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42, (3), 283-296 (2002).
  30. Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. Cancer Research. 48, (11), 3014-3018 (1988).
  31. Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. Cancer Research. 51, 6199-6201 (1991).
  32. Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
  33. Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7, (5), 2337-2361 (2010).
  34. Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4, (10), 1257-1272 (2012).
  35. Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, (5), 1417-1421 (1988).
  36. Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53, (7), 969-977 (1997).
  37. Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280, (10), 9586-9594 (2005).
  38. Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7, (3), 182-188 (2011).
  39. Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68, (13), 5257-5266 (2008).
  40. Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8, (10), 2780-2790 (2009).
  41. MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. Life Technologies. Carlsbad. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/1330M_G.pdf (2014).
  42. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27, (2-3), 126-139 (2006).
  43. Quick Spin Columns Protocol. Roche Diagnostics GmbH. Mannheim. Available from: https://pim-eservices.roche.com/LifeScience/Document/95c2b1f8-7cf1-e311-98a1-00215a9b0ba8 (2013).
  44. RNA quality control. KU Leuven: Biomedical Genomics. Leuven. Available from: http://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.html (2007).
  45. Sabris, R. W. Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. Wiley. Hoboken, NJ. (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics