Bedömning av dendritiska arborization i gyrus dentatus i hippocampus regionen hos möss

1VA Palo Alto Health Care System, 2Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 3Department of Physical Therapy, Arkansas State University
Published 3/31/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Das, D., Phillips, C., Lin, B., Mojabi, F., Akif Baktir, M., Dang, V., et al. Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52371, doi:10.3791/52371 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Dynamiska förändringar i antal och struktur synapser är kännetecknen för utveckling, åldrande, och många neurodegenerativa sjukdomar 1-3. Förmågan av nervceller för att ta emot och integrera synaptiska informationen beror på dendritiska morfologi och dynamiska förändringar i synapsförbindelser. Faktum finns ett positivt samband mellan dendritiska ryggraden och synaps nummer, vilket både påverkar kognitiv funktion 4. Det är alltså inte förvånande att minskningar i dendritiska ryggraden nummer har förknippats med kognitiv dysfunktion i ett antal neurologiska sjukdomar 5-7, vilket fick stort intresse dendritiska ryggraden kvantifiering. Ändå kvantifiering av ryggraden täthet förblir en tidskrävande och mödosam uppgift som misslyckas med att generera användbar information om topografi och distribution av synapser över dendritiska träd. Lyckligtvis färgningsmetoder (t.ex. Golgi-Cox och doublecortin (DCX)) tillsammansmed sofistikerade avbildningstekniker kan användas för att övervinna de nuvarande hindren och producera högupplösta bilder av dendritiska arborization på ett tillförlitligt och snabbt sätt. Medan Golgi-Cox färgningsmetoden kan användas för att bedöma tillståndet i dendritiska arborization i alla nervceller 8, kan DCX sättas in för att märka nyfödda nervceller särskilt i gyrus dentatus och subventrikulära zon 9, en viktig faktor med tanke på att neurogenes sker i både dessa regioner i hela livslängden 10,11.

Efter färgning, var två avbildningsmetoder användas för att bedöma dendritiska egenskaper: i) i realtid imaging (RTI) och ii) förlängdes skärpedjup imaging (EDFI). RTI-tekniken ger ett medelvärde för att spåra och kvantifiera längd och inbördes ordning arborization längs de enskilda dendritiska segmenten och grenar. Alltså det gör man för att uppskatta den totala ytan och volymen upptas av varje dendritiska träd. Fler specifically, i RTI-metoden användaren identifierar kontinuerligt de segment och refocuses iterativt som neuron spåra programvaran samlar x, y och z koordinater för dendritiska strukturen och rekonstruerar banan för dendritiska strukturen i 3D. Jämförelsevis ger EDFI metoden en ganska enkel och expedierade medel för att bedöma dendritiska täthet i ganska tjocka vävnadsprover genom att generera en sammansatt bild, som ger information om hela z-axeln. För att göra detta, registrerar användaren högupplösta videofiler genom hela tjockleken på sektionen och sedan använder programvara för att söka i bildrutor för att identifiera punkter där en pixel är helt i fokus. Därefter är de fokuserade pixlarna samman och integreras i en hög upplösning, komposit 2D-bild. Denna sammansatta bilden innehåller alla pixlar som var i fokus, oavsett deras position i z-axeln. Kvalitativ och kvantitativ analys av dessa 2D-bilder kan användas senare för att bestämma densitetenav dendritiska förgrening i varje fält.

Slutligen presenterar vi en panorama metod för att generera extremt högupplösta bilder för analys och bedömning av dendriter i en hel region av intresse. Denna teknik kan användas för att avhjälpa bristen på tillgång till mycket hög upplösning och dyra digitalkameror. Med denna metod, man fångar seriebilder på olika platser längs x- och y-axlarna och sedan automatiskt stygn ihop dem med ett gratisprogram (t.ex. Bild Composite Editor). Noterbart kan denna metod användas för kvalitativ och kvantitativ bedömning av dendritisk arborization i ett ganska stort område.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Experiment utfördes i enlighet med de etiska normer som godkänts av kommittén för djurs Forskning vid Veterans Affairs Palo Alto hälsovården.

