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Bioengineering

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Summary

Gallium (III) 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole und seine Freebase analogen aufweisen niedrigen mikromolaren Zell-Zytotoxizität. Diese Handschrift beschreibt ein RNA-Transkriptionsreaktion, Imaging-RNA mit einem Ethidiumbromid-gefärbten Gel und Quantifizierung RNA mit UV-Vis-Spektroskopie, um die Transkription Hemmung durch Corrolen bewerten und zeigt eine einfache Methode zur Bewertung Krebskandidat Eigenschaften.

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Tang, G. Y., Pribisko, M. A., Henning, R. K., Lim, P., Termini, J., Gray, H. B., Grubbs, R. H. An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles. J. Vis. Exp. (97), e52355, doi:10.3791/52355 (2015).

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Abstract

Chemotherapie oft mit Breitspektrum-zytotoxischen Substanzen mit vielen Nebenwirkungen und begrenzte Targeting. Corrolen sind eine Klasse von Tetrapyrrol-Makrozyklen, die Differenz zytostatische und zytotoxische Eigenschaften in bestimmten Zelllinien, abhängig von der Identität des chelatisierten Metall und funktionelle Gruppen aufweisen. Die einzigartige Verhalten von funktionalisierten Corrole auf bestimmte Zelllinien wird die Möglichkeit der gezielten Chemotherapie.

Viele Krebsmedikamente sind durch ihre Fähigkeit, die RNA-Transkription zu inhibieren. Hier stellen wir einen Schritt-für-Schritt-Protokoll für die RNA-Transkription in Gegenwart von bekannten und potentiellen Inhibitoren. Die Bewertung der RNA-Produkte der Transkriptionsreaktion durch Gelelektrophorese und UV-Vis-Spektroskopie liefert Informationen über hemmende Eigenschaften potentieller Antikrebsarzneimittelkandidaten und mit Modifikationen an der Assay mehr über deren Wirkmechanismus.

Wenigwird über den molekularen Wirkmechanismus von Corrol Zytotoxizität bekannt. In diesem Experiment betrachten wir zwei Corrol Verbindungen: Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) und freien Base analogen 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Ein RNA-Transkriptionsassay wurde verwendet, um die hemmenden Eigenschaften der Corrole untersuchen. Fünf Transkriptionsreaktionen wurden hergestellt: [template DNA-Basen] Verhältnis von 0,01 sind, und einer unbehandelten Kontrolle: mit Actinomycin D, Triptolid, Ga (tpfc) tpfc an einem [komplexen] behandelte DNA.

Die Transkriptionsreaktionen wurden nach 4 h unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese und UV-Vis-Spektroskopie analysiert. Es ist klar, Hemmung durch Ga (tpfc), Actinomycin D und Triptolid.

Das RNA-Transkriptionsassay kann modifiziert werden, um mehr mechanistischen Detail durch Variieren der Konzentrationen des Antikrebs-Komplex, DNA oder Polymeraseenzym bereitstellen, oder durch Inkubieren der DNA-Polymerase oder mit dem complexes vor der RNA-Transkription; Diese Modifikationen würden zwischen einer Hemmung Mechanismus mit der DNA oder das Enzym unterscheiden. Zugabe des Komplexes nach der RNA-Transkription verwendet werden, um zu testen, ob die Komplexe zersetzen oder hydrolysiert das RNA ist. Dieser Assay kann auch verwendet werden, um zusätzliche Antikrebskandidaten zu untersuchen.

Introduction

Chemotherapie beinhaltet oft Breitspektrum cytotoxischen Mitteln mit unerwünschten Nebenwirkungen und begrenzten Ausrichtung, aber mit einem besseren Verständnis der Krebsbiologie, gibt es eine ständig steigende Nachfrage nach Antikrebsmitteln mit höheren krebs Targeting Wirksamkeit und weniger Nebenwirkungen. 1 Humankrebszellen werden häufig 2 somit von einem einzigen aktiviert oder überexprimiert Onkogen für das Überleben., viele Krebsmedikamenten durch ihre Fähigkeit, die RNA-Transkription zu inhibieren. Behandlungen, die die Expression dieser Gene zu blockieren Transformation sind wirksam bei der Beseitigung von Krebszellen und führen zu Zelltod. 3 Transformierte Zellen sind empfindlicher gegenüber Störungen in der RNA-Transkription als auch entsprechende normale Zellen. 4 Medikamente gegen Krebs, welche die Transkription hemmen sollen selektiv gehemmt Expression der Onkogene, die notwendig für die Krebszelle, um zu überleben. 5 Folglich RNA Transkription inhibition ist eine nützliche Methode, um mögliche Krebsmedikamentenkandidaten zu identifizieren und mehr über ihre Wirkungsweise. Dieses Protokoll zeigt, dass Ga (tpfc) hemmt die RNA-Transkription auf der gleichen Reihenfolge wie die Chemotherapeutika Actinomycin D und Triptolid; ähnliche Vergleiche können mit diesem Protokoll mit anderen Krebsmedikamentenkandidaten durchgeführt werden. Actinomycin D ist ein RNA-Transkriptionsinhibitor häufig verwendet, um Schwangerschafts trophoblastic Krebs, Hodenkrebs, Wilms-Tumor, rhabdomyosacoma behandeln und Ewing-Sarkom 6. Actinomycin D wurde in der Krebstherapie fast fünfzig Jahre lang verwendet worden, da sie erstmals von der FDA zugelassenen 1964.Triptolide ist ein selektiver Inhibitor der Transkription, die in vitro und in verschiedene tumortragenden Tiermodelle für 30 Jahre untersucht worden ist. 7

Die amphiphile Natur der makrozyklischen Corrolen vermittelt wesentliche Vorteile gegenüber anderen Substanzklassen, wie kleine Moleküle oder biologischens. 8-14 makrocyclischen Charakter ermöglicht Zellpermeabilität, die größer ist als für solche großen Moleküle erwarten ist, und dass sie groß genug ist, um mit makromolekularen Oberflächen, wie jene von Proteinen in Wechselwirkung treten können. 8 Corrole bekannt, um enge kovalente Komplexe mit Biomolekülen zu bilden und Arzneimitteln. 10 zusätzlich zu der inhärenten Cytotoxizität des Corrol Rahmen haben wir gezeigt, daß ein sulfoniertes Corrol wirkt als Trägermolekül für chemotherapeutische Mittel, insbesondere die DNA-interkalierende Anthracyclin Doxorubicin. Wenn das sulfonierte Corrol wurde mit Doxorubicin verabreicht wurde eine 3-fache Steigerung in der IC 50 von Doxorubicin für DU-145-Zellen beobachtet. 9 Corrol Rahmen ist stabil und hat inhärente Absorption und Fluoreszenz-Eigenschaften, die, wenn funktionalisierte laufen einzigartige Absorptionsschichten das kann für die Charakterisierung verwendet werden. 10 Funktionalisierung des Gerüsts nicht von Natur aus affect die photophysikalischen Eigenschaften des Corrol, 9-15, aber, wie mit einem sulfonierten Corrol gesehen, selektiven Modifizieren der Rahmen des Corrol seine biologischen Eigenschaften wesentlich zu verändern. 16. Wir haben bereits ausgewertet sechs metallocorroles gegen sieben menschlichen Krebszelllinien. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Toxizität gegenüber menschlichen Krebszellen ist abhängig von der spezifischen Metallionen sowie funktionelle Gruppe Substitution. Zum Beispiel sulfonierte Gallium Corrole erfahren hohe zelluläre Aufnahme und drang selektiv in den Kern der Gehirn metastatischen Prostatakrebszellen (DU-145); die gleiche Corrol, obwohl es nicht in den Kern der anderen Zelllinien durchdringen, weist höhere Zytotoxizität für Brustkrebs (MDA-MB-231), Melanom (SK-MEL-28) und Eierstock- (OVCAR-3) Krebszellen als für Prostatakrebs. 9

Erste Tests auf Zellbasis zeigen, dass diese Verbindungen zeigen Versprechen als Anti-Krebs-Therapeutika, welche furth Verdiensteer Untersuchung des Wirkmechanismus. Transkriptionshemmung mit bestimmten organometallischen Komplexen 17-27 beobachtet, und man versucht, diesen Prozess als ein möglicher Mechanismus für die zytotoxische Verhalten des Corrol Familie untersuchen. Diese Transkriptions-Assay bietet eine einfache, kostengünstige und einfache Methode zur Beurteilung der Inhibierung der Transkription, was mehr detaillierte Informationen über die Wirkung dieser Moleküle in lebende Zellen führt.

Hier wird die Transkription Hemmung von Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) und seine freie Base analogen 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figur 1) getestet. Anders als bei einigen Übergangsmetallkomplexe, (III) Gallium ist Redox inaktiv und wird daher nicht direkt in der Redox-Prozess des Redox-basierte Stoffwechselwegen beteiligt sind. 28. Unabhängig, Gallium (III) nicht aufweisen cytotoxischen Eigenschaften und ist für therapeutische Zwecke untersucht. Gallium ist die zweite vielversprechendsten Metall für Krebstherapeutika nach Platin und hat zahlreiche Studien und Untersuchungen unterzogen wurden; Nitrat und Chlorid Galliumsalzen wurden in klinischen Studien gegen Hepatom, Lymphom, Blasenkrebs und anderen Krankheiten untersucht worden. 29-34 Gallium (III) ist daher ideal für Anti-Krebs-Corrol Studien. Erste Daten zeigen, Ga (tpfc) und tpfc haben einen niedrigen GI-50, die Drogenkonzentration notwendig, 50% der maximalen Zellproliferation zu hemmen, mit verschiedenen Krebszelllinien (siehe Abbildung 2); Dies bekräftigt die Gültigkeit der weiteren Experimenten auf diesen beiden Verbindungen, ihre hemmende Eigenschaften zu bestimmen. Vergleicht man diese Verbindungen mit den gemeinsamen Krebsmedikamente Actinomycin D und Triptolid. Actinomycin D Interkalate DNA inhibiert RNA Dehnung und induziert Apoptose in bestimmten Zelllinie bei picomolaren Konzentrationen 6,35-37 Triptolid wurde gezeigt, dass das Tumorwachstum zu hemmen. es um Menschen XPB / ERCC3, eine Untereinheit o bindetf Transkriptionsfaktor TFIIH, was zur Hemmung der RNA-Polymerase II-Aktivität. 6-7,38-40

Während es allgemein bekannt ist, dass Corrole aufweisen cytotoxischen Eigenschaften besteht wenig Informationen über die verschiedenen Mechanismen, die aus Funktionalisierung. Corrol Hemmung der RNA-Transkription würde einen besseren Einblick auf ihre Wechselwirkungen mit Biomakromolekülen bieten. Andere Komplexe bekannt, an DNA zu binden, wie dirhodium (II, II) -Komplexe, Chrom (III) Komplexe, Ruthenium (II) Polypyridylkomplexe, Rhodium (III) -Komplexe und verschiedene andere, wurden die RNA-Transkriptionstests unterworfen, 18- 27 was zu mehr Verständnis für ihre Interaktionen mit Biomakromolekülen. Diese einfache und weithin verfügbar Experiment ist auch ein guter erster Test, um die Zytotoxizität Eigenschaften eines Moleküls zu bewerten und festzustellen, ob es verdient eine weitere biologische Tests. Das RNA-Transkriptionsassay ermöglicht auch viele Modifikationen, wie varying die Menge einer Verbindung oder Enzymen verwendet wird; Variieren der Inkubationszeit, der Reaktionszeit und der Probenzeitpunkten; und Verändern der DNA-Matrize Länge und Sequenz, unter anderen Variablen von Interesse, wodurch potenziell eine große Menge von Daten. Diese Transkriptions Assay ist auch leicht erschwinglich Kits mit allen vorgesehenen notwendigen Reaktionskomponenten zur Verfügung, obwohl Komponenten können gekauft und individuell vorbereitet werden. In diesen Experimenten verwenden wir eines kommerziell erhältlichen Kits bekannt, hohe Ausbeute zu haben. 41

Transkription Hemmung beurteilen, nutzen wir zwei Methoden: Agarose-Gelelektrophorese und UV-Vis-Spektroskopie. Agarose-Gel-Elektrophorese ist ein einfaches und effektives Verfahren zur Trennung, Identifizierung und Reinigung von 0,5-bis 25-kb-DNA und RNA-Fragmente. 42 UV-Vis-Spektroskopie kann verwendet werden, um die Konzentration und Reinheit der RNA zu bestimmen. 43

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Protocol

HINWEIS: Bei der Arbeit mit RNA pflegen eine saubere Arbeitsumgebung, um eine Verunreinigung durch DNase und RNase Enzyme, die DNA und RNA abbauen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitzen und Schläuche sind DNase und RNase frei. Es ist auch hilfreich, um abwischen Labor Oberflächen und Geräte wie Pipetten, Rohrhalter, etc. mit einer Dekontaminationslösung.

1. RNA-Transkription mit Corrol Behandlung

  1. Bereiten Sie die Corrol und Inhibitorverbindungen in einem 0,01: 1 Molverhältnis von [komplexen]: [DNA].
    HINWEIS: In unserem Fall ist das Verhältnis bei 4,3 fmol Komplex: 0,43 pmol DNA, wobei die DNA-Matrize verwendet wurde, APET-28c Vektor mit LIGA-Gen aus E. coli unter der Kontrolle des T7-Promotors. Andere DNA mit dem T7-Promotor gelten auch Kandidaten für den Betrieb des Transkriptionsassay.
    1. Löse Actinomycin D, Triptolid tpfc und Ga (tpfc) in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer sauberen, getrennten Behältern. Erhalten Endkonzentration einer 0,01: 1 molaren Verhältnis von [complexe]: [DNA] mit Verdünnungsreihen mit Nuklease-freies Wasser.
      1. Lösen Sie 1 mg Actinomycin D in 1,8 ml DMSO. Aliquot 10 ul auf einem separaten Behälter und auf 1 ml zu verdünnen mit Nuklease-freies Wasser, um eine 1/100 Verdünnung erstellen. Aliquot 1 ul der Verdünnung auf einem separaten Behälter und mit Wasser auf 1 ml mit Nuklease-freiem Wasser auf ein 1 / 1.000-Verdünnung zu schaffen.
        HINWEIS: Die Konzentration der fertigen Lösung von Actinomycin D ist 4,3 fmol.
      2. Lösen Sie 1 mg Triptolid in 0,64 ml DMSO. Aliquot 1 ul auf einem separaten Behälter und auf 1 ml zu verdünnen mit Nuklease-freies Wasser, um eine 1/1000-Verdünnung erstellen. Aliquot 1 ul der Verdünnung auf einem separaten Behälter und mit Wasser auf 1 ml mit Nuklease-freies Wasser, um eine zweite 1/1000-Verdünnung erstellen.
        HINWEIS: Die Konzentration der fertigen Lösung von Triptolid 4,3 fmol.
      3. Lösen Sie 1 mg tpfc in 2,9 ml DMSO. Aliquot 10 ul auf einem separaten Behälter und mit Wasser auf 1 ml mit Nuklease-freies Wasser, um eine 1/100 d erstellenilution. Aliquot 1 ul der Verdünnung auf einem separaten Behälter und mit Wasser auf 1 ml mit Nuklease-freiem Wasser auf ein 1 / 1.000-Verdünnung zu schaffen.
        HINWEIS: Die Konzentration der Endlösung tpfc 4,3 fmol.
      4. Lösen Sie 1 mg Ga (tpfc) in 2,6 ml DMSO. Aliquot 10 ul auf einem separaten Behälter und auf 1 ml zu verdünnen mit Nuklease-freies Wasser, um eine 1/100 Verdünnung erstellen. Aliquot 1 ul der Verdünnung auf einem separaten Behälter und mit Wasser auf 1 ml mit Nuklease-freiem Wasser auf ein 1 / 1.000-Verdünnung zu schaffen.
        HINWEIS: Die Konzentration der fertigen Lösung von Ga (tpfc) 4,3 fmol.
        ANMERKUNG: Diese Corrole und Inhibitoren sind in Wasser nicht löslich und müssen in DMSO vorgelöst. Kleine Mengen von DMSO (unter 1%) induzieren keine Zytotoxizität in den Zellen (unveröffentlichte Daten).
  2. Vor Beginn des Transkriptionsreaktion, bereiten die notwendigen Reagenzien einzeln oder kaufen sie von einem kommerziellen Anbieter.
    1. Thaw auf Eis fror allen Reagenzien (siehe Tabelle 1 finden Sie eine Liste von gefrorenen Reagenzien).
    2. Lassen Sie die 10x Reaktionspuffer und die 4 Ribonukleotid (ATP, CTP, GTP und UTP) Lösungen Zeit zu mischen, bis sie vollständig in Lösung gelöst.
    3. Kurz zentrifugieren alle Reagenzien, um den Verlust von Material auf den Rand des Rohres zu verhindern. Nach dem Auftauen Shop Ribonukleotiden auf Eis, während das 10x Reaktionspuffer bei Raumtemperatur.
    4. Kombinieren Reagenzien für die Transkriptionsreaktion bei Raumtemperatur (siehe Tabelle 2 für eine Liste von Reagenzien).
      HINWEIS: Die Spermidin im 10x Reaktionspuffer kann die Matrizen-DNA auszufällen, wenn die Reaktion auf Eis statt bei RT montiert.
    5. Gründlich mischen Dazu den Schlauch oder Pipettieren der Mischung nach oben und unten vorsichtig ab. Nach dem Mischen, um kurz zentrifugieren Reaktionsgemisch am Boden des Röhrchens zu sammeln.
    6. Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für insgesamt 2-4 Std.
      HINWEIS: Die erforderlichen Reaktionszeiten variierenmit DNA-Template Größe und Reihenfolge. Dieser Schritt kann die Optimierung für bestimmte Sequenzen erforderlich. Kürzere Schablonen können längere Reaktionszeiten für eine hohe Ausbeute an Gesamt-RNA, erfordern.
    7. Entfernen Sie 4 ul Aliquots von jeder Reaktion nach jeder Stunde und bei -20 ° C. Ändern Sie wie gewünscht Zeitpunkten benötigt.

2. RNA Spin Column

  1. Im Anschluss an die Transkriptionsreaktion, reinigen die RNA mit Mikro-kompatiblen Chromatographiesäulen.
    HINWEIS:. Die Verwendung von RNA-Spin-Säulen, um RNA mit mehr als 20 Basen kommt es mehr als 80% Rückgewinnung zu reinigen 44
    HINWEIS: Die Säulenchromatographie ist eine bekannte und geeignete Verfahren, um RNA zu reinigen. Weitere mögliche Reinigungsverfahren existieren auch, wie Lithiumchlorid Ausfällung, Phenol: Chloroform-Extraktion, Präzipitation mit Isopropanol sowie anderen handelsüblichen Kits.
    1. Gleichmäßig resuspendieren Sephadex Matrix im Säulenpuffer durch heftiges Umdrehen derSpalte drei oder mehrere Male. Tun Sie dies durch Schwenken der Säule scharf.
    2. Entfernen Sie die obere Abdeckung von der Spalte. Es wird eine gewisse Rest Sephadex Matrix in der Kappe ist; wenn die Kappe mit der Matrix gefüllt ist, die Kappe wieder auf die Säule und wiederholen Sie den vorherigen Schritt, bis der Großteil der Matrix in der Säule.
    3. Snap off der unteren Spitze der Kolonne.
      Hinweis: einige Flüssigkeit aus der Säule zu entkommen.
    4. Verpacken Sie die Spalte.
      1. Zeigen Spalte in einer sterilen (von RNase und DNase) 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
      2. Zentrifugieren Sie das Röhrchen in einer Tischzentrifuge bei 1.000 × g für 1 min.
    5. Entsorgen Sie die 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Puffer eluiert aus der Säule.
    6. Sofort legen Sie die Spalte in einem neuen sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und die Probe in die Mitte der Säule Bett. Verwenden Sie 20 bis 50 ul Probe, um eine Überlastung der Spalte.
    7. Zentrifugieren Sie das Röhrchen in einer Tischzentrifuge bei 1.000 · gfür 1 min.
      HINWEIS: Das Laufmittel ist die gereinigte RNA-Probe.

3. Agarose-Gel-Elektrophorese (1% Agarose-Gel) 42

HINWEIS: Ethidiumbromid fluoresziert bei der Bindung an DNA und RNA, daher sind diese Biomoleküle können mit UV-Licht durch Inkubation mit 0,5 ug / ml Ethidiumbromid-Lösung visualisiert werden.

  1. Vorbereiten einer 1,000x Stammlösung von Ethidiumbromid (0,5 mg / ml) hergestellt, indem 5 mg Ethidiumbromid in 10 ml Wasser.
  2. Bereiten Tris Acetat EDTA (TAE) Laufpuffer für die Gelelektrophorese. Um eine 50-fach TAE-Puffer kombiniert 2,0 M Tris-Acetat mit 0,05 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und den pH-Wert auf 8,5.
  3. Eine 1% (Gewicht / Volumen) Agarosegel durch Auflösen von 10 g Ultra Agarose in 1 l 1x TAE-Puffer und Schmelzen der Agarose mit einem herkömmlichen Mikrowellenofen. Sobald es auf 50 ° C abgekühlt, mit 1 ml 1,000x Ethidiumbromid zu der 1% igen Agarosegel solution, mischen durch vorsichtiges Schütteln oder durch Umdrehen in einem geschlossenen Behälter, dann gießen Sie die Agarose-Lösung in ein Gel-Casting-Plattform und lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur fest werden.
    HINWEIS: Ethidiumbromid ist ein Mutagen und potenziellen Karzinogen. Handschuhe und Lösungen vorsichtig handhaben. Für diese entsprechend gehandhabt Ethidiumbromid finden Sie unter: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 .
  4. Nachdem das Gel erstarrt ist, legen Sie die Set-Gel in die Elektrophorese-Tank. Fügen Sie genug TAE-Puffer, um das Gel zu decken, bis die Vertiefungen eingetaucht sind. Prüfen, ob der Pegel des TAE-Puffer ist ungefähr 1 mm über dem Niveau des Gels. Entfernen Sie das Gel Kamm.
    HINWEIS: Entfernen Sie den Kamm nach Brunnen getaucht werden verhindert, dass Luftblasen aus, die in den Vertiefungen eingeklemmt.
  5. Bereiten Sie die RNA-Proben. Kombinieren Sie 1 ul jeder gereinigten Probenaliquot mit 1 ul Gelladepuffer (oder mit 1 ul 10x Ladepuffer und verded auf 10 ul mit Nuklease-freies Wasser) und gründlich mischen durch Auf-und Abpipettieren mit einer Mikropipette.
    HINWEIS: 10x Ladepuffer enthält 20% Ficoll 400, 0,1 M Na 2 EDTA, pH 8,0, 1,0% SDS, 0,25% Bromphenolblau. 0,25% Xylencyanol kann auch der Ladepuffer 42 hinzugefügt werden, wie es läuft ~ 50% so schnell wie Bromphenolblau und kann für die Überwachung sehr lange Läufe nützlich sein.
  6. Laden des Gels mit jeder Probe durch vorsichtiges Pipettieren der Lösung in den Boden jeder Vertiefung. Achten Sie darauf, alle Luftblasen zu verlassen oder mischen Proben zwischen den Wells.
    Hinweis: eine RNA-Leiter können ebenfalls verwendet werden, um die Größe des Transkripts zu bestimmen.
  7. Bringen Sie die Kabel so, dass die DNA wird in das Gel zur positiven Leitung migrieren. Die Spannung auf den gewünschten Wert, typischerweise 1 bis 10 V / cm Gel. Die Elektrophorese für wie lange reicht für signifikante Trennung zwischen den RNA-Fragmente, mit der Migration von Farbstoffen, um das Fortschreiten der Trennung zu überwachen.
    NHINWEIS: Ein 23 cm x 25 cm Gel bei 250 V dauert ca. 1 Stunde, während ein 8 cm x 8 cm Gel bei 150 V wird ca. 20 Minuten dauern. Kleinere RNA-Fragmente haben eine bessere Auflösung als bei höheren Spannungen führen.
  8. Schalten Sie die Stromversorgung, wenn der Farbstoff aus der Ladepuffer eine Strecke als ausreichend für die Trennung zwischen den RNA-Fragmente migriert.
  9. Bild der RNA unter UV-Licht als Ethidiumbromid fluoreszieren.
  10. Machen Sie ein Foto des Bildes und vergleichen Fluoreszenzintensitäten der gereinigte RNA von jeder Bedingung.

4. RNA-Quantifizierung mittels UV-Vis-Spektroskopie

  1. Platz 2 ul H 2 O auf einem Nanodrop 2000 oder ähnliche Maschine, und messen Sie den Blank.
  2. Als nächstes legen 2 ul von jeder RNA-Probe, nach der Reinigung, im Spektralphotometer gemessen werden UV-Vis aus einem Wellenlängenbereich von 200 nm bis 800 nm.
    HINWEIS: Ein A ​​260 Lesung von 1,0 entspricht etwa 40 ug / ml RNA,und reine RNA hat eine A 260 / A 280-Verhältnis von 2,1. 45
  3. In dem Fall, daß die Absorption über 1 OD, verdünnt den Proben in Nuklease-freies Wasser bis zu einer OD von weniger als 1 zu erhalten.
  4. Verwenden Sie grafische Software, um die verschiedenen Proben des Grundstückes und vergleichen OD bei 260 nm.

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Representative Results

RNA Transcription qualitativ durch Agarosegelelektrophorese Beurteilt

Agarosegelelektrophorese wird zur Abbildung der transkribierten RNA. Ethidiumbromid fluoresziert bei der Bindung (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46 ermöglicht Abbildung von RNA. Dunkler Banden im Gel entsprechen höheren Konzentrationen von RNA. Wenn Actinomycin D inhibiert Triptolid oder entweder Corrol komplexen RNA-Transkription ist die Produktion von RNA reduziert und das Band wird heller erscheinen. Durch dieses Konzept ist relativ Hemmung beurteilen.

Abbildung 3 zeigt die Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegel (1%) von RNA Transkriptionsreaktionen ohne komplexe, Actinomycin D, Triptolid tpfc oder Ga (tpfc) vorbehandelt bei einer [Komplex]: [template DNA base] Verhältnis von 0,01 : 1 liegt. Actinomycin D und Triptolid zeigen eine deutliche Abnahme der RNA im Vergleich zu der Kontrolle, von den erwartetenDiese langfrissuchten Inhibitoren. Die Ga (tpfc) Band hat auch eine sehr niedrige Niveau der RNA, während die tpfc Band zeigt wenig bis gar keine Hemmung und zeigt die gleiche relative Intensität als Kontrolle.

RNA-Transkription durch UV-Vis-Spektroskopie Quantifizierte

UV-Vis-Messungen wurden für jede Probe die nach einer RNA-Transkription für 4 Stunden entnommen und mit RNA-Spinsäule gereinigt. Die Spektren der Wellenlängen 220 nm und 350 nm sind in Figur 4 gezeigt, mit dem λ max bei 260 nm auftritt, was RNA Absorption und einem Extinktionskoeffizienten von 0,025 (& mgr; g / ml) -1 cm -1. Die Absorption bei 260 nm und 280 nm sind in Tabelle 3 angegeben. Ein A ​​260 Lesung von 1,0 entspricht etwa 40 ug / ml RNA und reine RNA hat ein A 260 / A 280 Verhältnis von 2,1, was eine quantitative Berechnung der RNA während der trans hergestelltchreibu Reaktion und eine Bewertung der Reinheit der RNA nach der Verwendung des RNA-Spin-Säule. 44 Drei der vier Inhibitor-behandelte Transkriptionsreaktionen ergab weniger RNA als die Kontrolle, mit Ga (tpfc) behandelten DNA Transkription nur 0,07 mal so viel RNA wie die unbehandelte DNA. tpfc-behandelte DNA ergab keine offensichtliche Hemmung. Alle Proben haben eine A 260 / A 280-Verhältnis von etwa 2,2, was auf relativ reine Proben. Reinigung durch RNA-Spin-Säulen entfernt kurze RNA-Stränge 20 oder weniger Nukleotide lang. Residual DNA oder Stränge länger als 20 Nukleotide können in dem, was als die gereinigten Proben vorhanden sein. Diese leichte Verunreinigungen würden in einer / A 280 Verhältnis A 260 etwas größer als 2.1 führen.

Figur 1
Abbildung 1. Molekülstruktur von Gallium (III) 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tPFC)) und der Freebase analogen 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Die Zytotoxizität Kurven und GI 50 Werte Corrolen in Prostata (DU-145) (grau), Brust (MDA-MB-231) (blau), Haut (SK-MEL-28) (orange) und Eierstock (OVCAR -3) (grün) Krebszelllinien. Die Zellen wurden mit (A) Ga (tpfc) und (B) tpfc, gefolgt von der Bestimmung der Lebensfähigkeit unter Verwendung des inkubiert MTS-basierten colorimetrischen Zelllebensfähigkeitstest nach dem Protokoll des Herstellers. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version davon zu sehenFigur.

Figur 3
Abbildung 3. Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel (1%) von Transkriptionsreaktionen nach 4 h Inkubation. Spur 1 ist ein 1000 bp-DNA-Leiter als Standard. Bahnen 2-6 zeigen die RNA von 0,43 pmol DNA transkribiert und mit 4,3 fmol jedes Inhibitors behandelt (a [komplexen]: [template DNA-Basen] Verhältnis von 0,01): die Steuerung (Bahn 2), Actinomycin D (Bahn 3), Triptolid (Spur 4), tpfc (Spur 5) und Ga (tpfc) (Spur 6).

4
Abbildung 4. UV-Vis-Spektrum von 1:. 200 Verdünnung transkribierten RNA an nach 4 h Inkubation wurde die DNA-Matrize für die Transkription Reaktion wurde ohne Komplex behandelt oder mit Actinomycin D, Triptolid tpfc oder Ga (tpfc) an a [komplexen]: [template DNA-Basen] Verhältnis von 0,01: 1. Die RNA-Konzentration wird durch OD bei 260 nm gemessen.

Tauen Sie gefrorene Reagenzien auf Eis:
75 mM Lösungen von Adenosintriphosphat, Guanosintriphosphat, Cytidintriphosphat und Uridin-Triphosphat (ATP, CTP, GTP, UTP)
Nuklease-freiem Wasser
10x Reaktionspuffer (1x Reaktionspuffer: 40 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl 2, 2 mM Spermidin, 10 mM Dithiothreitol, pH 7,9)
Linearisierte Matrizen-DNA (0,5 ug / ml, 1,85 kb)
RNA-Polymerase-Enzym (20 U / ul)

Tabelle 1. Liste der gefrorene Reagenzien.

Um die Transkriptionsreaktionen beginnen, fügen Sie den folgenden Volumina der verschiedenen Reagenzien in 0,2 ml dünnwandigen PCR-Röhrchen:
2 & mgr;ATP-Lösung (75 mM)
2 ul CTP-Lösung (75 mM)
2 & mgr; l GTP (75 mM)
2 & mgr; l UTP (75 mM)
1 ul Nuklease-freies Wasser
2 ul 10x Reaktionspuffer
2 ul 0,5 ug / ul lineare Matrizen-DNA
5 ul-Komplex (Kern-freies Wasser als der Rohling, Actinomycin D, Triptolid, tpfc, Ga (tpfc))
2 & mgr; l RNA-Polymerase (20 U / ul)

Tabelle 2. Liste der Reagenzien für die Transkriptionsreaktion.

Zeitpunkt (hr) Komplex A 260 A 280 </ Strong> A 260 / A 280 Verdünnungsfaktor [RNA]: A 260
(Ug / ml)
[RNA] (mg / ml)
4 Steuerung 7,583 3,516 2.16 200 40 60,67
4 Actinomycin D 0,955 0,438 2.18 200 40 7,638
4 Triptolid 1,794 0,816 2.2 200 40 14,35
4 tpfc 7,858 3,631 2.16 200 40 62,87
4 Ga (tpfc) 0,554 0,232 2.39 200 40 4,434

Tabelle 3 Konzentration und Reinheit der transkribierten RNA nach 4 Stunden durch UV-Vis-Spektroskopie gemessen. Der Extinktionskoeffizient einzelsträngige RNA ist 0.025 (ug / ml) -1 cm -1, ist ein A 260 Lesung von 1,0 Äquivalenten bis etwa 40 ug / ml RNA und RNA hat eine reine A 260 / A 280-Verhältnis von 2,1. 45

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Discussion

Dieser Test zeigt, dass die Zugabe von Ga (tpfc) inhibiert RNA Transkriptions vergleichsweise zu bekannten DNA-bindenden Antikrebs Komplexe Actinomycin D und Triptolid. Die zytotoxische Verhalten von Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1 bis 154,7 uM) kann seine hemmenden Eigenschaften zurückzuführen. Da kein Transkriptionshemmung in tpfc beobachtet wird, ist die Zytotoxizität tpfc aufgrund RNA Transkriptionshemmung aber durch andere Mittel noch nicht untersucht verursacht.

In den vier Transkriptionsreaktionen durchgeführt wird, wurde die DNA mit Actinomycin D, Triptolid tpfc oder Ga (tpfc) behandelt, um ein [Komplex]: [template DNA base] Verhältnis von 0,01 oder jeweils eine unbehandelte Kontrolle. Die Transkriptionsreaktion Reagenzien wurden vereinigt und das Transkriptions-Reaktion wurde für 4 h bei 37 ° C ablaufen. Die transkribierte RNA wurde durch eine RNA-Spin-Säule, und die Ausbeute von UV-Vis und Gelelektrophorese gereinigt. Die Art der Transkriptionshemmung kann Furt werdensie untersuchten mit diesen gleiche Technik mit verschiedenen Modifikationen, oder die Verbindungen können auf alternative in vitro und in vivo-Untersuchungen unterzogen werden. Weitere Experimente, die helfen, die molekulare Natur der Hemmung können, sind Röntgenkristallographie möglicher Corrol-DNA-Addukte oder rechnerische Modellierung des Transkriptionsreaktion. Das Ziel dieses Experiments war es zu bestimmen, ob die Verbindungen hemmen die Transkription, um Informationen über ihre potentielle Antikrebseigenschaften zu sammeln. Dieses Ziel wurde erreicht: tpfc zeigten keine Hemmung, während Ga (tpfc) zeigten deutliche Hemmung und verdient eine weitere Untersuchung.

Das RNA-Transkriptionsassay kann modifiziert werden, um mehr mechanistischen Details liefern. Die Zugabe der Antikrebsmittel (zB die Corrol Komplexe) nach dem Transkriptionsreaktion vollständig ist kann zeigen, ob die Komplexe zersetzen oder hydrolysiert die RNA. Eine weitere empfohlene Experiments ist es, zu führendie Transkriptionsreaktion mit allen Bestandteilen mit Ausnahme von der RNA-Polymerase-Enzym 10-fach niedriger für die Differenzierung zwischen einer Hemmung Mechanismus, der die DNA oder das Enzym zu ermöglichen. Schließlich Inkubation der DNA oder die Polymerase mit den Komplexen vor RNA-Transkription würde zur Erhöhung der Bindung zwischen dem Komplex und dem entsprechenden Ziel ermöglichen, festzustellen, ob der Komplex hemmenden Qualitäten werden in DNA und Polymerase-Bindung, jeweils beteiligt.

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Acknowledgments

Wir danken Dr. Cindy N. Chiu für die Hilfe bei der Gelelektrophorese und Andy Zhou und Michael Grodick für die großzügige Spende von DNA und Restriktionsenzym. Wir danken Professor J. Heath und Professor D. Prober für großzügigen Zugang zu Ausrüstung und Materialien. Wir danken Dr. Karn Sorasaenee für Anregungen. Wir danken Mary H. Tang für die Erstellung der Darstellung in der schematische Übersicht in dem Video verwendet. Die Finanzierung wurde von Johnson & Johnson und USC Y86786 vorgesehen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actinomycin D Sigma-Aldrich A1410 Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide Sigma-Aldrich T3652 Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2 Life Technologies AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit Life Technologies AM1334 Store at –20 °C 
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate Sigma-Aldrich T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-100
mini Quick Spin RNA Columns Roche Life Science 11814427001 Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S Store at –20 °C 

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References

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