Un dosage multi-détection pour moustiques vecteurs du paludisme

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Le complexe d'espèces Anopheles gambiae comprend le principal moustiques transmettent le paludisme en Afrique. Parce que ces espèces sont d'une telle importance médicale, plusieurs traits sont généralement caractérisés par des tests moléculaires pour aider dans les études épidémiologiques. Ces caractéristiques comprennent l'identification des espèces, la résistance aux insecticides, l'état de l'infection par le parasite, et de préférence d'hôte. Comme les populations du complexe Anopheles gambiae sont morphologiquement indiscernables, une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est traditionnellement utilisée pour identifier les espèces. Une fois l'espèce est connue, plusieurs essais sont régulièrement effectuées en aval pour élucider d'autres caractéristiques. Par exemple, des mutations connues sous le nom de KDR dans un gène par confèrent une résistance contre le DDT et les pyréthrinoïdes. En outre, les dosages d'enzyme-linked immunosorbent (ELISA) ou Plasmodium essais de PCR de détection de l'ADN du parasite sont utilisés pour détecter les parasites présents dans les tissus de moustiques. Enfin, une combination de la PCR et digestion de l'enzyme de restriction peut être utilisée pour élucider préférence de l'hôte (par exemple, humain contre le sang animal) par criblage de la farine de sang de moustique pour l'ADN spécifique à l'hôte. Nous avons développé un essai multi-détection (MDA) qui combine tous les tests mentionnés ci-dessus dans un seul multiplex 33SNPs réaction de génotypage pour 96 ou 384 échantillons à la fois. Parce que le MDA comprend de multiples marqueurs pour les espèces, Plasmodium détection, l'identification et de l'hôte dans le sang, la probabilité de générer des faux positifs ou négatifs est fortement réduite à partir de dosages précédentes comprenant un seul marqueur par trait. Ce test robuste et simple peut détecter ces traits de moustiques clés rentable et en une fraction du temps de tests existants.

Introduction

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii et Anopheles gambiae sont les principaux vecteurs responsables de la transmission du paludisme en Afrique 1. Ces trois espèces sont morphologiquement indiscernables 2 et ne peuvent être distingués par des analyses moléculaires 9.3. En outre, il existe de nombreux tests en aval régulièrement menées pour faciliter les études de génétique épidémiologique et de la population. Il se agit notamment (1) un test de génotypage pour les îles de spéciation 10-12, (2) un test de génotypage reconnaissant SNP non synonymes dans le 1014 ème acide aminé en position de codon du gène par (la résistance knock-down, ou KDR, SNP) 13 -18, (3) la détection des parasites PCR 19-23, et (4) le dépistage de l'ADN spécifique de l'hôte dans estomacs de moustiques 24,25.

Nous avons développé un essai multi-détection (MDA) qui combine tous ces essais dans une réaction multiplex unique avec l'objectif d'unealyzing caractéristiques épidémiologiques importantes de vecteurs du paludisme en Afrique. Le dosage MDA comprend plusieurs marqueurs de détection (1) espèce (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, ou autres (aucun des trois)), (2) la résistance aux insecticides représentés dans kdr SNP (deux L1014F et L1014S) , (3) la présence de deux grandes parasites du paludisme, Plasmodium falciparum et P. vivax, et (4) une source aviaire et six sang des hôtes mammifères.

Traditionnellement, ces essais ont été réalisés dans des réactions en chaîne par polymérase séparées. Lorsque tous ces essais sont effectués en utilisant une plate-forme PCR conventionnelle, il faut mener 8-10 dosages PCR de réaction et l'accompagnement des mesures d'électrophorèse en gel. Chaque réaction individuelle PCR de la préparation à la documentation des résultats prend 4-5 h, alors que la méthode MDA présenté ici prend environ 5 heures en totalité. Ceci est équivalent à un 90% d'économies sur les seuls coûts de main-d'œuvre. Le MDA présentée ici coûte 5 $par échantillon pour génotyper les 33 SNP. Ce est beaucoup moins cher que les tests à base de gel agarose simples, qui coûte environ 1,50 $ par échantillon. Dosages de détection toutes les caractéristiques couvertes par le MDA exigerait un minimum de 8 à 10 essais à base de gel agarose distincts à un coût de 12 à 15 $ par échantillon. En outre, le MDA diminue considérablement le risque de génération d'un faux positif ou négatif par l'utilisation d'au moins trois marqueurs pour chaque détection de parasite ou de la source hôte.

La plate-forme nous avons utilisé est pas limitée aux vecteurs du paludisme, mais peut être utilisé dans une grande variété d'applications telles que la médecine, de la médecine vétérinaire et de la biologie de base de 26 à 28. Des études approfondies d'association ou la génétique des populations études impliquant un grand nombre (dans l'ordre de 100s) des échantillons nécessitent des essais rentables dépistage de marqueurs multiples simultanément. La plupart des études qui utilisent deux ou plusieurs tests de PCR séparées puissent appliquer la MDA pour des résultats plus rapides à un coût moindre.

Protocol

1. Amplification par PCR

  1. Mélanger tous les amorces de PCR (Voir Tableau supplémentaire S1) dans un microtube de 1,5 ml. Chaque SNP a deux amorces (avant et arrière). Assurez-vous que la concentration de l'action de chaque amorce PCR est maintenue à 100 um. Faire assez mélange d'amorces pour les réactions 500-1000 pour réduire pipetage erreur et le temps sur le banc (Voir Tableau supplémentaire S2). Si vous le souhaitez, pour préparer des aliquotes de 100 à 200 réactions par tube et conserver à -20 ° C.
  2. Préparer cocktail de PCR tel que décrit dans le protocole du fabricant (tableau 1). Le volume de réaction 96 comprend un surplomb de 20%. Vortex le tube contenant le cocktail PCR légère et centrifuger pendant 30 secondes à 2000 x g.
  3. Distribuer 3 ul du cocktail PCR dans chaque puits d'une non-jupe plaque de 96 puits. Une pipette de répéteur peut gagner du temps pour ce processus.
  4. Ajouter 2 ul de l'ADN génomique appropriée de moustiques dans chaque puits.
    Note: Le processus d'obtention de l'ADN génomique de m tissus osquito (tête / thorax, l'abdomen ou corps entier) est décrite dans les autres littératures 29-32. Choisir un protocole d'extraction d'ADN appropriée pour différencier ceux avec Plasmodium dans le sang (abdomen) à partir de moustiques infectieux (Plasmodium dans la tête / thorax). Nous utilisons généralement l'ADN extrait des parties du corps (tête / thorax ou de l'abdomen) de moustiques, donc la concentration de l'ADN varie de 0.05-2ng / ul. Bien que l'entrée de l'ADN total est inférieur à la recommandation du constructeur (5-10ng / rxn), nous obtenons généralement robuste SNP appelle à partir de 98% des échantillons d'ADN sans amplification du génome entier.
  5. Sceller la plaque, mélanger délicatement ou vortex et centrifuger pendant 1 min à 370 x g.
  6. Utiliser le protocole de cyclage thermique suivant pour effectuer l'amplification par PCR: (1) 94 ° C pendant 2 min, (2) 94 ° C pendant 30 secondes, (3) 56 ° C pendant 30 secondes, (4) 72 ° C pendant 1 min (5) répéter l'étape (2) - (4) pendant 45 cycles, (6) 72 ° C pendant 1 min et 4 ° C en attente.
_title "> 2. Traitement SAP

  1. Préparer la solution d'enzyme SAP dans une plaque à 96 puits (voir le tableau 2). Traiter 96 échantillons en une plaque. Le volume de réaction 96 comprend un surplomb de 20%.
  2. Vortex le tube de solution enzymatique SAP légère et centrifuger pendant 30 secondes à 2000 x g. Distribuer 2 pi de la solution d'enzyme SAP dans chaque puits. Encore une fois, une pipette de répéteur peut gagner du temps pour ce processus.
  3. Sceller la plaque, mélanger délicatement ou vortex et centrifuger pendant 1 min à 370 x g. Incuber la plaque comme suit: (1) 37 ° C pendant 40 min, (2) 85 ° C pendant 5 minutes pour inactiver l'enzyme, (3) 4 ° C en attente. A l'achèvement de cette étape, la plaque stocker à -20 ° C avant de poursuivre. Traitement de la plaque stockée dans les 2 semaines.

3. SNP Extension

  1. Si la plaque d'échantillon est gelé après le traitement SAP, lui permettre de dégeler à la température ambiante avant de procéder.
  2. Préparer le mélange extension d'amorce (tableau supplémentaire S2). Chaque SNP a une exteamorce nsion. Maintenir la concentration de l'action de chaque amorce d'extension à 500 um. Eventuellement, aliquote de 100 à 200 réactions par tube et conserver à -20 ° C.
  3. Préparer prolongement mélange comme décrit dans le tableau 3. Le volume 96 de réaction comprend un surplomb de 20%.
  4. Vortex le tube de l'extension cocktail légère et centrifuger pendant 30 secondes à 2000 x g. Distribuer 2 pl du cocktail d'extension dans chaque puits. Encore une fois, une pipette de répéteur peut gagner du temps pour ce processus.
  5. Sceller la plaque, mélanger délicatement ou vortex et centrifuger pendant 1 min à 370 x g. Thermocycle la plaque, comme le montre la figure 1. À ce stade, procéder à la spectrométrie de masse ou de stocker la plaque à -20 ° C jusqu'à deux semaines.

4. Conditionnement du produit Extension SNP pour optimiser l'analyse de spectrométrie de masse

  1. Si la plaque d'échantillon est gelé après l'extension SNP, lui permettre de dégeler à la température ambiante avant de procéder.
  2. Transférer 15 mg de résine à partir de son contaINER sur la plaque en utilisant une cuillère fossette allongée. Utilisez le grattoir pour répandre la résine dans les puits de la plaque fossette. Balayer le racleur de gauche à droite à travers la plaque fossette de répandre la résine. Assurez-vous qu'il est de la résine dans chaque puits.
  3. Grattez l'excédent de résine de la plaque fossette d'utiliser le racloir. Laisser reposer la résine dans la coupelle de fossette pendant au moins 20 min. Tout en laissant reposer la résine dans la coupelle de fossette, ajouter 41 ul d'eau de qualité HPLC à chaque puits de la plaque d'échantillons.
  4. Placez délicatement la plaque d'échantillon à l'envers, sur la plaque fossette. Assurez-vous que les réinitialisations de plaques échantillons contre le petit poste arrondie de la plaque fossette, qui aligne les puits dans la plaque de l'échantillon avec les puits de la plaque fossette.
  5. Tenir la plaque de l'échantillon et la plaque fossette ensemble, retournez-les délicatement sur tant la résine se situe hors de la plaque fossette dans les puits de la plaque de l'échantillon. Appuyez sur la plaque fossette donc la résine tombe dans la plaque de l'échantillon. Assurez-vous que toute la résine dans le diplaque de mple tombe dans les puits de la plaque d'échantillon. Centrifuger la plaque à 3200 g pendant 30 sec.
  6. Faire tourner la plaque d'échantillons sur un agitateur pendant 5 min à température ambiante. Rotateur doit tourner la plaque d'échantillons 360 ° autour de l'axe de temps.
  7. Centrifuger la plaque d'échantillon à 3200 g pendant 5 min. Après cette étape, mémoriser la plaque d'échantillons à -20 ° C jusqu'à 2 semaines avant de procéder à l'étape suivante.

5. MALDI-TOF spectrométrie de masse

  1. Transférer le produit d'extension SNP conditionné sur un BioArray comme SpectroCHIP selon les instructions du fabricant. Nous utilisons MassARRAY Nanodispenser pour cette étape.
  2. Une fois le transfert terminé, définir comment essais et plaques doivent être mis en place dans la base de données de test. Nommez le dosage et les plaques de telle sorte que chaque plaque a identificateur unique qui relie à la conception de test spécifique (tableau supplémentaire S3).
  3. Après analyse et la plaque ont été définis, d'acquérir des spectres en utilisant un spectromètre de masse.

  1. Effectuer l'analyse des données en utilisant une analyse PCR logiciels d'interprétation de données en temps réel telles que typer Analyzer ou TyperViewer (Sequenom). Obtenir des données dans le format .xml qui contient la disposition de l'échantillon, spectrogramme de masse pour chaque puits, les informations de marqueur y compris le nom, la masse attendue pour chaque variante du SNP correspondant, et toute erreur ou des messages d'avertissement associés à chaque réaction. Voir Figure 2 pour le spectrogramme de masse résultante.
  2. Procéder à une analyse de clustering SNP génotype en fixant le seuil de détection (de magnitude ou rapport signal sur bruit) et la tolérance / variance autorisé pour chaque génotype. La figure 3 montre un exemple de 04707-KDR # 2 SNP grappes génotypiques.
  3. Exporter les appels résultant SNP génotype dans un tableur.

Representative Results

L'identification des espèces:

Les cinq SNP suivants ensemble identifient trois espèces (A. arabiensis, A. et A. gambiae coluzzii) (tableau 4). Si un échantillon ne est pas l'une des trois espèces, les trois SNP (01073-213, 04679-157 et 10313 -052) ne parviennent pas à amplifier.

kdr génotype pour déduire la résistance aux insecticides:

Le 1014 ème codon du canal sodique voltage-dépendant para correspond à KDR. Deux SNP sur le 2 ème et 3 ème base de la 1014 e codon déterminent les trois acides aminés possibles. . Les combinaisons possibles des génotypes sont énumérés dans le tableau 5 Ce SNP travaille pour trois espèces de vecteurs du paludisme en Afrique: A. arabiensis, A. et A. coluzzii gambiae. Ces SNP ne parviennent pas à se amplifier dans A. darlingi, un vecteur du paludisme brésilien. Ce ne est passurprenant étant donné que mitochondrial similarité de séquence du génome entre A. darlingi et A. gambiae ne est que de 88,9%, tandis que mitochondrial similarité de séquence du génome entre trois vecteurs du paludisme en Afrique sont plus de 98%. D'autres espèces ne ont pas été testés. Nous avons réussi à l'amplification des échantillons prélevés au Mali, le Cameroun, la Tanzanie et la Zambie.

détection de Plasmodium:

Si intacte Plasmodium ADN est présent dans le tissu de moustiques, nous nous attendons à détecter P. P. falciparum ou vivax ADN spécifique dans l'échantillon d'ADN extrait de moustique. Les espèces SNP spécifiques ont été identifiés à partir de l'alignement de séquence de la séquence du cytochrome b de 123 P. falciparum, P. 97 vivax, P. 11 malariae et 18 P. ovale isoler des séquences d'Afrique disponible sur GenBank. Nous avons conçu six SNP qui produisent génotypes uniques SNP de distinguer P. P. falciparum ou vi vax d'autres espèces de Plasmodium (tableau 6). Nous avons testé ce test sur des échantillons de moustiques collectés au Mali, le Cameroun, la Tanzanie, la Zambie et le Brésil et a confirmé que cet ensemble particulier de marqueurs fonctionne indépendamment des espèces de moustiques.

Farines de sang PCR de détection:

Cytochrome b séquences de sept espèces hôtes (humaines, poulet, vache, le chien, chèvre, porc et moutons) ont été recueillies auprès de Genbank et séquences consensus ont été générés. SNP informatifs pour chaque hôte ont ensuite été sélectionnés pour le génotypage. Nous avons testé ce avec des sources de 7 animaux différents (tableau 7) de sang.

Parce que des fragments PCR sont courtes (de 80 à 120 pb), cela fonctionne sur l'ADN peu dégradées ou repas de sang sur partiellement digérés de tissus de moustiques. La probabilité d'appels de faux positifs est considérablement réduit en ayant plusieurs marqueurs par type d'hôte.

s "> Figure 1
Figure 1. programme de thermocycleur pour SNP étape d'extension. Le cycle d'amplification est total de 200 (5x40).

Figure 2
Figure 2. spectrogramme de masse de la MDA. L'axe des X est la masse (Da) des produits d'extension SNP et l'axe Y est l'intensité du signal. Les lignes rouges indiquent la masse attendue de l'amorce non organisé Extension, SNP allèle 1 et 2 pour l'allèle marqueur sélectionné. Lignes grises indiquent devraient masse des autres marqueurs de la MDA. Cette parcelle est généré à partir du logiciel d'analyse de données (typer Analyzer ou typer Viewer) à partir du fichier de données de sortie après l'étape 5. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

e = "always"> Figure 3
Figure 3. individuelle SNP cluster de génotype voir L'axe X est la valeur arctangente (étiqueté comme «Angle») des intensités de signal de SNP allèle 1 et SNP allèle 2. L'axe des Y est l'ampleur du signal de génotype appel. Cette parcelle est fourni dans le logiciel d'analyse de données (Analyzer Typer ou typer Viewer). Toutes les données particulières peuvent être sélectionnés avec un clic d'un bouton de la souris et les données de l'échantillon sélectionné est indiqué par le cercle. analyse de la concentration prévue dans les pôles de logiciels génotypes avec un seuil de variance définie par l'utilisateur et les couleurs automatiquement trois génotypes d'un SNP biallélique. Exemple ci-contre montre homozygotes individus T (TT) que triangles bleus, hétérozygote (TA) sous forme de carrés verts et homozygotes individus A (AA) comme Orange inversé triangles. Les cercles rouges représentent Aucun appel (pas d'amplification).t = "_ blank"> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Réactif Concentration dans 5 ul Volume Volume
(1 RXN) (96) rxns
L'eau (qualité CLHP) N / A 0,8 pl 92,2 pi
PCR Buffer 10x avec 20 mM de MgCl2 1x (2 mM MgCl2) 0,5 ul 57,6 pi
MgCl2 (25 mM) ** 2 mM 0,4 pl 46,1 pi
dNTP mix (25 mM chacun) *** 500 pM 0,1 pl 11,5 pi
Mélange d'amorces (500 nM chacune) 100 nM 1,0 ul 115,2 pi
Enzyme PCR (5 UI / ul) 1,0 U / rxn 0,2 pl 23,0 pi
Volume total: 3,0 pl 345,6 pi

Tableau 1. Multiplex PCR cocktail recette. Le volume de chaque réactif pour l'étape d'extension pour une réaction de PCR et des réactions avec 96 une saillie 20%.

Volume total
Réactif Volume (1 rxn) Volume (96 RXN)
L'eau (qualité CLHP) 1,53 pi 176,3 pi
SAP Buffer (10x) 0,17 pi 19,6 pi
SAP enzyme (1,7 U / pl) 0,30 pi 34,6 pi
2,00 pi 230,4 pi

Tableau 2. solution d'enzyme SAP. Le volume de chaque réactif pour le traitement de crevettes pour la phosphatase alcaline et une réaction 96 réactions avec un surplomb de 20%.

Réactif Conc. En 9 ul Volume (1rxn) Volume (96 rxns)
L'eau (qualité CLHP) N / A 0,6190 pl 71,3 pi
iPLEX Buffer Plus (10x) 0.222x 0,2000 pl 23,0 pi
iPLEX Résiliation mélange 1x 0,2000 pl 23,0 pi
Primer Extension mélange 0,9400 pl 108.3 ul
iPLEX enzyme 1x 0,0410 pl 4,7 pl
Volume total 2,0000 pl 230,4 pi

Tableau 3. Extension SNP cocktail Le volume de chaque réactif pour l'étape d'extension SNP pour une réaction et 96 des réactions avec un surplomb de 20%.

Tableau 4
Tableau 4. génotypes SNP pour chaque espèce. 28S IGS-540, 28S IGS-649 et 01073 à 213 sont situés sur le chromosome X, 04679-157 est sur ​​le chromosome 2 et 10313-052 est sur ​​le chromosome 3. hybride génotype (hétérozygote) est surligné en jaune. Variante fixe dans A. coluzzii est marqué dans la variante bleu et fixe la lumière dans A. gambiae est marqué dans l'obscuritébleu.

Tableau 5
Tableau 5. génotypes SNP pour KDR. Deux SNP KDR N ° 1 et N ° 2 KDR constituent un génotype pour le 1014 ème codon du gène par. La première base est invariable de sorte qu'il ne est pas inclus dans l'essai. Génotypes homozygotes sensibles sont marquées en bleu. Le plus résistant L1014F homozygote génotype est marqué en bleu foncé. La couleur jaune indique hétérozygote. Le L1014 S, intermédiaire génotype résistant, est représentée en orange.

Tableau 6
Tableau 6. SNP génotypes de P. falciparum et P. vivax ong>. Total 6 SNP sont utilisés pour déterminer la présence de parasite du paludisme. PL-0041, PL-1269 et PL-1549 contiennent P. falciparum allèles spécifiques (G, T et T respectivement). Amplification simultanée des trois alleles indique la présence de relativement intact P. ADN falciparum dans l'ADN de l'échantillon. Amplification des alternatives allèles (A pour PL-0041 et PL-1269) indique la présence d'autres espèces de Plasmodium (par exemple, P. vivax, P. ovale ou P. malariae) dans l'échantillon. Pf-1549 se trouve dans les régions avec beaucoup plus P. spécifique falciparum régions adjacentes ainsi ce SNP ne est amplifié lorsque P. falciparum est présent. PL-0071, PL-1245 et PL-0157 contiennent P. vivax allèles spécifiques (G, G et T respectivement). L'amplification des allèles de remplacement (A, A et C, respectivement) indique la présence d'un autre ADN de Plasmodium dans l'échantillon. Moustiques non infectés ne auront aucune amplification sur les 6 marqueurs. Tableau 7
Tableau 7. génotypes SNP pour 7 hôtes:. Humain, poulet, vache, le chien, chèvre, porc et mouton "NC" est synonyme de "Pas de Call" (pas d'amplification) dans le tableau suivant. Notez que certains amplification non spécifique peut se produire à certains loci, mais pas pour tous les SNP d'un hôte particulier. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le MDA est composé de cinq étapes principales: amplification PCR, phosphatase alcaline de crevette (SAP) réaction, vulgarisation SNP, produit d'extension conditionnement et laser assistée par matrice de désorption / ionisation - temps de vol (MALDI-TOF) spectrométrie de masse 33-37. La première étape d'amplification PCR amplifie l'ADN flanquant chaque SNP sorte que l'ADN matrice assez sera disponible à l'étape d'extension SNP. La réaction de SAP neutralise dNTP non utilisées qui peuvent interférer avec l'étape d'extension SNP suivante. L'extension SNP implique une seule amorce d'extension par locus SNP et les nucléotides de terminaison de masse modifiée. Les nucleotides modifiés extrémité 3 'des nucléotides suivants empêchent d'être incorporé dans l'amorce d'extension. Ainsi, la masse de la base unique indique le génotype du SNP correspondant.

L'étape la plus critique pour assurer le succès de cette approche est d'avoir un bon jeu de données de polymorphismes existant dans l'organisme cibles. Nous avons utilisé SNP bien caractérisés pour l'identification des espèces (N> 900) 10,12,38-40 et KDR (N> 1000) 15,18. Les SNP spécifiques pour les espèces Plasmodium ont été identifiés à partir de l'alignement de séquences des séquences de cytochrome b 123 P. falciparum, P. 97 vivax, P. 11 malariae et 18 P. isoler ovale séquences d'Afrique qui étaient disponibles sur Genbank. Cytochrome b séquences de sept espèces hôtes (humaines, poulet, vache, le chien, chèvre, porc et moutons) ont été recueillies auprès de Genbank pour l'identification de SNP spécifique à l'hôte. Sur la base de ce vaste ensemble de données de séquences, nous avons pu concevoir un test de diagnostic robuste en utilisant un logiciel de concepteur de dosage.

Le nombre de marqueurs chaque réaction peut accueillir est déterminée par la compatibilité biochimique de l'amorce mélange donné une tolérance à l'amorce potentiel dimère (0,9 0-1 échelle). Auteurs utilisé la valeur par défaut (1; la plus stricte) pour le potentiel d'amorçage faux. Relaxation de ce paramètre peut potentiellement augmenter le nombre de SNP qui peuvent être dosés dans une seule réaction en plus du SNP inclus dans cette étude.

Les étapes d'amplification par PCR sont robustes et ne nécessitent généralement pas de réglage de la conception de l'essai initial. L'extension mélange SNP (tableau 3), cependant, peut nécessiter des modifications en quantité relative de chaque amorce en utilisant la spectrométrie de masse pour assurer un signal suffisant par rapport au bruit est réalisée pour chaque amorce. La recette fournie SNP extension d'amorce est le résultat de ces ajustements. Compatibilité entre les amorces d'extension peut limiter le nombre total de SNP qui peut être multiplex en une seule réaction. Etant donné que le volume de réaction est faible (5-8 ul), la plaque d'échantillons doit être correctement scellé pour empêcher l'évaporation au cours des étapes d'amplification.

Cette plate-forme peut marquer simultanément jusqu'à 35 SNP par réaction, tandis que d'autres plates-formes de génotypage SNP peuvent HÉBERGEMENTe plus de mille SNP par réaction 41. Avec les progrès de la technologie de séquençage du génome, on peut acquérir des millions de SNP en utilisant le séquençage de prochaine génération 29,42,43. Cependant, la technique utilisée ici fournit une application idéale pour les études qui nécessitent le génotypage d'un nombre relativement restreint de marqueurs pour de nombreux (100s-1,000s) personnes. Une discussion plus approfondie des contraintes de conception différente de la plate-forme de génotypage SNP est couvert dans les études précédentes 41.

Le MDA vise à caractériser les traits épidémiologiquement importants de vecteurs du paludisme et fournit un protocole idéal pour débit moyen SNP tests de génotypage analyse des milliers de moustiques collectés dans les populations naturelles. Le MDA est présenté ici (1) sur une réduction de 90% du temps de travail, (2) une réduction de 60% des coûts de réactifs, et (3) la réduction des faux positifs / négatifs en utilisant plusieurs marqueurs. Le dosage proposé peut renforcer par des études épidémiologiquesqui facilite grandement la collecte de données. En outre, il peut améliorer les études d'association pangénomique en caractérisant les échantillons de moustiques par rapport à l'origine de la population, la résistance aux insecticides, la sensibilité des parasites et le choix de l'hôte. Enfin, cette MDA peut servir d'inspiration et un modèle pour la conception d'autres essais multiplex en utilisant une plate-forme à base de génotypage SNP MALDI-TOF.

Acknowledgments

Nous remercions les Drs. Anthony Cornel et Laura Norris à l'UC Davis et le Dr Katharina Kreppel à l'Université de Glasgow pour fournir des spécimens de moustiques de la Tanzanie. Nous remercions Mme Smita Das et le Dr Douglas Norris de la Johns Hopkins School of Public Health de partager des échantillons de moustiques de la Zambie. Nous remercions également M. Lee V. Millon au Laboratoire de génétique vétérinaire de formation sur la conception de l'essai. Ce travail a été soutenu par l'Institut national de la santé et accorder R01AI 078183 R21AI062929.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
  2. Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
  3. Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
  4. Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
  5. Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
  6. Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
  7. Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
  8. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. (2013).
  9. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
  10. White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
  11. Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
  12. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
  13. Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
  14. Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
  15. Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
  16. Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
  17. Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
  18. Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
  19. Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
  20. Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
  21. Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
  22. Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
  23. Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
  24. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
  25. Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
  26. Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
  27. Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
  28. Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
  29. Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
  30. Methods in Anopheles Research. Second edition, MR4. Available from: http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx 1725-1732 (2010).
  31. Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
  32. Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
  33. Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. (2011).
  34. Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
  35. Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2, (Unit 2.12), (2009).
  36. Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
  37. Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
  38. Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
  39. Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
  40. Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
  41. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
  42. Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
  43. Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics