En

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole og dens frie basen analogt oppviser lavt mikromolområde celle cytotoksisitet. Dette manuskriptet beskriver en RNA transkripsjon reaksjon, avbildning RNA med en etidiumbromid-farget gel, og kvantifisering av RNA med UV-vis spektroskopi, for å bedømme inhibering av transkripsjon corroles og demonstrerer en grei metode for å vurdere anticancer kandidat egenskaper.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tang, G. Y., Pribisko, M. A., Henning, R. K., Lim, P., Termini, J., Gray, H. B., Grubbs, R. H. An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles. J. Vis. Exp. (97), e52355, doi:10.3791/52355 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kjemoterapi innebærer ofte bredspektret cytotoksiske midler med mange bivirkninger og begrenset målretting. Corroles er en klasse av tetrapyrrolic makrocykler som viser differensial cytostatiske og cytotoksiske egenskaper i spesifikke cellelinjer, avhengig av identiteten til det chelaterte metall og funksjonelle grupper. Den unike oppførsel av funksjon corroles mot bestemte cellelinjer introduserer muligheten for målrettet kjemoterapi.

Mange anticancer legemidler evalueres ved deres evne til å hemme RNA-transkripsjon. Her presenterer vi en trinn-for-trinn-protokoll for RNA-transkripsjon i nærvær av kjente og potensielle inhibitorer. Evalueringen av RNA-produkter av transkripsjonsreaksjon ved gelelektroforese og UV-vis spektroskopi gir informasjon om inhibitoriske egenskaper av potensielle anticancerlegemiddelkandidater, og med modifikasjoner av analysen, flere om deres virkningsmekanisme.

Litter kjent om den molekylære virkningsmekanismen til corrole cytotoksisitet. I dette forsøket, vi vurdere to corrole forbindelser: gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) og freebase analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Et RNA-transkripsjon assay ble brukt for å undersøke de inhibitoriske egenskaper av corroles. Fem transkripsjonsreaksjoner ble fremstilt: DNA behandlet med Actinomycin D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc ved en [kompleks]: [templat DNA basen] forhold på 0,01, henholdsvis, og en ubehandlet kontrollgruppe.

De transkripsjonsreaksjoner ble analysert etter 4 timer ved hjelp av agarosegel-elektroforese, og UV-vis spektroskopi. Det er klart hemming av Ga (tpfc), Actinomycin D, og ​​triptolide.

Denne RNA-transkripsjon assay kan bli modifisert for å tilveiebringe mer mekanistiske detaljer ved å variere konsentrasjonen av anticancer kompleks, DNA, eller polymerase-enzym, eller ved inkubering av DNA-polymerase eller med komplekserxes før RNA transkripsjon; Disse modifikasjoner vil skille mellom et inhibering mekanisme som involverer DNA, eller enzymet. Tilsetning av komplekset etter RNA-transkripsjon kan brukes til å teste om komplekser brytes ned eller hydrolysere RNA. Denne analysen kan også bli brukt til å studere ytterligere anticancer-kandidater.

Introduction

Kjemoterapi innebærer ofte bredspektret cytotoksiske midler med uønskede bivirkninger og begrenset målretting, men med større forståelse av kreft biologi, det er en stadig økende etterspørsel etter antikreftstoffer med høyere kreft målretting effekt og færre bivirkninger. En menneskekreftceller ofte blitt avhengig av en enkelt aktivert eller overuttrykt onkogen for å overleve. 2. Således er mange anti-cancer medikamenter bedømt ved deres evne til å hemme RNA-transkripsjon. Behandlinger som blokkerer ekspresjonen av disse transformerende gener som er effektive i å eliminere kreft celler, og fører til celledød. 3 Transformerte celler mer følsomme for forstyrrelser i RNA-transkripsjon enn det tilsvarende normale celler. 4 anticancer legemidler som hemmer transkripsjon forventes å selektivt inhiberer ekspresjon av onkogener som er nødvendig for kreftcellen for å overleve. 5 Følgelig RNA transkripsjon inhibition er en nyttig måte å identifisere potensielle antikreftlegemiddelkandidater og lære mer om deres virkningsmekanisme. Denne protokollen viser at Ga (tpfc) hemmer RNA transkripsjon på samme rekkefølge som kjemoterapi narkotika Actinomycin D og triptolide; tilsvarende sammenligninger kan gjøres ved hjelp av denne protokollen med andre anticancer narkotika kandidater. Actinomycin D er et RNA transkripsjon hemmer vanlig å behandle svangerskaps trophoblastic kreft, testikkelkreft, Wilm tumor, rhabdomyosacoma, og Ewings sarkom 6. Actinomycin D har vært brukt i kreftbehandling i nesten femti år siden den først ble godkjent av FDA i 1964.Triptolide er en selektiv transkripsjon inhibitor som er undersøkt in vitro og i ulike tumorbærende dyremodeller for 30 år. 7

Den amfifil makrocykliske natur corroles formidler betydelige fordeler fremfor andre legemiddelklasser som små molekyler eller biologisks. 8-14 The makrocykliske karakter tillater cellulær permeabilitet som er større enn forventet for slike store molekyler, og de ​​er store nok til å interagere med makromolekylære overflater, slik som de av proteiner. 8 Corroles er kjent for å danne tette ikke-kovalente komplekser med biomolekyler og medikamenter. 10 I tillegg til den iboende cytotoksisitet av corrole rammeverk, har vi vist at en sulfonert corrole virker som et bærermolekyl for kjemoterapeutiske midler, spesielt DNA-interkalerende antracyklin medikament doksorubicin. Når sulfonatert corrole ble gitt sammen med doxorubicin, ble en tre-fold forbedring i IC 50 av doxorubicin observert for DU-145 celler. 9 corrole rammeverket er stabil og har iboende absorbans og fluorescens egenskaper som, når funksjon, gjennomgår unike absorbans skift som kan brukes for karakterisering. 10 Funksjonalisering av stillaset ikke iboende affect de photophysical egenskapene til corrole, 9-15, men, sett med en sulfonatert corrole, selektivt å modifisere rammen av corrole kan vesentlig endre sine biologiske egenskaper. 16 Vi har tidligere evaluert seks metallocorroles mot syv menneskelige kreftcellelinjer. Resultatene indikerer at toksisiteten mot humane kreftceller er avhengig av det spesifikke metallioner, så vel som funksjonelle gruppe substitusjon. For eksempel, sulfonaterte gallium corroles opplevd høy cellulært opptak og trengt selektivt inn i kjernen av hjernemetastatisk prostata kreft celler (DU-145); samme corrole, selv om den ikke trenger inn i kjernen av andre cellelinjer, oppviser større cytotoksisitet for bryst (MDA-MB-231), melanom (SK-MEL-28) og ovarie (OVCAR-3) kreftceller enn for prostatakreft. 9

Innledende cellebaserte analyser tyder på at disse forbindelser viser lovende som anti-kreft terapeutiske midler, som fordeler Further etterforskning i virkningsmekanismen. Transkripsjon inhibering observeres med visse metallorganiske komplekser 17-27, og vi har søkt å undersøke denne prosessen som en mulig mekanisme for den cytotoksiske virkemåten til corrole familien. Dette transkripsjon analysen gir en grei, billig og lettvint metode for å vurdere transkripsjon hemming, som vil føre til mer detaljert informasjon om effektene av disse molekylene i levende celler.

Her transkripsjons inhibering av gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) og dens frie basen analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (figur 1) blir testet. I motsetning til enkelte overgangsmetallkomplekser, (III) er gallium Redox inaktive og er derfor ikke direkte involvert i redoksprosessen redoks-baserte stoffskifte. 28 Uansett, gallium (III) ikke utviser cytotoksiske egenskaper og har blitt undersøkt for terapeutiske formål. Gallium er den nest mest lovende metall for kreftbehandling etter platina og har gjennomgått mange studier og undersøkelser; nitrat og klorid gallium salter har blitt evaluert i kliniske studier mot hepatom, lymfom, blære kreft og andre sykdommer. 29-34 Gallium (III) er derfor ideell for kreft corrole studier. Innledende data viser Ga (tpfc) og tpfc har lav GI 50, medikamentkonsentrasjon er nødvendig for å hemme 50% av maksimal celleproliferasjon, med forskjellige cancercellelinjer (se figur 2); Dette bekrefter gyldigheten av videre forsøk på disse to forbindelser å bestemme sine inhibitoriske egenskaper. Vi sammenligner disse forbindelsene med de vanligste kreft narkotika Actinomycin D og triptolide. Actinomycin D intercalates DNA, RNA hindrer forlengelse, og induserer apoptose i visse cellelinje ved picomolar konsentrasjoner 6,35-37 Triptolide har vist seg å hemme tumorvekst.; det binder seg til menneskelig XPB / ERCC3, en underenhet of transkripsjonsfaktor TFIIH, som fører til hemming av RNA polymerase II aktivitet. 6-7,38-40

Mens det er allment kjent at corroles utviser cytotoksiske egenskaper, det finnes lite informasjon om de ulike mekanismene som oppstår fra funksjon. Corrole hemming av RNA transkripsjon ville gi større innsikt i sine interaksjoner med biomacromolecules. Andre komplekser som er kjent for å binde til DNA, slik som dirhodium (II, II) komplekser, krom (III) -komplekser, ruthenium (II) polypyridyl komplekser, rhodium (III) komplekser, og forskjellige andre, ble underkastet RNA-transkripsjon assays, 18- 27 resulterer i større forståelse for deres samhandling med biomacromolecules. Denne lettvinte og allment tilgjengelig eksperimentet er også en god innledende test for å vurdere cytotoksisitets egenskapene til et gitt molekyl og avgjøre om det fortjener ytterligere biologisk testing. RNA-transkripsjon analysen gir også mulighet for mange modifikasjoner, som variasjong mengden av forbindelsen eller enzymer som brukes; variering av inkubasjonstiden, reaksjonstid og prøve tidspunkter; og variering av DNA-templatet lengde og sekvens, blant andre variable av interesse, og dermed potensielt å tilveiebringe en stor mengde data. Dette transkripsjon analysen er også lett tilgjengelig som rimelige sett med alle nødvendige reaksjonskomponentene, selv om komponentene kan kjøpes og forberedt individuelt. I disse eksperimentene, bruker vi en kommersielt tilgjengelig kit kjent for å ha høyt utbytte. 41

For å vurdere transkripsjon hemming, bruker vi to metoder: agarosegelelektroforese og UV-VIS spektroskopi. Agarose gel elektroforese er en enkel og effektiv metode for å separere, identifisering og rensing av 0,5- til 25-kb DNA- og RNA-fragmenter. 42 UV-Vis-spektroskopi kan anvendes for å bestemme konsentrasjonen og renheten av RNA. 43

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Når du arbeider med RNA opprettholde et rent arbeidsmiljø for å unngå forurensning av DNase og RNase enzymer som bryter ned DNA og RNA. Sikre at pipettespissene og rør er DNase og RNase gratis. Det er også nyttig å tørke ned lab overflater og utstyr som pipetter, rørholder, etc. med en dekontaminering løsning.

1. RNA transkripsjon med Corrole Treatment

  1. Klargjør corrole og inhibitor-forbindelser i et 0,01: 1 molart forhold av [kompleks]: [DNA].
    MERK: I vårt tilfelle, var forholdet 4.3 fmol komplekset: 0,43 pmol DNA, hvor DNA mal som ble brukt var APET-28c vektor med Liga genet fra E. coli under kontroll av T7-promoteren. Andre DNA med T7-promoteren er også gyldige kandidater for å drive transkripsjon analysen.
    1. Oppløse Actinomycin D, triptolide, tpfc, og Ga (tpfc) i dimetylsulfoksid (DMSO) i rene, egne containere. Oppnå sluttkonsentrasjon på 0,01: 1 molart forhold av [complex]: [DNA] ved hjelp seriefortynninger med nukleasefritt vann.
      1. Løs opp 1 mg Actinomycin D i 1,8 ml DMSO. Alikvoter 10 ul til en separat beholder og fortynnet til 1 ml med nuklease-fritt vann for å lage en 1/100 fortynning. Alikvoter 1 ul av fortynningen til en separat beholder og fortynnet til 1 ml med nuklease-fritt vann for å lage en 1 / 1.000 fortynning.
        MERK: Konsentrasjonen av den endelige oppløsning av Actinomycin D er 4,3 fmol.
      2. Løs opp 1 mg triptolide i 0,64 ml DMSO. Alikvoter 1 pl til en separat beholder og fortynnet til 1 ml med nuklease-fritt vann for å lage en 1 / 1.000 fortynning. Alikvoter 1 ul av fortynningen til en separat beholder og fortynnet til 1 ml med nuklease-fritt vann for å skape en andre 1/1000-fortynning.
        MERK: Konsentrasjonen av den endelige løsning av triptolide er 4.3 fmol.
      3. Løs opp 1 mg tpfc i 2,9 ml DMSO. Alikvoter 10 ul til en separat beholder og fortynn til 1 ml med nuklease-fritt vann for å lage en 1/100 dilution. Alikvoter 1 ul av fortynningen til en separat beholder og fortynnet til 1 ml med nuklease-fritt vann for å lage en 1 / 1.000 fortynning.
        MERK: Konsentrasjonen av den endelige løsning av tpfc er 4.3 fmol.
      4. Løs opp 1 mg Ga (tpfc) i 2,6 ml DMSO. Alikvoter 10 ul til en separat beholder og fortynnet til 1 ml med nuklease-fritt vann for å lage en 1/100 fortynning. Alikvoter 1 ul av fortynningen til en separat beholder og fortynnet til 1 ml med nuklease-fritt vann for å lage en 1 / 1.000 fortynning.
        MERK: Konsentrasjonen av den endelige løsning av Ga (tpfc) er 4.3 fmol.
        MERK: Disse corroles og hemmere er ikke løselig i vann og må forhånds løst i DMSO. Små mengder av DMSO (under 1%) ikke indusere cytotoksisitet i cellene (upubliserte data).
  2. Før start av transkripsjon reaksjon, forberede de nødvendige reagenser individuelt eller kjøpe dem fra en kommersiell leverandør.
    1. Tine på is all frøsn reagenser (se tabell 1 for en liste over frosne reagenser).
    2. La 10x reaksjonsbuffer og 4 ribonukleotid (ATP, CTP, GTP og UTP) løsninger tid til å blande seg før de er fullstendig oppløst i løsningen.
    3. I korthet sentrifuger alle reagenser for å hindre tap av materiale på kanten av røret. Tint, butikk ribonukleotider på is mens du holder 10x reaksjonsbuffer ved RT.
    4. Kombiner reagenser for transkripsjon reaksjon ved RT (se tabell 2 for en liste av reagenser).
      MERK: spermidin i 10x reaksjonsbuffer kan kopresipitat av templat-DNA hvis reaksjonen er montert på is i stedet for ved romtemperatur.
    5. Bland grundig ved å slå røret eller pipettering blandingen opp og ned forsiktig. Etter blanding til sentrifugen raskt samle reaksjonsblanding i bunnen av røret.
    6. Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 ° C for totalt 2 til 4 timer.
      MERK: De nødvendige reaksjonstidene vil varieremed DNA-templat størrelse og sekvens. Dette trinn kan kreve optimalisering for bestemte sekvenser. Kortere maler kan kreve lengre reaksjonstider for et høyt utbytte av total RNA.
    7. Fjern 4 ul porsjoner fra hver reaksjon etter hver time og oppbevares ved -20 ° C. Modifisere etter behov for ønskede tidspunkter.

2. RNA Spin kolonne

  1. Etter transkripsjon reaksjon, rense RNA ved hjelp mikrosentrifugerør-kompatibel kromatografikolonner.
    MERK:. Bruk av RNA spin kolonner for å rense RNA med større enn 20 baser resulterer i mer enn 80% gjenvinning 44
    MERK: Kolonne-kromatografi er en vanlig og praktisk metode for å rense RNA. Andre rensemetoder også foreligge for eksempel litiumklorid utfelling, fenol: kloroform-ekstraksjon, utfelling isopropanol, så vel som andre kommersielt tilgjengelige sett.
    1. Jevnt resuspender Sephadex matrisen buffer kolonnen ved kraftig å invertereKolonnen tre eller flere ganger. Gjør dette ved å flikke kolonnen kraftig.
    2. Fjerne topphetten fra kolonnen. Det vil være noen rest Sephadex matrise i hatten; Hvis lokket er fylt med matrisen, sett korken på kolonnen og gjenta det foregående trinnet til flertallet av matriksen er i kolonnen.
    3. Knekk av den nederste tuppen av kolonnen.
      MERK: Noe væske kan flykte fra kolonnen.
    4. Pakk kolonnen.
      1. Plasser kolonne i et sterilt (RNase og DNase gratis) 1,5 ml mikro tube.
      2. Sentrifuger røret i en bordsentrifuge ved 1000 x g i 1 min.
    5. Kast 1,5 ml mikrosentrifugerør med eluerte buffer fra kolonnen.
    6. Umiddelbart sette kolonnen i et nytt sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør og pipettere prøven til midten av sengen kolonnen. Bruk 20-50 mL av prøven for å unngå overbelastning av kolonnen.
    7. Sentrifuger røret i en tabletop sentrifuger ved 1000 xgi 1 min.
      MERK: Elueringsmiddelet er renset RNA prøven.

3. agarosegel-elektroforese (1% agarosegel) 42

MERK: Etidiumbromid fluorescerer ved binding til DNA og RNA, og derfor disse biomolekyler kan bli visualisert med UV-lys ved å inkubere dem med 0,5 ug / ml etidiumbromid løsning.

  1. Tilbered en 1,000x stamløsning av etidiumbromid (0,5 mg / ml) ved å løse opp 5 mg etidiumbromid i 10 ml vann.
  2. Forberede Tris Acetate EDTA (TAE) kjører buffer for gel elektroforese. For å gjøre en 50x TAE buffer kombinere 2,0 M Tris-acetat med 0,05 M Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), og justere pH til 8,5.
  3. Tilbered en 1% (vekt / volum) agarosegel ved å oppløse 10 g Ultrapure Agarose i 1 l 1 x TAE-buffer og smeltende agarose med en konvensjonell mikrobølgeovn. Når den er avkjølt til 50 ° C, tilsett 1 ml 1,000x etidiumbromid til 1% agarosegel Løsnsjon, blandes ved forsiktig virvling eller ved invertering i en lukket beholder, og hell agarose løsningen til en gel-støping av plattformen og lar gelen stivne ved romtemperatur.
    MERK: Etidiumbromid er et mutagen og potensielle kreftfremkallende. Bruk hansker og håndtere løsninger nøye. For riktig håndtering prosedyrer etiumbromid se: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 .
  4. Etter at gelen har stivnet, plasser apparatet gel i elektroforese tank. Tilsett nok TAE-buffer for å dekke gelen før brønnene er neddykket. Kontroller at nivået av TAE-buffer er omtrent 1 mm over nivået av gelen. Ta av gel kam.
    MERK: Ta av kammen etter brønnene er nedsenket hindrer luftlommer fra å bli fanget i brønnene.
  5. Forbered RNA prøver. Kombiner en mL av hver renset prøvealiquot med en ul Gel Loading Buffer (eller med en mikroliter 10x lasting buffer og diluted til 10 pl med nukleasefritt vann) og bland godt ved å pipettere opp og ned med en mikropipette.
    MERK: 10x ladningsbuffer inneholder 20% Ficoll 400, 0,1 M Na2EDTA, pH 8,0, 1,0% SDS, 0,25% bromfenolblått. 0,25% xylencyanol, kan også tilsettes til lastebuffer, som det går ~ 50% så fort som bromfenolblått og kan være nyttig for å overvåke meget lange serier. 42
  6. Installering av gel med hver prøve ved forsiktig pipettering av oppløsningen inn i bunnen av hver brønn. Pass på å ikke la noen luftbobler eller blande prøvene mellom brønnene.
    MERK: En RNA stigen kan også brukes til å bestemme størrelsen på karakterutskriften.
  7. Fest ledningene slik at DNA vil migrere inn i gelen mot den positive. Sett spenningen til det ønskede nivå, vanligvis 1 til 10 V / cm gel. Kjør gel for uansett hvor lenge er tilstrekkelig for betydelig skille mellom RNA fragmenter, ved hjelp av migrasjon av fargestoffer for å overvåke fremdriften av separasjon.
    NERK: En 23 cm x 25 cm gel på 250 V vil ta omtrent en time, mens en 8 cm x 8 cm gel på 150 V vil ta ca 20 min. Mindre RNA fragmenter har bedre oppløsning når det kjøres på høyere spenninger.
  8. Slå av strømtilførselen når fargestoff fra appliseringsbuffer har migrert en avstand dømt tilstrekkelig for separasjon mellom RNA fragmenter.
  9. Bilde RNA under UV-lys som etidiumbromid vil fluorescere.
  10. Ta et bilde av bildet og sammenligne fluorescensstyrkene av renset RNA fra hver tilstand.

4. RNA Kvantifisering via UV-VIS spektroskopi

  1. Plassere 2 ul H 2 O på en Nanodrop 2000, eller tilsvarende maskin, og måle Blank.
  2. Deretter plasserer 2 ul av hver RNA-prøve, etter rensing på spektrofotometer og måle UV-Vis fra et bølgelengdeområde fra 200 nm til 800 nm.
    MERK: En A 260 lesing på 1,0 tilsvarer ca 40 mikrogram / ​​ml av RNA,og ren RNA har en A 260 / A 280-forhold på 2,1. 45
  3. I det tilfelle at absorbansen er over en OD, fortynne prøvene i nuclease-fritt vann for å oppnå en OD mindre enn 1.
  4. Bruk grafer programvare å plotte de ulike prøvene og sammenligne OD ved 260 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RNA transkripsjon Kvalitativt Vurdert ved agarosegelelektroforese

Agarosegelelektroforese blir brukt til å avbilde transkribert RNA. Etidiumbromid fluoresces ved binding (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46 tillater avbildning av RNA. Mørkere båndene i gelen svarer til høyere konsentrasjoner av RNA. Hvis Actinomycin D, triptolide, eller enten corrole komplekset inhiberer RNA transkripsjon, blir produksjonen av RNA redusert og bandet vil lysere. Ved hjelp av dette konseptet, kan relative hemming vurderes.

Figur 3 viser etidiumbromid farget agarosegel (1%) av RNA-transkripsjonsreaksjoner forbehandlet med noe kompleks, Actinomycin D, triptolide, tpfc eller Ga (tpfc) ved en [kompleks]: [templat DNA basen] forhold på 0,01 : 1. Actinomycin D og triptolide viser en tydelig reduksjon av RNA sammenlignet med den for kontrollprøven, som forventet avdisse lang studert hemmere. Ga (tpfc) bånd har også et meget lavt nivå av RNA, mens tpfc bandet viser liten eller ingen inhibering, og utviser den samme relative intensitet som kontroll.

RNA transkripsjon kvantifisert ved UV-VIS spektroskopi

UV-Vis-målinger ble utført for hver prøve etter under RNA-transkripsjon i 4 timer og renset RNA spin-kolonne-kromatografi med. Spektrene av bølgelengder 220 nm til 350 nm er vist i figur 4, med λ max oppstår ved 260 nm, tilsvarende RNA-absorpsjon, og en ekstinksjonskoeffisient på 0,025 (pg / ml) -1 cm -1. Absorbansen ved 260 nm og 280 nm er gjengitt i tabell 3. En A 260 avlesning på 1,0 tilsvarer omtrent 40 ug / ml av RNA og RNA ren har en A-260 / A 280-forhold på 2,1, noe som åpner for kvantitative beregninger av RNA produsert i løpet av transbeskrivelsene reaksjon og en vurdering av renheten av RNA etter bruk av RNA-spinnkolonne. 44 Tre av de fire inhibitor-behandlede transkripsjonsreaksjoner ga mindre RNA enn kontrollen, med Ga (tpfc) -behandlet DNA transkribere bare 0,07 ganger så mye RNA som den ubehandlede DNA. tpfc-behandlet DNA viste ingen åpenbar hemming. Alle prøver har en A 260 / A 280 forhold på omtrent 2,2, som indikerer relativt rene prøver. Rensing av RNA spin kolonner fjerner kort RNA tråder 20 eller færre nukleotider lang. Gjenværende DNA eller tråder som er lengre enn 20 nukleotider kan være tilstede i det som regnes de rensede prøvene. Disse små urenheter ville resultere i en A-260 / A-forhold 280 er litt større enn 2.1.

Figur 1
Figur 1. Molekylære strukturer av Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tPFC)) og freebase analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Cytotoksisitetsdata kurver og GI 50 verdier av corroles i prostata (DU-145) (grå), bryst (MDA-MB-231) (blå), hud (SK-MEL-28) (oransje), og eggstokkreft (OVCAR -3) (grønn) kreftcellelinjer. Celler ble inkubert med (A) Ga (tpfc) og (B) tpfc, etterfulgt av bestemmelse av levedyktighet ved bruk av MTS-basert kolorimetrisk analyse celleviabilitet i henhold til produsentens protokoll. Klikk her for å se en større versjon av dettefigur.

Figur 3
Figur 3. Etidiumbromid farget agarosegel (1%) av transkripsjonsreaksjoner etter 4 timer med inkubasjon. Felt 1 er et 1000 bp DNA-stige som en standard. Baner 2-6 viser RNA transkribert fra 0,43 pmol DNA og ble behandlet med 4,3 fmol av hver inhibitor (a [kompleks]: [templat DNA basen] forhold på 0,01): kontroll (spor 2), Actinomycin D (spor 3), triptolide (felt 4), tpfc (felt 5), og Ga (tpfc) (felt 6).

Figur 4
Figur 4. UV-Vis spekteret av. 1: 200 fortynning av transkribert RNA ved etter 4 timers inkubasjon DNA-templat for transkripsjon reaksjonen ble behandlet med noe kompleks, eller med Actinomycin D, triptolide, tpfc eller Ga (tpfc) hos en [kompleks]: [mal DNA basen] ratio på 0,01: 1. RNA-konsentrasjonen ble målt ved OD på 260 nm.

Tine frosne reagenser på is:
75 mm løsninger av adenosin trifosfat, guanosin trifosfat, cytidine, og uridin trifosfat (ATP, CTP, GTP, UTP)
Nukleasefritt Water
10x reaksjonsbuffer (1 x reaksjonsbuffer: 40 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl2, 2 mM spermidin, 10 mM dithiothreitol, pH 7,9)
Linearisert templat-DNA (0,5 ug / ml, 1,85 kb)
RNA polymerase Enzyme (20 U / mikroliter)

Tabell 1. Liste over frosne reagenser.

Til å begynne transkripsjons reaksjoner, legger du til følgende beløp for hver reagens i 0,2 ml tynnveggede PCR-rør:
2 plATP-løsning (75 mm)
2 ul CTP-løsning (75 mm)
2 ul GTP løsning (75 mm)
2 ul UTP løsning (75 mm)
1 ul nukleasefritt vann
2 ul 10x reaksjonsbuffer
2 pl av 0,5 pg / pl lineær templat DNA
5 ul kompleks (nucleus-fritt vann som blindprøven, actinomycin D, triptolide, tpfc, Ga (tpfc))
2 ul RNA polymerase (20 U / mikroliter)

Tabell 2. Liste over reagenser for transkripsjon reaksjon.

Tidspunkt (t) Complex En 260 En 280 </ Strong> A 260 / A 280 Fortynning Factor [RNA]: A 260
(Pg / ml)
[RNA] (mg / ml)
4 Kontroll 7,583 3,516 2.16 200 40 60.67
4 Actinomycin D 0,955 0,438 2.18 200 40 7,638
4 triptolide 1,794 0,816 2.2 200 40 14.35
4 tpfc 7,858 3,631 2.16 200 40 62.87
4 Ga (tpfc) 0,554 0,232 2.39 200 40 4,434

Tabell 3. Konsentrasjon og renhet av transkribert RNA etter 4 timer målt ved hjelp av UV-vis spektroskopi. Ekstinksjonskoeffisienten av enkelt-trådet RNA er 0,025 (pg / ml) -1 cm -1, er en A-260 lesning av 1,0 ekvivalent til ca. 40 ug / ml av RNA og RNA ren har en A-260 / A 280-forhold på 2,1. 45

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne analysen viser at tilsetningen av Ga (tpfc) hemmer RNA transkripsjon forhold til de kjente DNA-bindende anticancer komplekser Actinomycin D og triptolide. Den cytotoksiske atferd Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1 til 154,7 mm) kan på grunn av sin inhibitoriske egenskaper. Siden ingen transkripsjon inhibering ble observert i tpfc, er cytotoksisiteten til tpfc ikke på grunn av RNA-transkripsjon inhibering, men er forårsaket av andre midler, men er ikke undersøkt.

I de fire transkripsjonsreaksjoner utført, ble DNA behandlet med Actinomycin D, triptolide, tpfc eller Ga (tpfc), ved en [kompleks]: [templat DNA basen]-forhold på 0,01, henholdsvis, eller i en ubehandlet kontroll. De transkripsjonsreaksjons reagenser ble kombinert og transkripsjons reaksjonen ble tillatt å forløpe i 4 timer ved 37 ° C. Den transkribert RNA ble renset gjennom en RNA-spinnkolonne og utbyttet analysert ved hjelp av UV-Vis og gel-elektroforese. Naturen av transkripsjon hemming kan Furthennes undersøkt ved anvendelse av den samme teknikken med ulike modifiseringer, eller forbindelsene kan bli utsatt for alternativ in vitro og in vivo studier. Ytterligere eksperimenter som kan bidra til å bestemme den molekylære natur av hemmingen omfatter røntgenkrystallografi av mulige corrole-DNA-addukter eller beregnings modellering av transkripsjonsreaksjon. Målet med dette forsøket var å finne ut om de forbindelser hemme transkripsjon for å samle inn informasjon om sine potensielle kreft egenskaper. Dette målet ble nådd: tpfc viste ingen hemming, mens Ga (tpfc) viste klar hemming og fortjener videre undersøkelse.

RNA-transkripsjon assay kan bli modifisert for å tilveiebringe mer mekanistiske detaljer. Tilsetning av anticancermidler (f.eks corrole komplekser) etter transkripsjon reaksjonen er fullført kan vise om kompleksene nedbryter eller hydrolysere RNA. En annen anbefalt eksperimentet er å gjennomføretranskripsjons reaksjon med alle komponentene med unntak av RNA-polymerase-enzym 10 ganger lavere for å muliggjøre differensiering mellom inhibering mekanisme som involverer DNA, eller enzymet. Til slutt inkubering av DNA-polymerase eller med komplekser før RNA-transkripsjon ville tillate økt binding mellom komplekset og den respektive mål, å fastslå om de komplekse inhibitoriske egenskaper er involvert i DNA-polymerase, eller binding, respektivt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Cindy N. Chiu for hjelp med gel elektroforese, og Andy Zhou og Michael Grodick for deres generøse donasjon av DNA og restriksjonsenzym. Vi ønsker å takke for Professor J. Heide og professor D. Prober for sjenerøs tilgang til utstyr og materialer. Vi takker Dr. Karn Sorasaenee for nyttige forslag. Vi takker Mary H. Tang for å lage illustrasjonen brukes i skjematisk oversikt i videoen. Finansiering ble gitt av Johnson & Johnson og USC Y86786.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actinomycin D Sigma-Aldrich A1410 Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide Sigma-Aldrich T3652 Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2 Life Technologies AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit Life Technologies AM1334 Store at –20 °C 
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate Sigma-Aldrich T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-100
mini Quick Spin RNA Columns Roche Life Science 11814427001 Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S Store at –20 °C 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Cancer Society. American Cancer Society. Atlanta. Available from: http://www.cancer.org (2014).
  2. Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
  3. Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41, (16), 2569-2576 (2005).
  4. Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17, (12), 7306-7316 (1997).
  5. Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3, (4), 4170-4190 (2011).
  6. Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2, (3), 103-108 (2011).
  7. Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11, (3), 377-383 (2011).
  8. Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15, (4), 738-746 (2004).
  9. Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25, (2), 400-409 (2012).
  10. Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39, (22), 4048-4051 (2000).
  11. Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16, (6), 1-6 (2011).
  12. Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (15), 6105-6110 (2009).
  13. Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163, (3), 368-373 (2012).
  14. Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17, (1), 11 (2012).
  15. Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8, (6), 2233-2243 (2011).
  16. Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124, (25), 7411-7420 (2002).
  17. Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46, (23), 4320-4324 (2007).
  18. Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42, (3), 878-884 (2003).
  19. Sorasaenee, K., Fu, P. K. -L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42, (4), 1267-1271 (2003).
  20. Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46, (18), 7494-7502 (2007).
  21. Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251, (1-3), 61-65 (2008).
  22. Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48, (13), 5599-5601 (2009).
  23. Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104, (5), 576-582 (2010).
  24. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378, (1), 140-147 (2011).
  25. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10, (3), 367-384 (2013).
  26. Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43, (3), 1175-1183 (2004).
  27. Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
  28. Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536, (1), 43-54 (2001).
  29. Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42, (3), 283-296 (2002).
  30. Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. Cancer Research. 48, (11), 3014-3018 (1988).
  31. Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. Cancer Research. 51, 6199-6201 (1991).
  32. Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
  33. Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7, (5), 2337-2361 (2010).
  34. Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4, (10), 1257-1272 (2012).
  35. Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, (5), 1417-1421 (1988).
  36. Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53, (7), 969-977 (1997).
  37. Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280, (10), 9586-9594 (2005).
  38. Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7, (3), 182-188 (2011).
  39. Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68, (13), 5257-5266 (2008).
  40. Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8, (10), 2780-2790 (2009).
  41. MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. Life Technologies. Carlsbad. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/1330M_G.pdf (2014).
  42. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27, (2-3), 126-139 (2006).
  43. Quick Spin Columns Protocol. Roche Diagnostics GmbH. Mannheim. Available from: https://pim-eservices.roche.com/LifeScience/Document/95c2b1f8-7cf1-e311-98a1-00215a9b0ba8 (2013).
  44. RNA quality control. KU Leuven: Biomedical Genomics. Leuven. Available from: http://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.html (2007).
  45. Sabris, R. W. Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. Wiley. Hoboken, NJ. (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics