マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

1VA Palo Alto Health Care System, 2Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 3Department of Physical Therapy, Arkansas State University
Published 3/31/2015
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Neuroscience

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Summary

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Das, D., Phillips, C., Lin, B., Mojabi, F., Akif Baktir, M., Dang, V., et al. Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52371, doi:10.3791/52371 (2015).

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Abstract

Introduction

シナプスの数と構造の動的な変化は、開発の特徴で、高齢化、および多数の神経変性疾患1-3である。シナプスの情報を受信し、統合するための神経細胞の能力は、樹状形態とシナプス結合の動的な変化に依存している。確かに、正の相関が樹状突起棘と認知機能4に影響与えるの両方シナプス数、間に存在する。従って、樹状突起棘の数のデクリメントが樹状突起棘の定量化に大きな関心を促し、神経疾患5-7多数の認知機能障害と関連していることは驚くべきことではない。それにもかかわらず、背骨密度の定量化は、樹状ツリー全体のシナプスの地形や流通に関する有用な情報を生成するのに失敗し、時間がかかり、面倒な作業のまま。一緒に幸いなことに、染色方法( 例えば 、ゴルジ-コックスとダブルコルチン(DCX))高度なイメージング技術と現在の障壁を克服し、信頼性が高く、迅速な方法で樹枝状分岐の高解像度画像を生成するために利用することができる。ゴルジ-コックス染色法は、すべてのニューロン8の樹樹枝状分岐の状態を評価するために展開することができますが、DCXは、特に歯状回と脳室下帯9で新たに生まれたニューロンを標識するために展開することができ、重要な考慮事項は、神経新生の両方で発生していることを与えられた寿命10,11を通じて、これらの地域。

染色後、つの撮像方法は、樹状特性を評価するために配備された:i)のリアルタイムイメージング(RTI)及びフィールドイメージング(EDFI)のii)の拡張深度。 RTI技術は、個々の樹状セグメントと枝に沿って樹枝状分岐の長さと順序をトレースし、定量化するための平均値を提供します。したがって、それぞれの樹状ツリー占める総面積と体積を推定するために1を可能にします以上のSpecifically、RTIの方法では、ユーザは、連続的セグメントを識別し、ソフトウェアを追跡するニューロンは、樹枝状構造のx、y、およびz座標を収集するように反復的に再集束及び3Dにおける樹枝状構造の軌道を再構成する。比較的、EDFI方法は全体z軸に関する情報を提供し、合成画像を生成することではなく、厚い組織標本において、樹状密度を評価するための比較的単純かつ迅速な手段を提供する。そうするために、ユーザは、セクションの厚さ全体の高解像度ビデオファイルを記録し、画素に焦点が完全であることを特徴とするポイントを識別するためにビデオフレームを検索するためのソフトウェアを使用する。その後、フォーカスピクセルがマージされ、高解像度、合成2D画像に統合される。この合成画像は関係なく、z軸での位置の中で、焦点となったすべてのピクセルが含まれています。これらの2D画像の定性的および定量的分析は、濃度を決定するためにその後に使用することができの樹状突起の各分野での分岐。

最後に、関心領域全体における樹枝状結晶の分析および評価のために非常に高解像度の画像を生成するパノラマの方法を提示する。この技術は、非常に高解像度で高価なデジタルカメラへのアクセスの欠如を克服するために展開することができる。この方法を使用して、一方がx軸とy軸に沿った異なる位置で連続画像を取得し、自動的にそれらを一緒にフリーウェアを使用してステッチ( 例えば 、画像のコンポジット·エディタ)。特に、この方法は、かなり広範囲に樹状樹枝状分岐の定性的および定量的評価のために使用することができる。

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Protocol

注:実験は、退役軍人パロ​​アルトヘルスケアシステムにおける動物研究委員会によって承認された倫理基準に従って行った。

1.ゴルジ - コックス染色

  1. 脳抽出と染色
    1. 第一日目には、深く放血を経由して安楽死の前に100mg / kgのケタミンおよび10mg / kgキシラジンでマウスを麻酔。
    2. 慎重に頭蓋冠を削除し、脳を解剖する。
      1. まず小脳の上に湾曲したハサミを置く、頭蓋骨の上に皮膚を除去し、軽くはさみの先で中心溝に頭蓋冠と平行を切断嗅球に向かう方向に移動する、外側に指摘した。両側にこのプロセスを繰り返します。
      2. 嗅球に向かってそれを回しながら頭蓋冠を持ち上げるために、外科ピンセットを使用して、それを破る。その後、逆さまに頭蓋骨を反転し、視神経を切断するためにピックを使って神経や脳を緩めます。最後に、大後頭孔のレベルで脊髄から脳を分離するためにピックを使用しています。
    3. すぐに市販の、希釈されていないゴルジ - コックス溶液15mlで脳を浸す。暗所で室温で蓋をし、20ミリリットルのガラス瓶にゴルジ液に脳に保管してください。
    4. 2日目、ゆっくりとソリューションを注ぐと15ミリリットル新鮮なゴルジ - コックス·ソリューションと交換してください。脳を含むボトルをおさらいし、暗所で別の9日間、平静なままにしておきます。
  2. セクショニングと埋め込み
    1. 11日の日に、脱水のためのddH 2 O中で調製30%のショ糖溶液中で脳を、置く。 12時間後に、新たに調製した30%のスクロースを含むソリューションを変更します。 4℃で3日間、30%ショ糖溶液中で脳をインキュベートする。
    2. ブレードが覆われるまで14日目に、30%のショ糖液でビブラトームのリザーバを埋める。 1メートルに速度を設定しますメートル/秒0.95ミリメートルの振幅である。
    3. 余分な水分を除去し、冠状に切断し、カミソリの刃を使用して、小脳を除去しキムワイプで脳ブロット。
    4. しっかりと瞬間接着剤を使用したビブラトームプラットフォームに全脳をマウントし、それが2-4分間に設定することができます。リザーバ内に付着した脳を持つプラットフォームを挿入し、脳のトップに刃を調整します。
    5. ビブラトームを使用して、3回目の脳の後にブレードを変更するには、覚えて、室温で150ミクロン厚の切片に脳スライス。
    6. 小さ ​​な傾いてブラシを使用して、リザーバーからのセクションをピックアップし、のddH 2 Oで行われた0.3%ゼラチンを含むペトリ皿にそれらを浸すのセクションでは、ペトリ皿に残っている各スライド上の0.3%のゼラチンの0.5ミリリットルを追加し、スーパーフロスト+スライドを広げて、コーティングするためにブラシを使用している間。
    7. 静かにペトリ皿から浸さセクションをピックアップし、ゼラチン化スライド上に配置します。による脳切片の向き唯一の彼らの側にしていないのトップスにそれらに触れる。
    8. 約10分後、コート組織の前に30%のスクロースを含むセクションが完全に乾く。その後、空気は、3日間のスライドラックに暗い場所で準備スライドを乾燥させます。
    9. 市販の希釈して10倍ののddH 2 Oを使用して1倍するソリューションの開発7-10分のためのソリューションの開発にスライドを浸す。のddH 2 Oにスライドを3回すすぎ
  3. 脱水
    1. 蒸留のddH 2 Oを使用して20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、および95%エタノール溶液を調製し
    2. 10分ごとに、ますます高いエタノール溶液にスライドを浸す。
    3. 各回10分間、100%エタノール溶液で3回スライドを浸し。
    4. 彼らはカバースリップしているまで、最終溶液中のセクションを保ち、5分ごとに100%のキシレンに3回連続してスライドを浸す。
    5. DPXの寛大な量(キシレン中のジ-n-ブチルフタレート)マウンティング培地(ABを配置プラスチック転送ピペットを使用して、各スライドのうち1〜1.5ミリリットル)。慎重に泡を避けるために、カバースリップを配置。
    6. エアドライカバーが滑っ脳セクションを水平に3日間。

2.ダブルコルチン染色

  1. 深く(ステップ1.1.1を参照)、動物を麻酔。
  2. リン酸緩衝液12で行われた、新たに調製した4%パラホルムアルデヒドで心臓灌流を行います。
  3. ロッキングシェーカー上で一晩4℃で4%パラホルムアルデヒドの45ミリリットル中の脳(1.1.2を参照)、店舗を抽出します。
  4. 30%のショ糖溶液に脳を移し、4℃で48時間、完全な脱水を待つ。ショ糖から脳を取り出し、ドライアイス上に置き、銅ブロックの上に直接配置します。
  5. 最適な切削温度(OCT)化合物でブロックを記入し、ランドマークとして嗅球を用いて脳の向きをマーク。
  6. クライオスタットを用いて、-20ºCで70ミクロン厚の切片を切り出し、それらを配置凍結保護物質溶液(0.05 Mリン酸ナトリウム緩衝液中の25%エチレングリコール、25%グリセロール、pH7.4)で-20℃で使用するまで続ける。
  7. 50%の凍結保護剤および50%メタノールの溶液を作る。この溶液に、0.5%過酸化水素水(体積/体積)を加える。室温で30分間浮遊切片をインキュベートする。
  8. 組織学的オーブンに入れて、30〜40分間、TBSで37ºC(トリス緩衝食塩水)でウォームセクション。
  9. 免疫染色の前に室温で45分間、0.3%トリトンおよび3%の正常ウマ血清を持つセクションをインキュベートする。 0.3%トリトンと1%正常ウマ血清をTBSで500:1に希釈DCX抗体の3ミリリットル溶液中で一晩4ºCでのセクションをインキュベートします。
  10. 次の日は、セクションをTBSで3回連続して(10分ずつ)洗浄します。
  11. 室温で2時間:(TBS中200 1)ビオチン化ウマ抗ヤギを持つセクションをインキュベートします。セクションをTBSで3回連続して(10分ずつ)洗浄します。
  12. Tをインキュベート室温で1.5時間:ABC Liteの(千1)と裾。
  13. 1 Mトリス塩酸(pH7.6)で15mlに溶解DAB(3,3 "-Diaminobenzidine)の溶液に10mgの1錠30%のH 2 O 2の5μLを加える。 5分間この溶液に、すぐにセクションをインキュベートする。
  14. 氷冷TBSで室温でTBSで1回洗浄した三回、それらを洗浄することにより反応を停止。
  15. キシレンで透明なエタノール溶液(50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、5分毎)を用いた一連の切片を脱水した後、ステップ1.3のようDPXを用いてスリップをカバーする。

3.可視化

  1. セクションの完全な乾燥の後、鋭利な刃で、スライドの上に過剰DPXを削除し、顕微鏡の走査ステージ上に置きます。システムは、走査ステージ、ジョイスティック、およびカラー12ビットのカメラを備えた顕微鏡で構成されている。
  2. プログラムを起動します。新しいデータファイルを開きます。
  3. 場所任意の場所でマウスポインタでクリックすることで、画面上の基準点。これは、プログラムウィンドウのツールパネルからすべてのアイコンがアクティブになります。
  4. ツールバーの「ジョイスティック無料」アイコンをクリックし、第一項の海馬の歯状回を見つけるためにジョイスティックを使用しています。
  5. プログラムウィンドウの「ツール」タブで、「シリアル課長」を選択します。ウィンドウの左下隅の「新規セクション」アイコンをクリックします。これは「シリアルセクションの設定」ウィンドウが開きます。
  6. 連続切片Setupウィンドウを選択してから、海馬領域を含むセクションの合計数を入力します。評価間隔を選択します。 (DCXのための70ミクロンとゴルジ染色切片のために150μm)の厚さをカットセクションを入力します。
  7. ツールバーの「フリーハンド輪郭描画」アイコンをクリックして歯状回領域トレースを開始。歯状回顆粒細胞層の概要を説明します。</ LI>
  8. 「倍率」メニューから「100X」を選択します。セクションのイマージョンオイルの滴を追加し、100Xに目標を切り替えます。この目的の下で歯状回顆粒細胞体と樹状突起の位置を確認します。
  9. 選択したニューロンに焦点を当て、ツールバーの「ニューロントレース」アイコンをクリックしてください。歯状回顆粒細胞体の周囲をトレースします。トレースが終了したら、右の「完了セルボディ」をクリックして選択します。
  10. x、y、z方向に手動で樹状突起のトレースを開始し、ジョイスティック及びz運動ノブを使用して、各ブランチに従う。分岐または三分岐ノードでは、右クリックすると、ドロップダウンメニューからそれぞれのオプションを選択します。これらのノードから発生する枝のそれぞれをトレースします。各ブランチの終わりに右クリックし、ドロップダウンメニューから「エンディング」を選択します。
  11. ソフトウェアのウィンドウに矢印キーのアイコンを使用すると、ランダムに別の歯状回顆粒細胞を選択し、DESCRと同じ手順に従ってくださいステップ3.9から3.10にアイベッド。全体のトレースを保存します。
  12. ニューロンのトレースソフトウェアを起動します。
  13. 実験群の最初のマウスからの第NRXデータファイルを開きます。実験群の第二のマウスのNRXファイルを追加します。このグループからすべてのNRXファイルが追加されるまで継続する。
  14. 分析]タブの下で、「ファンインダイアグラム」を選択します。これはファンイン分析ウィンドウが開きます。マーク「樹状突起」をチェックして、マウスのこのグループ( 図1)のための樹状突起の長さと分岐パターンを示しているディスプレイをクリックします。

4. EDFI

注:この方法は、迅速に各フィールドのz軸を介して多数の画像を記録し、z軸全体のすべての集中画素を含む二次元画像を生成することを可能にする。その結果、収集した画像からのすべての集中画素を含む合成画像になります。

  1. デジタルカムにマイクロスコープを接続時代。顕微鏡に接続された走査ステージに最初のセクションを配置して、10倍の対物レンズに切り替える。関心のある領域にステージを移動します。
  2. ビデオキャプチャプログラムを起動します。
  3. 録音ボタンを押します。とすぐに録音ボタンを押している、4秒の合計セクションの上から下に移動するために、マクロフォーカスノブを使用しています。結果のビデオファイルを保存します。
  4. ファイルを開き、圧縮されていないファイル形式で保存することで、非圧縮フォーマットにAVIビデオファイルを変換するImageJのフリーウェアを使用してください。
  5. 画像解析プログラムを起動し、AVIファイルを開きます。 「プロセス」メニューに移動し、「フィールドの拡張深さ」をクリックしてください。対応するビデオファイルを選択します。 「出力」オプションでは、「コンポジットベスト焦点画像の生成」を選択します。
  6. 「フォーカス解析」オプションでは、「正規化照明」と「最大局所コントラスト」オプションを選択します。その後、「Creを選択「食べた。結果の画像は、z軸( 図2)を通してすべてのフォーカスピクセルを表す。
  7. 結果の画像を保存します。

5.極めて高解像度の画像を生成

注:この方法では、ユーザーは自動的に自動化された方法で、高倍率·高解像度画像から低倍率で非常に高解像度の画像を生成することを可能にする。

  1. 顕微鏡に接続された走査ステージに最初のセクションを配置します。顕微鏡デジタルカメラに接続されている。関心のある領域にステージを移動します。
  2. 画像取得プログラムを起動します。
  3. 関心領域の画像は、少なくとも10%のオーバーラップを有することを確認して(xは3116 4076)10倍対物レンズを使用し、高解像度を取得し、保存する。
  4. イメージをステッチするイメージコンポジット·エディタを実行します。
  5. メニューをファイルに移動し、「新しいパノラマ」をクリックしてください。画像はSTされているフォルダを選択します論理和。同じ領域を押して「OK」に属している画像を選択します。
  6. ボタンを押して「ディスクに書き出し」とイメージを保存します。この画像は、分析および/ ​​または実演( 図3)のために使用することができる関心領域の非常に高解像度の画像を表す。

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Representative Results

現存及び新生歯状回顆粒細胞から生じる樹枝状分岐の程度は、ゴルジコックスまたはDCX染色( 図1)のいずれかを使用して、野生型マウスにおいて分析した。 DCX陽性細胞の樹状突起セグメントは、13-36ミクロンの長いことが判明した。樹状長さの正規分布は、コルモゴロフ-スミルノフ検定を用いて試験した(D = 0.1217のp <0.01、Liliefors pは<0.001; 図4および図5)。

樹枝状分岐のオーダーごとのセグメントの長さの分析では、最も長いセグメントは、樹枝状分岐の最初の注文(38.38 + 1.45ミクロン)で発見された。同様のパターンは、表面(111.98 + 3.93平方ミクロン)と体積(27.93 + 1.03立方ミクロン)について見出された。これらのセグメントによって占められたセグメントの長さおよび表面積及び/または体積の間の線形相関も試験した。表面た(p = 0.001、rは2 = 0.873)およびボリュームた(p = 0.001、rは2 = 0.621)からc両方各樹状セグメントの長さを大幅にorrelated。

図1
図1:ファン図は海馬の歯状回顆粒細胞の樹状突起の長さを評価した。ここで 、この視覚化ツールは、樹状長さの別の治療的介入または遺伝子型の効果を比較するために使用することができる。測定の単位はミクロンである。

図2
図2:(A)なしの樹樹枝状分岐の可視化とEDFI(B)メソッドを持つ。ベストフォーカス面を求める従来の方法は、EDFI(データは示さず)と比較し、EDFI方法た(p = 0.02)を使用して、樹状領域の有意に高い値を発見された。スケールバー=100μmである。

図3
図3:マウスにおける海馬領域の高解像度画像は、この非常に高解像度の画像を自動的に10(4076のx 3116)-pixel画像をステッチから構築される。スケール裸=100μmである。

図4
図4:分岐の異なる順序で樹状突起によって占有長さとボリュームの定量化は、最大長さとボリュームが順番1で達成された。

図5
図5:歯状回顆粒細胞の樹状突起の長さのヒストグラム Dの樹状セグメントの大多数CX-染色樹状突起の長さは13-26だった。赤い点線は提示されたデータの正規分布を示している。

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Discussion

ここでは、2つの方法がRTIとEDFIと組み合わせて、従来の染色法を用いて、成熟した、新たに生まれたニューロンにおける樹状突起樹枝状分岐の程度を定量化するために記載された。ニューロンの高解像度画像の取得は、神経変性障害の有害な影響を試験するための非常に有用な方法を提供し、ひいては、海馬神経細胞を標的とする治療戦略を評価するための手段を提供する。

RTI方法は樹枝状分岐、および地形の程度に関係の深いデータをキャプチャするために利用されたが、EDFI方法は、個体のセグメントまたは木の複雑さに関する情報を提供することができない。それにもかかわらず、EDFI方法の利点は、高価なハードウェアを購入する必要がなく、少ない時間を消費しているという事実にある。

画像解析プログラムは、ビデオファイルにEDFIを実行するために使用された。高分解能かつ高速のアクセスを有するカメラは、各フィールドの厚さ全体にわたって多数の画像の収集を可能にし、真のx、y、およびz寸法を表す画像を生成する。 EDFI方法の1つの欠点は、複数の画素(同じxおよびy)z軸全体に異なる平面に集束が存在し得るという事実に関係する。この方法は、正確に2D画像内の3Dプロファイルの程度を表すこれらの画素に異なる色を割り当てることが想定される。これは、EDFI方法はまた、細胞のプロファイル( 例えば 、シナプス、ミクログリアおよび星状細胞)の解析に使用することができることに留意されたい。さらに、この方法は、セクション7の厚さ全体にわたってミクログリア分布の程度を分析するために使用することができる。ここでの2つの方法は、相補的に使用することができる。 RTI方法がパターンに分岐の地形に関する正確な情報を提供していますが、EDFIは私たち​​に中のエリアに樹状突起の密度を評価するためではなく、シンプルで迅速な方法を提供しますterest。特に、EDFIを取得することができる部分の厚さは、顕微鏡対物レンズの光学焦点と組み合わせた顕微鏡ステージ上のzの焦点の範囲と非常に可変的EDFIの境界を決定する。

本明細書に記載する方法は、複数のコンテキストで展開される可能性がある。 EDFIは、ミクログリアの活性化7を定量化するために使用されたのに対し、本研究では、樹枝状分岐の前後の介入の変化を評価するための手段を提供した。したがって、この技術は、最終的な目標は、複数の層に見られる小さなプロファイルの変化を評価することであることを特徴とするアプリケーションに適している。

最後に、これらの技術は、非常に高い解像度で高価なデジタルカメラへのアクセスの欠如を克服することができる。本質的に、この方法は、最終的にyieldin、試料内の位置の異なるポイントで連続画像をキャプチャし、フリーウェアを使用してそれらを一緒にステッチする方法が示されたはるかに信頼性が高く、迅速な従来の方法に比べて同様にグラム高解像度画像。

重要なステップ

ゴルジ染色

ストックゴルジの量及び現像溶液は、染色およびインキュベーションプロトコルは溶液を室温で利用する必要がまだ記憶のために4℃で保持している。ゴルジ冷却し、氷上で、または冷蔵庫でソリューションを開発することにより、悪の樹状染色の品質に影響を与える。また、それは我々が急速に発展ゴルジソリューションを使用したことに注目すべきである。本研究で使用ゴルジコックス液の正確な組成は、独自のものであるが、ゴルジコックス染色13を実行するために使用できる詳細なプロトコルで複数のソースそのリストがある。しかし、他のゴルジ溶液の使用を大幅に応じてなされるべき手順のために持続時間及び修正を染色変える。また、私たちは一緒に他の人と私たちを持っているそれは一般的に歯状回顆粒細胞arborizationsに冠状と並行してこの厚さの部分をカットすることは、樹状枝を切断する危険性を最小限に抑えることが合意されたとしてDGCニューロン14,15を分析するために150μmの厚さの切片をエド。

DCX染色

DCX染色プロトコルは、温度への明示的な注意を払う必要があります。プレインキュベーション期間に37℃に溶液を加熱する障害を著しく損なう染色および樹状視覚化の喪失をもたらす。また、セクションの厚さに注意が保証されています。本研究では、DGCs樹樹枝状分岐の最大範囲をキャプチャするために70μmの厚さの切片を使用していました。それが大幅にフローティングセクションの厚さ全体にわたって抗体の浸透を容易にするので、我々の経験では、0.3%のトリトンの使用が必要です。実際、以前の研究では、70μmの厚さの16を貫通し、トリトンを使用していたか、さらに厚い(120μm)の17セクションときラベルDGCデンドライト。 DCX染色18の完全な詳細についてはHussainiを参照してください。

最後に、代替のオープンソースプログラム( 例えば flNeuronToolまたはSimple_Neurite_Tracer)はx、y、z方向におけるステージの動きを記録する機能が存 ​​在することに留意すべきである。このようなプログラムは、それらが走査ステージと通信するためにイネーブルされるように、樹状トレースのために使用することができる。

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Disclosures

この記事の発行手数料はMBFバイオサイエンスが主催している。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Modified Golgi-cox staining solution  Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x) Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
30% Sucrose, Sigma CAS # 57-50-1 make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin Sigma CAS # 9000-70-8 NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) Sigma CAS 603-003-00-5 NA
Xylene Sigma CAS # 1330-20-7 NA
DPX Medium EMS  #13510 NA
Superfrost (+) white Electron Microscopy Sciences 71869-10 NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) VWR  #4811-703 NA
DCX Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-8066 4 C
DAB Sigma CAS Number 91-95-2   -20
OCT Tissue-tek 4583 NA
Tris Sigma CAS Number 77-86-1   NA
ABC Lite Vector PK4000 NA
Microscope Nikon Eclipse 80i
Digital Camera Nikon DS-Ri1
12 bit Camera  QImaging  01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System MBF Bioscience V.10
Image Composite Editor Microsoft 1.4.4.0
NIS Elements Nikon F 3.0
Image Pro Plus Mediacy Versin 7.00

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References

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