1. Golgi-Cox Färgning

  1. Brain utvinning och färgning
    1. Den 1: a dagen, djupt söva möss med 100 mg / kg ketamin och 10 mg / kg xylazin innan euthanizing via blodtappning.
    2. Försiktigt bort calvarium och dissekera ut hjärnan.
      1. Först bort huden på toppen av skallen, placera en krökt sax på toppen av lillhjärnan och försiktigt skära genom calvarium parallell med den centrala sulcus med spetsen på saxen pekade utåt, rör sig i riktning mot den olfaktoriska bulben. Upprepa denna process på båda sidor.
      2. Använd en kirurgisk pincet att lyfta calvarium samtidigt vrida den mot lukt glödlampor och bryta den. Fäll sedan skallen upp och ner och använd en pick att skära igenom optikennerver och lossa hjärnan. Slutligen använder pick att separera hjärnan från ryggmärgen i höjd med foramen magnum.
    3. Omedelbart Doppa hjärnan i 15 ml kommersiellt tillgänglig, outspädd Golgi-Cox-lösning. Förvara hjärnan i Golgi-lösning i ett kapslat, 20 ml glasflaska vid rumstemperatur i mörker.
    4. Den 2: a dagen, sakta hälla ut lösningen och ersätta den med 15 ml färsk Golgi-Cox lösning. Sätt på locket på flaskan med hjärnan och lämna ostört i ytterligare nio dagar i mörker.
  2. Sektione och inbäddning
    1. På den 11: e dagen, placera hjärnor i 30% sackaros lösning, som utarbetats i DDH 2 O för uttorkning. Ändra lösning med nyberedd 30% sackaros efter 12 timmar. Inkubera hjärnorna i en 30% sackaroslösning under 3 dagar vid 4 ° C.
    2. På den 14: e dagen, fylla behållaren av vibratome med en 30% sackaroslösning tills bladet är täckt. Ställ in hastigheten till 1 mm / s med amplitud 0,95 mm.
    3. Blot hjärnan med en Kimwipe att avlägsna fukt och ta bort lillhjärnan med ett rakblad för att skära koronalt.
    4. Fast montera hela hjärnan på vibratome plattform med hjälp superlim och låt den inställd för 2-4 minuter. Sätt i plattform med den vidhäftade hjärnan in i reservoaren och justera blad till toppen av hjärnan.
    5. Använda vibratome, skär hjärnan i 150 nm tjocka sektioner vid rumstemperatur, komma ihåg att ändra bladet efter varje 3: e hjärna.
    6. Plocka upp de avsnitt från reservoaren med en liten spets pensel och doppa dem i en petriskål innehållande 0,3% gelatin framställt i DDH 2 O. Medan avsnitten kvar i petriskål, till 0,5 ml 0,3% gelatin på varje bild och använd en borste för att sprida och belägga Superfrost + diabilder.
    7. Plocka försiktigt upp nedsänkta avsnitten från petriskål och placera dem på de gelatiniserade diabilder. Orientera hjärnan sektioner medvidröra dem bara på deras sidor och inte på topparna.
    8. Efter cirka tio minuter, päls sektionerna med 30% sackaros innan vävnaden torkar helt. Då lufttorka de beredda diabilder i en mörk plats i en bild rack i 3 dagar.
    9. Späd kommersiellt tillgängliga 10x Utveckla lösningen till 1x använder DDH 2 O. Doppa objektglasen i framkallningslösning för 7-10 min. Skölj objektglasen 3 gånger i DDH 2 O.
  3. Dehydrering
    1. Förbered 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, och 95% etanol lösningar med destillerat DDH 2 O.
    2. Blöt glasen i allt högre etanollösningar i 10 min vardera.
    3. Blöt glasen i 100% etanollösning tre gånger för 10 minuter varje gång.
    4. Blöt bilderna i 100% xylen 3 gånger efter varandra på fem minuter vardera, hålla sektionerna i den slutliga lösningen tills de är cover-halkade.
    5. Placera en generös mängd DPX (di-n-butylftalat i xylen) monteringsmedium (abut 1-1,5 ml) på varje bild med hjälp av en plast överföring pipett. Placera försiktigt täck att undvika bubblor.
    6. Lufttorka omslaget halkade-hjärn sektioner vågrätt i 3 dagar.

2. Doublecortin Färgning

  1. Djupt söva (se steg 1.1.1) djuren.
  2. Utför hjärtperfusion med nygjord 4% paraformaldehyd görs i fosfatbuffert 12.
  3. Utdrag hjärnan (se 1.1.2) och lagra i 45 ml 4% paraformaldehyd vid 4 ° C över natten på en gungande shaker
  4. Överför hjärnorna till en 30% sackaroslösning och vänta på fullständig dehydratisering för 48 h vid 4 ° C. Ta hjärnorna från sackaros och placera dem direkt på kopparblock placeras på torris.
  5. Fyll blocket med optimala skärtemperatur (oktober) förening och markera orienteringen av hjärnan med hjälp luktloben som landmärke.
  6. Med hjälp av en kryostat, skär 70 mikron tjocka sektioner vid -20 ºC och placera demi kryoskyddande lösning (25% etylenglykol, 25% glycerol, i 0,05 M natriumfosfatbuffert, pH 7,4) och hålls vid -20 ° C fram till användning.
  7. Gör en lösning av 50% frysskyddsmedel och 50% metanol. Till denna lösning tillsätts 0,5% väteperoxid (vol / vol). Inkubera flytande sektioner i 30 minuter vid rumstemperatur.
  8. Varma sektioner i 37 ºC i TBS (Tris-saltlösning) under 30-40 minuter genom att placera dem i en histologisk ugn.
  9. Inkubera sektioner med 0,3% triton och 3% normalt hästserum under 45 min vid rumstemperatur före immunfärgning. Inkubera sektioner vid 4 ºC över natten i 3 ml lösning av DCX antikropp utspädd 1: 500 i TBS med 0,3% triton och 1% normalt hästserum.
  10. Följande dag tvätta sektionerna 3 gånger i rad i TBS (10 min vardera).
  11. Inkubera sektioner med en biotinylerad häst-anti-get (1: 200 i TBS) under två timmar vid rumstemperatur. Tvätta sektionerna 3 gånger i rad i TBS (10 min vardera).
  12. Inkubera tfåll med ABC Lite (1: 1000) under 1,5 h vid rumstemperatur.
  13. Lägg 5 pl av 30% H 2 O 2 till en tablett av 10 mg DAB (3,3 "-Diaminobenzidine) lösning upplöst i 15 ml av 1 M Tris-HCl (pH 7,6). Inkubera sektionerna omedelbart i denna lösning under 5 min.
  14. Avsluta reaktionen genom att tvätta dem med iskall TBS tre gånger följt av en tvätt i TBS vid rumstemperatur.
  15. Torka sektioner med hjälp av en serie av etanollösningar (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 min vardera), klar i xylen, och sedan täcka slip använder DPX som i steg 1.3.

3. Visualisering

  1. Efter fullständig torkning av sektionerna, ta bort överflödig DPX ovanpå bilderna med en vass kniv, och placera dem på skannings skede av mikroskop. Systemet består av ett mikroskop utrustat med avsökningssteget, styrspak och en färg 12-bitars kamera.
  2. Starta programmet. Öppna en ny datafil.
  3. Platsen referenspunkt på skärmen genom att klicka med musen på något ställe. Detta kommer att aktivera alla ikoner från verktygspanelen programfönstret.
  4. Klicka på "Joystick Free" -ikonen i verktygsfältet och sedan använda joysticken för att lokalisera gyrus dentatus i hippocampus i det första avsnittet.
  5. I "Verktyg" fliken i programfönstret, välj "Serial sektionschef". Klicka på "Ny avdelning" ikonen i det nedre vänstra hörnet av fönstret. Detta kommer att öppna "Serial Avsnitt Setup" fönstret.
  6. Välj fönstret Serial avsnitt Inställningar och sedan ange det totala antalet sektioner som innehåller hippocampus regioner. Välj utvärderingsintervallet. Ange avsnittet cut tjocklek (70 pm för DCX och 150 nm för Golgi-färgade snitt).
  7. Börja spåra gyrus dentatus regionen genom att klicka på "Freehand Contour Drawing" -ikonen i verktygsfältet. Disposition dentate granulat cellager. </ Li>
  8. Välj "100X" från menyn "Förstoring". Lägg en droppe immersionsolja på sektionen och växla målet att 100X. Leta gyrus granulat cellkroppar och dendriter enligt detta mål.
  9. Fokusera på en utvald neuron och klicka på "Neuron Tracing" ikonen i verktygsfältet. Trace omkretsen av gyrus granulat cellkroppen. När du är klar spårning, högerklicka och välj "Slutför Cell Body".
  10. Börja spåra dendriter manuellt i x, y och z riktningar och följ varje gren med styrspaken och z-motor ratten. Vid en förgrening eller trifurcation nod, väljer du respektive alternativ från rullgardinsmenyn vid högerklick. Spåra varje bransch som uppstår från dessa noder. Vid slutet av varje gren högerklicka och välj "Avsluta" från rullgardinsmenyn.
  11. Använda piltangent ikonerna i fönstret mjukvaran slumpmässigt välja en annan dentate granulat cell och följ samma procedur som described i steg 3,9-3,10. Spara hela spårning.
  12. Starta det neuronala spårning programvara.
  13. Öppna första NRX datafil från den första musen i försöksgruppen. Bifoga NRX-filen i den andra musen i försöksgruppen. Fortsätt tills alla NRX filer från denna grupp bifogas.
  14. Under fliken Analysis, välj "Fan In-diagram". Detta öppnar Fan I-analysen fönstret. Bock "dendriter" och klicka på Visa, som skildrar de längder och förgreningsmönster dendriter för denna grupp av möss (Figur 1).

4. EDFI

OBS: Denna metod möjliggör för användaren att snabbt registrera ett stort antal bilder genom z-axeln för varje fält och generera en 2D-bild som innehåller alla de fokuserade bildpunkter i hela z-axeln. Resultatet blir en sammansatt bild som innehåller alla fokuserade pixlar från insamlade bilder.

  1. Anslut mikroskopet till en digital kameran. Placera sektionerna först på skannings scenen ansluten till mikroskop och sedan byta till en 10X objektiv. Flytta scenen till området av intresse.
  2. Starta en video fånga program.
  3. Tryck på inspelningsknappen. Så snart inspelningsknappen trycks, använd makrofokus ratten för att flytta från toppen till botten av sektionen för totalt 4 sek. Spara den resulte videofil.
  4. Använd ImageJ freeware att konvertera AVI videofiler till ett okomprimerat format genom att öppna filen och spara dem i okomprimerat filformat.
  5. Starta ett bildanalysprogram och öppna AVI-fil. Gå till menyn "Process" och klicka på "Extended skärpedjup". Välj motsvarande videofilen. I "Output" alternativ, välj "Generera Composite Bäst-Focus Image".
  6. I "Fokus Analysis" alternativ, välj "Normaliserad Illumination" och "Max Local Kontrast" alternativ. Välj sedan "Creåt ". Den resulterande bilden representerar alla de fokuserade pixlar hela z-axeln (Figur 2).
  7. Spara den resulterande bilden.

5. Generera Extremt-Högupplösta bilder

OBS: Denna metod tillåter användaren att automatiskt generera låg förstoring och extremt högupplösta bilder från hög förstoring-högupplösta bilder på ett automatiserat sätt.

  1. Placera sektionerna först på avsökningssteget ansluten till mikroskopet. Mikroskopet är ansluten till en digital kamera. Flytta scenen till området av intresse.
  2. Starta en bild förvärv program.
  3. Använd ett 10X objektiv och förvärva och spara högupplösta (4076 x 3116) bilder från regionen av intresse att se till att ha minst 10% överlappning.
  4. Kör Bild Composite Editor för att sy bilderna.
  5. Gå till Arkiv-menyn och klicka på "Nytt Panorama". Välj den mapp som bilderna är stORed. Välj de bilder som tillhör samma region och tryck på "OK".
  6. Tryck på "Exportera till disk" och spara bilden. Denna bild är en extremt högupplöst bild av området av intresse som skulle kunna användas för analys och / eller demonstration (Figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Omfattningen av arborization härrör från bevarade och nyfödda dentate granulceller analyserades i möss av vildtyp med användning av antingen Golgi-Cox eller DCX färgning (figur 1). Dendritiska segment av DCX-positiva celler befanns vara 13-36 mikron långa. Den normala fördelningen av dendritiska längd testades med användning av Kolmogorov-Smirnov test (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001, fig 4 och 5).

I analysen av längden av segment per beställning av arborization var de längsta segment som finns i den första beställningen av arborization (38,38 + 1,45 um). Liknande mönster återfanns för ytan (111,98 + 3,93 kvadrat micron) och volym (27,93 + 1,03 kubik um). Den linjära korrelationen mellan längden på segmenten och ytarean och / eller volymen som upptas av dessa segment testades också. Både yta (p = 0,001, r 2 = 0,873) och volym (p = 0,001, r 2 = 0,621) correlated signifikant med längden på varje dendritiska segment.

Figur 1
Figur 1:. Här Fläktdiagram användes för att bedöma den dendritiska längd dentate granulat celler i hippocampus kan detta visualiseringsverktyg användas för att jämföra effekterna av olika terapeutiska ingrepp eller genotyper på dendritiska längd. Enheten mätningar är pm.

Figur 2
Figur 2: Visualisering av dendritisk arborization utan (A) och med EDFI (B) metoder. Den traditionella metoden för att hitta den bästa fokusplanet jämfördes med EDFI (data visas ej) och fann signifikant högre värden av dendritiska område med hjälp av EDFI metoden (p = 0,02). Scale bar= 100 pm.

Figur 3
Figur 3:. En högupplöst bild av hippocampus regionen i en mus Denna extremt högupplöst bild automatiskt konstruerad av sy 10 (4076 x 3116) -pixel bilder. Scale bar = 100 | im.

Figur 4
Figur 4:. Kvantifieringen av längd och volym som upptas av dendriter i olika order av förgrening maximala längd och volym uppnåddes i ordningen 1.

Figur 5
Figur 5:. Histogram av dendritisk längd dentate granulceller Majoriteten av dendritiska segment av DCX-färgade dendriter var 13-26 i längd. Den röda streckade linjen visar normalfördelning av de uppgifter som presenteras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här, var två metoder beskrivits för att kvantifiera omfattningen av dendritiska arborization i mogna och nyfödda nervceller med hjälp av konventionella färgningsmetoder i samband med RTI och EDFI. Erhållandet av högupplösta bilder av neuroner ger en extremt användbar metod för att testa de skadliga effekterna av neurodegenerativa störningar och, i sin tur, ger ett medel för att utvärdera terapeutiska strategier som riktar hippocampusneuroner.

Medan RTI-metoden användes för att fånga fördjupade uppgifter som hänför sig till omfattningen av arborization och topografi, misslyckas EDFI metod för att ge information som rör komplexiteten i enskilda segment eller träd. Ändå fördelarna med EDFI metoden ligger i det faktum att det inte kräver inköp av dyr hårdvara och är mindre tidskrävande.

En bildanalysprogram användes för att utföra EDFI i videofiler. Att ha tillgång till hög upplösning och snabbkameror möjliggör insamling av ett stort antal bilder i hela tjockleken på varje fält och genererar bilder som verkligen representerar x, y och z dimensioner. En nackdel med den EDFI metod avser det faktum att det kan finnas fler än en bildpunkt (samma x och y) fokuserade i olika plan i hela z-axeln. En metod är tänkt att tilldela olika färger till dessa pixlar exakt representerar omfattningen av 3D-profiler i 2D-bilder. Det bör noteras att EDFI metod också skulle kunna användas för analys av cellulära profiler (t.ex. synapser, mikroglia och astrocyter). Dessutom kan denna metod användas för att analysera omfattningen av microglial fördelning genom tjockleken på ett avsnitt 7. De två metoder som beskrivs här kan användas på ett kompletterande sätt. Medan RTI metoden ger exakt information om topografi förgrening mönster, ger EDFI oss en ganska enkel och skyndsam metod för att bedöma tätheten av dendriter i ett område med itresse. Noterbart är tjockleken av sektioner som kan förvärvas med EDFI är mycket varierande eftersom utbudet av z fokus på mikroskop scenen i kombination med optisk fokus för mikroskop mål diktera gränser EDFI.

De metoder som beskrivs häri har potential att sättas i flera sammanhang. I denna studie gav vi ett medel för att bedöma förändringar i dendritiska arborization före och efter intervention, medan EDFI användes för att kvantifiera microglial aktivering 7. Således är denna teknik mottaglig för alla tillämpningar där det slutliga målet är att bedöma förändringar i små profiler som kan hittas i flera lager.

Slutligen kan dessa tekniker vinna bristande tillgång till mycket hög upplösning och dyra digitalkameror. I huvudsak var en metod som visas på hur man fångar seriella bilder på olika punkter av platser inom ett prov och sedan sy ihop dem med hjälp av en freeware, slutligen yielding högupplösta bilder på ett sätt som är långt mer tillförlitlig och snabb än konventionella metoder.

Kritiska steg

Golgi-färgning

Arkiv kvantiteter Golgi och utveckla lösningar hålls vid 4 ° C under lagring och ändå färgnings och inkubationsbetingelser protokoll kräver lösningen som skall utnyttjas vid rumstemperatur. Kylning Golgi och utveckla lösningar på is eller i kylskåpet negativt påverkar kvaliteten på dendritiska färgning. Dessutom bör det noteras att vi använt snabb utveckling Golgi lösningar. Även om den exakta sammansättningen av Golgi-Cox-lösning som används i denna studie är patentskyddad, det finns flera källor som listan i detalj protokoll som kan användas för att utföra Golgi-Cox färgning 13. Dock kommer användningen av andra Golgi-lösningar avsevärt ändra färgning löptider och modifieringar för dessa steg bör göras i enlighet därmed. Också, vi tillsammans med andra har ossed 150 nm tjocka sektioner för att analysera DGC nervceller 14,15 eftersom det är allmänt överens om att skära delar av denna tjocklek koronalt och parallellt med gyrus granulat cell arborizations minimerar risken för skär dendritiska grenar.

DCX färgning

Den DCX färgningsprotokollet kräver särskild uppmärksamhet på temperatur. Underlåtenhet att upphetta lösningen till 37 ° C under förinkubationsperiod kommer att avsevärt försämra färgning och resultera i förlust av dendritisk visualisering. Dessutom uppmärksammar snittjocklek motiverad. I denna studie använde vi 70 nm tjocka sektioner för att fånga det yttersta av DGCs dendritiska arborization. Enligt vår erfarenhet är användningen av 0,3% triton en nödvändighet eftersom det väsentligt underlättar penetrering av antikroppen genom hela tjockleken av de flytande sektioner. I själva verket har tidigare studier använt triton att penetrera 70 ^ m tjock 16 eller ännu tjockare (120 nm) 17sektioner när label DGC Dendrites. Se Hussaini för fullständig information om DCX färgning 18.

Slutligen bör det noteras att alternativa open source-program (t.ex. flNeuronTool eller Simple_Neurite_Tracer) existera med möjlighet att spela in rörelse på scenen i x-, y- och z-riktningarna. Sådana program kan användas för dendritisk spårning så länge som de är i stånd att kommunicera med avsökningssteget.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Publicerings avgifter för denna artikel är sponsrade av MBF Bioscience.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Modified Golgi-cox staining solution  Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x) Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
30% Sucrose, Sigma CAS # 57-50-1 make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin Sigma CAS # 9000-70-8 NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) Sigma CAS 603-003-00-5 NA
Xylene Sigma CAS # 1330-20-7 NA
DPX Medium EMS  #13510 NA
Superfrost (+) white Electron Microscopy Sciences 71869-10 NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) VWR  #4811-703 NA
DCX Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-8066 4 C
DAB Sigma CAS Number 91-95-2   -20
OCT Tissue-tek 4583 NA
Tris Sigma CAS Number 77-86-1   NA
ABC Lite Vector PK4000 NA
Microscope Nikon Eclipse 80i
Digital Camera Nikon DS-Ri1
12 bit Camera  QImaging  01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System MBF Bioscience V.10
Image Composite Editor Microsoft 1.4.4.0
NIS Elements Nikon F 3.0
Image Pro Plus Mediacy Versin 7.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22, (3), 383-388 (2012).
  2. Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587, (4), 727-729 (2009).
  3. Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. Synapses and Alzheimer’s disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. a005777 (2012).
  4. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
  5. Huttenlocher, P. R. Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms. Neurology. 24, (3), 203-210 (1974).
  6. Marin-Padilla, M. Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study. Brain Res. 38, (1), 1-12 (1972).
  7. Dang, V., et al. Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome. Biol Psychiatry. 75, (3), 179-188 (2014).
  8. Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study. Coll Antropol. 35, (Suppl 1), 25-30 (2011).
  9. Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10, (1), 32-46 (2010).
  10. Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis. Anat Rec. 296, (9), 1364-1382 (2013).
  11. Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis. Cell Mol Life Sci. 70, (12), 2045-2057 (2013).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).
  13. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
  14. Juraska, J. M. Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus. Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).
  15. Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus. PLoS One. 6, (9), e24566 (2011).
  16. Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche. J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).
  17. Merz, K., Lie, D. C. Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice. PLoS One. 8, (5), e62693 (2013).
  18. Hussaini, S. M., et al. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. (78), (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats