Оценка ветвления дендритов в зубчатой ​​извилине гиппокампа области у мышей

1VA Palo Alto Health Care System, 2Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 3Department of Physical Therapy, Arkansas State University
Published 3/31/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Das, D., Phillips, C., Lin, B., Mojabi, F., Akif Baktir, M., Dang, V., et al. Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52371, doi:10.3791/52371 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Динамические изменения в количестве и структуре синапсов являются отличительными чертами развития, старения, а также многочисленные нейродегенеративные расстройства 1-3. Способность нейронов получать и интегрировать синаптической информации зависит от дендритных морфологии и динамических изменений в синаптических соединений. Действительно, положительная корреляция существует между дендритных позвоночника и количество синапсов, которые, как повлиять на когнитивные функции 4. Таким образом, нет ничего удивительного в том, что уменьшается на единицу в дендритной числа позвоночника были связаны с когнитивной дисфункции в ряде неврологических расстройств 5-7, побуждая большой интерес к дендритной количественного позвоночника. Тем не менее, количественное определение плотности позвоночника остается много времени и утомительной задачей, которая не генерирует полезную информацию о топографии и распределения синапсов через дендритной дерева. К счастью, методы окраски (например, Гольджи-Кокса и Даблкортин (DCX)) в сочетаниисо сложными методами визуализации может быть использован для преодоления существующих барьеров и создания изображений с высоким разрешением ветвления дендритов в надежной и оперативным образом. В то время как метод окрашивания Гольджи-Кокса могут быть развернуты для оценки состояния ветвления дендритов во всех нейронов 8, DCX могут быть развернуты для обозначения новорожденных нейронов, особенно в зубчатой ​​извилине и субвентрикулярной зоне 9, важный фактор, учитывая, что нейрогенез происходит в обоих эти регионы на протяжении всей жизни 10,11.

После окрашивания два метода визуализации были развернуты для оценки дендритных характеристики: я) в реальном времени томография (РТИ) и б) Увеличение глубины резкости изображений (EDFI). Техника RTI обеспечивает среднее проследить и количественно длину и порядок разветвление вдоль отдельных дендритных сегментов и отраслей. Таким образом, она позволяет оценить общую площадь и объем, занимаемый каждым дереве дендритов. Ещё Specifically, в способе РТИ пользователь постоянно определяет сегменты и перефокусирует многократно, как нейрон отслеживания программного обеспечения собирает X, Y, и Z координаты дендритной структуры и восстанавливает траекторию дендритной структуры в 3D. Для сравнения, метод EDFI обеспечивает достаточно простые и быстрые средства для оценки дендритных плотность в образцах довольно толстых тканей путем создания составного изображения, обеспечивая информацию о всей оси. Чтобы сделать это, пользователь записывает видео высокой четкости файлы по всей толщине секции, а затем использует программное обеспечение для поиска видеокадров для идентификации точки, в котором пиксель полностью в фокусе. Впоследствии, ориентированные пикселы объединяются и интегрируются в высоком разрешении, композитный 2D изображения. Это составное изображение содержит все пиксели, которые были в фокусе независимо от их положения на оси Z. Качественный и количественный анализ этих 2D-изображений может быть использован в дальнейшем для определения плотностидендритных ветвлений в каждой области.

Наконец, мы представляем панорамный метод для генерации чрезвычайно высоким разрешением изображения для анализа и оценки дендритов в целой области интереса. Этот метод может быть развернута, чтобы преодолеть отсутствие доступа к очень высоким разрешением и дорогих цифровых камер. Используя этот метод, один захватывает последовательные изображения в различных местах вдоль х и у топоров, а затем автоматически сшивает их вместе, используя бесплатное программное обеспечение (например, изображения Композитный редактор). Следует отметить, что этот метод может быть использован для качественного и количественного определения ветвления дендритов в довольно большой площади.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты были проведены в соответствии с этическими стандартами, утвержденными Комитетом по исследованиям животных в системе здравоохранения по делам ветеранов в Пало-Альто.

1. Гольджи-Кокса Окрашивание

  1. Добыча Мозг и окрашивание
    1. На первый день, глубоко анестезию мышей 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина до эвтаназии с помощью обескровливания.
    2. Осторожно снимите свода черепа и рассекать из мозга.
      1. Первый удаления кожи на верхней части черепа, размещение изогнутую ножницы в верхней части мозжечка и осторожно прорезать свода черепа параллельно центральной борозды с кончиком ножниц обращена наружу, двигаясь в направлении к обонятельной луковицы. Повторите этот процесс с обеих сторон.
      2. Используйте хирургическую pincet поднять свода черепа при повороте ее в направлении обонятельных луковиц и сломать его. Тогда, переверните череп с ног на голову и использовать кирку, чтобы прорваться через оптикойнервы и ослабить мозг. И, наконец, использовать выбор, чтобы отделить мозг от спинного мозга на уровне затылочного отверстия.
    3. Сразу погрузиться в мозг в 15 мл коммерчески доступного, неразбавленным раствором Гольджи-Кокса. Хранить в мозг Гольджи раствора в закрытой, 20 мл стеклянный флакон при комнатной температуре в темноте.
    4. На 2-й день, медленно вылейте раствор и заменить его 15 мл свежего раствора Гольджи-Кокса. Напомним бутылку, содержащую мозги и оставить в покое еще на 9 дней в темноте.
  2. Секционирование и посадки
    1. На 11-й день, место мозги в 30% растворе сахарозы, подготовленные в DDh 2 O для обезвоживания. Изменение раствора свежеприготовленного 30% сахарозы после 12 часов. Инкубируйте мозги в 30% -ном растворе сахарозы в течение 3 дней при температуре 4 ° С.
    2. На 14-й день, заполните резервуар vibratome с 30% раствором сахарозы в пока лезвие не покрыта. Установить скорость 1 мм / с с амплитудой 0,95 мм.
    3. Пятно мозги с Kimwipe, чтобы удалить лишнюю влагу и удалить мозжечок, используя лезвие бритвы, чтобы сократить коронки.
    4. Надежно смонтировать весь мозг на vibratome платформы с помощью суперклея и позволить ему установить в течение 2-4 мин. Вставьте платформу с прикрепленной мозга в резервуар и регулировать лезвие, чтобы в верхней части головного мозга.
    5. Использование vibratome, нарезать на мозг в 150 мкм секций при комнатной температуре, запоминание изменить лезвие после каждого третьего мозга.
    6. Возьмите разделы из резервуара с помощью небольшого наконечником кисть и погружают их в чашку Петри, содержащую 0,3% желатина, достигнутый в DDh 2 O. В то время как сечения остаются в чашке Петри, добавляют 0,5 мл 0,3% желатина на каждом слайде и использовать кисть, чтобы распространить и пальто SuperFrost + слайды.
    7. Аккуратно поднять погруженных участков из чашки Петри и помещают их на желатинизированные слайдов. Сориентируйте срезы головного мозга покасаясь их только на их сторонах, а не на вершинах.
    8. После примерно десяти минут нанесите на участки с 30% сахарозы до тканей полностью высохнет. Тогда воздух сухой подготовленные слайды в темном месте в режиме слайд-стойку в течение 3 дней.
    9. Развести имеющихся в продаже 10x Разработка решение 1x помощью DDh 2 O. Погрузитесь слайдов в разработке решения для 7-10 мин. Промыть слайды 3 раза в DDh 2 O.
  3. Обезвоживание
    1. Подготовка 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 95% этанола решений с использованием дистиллированной DDH 2 O.
    2. Замочите слайдов в более высоких решений этанол на 10 минут каждый.
    3. Замочите слайдов в 100% -ном растворе этанола 3 раза в течение 10 мин каждый раз.
    4. Замочите слайдов в 100% ксилола 3 раза подряд 5 мин каждая, сохраняя разделы в конечном растворе, пока они не прикрытие поскользнулся.
    5. Поместите щедрое количество DPX (ди-н-бутил фталат в ксилоле) монтажа среде (ABиз 1-1,5 мл) на каждого слайда, используя пластиковую передачи пипетки. Осторожно положите покровные, чтобы избежать пузырей.
    6. Воздух сухой покров поскользнулся-мозговые участки по горизонтали на 3 дня.

2. Даблкортин Окрашивание

  1. Глубоко обезболить (см шаг 1.1.1) животных.
  2. Выполните сердечной перфузии со свежеприготовленным 4% параформальдегида, сделанные в фосфатном буфере 12.
  3. Выписка мозги (1.1.2) и в магазине в 45 мл 4% параформальдегида при 4 ° С в течение ночи на ротационном шейкере.
  4. Передача мозги 30% раствора сахарозы в и ждать полного обезвоживания в течение 48 ч при 4 ° С. Удалить мозги из сахарозы и разместить их непосредственно на медных блоков, размещенных на сухом льду.
  5. Заполните блок с оптимальным температурным резки (OCT) соединения и отметить ориентацию мозга с помощью обонятельной луковицы в качестве ориентира.
  6. Использование криостат, разрезать 70 мкм срезы толщиной при -20 ° С и поместить ихВ криопротектора раствора (25% этиленгликоля, 25% глицерина, в 0,05 М буфере фосфата натри, рН 7,4) и держать при температуре от -20 ° С до использования.
  7. Сделать раствор 50% криопротектора и 50% метанола. К этому раствору добавляют 0,5% пероксида водорода (об / об). Инкубируйте плавающей секции в течение 30 мин при комнатной температуре.
  8. Теплые участки в 37 ° С в TBS (трис-солевой буфер) в течение 30-40 мин, помещая их в гистологической печи.
  9. Инкубируйте участки с 0,3% тритона и 3% нормальной лошадиной сыворотки в течение 45 мин при комнатной температуре до иммунной. Инкубируйте секций на 4 ° С в течение ночи в 3 мл раствора антитела DCX разбавленного 1: 500 в TBS с 0,3% тритона и 1% нормальной лошадиной сыворотки.
  10. На следующий день мыть разделах 3 раза подряд в TBS (10 мин каждый).
  11. Инкубировать срезы с биотинилированным анти-лошади козы (1: 200 в TBS) в течение двух часов при комнатной температуре. Вымойте разделах 3 раза подряд в TBS (10 мин каждый).
  12. Выдержите ткромка с ABC Lite (1: 1000) в течение 1,5 ч при комнатной температуре.
  13. Добавить 5 мкл 30% H 2 O 2 в одной таблетке 10 мг ДАБ (3,3 ") -Diaminobenzidine раствора, растворенного в 15 мл 1 М Трис-HCl (рН 7,6). Сразу же Инкубируйте секций в этом растворе в течение 5 мин.
  14. Завершение реакции промыванием их ледяным три раза TBS с последующей одной промывкой в ​​TBS при комнатной температуре.
  15. Высушить с помощью секции серию растворов этанола (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 мин каждый), четкое в ксилоле, а затем покрывают скольжения с помощью DPX, как на стадии 1.3.

3. Визуализация

  1. После полного высыхания секции, удалить излишки DPX на вершине горки с острым лезвием, и разместить их на этапе сканирования микроскопа. Система состоит из микроскопа, снабженного этапе сканирования, джойстика и 12-битного цвета камеры.
  2. Запустите программу. Откройте новый файл данных.
  3. МестоОпорная точка на экране, щелкнув указателем мыши в любом месте. Это активирует все иконки на панели инструментов окна программы.
  4. Нажмите на иконку "Джойстик Free" на панели инструментов, а затем с помощью джойстика найдите зубчатой ​​извилине гиппокампа в первом разделе.
  5. На вкладке "Сервис" в окне программы, выберите "Serial Раздел Manager". Нажмите на иконку "Новый раздел" на нижнем левом углу окна. Это откроет окно «Настройка последовательного сечения".
  6. Выберите последовательный окно настройки секции и затем введите общее количество разделов, которые содержат гиппокампа регионах. Выберите интервал оценки. Введите Раздел толщина резки (70 мкм для DCX 150 мкм для Гольджи окрашенных срезов).
  7. Начать трассировку зубчатой ​​извилине область, нажав на значок "Freehand Контур рисунка" на панели инструментов. Опишите зубчатые зернистый слой. </ Li>
  8. Выберите "100X" из меню "увеличивающим". Добавить каплю иммерсионного масла на участке и включить цель 100X. Найдите зубчатые тела ЗК и дендриты в рамках данной цели.
  9. Сосредоточьтесь на выбранной нейрона и нажмите на значок "Нейрон розыска" на панели инструментов. Проследите окружность зубчатого тела гранулярных клеток. После завершения трассировки, щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать "Finish Cell Body".
  10. Начать трассировку дендриты вручную в х, у и направлениях г и следуйте каждую ветвь с помощью ручки джойстика и Z-двигателя. В бифуркации или трифуркации узла, выберите соответствующую опцию из выпадающего меню при правой кнопкой мыши. Трассировка каждой из ветвей, которые возникают из этих узлов. В конце каждой ветви правой кнопкой мыши и выберите "Завершение" из выпадающего меню.
  11. Используя клавишу со стрелкой иконки в окне программы случайным образом выбрать другой зубчатой ​​ЗК и следовать той же процедуре, что и DESCRibed в шаге 3.9-3.10. Сохраните всю трассировку.
  12. Запустите программу нейронов трассировки.
  13. Открыть первый файл данных NRX от первой мыши из экспериментальной группы. Добавление файла NRX второго мыши из экспериментальной группы. Продолжайте, пока все файлы NRX из этой группы не добавляются.
  14. На вкладке Analysis, выберите "вентилятор в-схема". Это открывает вентилятор в-анализа окно. Галочка "дендриты" и нажмите дисплей, который изображает длины и ветвления шаблоны дендритов для этой группы мышей (рис 1).

4. EDFI

Примечание: Этот метод позволяет пользователю быстро записывать большое количество изображений с помощью Z-оси каждого поля и создать 2D изображение, которое содержит все сфокусированные пикселей по всей оси. Результат будет составное изображение, которое содержит все сосредоточены пикселей от собранных изображений.

  1. Подключите микроскоп к цифровому кулачкаЭпоха. Поместите разделы первую очередь на этапе сканирования, подключенного к микроскопу, а затем перейти к цели в 10 раз. Перемещение на сцену, чтобы интересующей области.
  2. Запуск программы оцифровки изображений.
  3. Нажмите на кнопку записи. Как только будет нажата кнопка записи, с помощью ручки макро-фокус, чтобы перейти от верхней к нижней части раздела в общей сложности 4 сек. Сохраните полученный видеофайл.
  4. Используйте ImageJ бесплатная программа для преобразования AVI видео файлов в несжатом формате, открыв файл и сохранять их в несжатом формате.
  5. Начните программу анализа изображения и откройте файл AVI. Перейти к меню "Process" и нажмите на кнопку "Увеличение глубины резкости». Выберите соответствующий видеофайл. В «выхода» вариантов, выберите "Создать композитный Best-фокус изображения".
  6. В «Фокус анализ» вариантов, выберите "нормализованное Освещение" и "Макс локальный контраст" варианты. Затем выберите "Creели ". Полученное изображение представляет все целенаправленные пикселей по всей оси (рис 2).
  7. Сохраните полученное изображение.

5. Создание Экстремально высокое разрешение изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод позволяет пользователю автоматически генерировать низкой кратности и чрезвычайно изображения с высоким разрешением изображения с высоким увеличением высоким разрешением, в автоматизированной форме.

  1. Поместите секции первого на этапе сканирования, подключенного к микроскопу. Микроскоп подключен к цифровой камере. Перемещение на сцену, чтобы интересующей области.
  2. Начните программу захвата изображений.
  3. Используйте цели 10X и приобрести и сохранить высокое разрешение (4076 х 3116) изображения с интересующей нас области убедившись, что есть по крайней мере 10% перекрытие.
  4. Запустите Image Composite Editor, чтобы сшить изображений.
  5. Перейти к меню File и нажмите на "Новом Панорама". Выберите папку, в которой Изображения улORed. Выберите изображения, которые принадлежат к той же области и нажмите "OK".
  6. Нажмите кнопку "Экспорт на диск" и сохраните изображение. Это изображение представляет картину чрезвычайно высоким разрешением области интересов, которые могут быть использованы для анализа и / или демонстрации (рисунок 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Степень разветвление, вытекающие из существующих и вновь рожденных зубчатой ​​ЗК была проанализирована в мышей дикого типа с использованием либо Гольджи-Кокса или DCX окрашивание (рисунок 1). Дендритные сегменты DCX-позитивных клеток были признаны пор 13-36 мкм. Нормальное распределение дендритных длины была протестирована с помощью Колмогорова-Смирнова (D = 0,1217, р <0,01, Liliefors р <0,001; рис 4 и 5).

При анализе длины сегментов в порядке разветвление, самые длинные сегменты были обнаружены в первом порядке разветвление (38,38 + 1,45 мкм). Похожие модели были найдены на поверхности (111,98 + 3,93 квадратных микрон) и объема (27,93 + 1,03 куб мкм). Были также испытаны линейной корреляции между длиной сегментов и площади поверхности и / или объема, занимаемого этих сегментов. Оба поверхность (р = 0,001, R 2 = 0,873) и объема (р = 0,001, R 2 = 0,621) сзначительно orrelated с длиной каждой дендритной сегмента.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Вот Fan схеме была использована для оценки дендритных длину зубчатой ​​ЗК в гиппокампе Этот инструмент визуализации может быть использован для сравнения эффектов различных терапевтических вмешательств или генотипов на дендритных длины. Единицей измерения является мкм.

Фиг.2
Рисунок 2: Визуализация ветвления дендритов без (а) и с методами EDFI (B). Традиционный метод поиска лучшего фокальную плоскость, сравнивали с EDFI (данные не показаны) и обнаружили, значительно более высокие значения дендритной области, используя метод EDFI (р = 0,02). Масштабная линейка= 100 мкм.

Рисунок 3
Рисунок 3:. Изображение с высоким разрешением в области гиппокампа у мыши Это чрезвычайно высокое разрешение изображения автоматически строится из шитье 10 (4076 х 3116) -pixel изображения. Масштаб голую = 100 мкм.

Рисунок 4
Рисунок 4:. Количественное определение длины и объема, занимаемого дендритов разных порядков ветвления максимальная длина и объем были достигнуты в порядке 1.

Рисунок 5
Рис. 5: Гистограмма дендритной длине зубчатой ​​ЗК большинство дендритных сегментов DCX-окрашенные дендриты 13-26 в длину. Красная пунктирная линия показывает нормальное распределение представленных данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Вот два способа были описаны количественно степень ветвления дендритов в зрелых и новорожденных нейронов с помощью обычных методов окрашивания в сочетании с РТИ и EDFI. Получение изображений высокого разрешения нейронов обеспечивает чрезвычайно полезный метод для проверки вредное воздействие нейродегенеративных расстройств и, в свою очередь, обеспечивает средства для оценки терапевтических стратегий, нацеленных на гиппокампа нейронов.

В то время как метод РТИ был использован для захвата углубленные данные, относящиеся к степени разветвление и топографии, метод EDFI не предоставляет информацию, имеющую отношение к сложности физических лиц сегментов или деревьев. Тем не менее, преимущества способа EDFI заключаются в том, что оно не требует приобретения дорогостоящего оборудования и меньше времени.

Программа анализа изображений использовался для выполнения EDFI в видео файлы. Имея доступ к высоким разрешением и быстрокамеры позволяет собирать большое количество изображений по толщине каждого поля и генерирует изображения, которые действительно представляют размеры X, Y, и Z. Один из недостатков способа EDFI относится к тому, что не может быть больше, чем один пиксель (такой же х и у) сосредоточены в разных плоскостях по всей оси. Метод предусмотрено назначать разные цвета, чтобы эти пикселы точно представляющих степень 3D профилей в 2D-изображений. Следует отметить, что способ EDFI также могут быть использованы для анализа клеточных профилей (например, синапсы, микроглии, и астроцитов). Кроме того, этот способ может быть использован для анализа степени микроглии распределения по всей толщине в разделе 7. Эти два метода, описанные здесь, могут быть использованы в дополнительной форме. Хотя RTI метод обеспечивает точную информацию о топографии ветвления, EDFI дает нам достаточно простой и ускоренный метод оценки плотности дендритов в области винтерес. Примечательно, что толщина участков, которые могут быть приобретены с EDFI весьма разнообразны как диапазон г акцентом на столике микроскопа в сочетании с оптическим фокусе внимания микрообъективов диктовать границы EDFI.

Методы, описанные здесь, имеют потенциал для развертывания в различных контекстах. В этом исследовании мы предоставили возможность оценить изменения в ветвления дендритов до и после вмешательства, в то время как EDFI был использован для количественного активации микроглии 7. Таким образом, эта методика поддается любым приложением, в котором конечной целью является оценка изменений в малых профилей, которые можно найти в несколько слоев.

Наконец, эти методы могут преодолеть отсутствие доступа к очень высоким разрешением и дорогих цифровых камер. В сущности, метод был показан на том, как захватить последовательный изображений в различных точках объектов в пределах образца, а затем сшить их вместе, используя бесплатное программное обеспечение, в конечном счете yieldinг изображения с высоким разрешением в манере, которая является гораздо более надежным и быстрым, чем традиционные методы.

Основные этапы

Окрашивание Гольджи

Стоковые количества Гольджи и разработку решений хранятся при 4 ° С для хранения и в то же окрашивания и инкубации протоколы требуют решения, которые будут использоваться при комнатной температуре. Охлаждение Гольджи и развитие решений на льду или в холодильнике отрицательно влияет на качество дендритных окрашивания. Кроме того, следует отметить, что мы использовали быстро развивающемся решения Гольджи. Хотя точный состав раствора Гольджи-Кокса используется в данном исследовании является собственностью компании, есть несколько источников, которые перечисляют в протоколе деталей, которые могут быть использованы для выполнения Гольджи-Кокса окрашивания 13. Тем не менее, использование других Гольджи-решений существенно изменят окрашивания длительности и модификации для этих шагов должно быть сделано соответствующим образом. Кроме того, мы наряду с другими имеют намиред 150 мкм срезы толщиной проанализировать РСК нейроны 14,15, так как обычно договорились, что сокращение разделов этой толщины коронки и параллельно зубчатой ​​arborizations ЗК сводит к минимуму риск сокращения дендритные ветви.

Окрашивание DCX

Протокол окрашивания DCX требует явного внимания к температуре. Неспособность нагревают раствор до 37 ° С в течение периода предварительной инкубации значительно ухудшает окрашивание и привести к потере дендритных визуализации. Кроме того, внимание к толщине сечения является оправданным. В этом исследовании мы использовали 70 мкм разделы, чтобы захватить максимально возможный объем РСК ветвления дендритов. По нашему опыту, использование 0,3% Тритон необходимость, поскольку это значительно облегчает проникновение антитела по всей толщине плавучих секций. В самом деле, предыдущие исследования использовали тритона, чтобы проникнуть 70 толщиной 16 мкм или даже толще (120 мкм) 17части, если метка РСК дендритов. Пожалуйста, см Хусайни для получения полной информации о DCX окрашивания 18.

Наконец, следует отметить, что альтернативные программы с открытым исходным кодом (например, flNeuronTool или Simple_Neurite_Tracer) существуют с возможностью записи движение этапа в направлениях X, Y, и Z. Такие программы могут быть использованы для отслеживания дендритной тех пор, пока они включены сообщение этапе сканирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Публикация сборы для этой статьи спонсируются ФМС Bioscience.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Modified Golgi-cox staining solution  Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x) Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
30% Sucrose, Sigma CAS # 57-50-1 make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin Sigma CAS # 9000-70-8 NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) Sigma CAS 603-003-00-5 NA
Xylene Sigma CAS # 1330-20-7 NA
DPX Medium EMS  #13510 NA
Superfrost (+) white Electron Microscopy Sciences 71869-10 NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) VWR  #4811-703 NA
DCX Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-8066 4 C
DAB Sigma CAS Number 91-95-2   -20
OCT Tissue-tek 4583 NA
Tris Sigma CAS Number 77-86-1   NA
ABC Lite Vector PK4000 NA
Microscope Nikon Eclipse 80i
Digital Camera Nikon DS-Ri1
12 bit Camera  QImaging  01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System MBF Bioscience V.10
Image Composite Editor Microsoft 1.4.4.0
NIS Elements Nikon F 3.0
Image Pro Plus Mediacy Versin 7.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22, (3), 383-388 (2012).
  2. Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587, (4), 727-729 (2009).
  3. Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. Synapses and Alzheimer’s disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. a005777 (2012).
  4. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
  5. Huttenlocher, P. R. Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms. Neurology. 24, (3), 203-210 (1974).
  6. Marin-Padilla, M. Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study. Brain Res. 38, (1), 1-12 (1972).
  7. Dang, V., et al. Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome. Biol Psychiatry. 75, (3), 179-188 (2014).
  8. Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study. Coll Antropol. 35, (Suppl 1), 25-30 (2011).
  9. Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10, (1), 32-46 (2010).
  10. Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis. Anat Rec. 296, (9), 1364-1382 (2013).
  11. Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis. Cell Mol Life Sci. 70, (12), 2045-2057 (2013).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).
  13. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
  14. Juraska, J. M. Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus. Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).
  15. Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus. PLoS One. 6, (9), e24566 (2011).
  16. Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche. J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).
  17. Merz, K., Lie, D. C. Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice. PLoS One. 8, (5), e62693 (2013).
  18. Hussaini, S. M., et al. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. (78), (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats