הדמיה ניגודיות בעכבר עוברים באמצעות תדר גבוהים אולטראסאונד

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להזריק סוכני אולטרסאונד ניגוד microbubble לחיים, עוברים עכברי שלב מאוחר-הריון מבודד. שיטה זו מאפשרת הלימוד של פרמטרים זלוף ושל סמנים מולקולריים של כלי דם בתוך העובר באמצעות הדמיה אולטרסאונד בתדר גבוה חומר ניגוד.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

ההדמיה אולטרסאונד contrast-enhanced עושה שימוש בחומרי ניגוד microbubble לדמיין ולאפיין את הסביבה של כלי הדם. סוכנים אלה מאפשרים הערכה לא פולשנית של זרימת הדם, כלי הדם ותפקוד לב וכלי דם. בנוסף, שינוי של פני השטח הבועה יכול לגרום microbubble ממוקד מחייב סמנים ביולוגיים אנדותל, כפי שהודגם ביישומים פרה-קליניים של אנגיוגנזה, טרשת עורקים ודלקת 1,2 עושים הדמיה אולטרסאונד מולקולרית של אירועי לב וכלי דם אפשריים. אולטרסאונד חומר ניגוד ולכן יכול לשמש כדי לזהות את הסביבות המורכבות ומגוונות המשפיעות על כלי דם בריאים ומדינות נגועות 3-5.

במספר האחרון של שנה, עניין בשירות של ההדמיה microbubble האריך למודל עובר עכבר תכליתי. כמודל להתפתחות יונקים, כניסתה של microbubbles לכלי הדם העוברי משפרת פיזיולוגית מחקר של מערכת הדם המתפתחת (זרימה למשל, דם, תפוקת לב) ובמקרים של מהונדס ומודלים של עכברים שעברו מוטציה ממוקדת של מחלות לב 6,7, עשוי להניב תובנות כיצד גנטי לשנות את תפקוד לב וכלי דם גורמים. למעשה, 2D כמותיים ואיכותי ניתוחים של כלי דם במוח עובריים כבר הושג 8. יתר על כן, את עובר העכבר מציג כמודל מצוין לבחינת המחייבת של microbubbles ממוקדת לסמני כלי דם in vivo. Bartelle et al. 9, למשל, הציג microbubbles avidin לתוך חדרי לב עובר להעריך ממוקדים מחייב בעוברים מהונדסים Biotag-בירה ולבחון האנטומיה של כלי דם. הדור של דגמי עכבר הטרוזיגוטיים והומוזיגוטים ניתן לשמש גם כתחליף ללימודי מודל גידול במטרה להגדיר את האופי הכמותי של אולטרסאונד המולקולרי - אמת מידה חשובה בתרגום בטכניקה זו למרפאת.

התחת = "jove_content"> microbubbles בתדירות הגבוהה ביותר הציג למחזור העוברי באמצעות זריקות תוך-לב לעוברי בודדים נחשפו דרך laparotomy 8-10. בזריקות ברחם, לעומת זאת, מתמודד עם מספר האתגרים. אלה כוללים הדרכת הזרקה, צורך לפעול נגד תנועה באמא ועובר exteriorized, תחזוקה של כדאיות hemodynamic באמא ועוברי exteriorized, פונים השפעות ארוכות הטווח של הרדמה וסיבוכים עקב דימום 11. לכן, המטרה של החקירה הייתה לפתח טכניקה להזרקת microbubbles לעוברי בשלב מאוחר חיים מבודדים 12. אפשרות זו מציעה יותר חופש במונחים של שליטת הזרקה ומיצוב, שחזור של מטוס ההדמיה ללא חסימה, וניתוח תמונה פשוט וכימות.

במחקר הנוכחי, אנו מתארים הליך חדשני להזרקה של microbubbles לעוברי עכבריים חיים for המטרות של לימוד התנהגות הקינטית microbubble ולימוד ממוקד microbubble מחייב סמני משטח אנדותל אנדוגני. הדמיה אולטרסאונד שאינו ליניארי ניגוד ספציפי משמשת למדידה של מספר הפרמטרים זלוף הבסיסיים כוללים שיפור שיא (PE), לשטוף-בשיעור ובזמן השיא (TTP) בעוברי E17.5 מבודדים. אנחנו גם מדגימים את תוקפו של מודל העובר להערכה כמותית של טבע אולטרסאונד המולקולרי באובדן endoglin עוברי של מודל עכבר מהונדס פונקציה, שבו endoglin הוא יעד רלוונטי מבחינה קלינית בשל הביטוי הגבוה שלה בתאי האנדותל של כלי דם באתרים של אנגיוגנזה הפעילה 13 . ההידבקות של שליטה (MB E), ממוקד endoglin אלוטיפ עכברוש IgG 2 (MB C) וmicrobubbles לא ממוקדת (MB U) מוערכת בendoglin הטרוזיגוטיים (Eng +/-) וendoglin הומוזיגוטים (Eng + / +) להביע עוברים. ניתוח של בינדי הממוקדng מגלה כי אולטרסאונד המולקולרי הוא מסוגל להבדיל בין גנוטיפים endoglin ונוגעים צפיפות קולטני לרמות אולטרסאונד מולקולריות לכימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הפרוצדורות שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים בSunnybrook מכון מחקר (טורונטו, אונטריו, קנדה). נהלים לטיפול ההומני לבעלי החיים חייבים להיות נצפו בכל העת. הנחה היא שהחוקר מיומן בפעולה הבסיסית של מערכת הדמיה אולטרסאונד. פרוטוקול זה עובד הכי טוב עם שני אנשים.

1. מודלים בבעלי חיים

  1. זכר CD-1 Mate ומאסכאלאס נקבה להשיג עוברי סוג בר ללימודי זלוף.
  2. לבדיקות הדמיה מולקולריות, ליצור עכברי +/- Eng ידי רקומבינציה ההומולוגית באמצעות תאי גזע עובריים של 129 המוצא / Ola כפי שתואר על ידי et al Bourdeau. 14.
    1. עכברי ההכלאה לאחור B6- +/- אנג, שנרכשו באדיבותו של ד"ר מישל Letarte, על הרקע CD-1. CD-1 +/- השימוש Eng עוברי backcrossed, כמו גם Eng + / + שיתוף littermatentrols. Mate העכברים לייצר עוברים מבוימים.

2. ניסיוני הכנה

  1. ליזום הזדווגות של עכברים ולבדוק תקעים יומיים. יום עוברי 0.5 מוגדר כבצהרים ביום תוסף נרתיק הוא ציין.
  2. הכן תקשורת עובר על ידי הוספת 50 מיליליטר של סרום שור עוברי, 5 מיליליטר של 1 M HEPES ו -5 מיליליטר של פניצילין, סטרפטומיצין (פניצילין 10,000 יחידות, 10,000 מיקרוגרם סטרפטומיצין) 500 מיליליטר הבינוני של הנשר (DMEM) עם גלוקוז גבוה שונה Dulbecco (4,500 מ"ג / L). לעטוף את הבקבוק בנייר כסף ולשמור צוננים על 4 מעלות צלזיוס.
  3. ג'ל צנטריפוגה ברור אולטרסאונד בצינורות חרוטי 50 מיליליטר ב 140 XG במשך 20 דקות. צייר ג 'עד ל -30 מיליליטר מזרקים. מלא 30 מיליליטר מזרקים עם ופר פוספט (PBS) ומניחים בצד (מסומנים) נוספים. המלטה אחת של עוברים בדרך כלל תדרוש בין 2-3 מזרקים של ג'ל אולטרסאונד ו- 4 מזרקים של PBS.
  4. משוך כ -30 מחטי זכוכית ובעדינות להדק לרצועה של פלסטלינהבצלחת תרבית תאי 100 x 20 מ"מ. הדבר מבטיח כי המחטים מופרדות ובטוחה במהלך טיפול. באמצעות חולץ זכוכית, השתמש בהגדרות הבאות על 1 x 90 מ"מ זכוכית נימים עם נימה: דוד 77, מגנט Sub 55, מגנט ראשי 70.
  5. הכן 11:50 צלחות דיסקציה (מספיק כדי להבטיח שכל עובר בהמלטה תקבל מנה משלו), באמצעות יחס של 1: 8 נפח של סוכן ריפוי לבסיס. יוצקים 40 מיליליטר של בסיס לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. הוסף סוכן ריפוי 5-6 מ"ל ומערבבים עם מקל עץ.
    1. יוצקים לתוך 60 x 15 מנות תרבות מ"מ, מילוי כל כלמחצית. בואו O הדוכן / N להגדיר.
  6. צרף luers הנשי לחתיכות ארוכות 400 מ"מ של פוליוויניל כלוריד (PVC) צינור (קוטר פנימי: 0.79 מ"מ). צינורות חייבים להגיע ממשאבת המזרק לבמה אולטרסאונד בנוחות.

3. ניסיוני Set-up

  1. מסדרים את פלטפורמת ההדמיה תחת מיקרוסקופ הניתוחי עם מנוע 3D ומערך ליניארי 21 MHמתמר z.
    1. אוריינט הפלטפורמה, כך שרכבת הר הוא בצד השמאל, עם הבמה ממוקמת ישירות מתחת למיקרוסקופ.
    2. צרף את מנוע 3D לכדור המשותף של זרוע הארכה של הפלטפורמה. לדפוק את ההודעה השחרור מהירה של המהדק מתמר לשחרור מהיר לעלות על הרכב, פונה קדימה, ומקם את הראש מתמר במהדק, מהדק את התפס.
    3. לאבטח את המחבר מתמר בנמל הפעיל בלוח הקדמי של העגלה. הדלק את המכשיר.
  2. ליזום מתמר אולטרסאונד 21 MHz, בחירת ההגדרה 'קרדיולוגיה' לבדיקות הדמיה מולקולריות, ו'כללי 'ללימודי זלוף. להעביר את כל המחוונים בזמן עלייה-פיצוי למצב האמצעי המדויק. עבור 'מצב ניגודיות', להגדיר את הפרמטרים הבאים: התדירות: 18 MHz, לשדר עוצמה: 4%, (0.39 MPA), השוו את רווח: 30 dB, מוקדים: 6 & 10 מ"מ, השווה מצב: לא לינארית זמן פרץ,: 100% 0.1רוחב שניות, Beam: Wide.
  3. תקשורת Aliquot 40 מיליליטר עובר כל לארבעה 50 מיליליטר צינורות חרוטי. מניחים על קרח.
  4. מחממים 1 ליטר של מים בכוס 2 L על פלטה חשמלית. לשמור על 45 מעלות צלזיוס. להוסיף מזרק אחד ג'ל אולטרסאונד וPBS לכוס למחממת. לשמור על טמפרטורה זו על ידי ניטור עם מדחום בכל העת.
  5. מניח בצד 11:50 1 מיליליטר מזרקים ו11:50 21 מחטי G לזריקה של microbubbles.

4. נוהל כירורגי

הערה: יש לך עוזר להכין את הבועות (שלב 5) ואילו המנתח מתחיל את ההליך כירורגי. הפרוטוקול המתואר כאן הותאם מויטלי et al. 15

  1. לאסוף E16.5 או E17.5 עובר מנקבת העכבר בהריון הבא נקע בצוואר הרחם.
    הערה: ההשפעות של הרדמה על עוברים עדיין לא נחקרו בפירוט 16. שיטות נוספות, כוללים עריפת ראש, עשויות להיות op המתאיםמשא ולהקרבה של העכברים בהריון.
    1. גזור לפתוח את הבטן כדי לחשוף את הרחם ועוברים. בזהירות ובמהירות להסיר את הרחם על ידי חיתוך בטיפים של קרן הרחם (ניתוק כלי השחלות ורחם) וניתוק בנרתיק ובשלפוחית ​​השתן.
    2. בעזרת מלקחיים קיסם, להעביר את הרחם לצינור של 40 מיליליטר של תקשורת עובר קר כקרח מהר ככל האפשר מבלי לפגוע בעוברים. מחק את פגר העכבר.
  2. לעבור למיקרוסקופ ושלב. להפקיד את הרחם לתוך צלחת תרבית תאי 100 x 20 מ"מ. העבר את הרחם לתוך צלחת חדשה מלאות ב50 מיליליטר תקשורת עובר טרי.
  3. באמצעות מעוקר (70% תרסיס אתנול) מלקחיים עדינים, בעדינות לקרוע ולמשוך משם הקרומים החיצוניים של הרחם מתחיל בקצה אחד. לחשוף את decidua השליה, שק חלמון הקודקודית והקרום של רייכרט להפריד ולהסיר מצק החלמון הקרביים הבסיסי.
  4. לנתח את העוברים אחד אחד, שמירה על y הקרבייםשקי olk שלמים וטיפול בשליה בעדינות ככל האפשר 17. תשמור על עצמך, כדי למנוע קרע של שק החלמון כעוברים קופצים החוצה מייד.
    1. השתמש בכף המחוררת להעביר את העוברים למנה אחרת שמרה על קרח עם תקשורת עובר טרי. שמור את העוברים מקוררים עד צורך. לשנות את התקשורת בצלחת העובר כל שעה 1-1.5. בתנאים אלה הם עוברים קיימא עבור עד 4 שעות לאחר ניתוח.

5. Microbubble הכנה

הערה: בצע הדמיה מולקולרית עם אולטרסאונד בשתי microbubbles ממוקדת ולא ממוקד. ניסוי בודד יכול לדרוש כמה שרק 3 בקבוקונים נפרדים של microbubbles: microbubbles i) microbubbles נוגדן ממוקד, ii) נוגדן אלוטיפ שליטה ממוקדת וiii) microbubbles לא ממוקדת. חומר הניגוד מגיע כאבקה יבשה-הקפאה וחייב לעבור תהליך עם מי מלח לפני ההזרקה. יש ~ 2 x 10 9 microbubbles בכל microb לא ממוקדבקבוקון ubble ו~ 8.8 x 10 8 microbubbles בבקבוקונים מוכנים היעד. Microbubbles יציבה לתקופה של עד 3 שעות לאחר הכינון מחדש.

  1. כינונה מחדש של בקבוקים מוכנים יעד
    הערה: דוגמאות להכנות מוכנות יעד: microbubbles endoglin ממוקדת (MB E, עם עכברוש biotinylated MJ נוגדן 7/18 לendoglin עכבר; במתקן hybridoma בית); קולט כלי דם פקטור הגדילה של אנדותל 2 (VEGFR2) microbubbles ממוקדת (MB V, עם אנטי עכבר CD309 ביוטין); microbubbles ממוקדת נוגדני IgG שליטת 2 אלוטיפ חולדה (MB C, אלוטיפ עכברוש ביוטין IgG 2 שליטת מיקוד IgG2a עכבר).
    1. לדלל את פתרון הנוגדן (20 מיקרוגרם) לתוך 1 מיליליטר (נפח סופי) של תמיסת מלח. שמור על קרח.
    2. מלא מזרק עם מי מלח 1 מיליליטר, הסרת כל בועות האוויר. חיבור מחט G 21, להזריק את הפתרון באיטיות לתוך בקבוקון microbubble.
    3. לאט לאט למשוך את הבוכנה, הסרת 1 מיליליטר של אוויר, ולמשוך את המחט. בעדינותלהתסיס. לתת לעמוד 5 דקות על קרח.
      הערה: ניתן להשמיד microbubbles אולטראסאונד תחת סביבות בלחץ גבוה.
    4. אחרי הזמן שחלף, למלא מזרק חדש עם דילול הנוגדן ולהוסיף לבקבוקון המתאים. בעדינות להתסיס. תן לתערובת (2 עכשיו מיליליטר) לעמוד במשך 10 דקות. שמור על קרח. בהנחת נטיית משטח מלאה, מספר יגנד הכרוך הממוצע לmicrobubbles הוא כ 18 7,600 ligands / מיקרומטר 2.
  2. כינונה מחדש של בקבוקים לא ממוקדים
    1. מלא מזרק עם מי מלח 1 מיליליטר, הסרת כל בועות האוויר. חיבור מחט G 21, להזריק את הפתרון באיטיות לתוך בקבוקון microbubble.
    2. לאט לאט למשוך את הבוכנה, הסרת 1 מיליליטר של אוויר, ולמשוך את המחט. בעדינות להתסיס. בואו לעמוד 5 דקות. להוסיף מלח 1 מיליליטר נוסף, כפי שתואר לעיל. בעדינות להתסיס ולתת לעמוד 10 דקות על קרח.
  3. ספירת קולטר
    1. בעדינות להתסיס את בקבוקון microbubble הרצוי ולצייר ~50 μl של הפתרון לתוך מזרק 1 מיליליטר באמצעות מחט 21 G. להזריק את microbubbles לתוך צינור microcentrifuge 2 מיליליטר ריק.
    2. פיפטה מדגם 10 μl של פתרון מניות microbubble לתוך 10 מיליליטר של מדלל.
    3. לאחר ערבוב עדין, להעריך את הפצות ריכוז וגודל אוכלוסיית microbubble באמצעות ספירת קולטר (ראה רשימה של חומרים). רוזן מינימום של שלוש 50 מדידות μl (לדגימה בקבוקון) באמצעות צמצם 30 מיקרומטר.
  4. Microbubbles מתכוננת להזרקה
    הערה: העוזר מבצע צעד זה כאשר "הזרקה של microbubbles לעוברי" (שלב 6) החלה. כל עובר מוזרק פעם אחת, עם הסוג של microbubble נבחר לכל זריקה שנבחר באופן אקראי על ידי העוזר כך שכל סוגי microbubble מופצים באופן שווה לאורך כל ההליך אבל בהתחשב בסדר אקראי. ודא המנתח הוא עיוור לסוג של בועה שהוזרק.
    1. לקבוע הדואר נפח של פתרון בועת המניות הנדרשים כדי לייצר ריכוז סופי של 1 x 10 8 MB ​​/ מיליליטר בנפח של 400 μl (לחשב את עוצמת הקול באמצעות הריכוזים שנמדדו בבורסת 5.3.3). Aliquot הנפח המתאים של תמיסת מלח לתוך צינור microcentrifuge ריק.
    2. בעדינות להתסיס את בקבוקון microbubble נבחר ולצייר נפח עודף (~ 50 μl גדול יותר מזה שחושב לעיל) של הפתרון לתוך מזרק 1 מיליליטר באמצעות מחט 21 G. להזריק את microbubbles לתוך צינור microcentrifuge ריק.
    3. פיפטה הנפח ההכרחי של פתרון מניות microbubble ולהוסיף לaliquot של תמיסת מלח. מערבבים על ידי ערבוב בעדינות עם הקצה של פיפטה.
    4. צייר את פתרון microbubble המדולל לתוך מזרק נקי באמצעות מחט 21 G. הסרת המחט, לחסל את כל בועות אוויר מהמזרק ולצרף luer וצינורות. לאט לאט לדחוף את הפתרון לסוף עשיית צינורות בטוח שלא ליצור בועות אוויר.
    5. הכנס את syringe למשאבת עירוי מזרק מוגדר לוותר microbubbles בשיעור של 20 μl / min להיקף כולל של 20 μl. צרף מחט זכוכית משך לסוף הצינור. הזז את המשאבה הקרובה לבמה ההזרקה.

6. הזרקה של microbubbles לעוברי

  1. באופן אקראי לבחור ולהסיר (עם כף מחוררת) עובר אחד מצלחת התקשורת מצוננת. מניחים בצלחת לנתיחה ממוקמת על הבמה אולטרסאונד תחת stereoscope ולהסיר את שק החלמון וקרומים מי שפיר עם המלקחיים העדינים, חיתוך / קורע מהצד שמופיע לפחות כלי דם (צד antimesometrial). זו מושגת בקלות על ידי פירסינג אזור סמוך לאזור הראש.
    1. לחתוך מספיק כדי להסיר את העובר מבפנים, אך לא יותר. לייצב את המנות לנתיחה באמצעות חתיכות קטנות של פלסטלינה.
  2. בעדינות לתמרן את השק מסביב העובר. מקם את העובר בצד שלה, עם השליה וכלי טבור בחזית. באמצעות סיכות חרקים, להצמיד את שק החלמון (4 סיכות מומלצת) וקצוות של השליה כנדרשת כדי להדביק במקום. הימנע מכולים גדולים.
  3. לשטוף את העובר עם מראש חימם 45 ° C PBS עד העובר מחיה. זהה את וריד הטבור ורשת כלי הדם הקשורים אליו. מקם את הצלחת כך שההזרקה ניתן לעשות בנוחות.
    הערה: ברגע שחמם, דם בעובר יתחיל לזרום, בעליל שאיבה בעורק הטבור. כאשר הזרימה מתחילה ראשונה, הוורידים יהיו בצבע אדום בוהק, עם הדם בשני כלי המופיעים במהירות זהה. הסניפים הנובעים מוריד הטבור בדרך כלל כיסוי אלה מעורק הטבור על פני השטח השליה.
  4. ברגע שהעובר שהחיה, לכסות אותו (אך לא את השליה) עם ג'ל ארה"ב המחומם מראש, להיות בטוח כדי להסיר בעדינות את כל בועות אוויר (באמצעות המלקחיים העדינים) מסביב העובר. למעלה מעלה את המנה עם PBS המחומם מראש.
    הערה: שים עין על הרמה של solutiבמזרקי PBS וג'ל ולהוסיף מזרקים גיבוי לכוס החימום בהתאם לצורך.
  5. הר מחט הזכוכית על כדור גדול של פלסטלינה בקצה הצלחת לנתיחה והכנס את קצה המחט לתוך PBS. בחירת וריד על פני השטח כוריוני של דיסק השליה, כרחוק מהסניף הראשי סביר, חתוך את הקצה לגודל באמצעות מספריים. הזרקה היא הקלה ביותר אם הקצה הוא לחתוך בזווית קלה. הסר את כל קצוות משוננים של הזכוכית באמצעות הקצה של המספריים באביב.
  6. באמצעות משאבת המזרק, להזריק לאט פתרון microbubble ב 20 μl / min לתוך מחט הזכוכית עד שכל האוויר שגורש מקצה המחט וניתן לראות microbubbles לזרום בחופשיות לתוך PBS. עצור את המשאבה ולאפס עבור נפח הזרקה של 20 μl. אל תאפשר לאוויר להיכנס למערכת כלי הדם של העובר במהלך הזרקה.
  7. הכנס את קצה מחט זכוכית בעדינות לתוך אחד הוורידים בשליה ולהבטיח שהוא נייח. תחבוט stereראש oscope ומיקום מתמר מעל העובר. ליזום הדמיה.

7. אולטראסאונד הדמיה מולקולרית

הערה: שימוש בתנאי ההדמיה קוי הניגוד שנקבעו בעבר, מקם את המתמר כדי שהעובר נמצא באופן שווה בין המוקדים בשעה 6 ו 10 מ"מ. ברגע שהמיקום, להתחיל את הזרקת בולוס של microbubbles. כאשר ההזרקה היא מלאה, להפעיל את הטיימר.

  1. זלוף הדמיה
    1. ודא שהמספר המרבי של מסגרות למצב ניגוד ליניארית נבחר על ידי לחיצה על הכפתור "ניהול מחקר 'ולחיצה על הכרטיסייה' Prefs 'בחלק העליון של דפדפן המחקר. סמן את התיבה המתאימה בחלון 'העדפות'.
    2. התאם את הגדרות הדמיה על ידי ייזום הדמיה קוי. לחץ על הכפתור 'מצב ניגודיות' בלוח הבקרה. לחדד את רווח 2D על ידי התאמת הרווח & #8217; החיוג ל -30 dB, להפחית את הכח 4% באמצעות 'הכח' לחייג, להקטין את התדירות להרץ 1 באמצעות "התדר" לחייג ולהגדיר את רוחב האלומה (פינה השמאלית תחתונה) לרחב באמצעות גלגלת הכדור / העכבר.
      הערה: כל הפקדים נמצאים בלוח הבקרה של מערכת אולטרסאונד.
    3. ללכוד את כל שטיפה-ובפיזור של בולוס microbubble על ידי הקלטת cine לולאת 20 דקות בקצב פריימים של 1 הרץ. סריקה / הקפאה לחץ כדי להתחיל את רכישת נתונים.
    4. ברגע שהרצף המלא של תמונות כבר נתפס, לחץ על הכפתור 'חנות cine' ממוקם בלוח הבקרה לשמירת הרצף של תמונות במאגר המערכת. המערכת יוצרת לולאת cine-חותמת תאריך של נתוני מודל הניגוד ליניארית רכשו.
  2. ההדמיה Microbubble ממוקדת
    1. תחת 'Prefs', קבע את זמן פרץ 0.1 שניות. הגדר את הפרמטרים ההדמיה המתאימים באמצעות הפקדים described לעיל (7.1.2.).
    2. ליזום הדמיה ניגוד ליניארית על ידי לחיצה על הכפתור "מצב ניגודיות 'בלוח הבקרה. להבטיח את העובר ממוקם כראוי תחת מתמר ושזרימת חומר ניגוד microbubble של דרך את העובר נראית בתמונה מצב ניגודיות קוי.
    3. כדי להעריך microbubble ממוקד מחייב במהלך בדיקות הדמיה מולקולריות עוברית, לאפשר microbubbles לזרום באין מפריעה במשך 3 דקות ו -40 שניות לאחר השלמת ההזרקה. הפעם הוא לאפשר שמירה של microbubbles במחזור. 'הסריקה / הקפאה "לחץ כדי לעצור הדמיה בתקופה זו.
    4. בדקות 3 ו -40 שניות, הדמיה קורות חיים כדי לוודא שהעובר עדיין גלוי, מכוסה כראוי עם PBS, ושmicrobubbles תמשיך לזרום. 'הסריקה / הקפאה "לחץ כדי ליזום הדמיה.
    5. לרכוש את רצף שיבוש / חידוש שבלאחר הזרקה 3 דקות ו -50 שניות על ידי הקלטה מראש בהרס 'רצף 'tion אקוסטית תגובה ב -29 הרץ. 'הסריקה / הקפאה "כדי להתחיל ברכישת נתונים. בהודעת הזרקת 4 דקות 18,19, ליזום פרץ אקוסטי בתדירות גבוהה 0.1 שניות. לחץ על כפתור 'הפרץ "ליישם פרץ.
    6. תמשיך להקליט מסגרות לשארית הרצף (עד קו החיץ מלא) ולשמור את cine הלולאה על ידי לחיצה על "חנות cine".
    7. לאסוף cine לולאה נוספת של מחזור microbubbles. רצף זה שלאחר מכן "לאחר ההרס" הדמיה הנחה הוא להכיל אותות בועה במחזור רק שמלאו את הקורה. 'הסריקה / הקפאה "לחץ כדי ליזום הדמיה ו'חנות cine' כדי לאסוף את התמונות.
    8. תווית לולאות cine לאחר ההדמיה כל עובר. "ניהול המחקר 'לחץ, סמן את הקובץ באמצעות מכבש הכדור ו'בחר' כפתור," תווית תמונה "עיתונות ושם כראוי.

    8. טיפול בעוברים לאחר הזרקה

    1. הדמיה הודעה, להעביר את המתמר, להוציא סיכת העובר ולהרדים (באמצעות עריפת ראש, נקע בצוואר הרחם, מחנק פחמן דו חמצני, או הרדמה ואחרי הקפאה או קיבעון מהיר) כרצוי.
    2. לכל זריקת עובר לאחר מכן יש להשתמש בקטע צלחת לנתיחה, מחט, מזרק וצינורות טרי, עם הכנה של המנה הבאה של מקום לקיחת פתרון הזרקת microbubble במהלך נתיחה ותחייה.
    3. להציל את דגימות רקמה (למשל, זנב, מוח) לניתוחים נוספים (למשל, גנוטיפ נקבע על ידי ניתוח PCR של DNA המבודד זנב, מכתים lacZ, או אמצעים חצי כמותית של ביטוי סמן ביולוגי באמצעות כתמים מערביים 21).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההזרקה של חומר הניגוד אולטרסאונד לעוברי עכבר לשעבר הרחם תלויה בבידוד המוצלח של חיים, עובר שלב מאוחר של הריון מהרחם והתחזוקה של כדאיות במהלך ההזרקה וההדמיה אולטרסאונד בנושא. ברגע שהעובר כבר exteriorized ואת מיקומו, כפי שמוצג באיור 1, הזרקה זהירה של חומר ניגוד לתוך כלי הדם העובריים היא אפשרית. תמונת אולטרסאונד B-מצב אופיינית לעובר עכבר E17.5 מוצגת באיור 2 א. לשטוף בשל microbubbles ושיפור מקביל בווריד הנבוב הנחות, הלב, המוח, ובכל בעל החיים יכולים להיות שנתפסו באמצעות שיטות הדמיה הניגוד ליניארית, ובכך הוכיחו את ההיתכנות של טכניקה זו. נקודות זמן בודדות מתוארות באיור 2 ולהראות את השינוי בניגוד לאורך זמן.

על ידי O הקלטה כל השטיפה-ובלשטוף החוצהf בולוס microbubble, ניתן למדוד פרמטרים זלוף שונים. בניתוח מצב לא מקוון, כלי עקבות אזור הניגוד שימש ליצירת 1.5 מ"מ 2 אזורים של עניין (ROI) באונות מוח ימין ועל שמאל העוברית. עוצמת האות הממוצעת בתוך ROIs אלה הייתה אז להתוות כפונקציה של זמן ומוחלק תוך שימוש במסנן חציון שבע נקודות. מעקומת וכתוצאה מעוצמת הניגוד (שמוצג באיור 2 ג), שיפור שיא המוח נקבע. שיעור השטיפה-ב, מוגדר כמדרון בין 10% ל 50% משיפור השיא המרבי (PE), גם חושב. לבסוף, זמן השיא (TTP) חושבו ממועד תחילת שיפור האות לזמן השיא. הבדלים בפרמטרי זלוף ממוצעים על פני סוגים שונים בועה נבדקו באמצעות מבחני t נפרדים 12. תוצאות אלו, שמסוכמות בטבלה 1, מראות כי ההזרקה של microbubbles מספקת valuשיטה מסוגלת לבירור פרמטרים חשובים זלוף בעכבר התפתחותית.

מבוא של microbubbles לכלי הדם העוברי מאפשר גם שימוש בעוברי עכבר כמערכות מודל להגדיר ולאפיין את היכולות הכמותיות של ההדמיה אולטרסאונד המולקולרית. בדוגמא הבאה, הפסד של מודל פונקציה, שבו מניפולציה גנטית שנוצרה דפוסי ביטוי הטרוזיגוטיים והומוזיגוטים של endoglin בעוברי עכברים, היה בשימוש על מנת לבחון את היכולת של הדמיה אולטרסאונד המולקולרית להבחין בין גנוטיפים. לאחר הזרקה ויישום של הדמיה הרס / חידוש microbubble, היחס של עוצמת האות הממוצעת של "טרום-ההרס" לרצפים "פוסט הרס 'שימש לייצור אמצעי של האות המולקולרית נקרא הניגוד מתכוון יחס כוח (CMPR ). מודל ליניארי מעורב (עם התאמות Bonferroni עשו להשוואות מרובות) בוצע כדי לברר w hether היה כל הבדל משמעותי בין endoglin ממוקד, שליטה וmicrobubble לא ממוקד מחייב Eng + / + או עוברי +/- Eng (לאחר הזרקה מזוהות באמצעות תגובת השרשרת של פולימראז (PCR) של דגימות זנב). אמצעי CMPR המוערך (ממוצע ± 95% מרווח ביטחון (CI)) מוצגים לכל סוג microbubble ועובר באיור 3 ומסוכמים בטבלה 2.

ממצאים אלה מספקים הפגנת בטון שהזרקה של חומר ניגוד אולטרסאונד בעוברי חיים מבודדים יכולה להיות מושגת. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר ההערכה של פרמטרים זלוף וניתן להשתמש בי להשוות microbubble הממוקד מחייב בדגמי עובר של מחלת כלי דם במאמץ על מנת להבהיר את היכולות של ההדמיה אולטרסאונד המולקולרית.

.jpg "/>
איור 1. ניסיוני הגדרה להזרקה של microbubbles לעוברי מבודדים. מתמר מערך ליניארי 21 MHz ממוקם מעל עובר E16.5 החיים exteriorized כפתרון microbubble 20 μl מוזרק לוריד שליה באמצעות צינורית זכוכית. בר סולם = 10 מ"מ. מDenbeigh, JM et al. 12 ברשות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. אולטראסאונד הדמיה של exteriorized החיים E17.5 עוברים. תמונה בניגוד הבלתי ליניארי של העובר לפני ואחרי ההזרקה של microbubbles תמונת אולטרסאונד B-מצב של עובר (א '). לפני ההזרקה של microbubbles ממוקדת (t = 0 שניות). (ב). פרי תמונה בניגוד ליניאריתאו לmicrobubble הזרקה (t = 0 שניות). רק הממשקים חזקים המשקפים (לדוגמא, עצם) נראים, עם אות מינימאלית מהרקמות הרכות. להלן, תמונה בניגוד לינארית של microbubbles בתוך העובר בזמן t = 50 שניות, t = 120 שניות וt = 420 שניות לאחר הזרקת בולוס. לעומת זאת מזוהה לאורך כל בעלי החיים, כולל הלב והמוח. פרמטרים זלוף (C) נגזרים מעקומות עוצמת זמן. עלילת עוצמת microbubbles כפונקציה של זמן בתוך ROI בודד במוח העוברי. הפרמטרים זלוף מזוהים על הגרף, כוללים שיפור שיא (PE), לשטוף-בשיעור (מדרון), וזמן שיא (TTP). ראשי חץ: R = צלעות, Ht = לב, Br = מוח. au, יחידות שרירותיות; החזר על השקעה, אזור של עניין; שניות, שניות. בר סולם = 3 מ"מ. נתון זה שונה מDenbeigh, JM et al. 12. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותרגרסה של נתון זה.

איור 3
איור 3. סיכום של הניגוד הממוצע מתכוון יחסי כוח (CMPR) לendoglin הממוקד (MB E), שליטה (MB C) וmicrobubbles לא ממוקדת (MB U) בEng + / + ועוברי +/- Eng. CMPRs מendoglin ממוקד microbubbles היו גבוהה באופן משמעותי (***, p <0.001) מאלו שנגבו עבור MB C וMB U, (לא שונה באופן משמעותי מזה, ללא קשר לגנוטיפ). MB E מחייבת נמצא להיות גבוה יותר באופן משמעותי בEng + עוברים / + (סמנים כהים) בהשוואה לעוברי +/- Eng (סמני אור). תוצאות מוצגות כמרווח ביטחון ± 95% ממוצעים. n מציין את מספר העוברים ייחודיים בכל אחת מקטגוריות. מDenbeigh, JM et al. 22 ברשות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Microbubble סוג T-בדיקות
p-value
זלוף פרמטר MB U MB C MB V MB U vs MB C MB U vs MB V MB <תת> C vs MB V
שיא השיפור, PE (au) 0.427 ± 0.063 0.490 ± 0.079 0.499 ± 0.064 0.19 0.06 0.81
שיעור נטילה ב( au / sec) .008 ± .002 .009 ± .002 0.011 ± .002 0.18 0.01 0.09
זמן השיא, TTP (שניות) 53.75 ± 7.96 51.75 ± 4.46 45.00 ± 5.33 0.55 0.03 0.03
# עוברים מוזרקים 4 4 3

טבלה 1. סיכום של פרמטרים זלוף העוברי E17.5. ממוצע ± סטיית תקן נגזרת מחלקות עצמת זמן לכל ROIs העובר (.u. = יחידות שרירותיות). הטבלה כוללת מדידות ללא ממוקד (MB U), IgG 2 שליטה ממוקדת (MB C) וVEGFR2 ממוקד microbubbles (MB V). מבחני t נפרדים בוצעו השוואה בין קבוצות. טבלה זו שונה מDenbeigh, JM et al. 12.

סוג Microbubble גנוטיפ CMPR Mean 95%
MB E Eng + / + 9.71 9.05, 10.38
Eng +/- 5.51 4.87, 6.15
MB C Eng + / + 1.42 0.41, 2.43
Eng +/- 1.46 0.45, 2.47
MB U Eng + / + 1.7 0.65, 2.75
Eng +/- 1.76 0.67, 2.84
דגם מעורב ליניארית: בין-נושא אפקטים
df F ערך p
גנוטיפ 1 12.75 <0.001
סוג Microbubble 2 147.65 <0.001
גנוטיפ * סוג Microbubble 2 18.29 <0.001

סיכום טבלה 2. ניתוח מודל המעורב לינאריmicrobubble מחייב בעוברים, עם תיקון Bonferroni להשוואות מרובות. גנוטיפ, סוג microbubble והאינטראקציה המשולבת (גנוטיפ * סוג microbubble) נמצא כגורמים משמעותיים בקביעת CMPR. df = דרגות חופש. מDenbeigh, JM et al. 22 ברשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הסוכנים בניגוד אולטראסאונד הוזרקו לעוברי עכבר הריון בשלב מאוחר ותמונות עם ניגודיות קוי נרכשו למדוד פרמטרים זלוף וממוקד microbubble מחייב. הדמיה מוצלחת של microbubbles בתוך כלי דם עובריים הייתה תלויה במספר גורמים, את כדאיות העובר להיות הראשונה. כל הציוד ומכשירים הוכנו מראש כדי למזער את הזמן הנדרש לבידודה של עוברים מהרחם לתחילת הזרקה. מאז את ההשפעות של חשיפה בודדת או חוזרת ונשנית להרדמה על עכברים עובריים לא נחקרו בפירוט, השימוש בהרדמה באם נמנעה לפני להקריב 16. במהלך בידוד עובר, זה היה חשוב כדי למנוע נזק לצק החלמון ולהבטיח עוברים הוחזקו מקוררים בכל העת, בתקשורת עובר לעתים קרובות רעננה. כאשר exteriorizing העובר לפני הזריקה ובמהלך מצמיד, כלי vitelline העיקריים היו להימנע להגביל likelihooד לדימום, שעלולה להיות קטלני. מצאנו שכאשר להחיות את העובר, זה היה הטוב ביותר ראשון כדי לכסות את השליה ולאחר מכן את העובר עם PBS, לפני יישום ג'ל אולטרסאונד לעובר בתנועה קדימה ואחורה והסרת כל בועות גדולות עם מלקחיים. היתרה של צלחת פטרי הייתה מלאה אז עם PBS. השימוש בג'ל וPBS הגביל את האפשרות של כיסי אוויר בין העובר ומתמר, אשר עשוי להשפיע על איכות תמונה. כעובר לתחייה, דם החל לזרום, בעליל שאיבה בעורק הטבור תוך ורידי הטבור הופיעו אדום בהיר 23. להתייחסות, הסניפים הנובעים מוריד הטבור בדרך כלל כיסוי אלה מעורק הטבור על פני השטח השליה. גם למרות שזה היה אפשרי להזריק לתוך arterioles מבוך השליה, הזרקת microbubbles בכיוון של זריקות דימום שליה זרימה מופחתת ורדיד אפשר microbubbles לעבור ישירות דרך העובר לפני מחזור המחוספס השליה.

בשל השבריריות שלהם, הכנה וטיפול microbubble נדרשו גם טיפול. ניתן להשמיד microbubbles אולטראסאונד תחת סביבות בלחץ גבוה. לכן, בדיוק באותו ההליך חזר על עצמו בכל ריכוז הכינון מחדש ובועה נמדד על מנת להבטיח עקביות ניסיוני. בקבוקון אחד של microbubbles היה בדרך כלל מספיק לכ-5-7 עוברים. מאז microbubbles יציבה בתוך הבקבוקון עד 3 שעות, בקבוקונים מרובים לעתים קרובות נדרשים לניסוי בודד. כדי למנוע קריעה של הרקמה, זה היה הטוב ביותר עבור הקצה של הכוס של מחט הזריקה להיות חדים ולחתוך בזווית קלה בעת שהתקרב כלי השיט קטנה כמו בזווית האפשרית. גזוז פעם אחת, קצה המחט הייתי צריך להיות גדול מספיק לבועות לזרום בקלות עד הסוף בלי להתנהל בכבדות, אבל קטן מספיק כדי להתאים בקלות בתוך הכלי. הגודל האידיאלי היה בדרך כלל <100 מיקרומטר. חלק באימון בשיפוט המתאיםהגודל היה צורך. במקרה שהקצה נחתך גדול מדי, או נסתם, מחט זכוכית חדשה יושמה. זה חלק ממקרים, ניתן היה לקצץ את המחט מעט מעל החסימה. זה היה קריטי כי אוויר לא יורשה להיכנס למערכת כלי הדם של העובר במהלך הזרקה, כמו זה יכול לגרום למותו של בעל החיים והיה לא רצוי במהלך ההדמיה (בועות אוויר יכולות להגיש בכלי הדם של העובר וניתן תהיה להבחין בתמונה אולטרסאונד , באופן מלאכותי להגדיל כל אות נמדדת). הדמיה הניגוד ליניארית שבוצעה בפרוטוקול זה משמש למצב של המערכת בתדירות גבוהה לאמנות (21 MHz) מיקרו-אולטרסאונד (Vevo2100) יחד עם מערכים ליניארי שתוכננו במיוחד עבור הדמיה קטנה של בעלי חיים (MS250). מיקרו או -ultrasound תדירות הגבוהה הוא אחד מכמה אופנים יוכלו, בשלב זה, כדי לספק תמונות ברזולוציה גבוהות של חיים עוברים ויילודי 16 עכבריים. מערכת זו יכולה להשיג החלטות ציריות ורוחב של 75 מיקרומטר וμ 165מ 'בהתאמה בעומקים גדולים כמו 15 מ"מ. לכן היה אפשרות לתמונה כל העובר ברזולוציות גבוהות בהרבה מהשיג בדרך כלל תוך שימוש במכשירים קליניים והצליל האקוסטי מmicrobubbles יכול להבחין בין רקמות באמצעות שיטות הדמיה הניגוד ליניארית (כולל היפוך דופק וטכניקות אפנון משרעת 24). למרות שהיה לנו ההצלחה הטובה ביותר עם הגדרות אולטרסאונד שתוארו כאן, ייתכן שחלק מההתאמה לפרמטרים אלה גם יפיק תוצאות משביעות רצון. בכל המקרים, צריכת חשמל נמוכה נדרש להדמית microbubble כדי למנוע הרס בלתי רצוי של microbubbles לפני תחילת פרץ, ואילו הפרץ הקצר מבטל רק חלק קטן מאוכלוסיית microbubble. בעזרת תרגול, ההליך כולו לעובר יחיד, ממיצוב להשלמת ההדמיה אולטרסאונד המולקולרי, לקח כ -15 דקות. יש לנו בהצלחה מוזרקת רבים כמו 12 עוברים מהמלטה אחת בפגישה אחת.

ניסויי הזרקה היו מוגבלים לחלון 4 שעות בשל הכדאיות המוגבלת של העוברים. מאחר שחלוקת microbubbles הייתה תלויה בזרימת הדם של העובר עצמו, זריקות לא יכלה להתרחש לפני פעימות לב (E8.5) וזרימה לזיהוי בvitelline ומחזור דם טבורים (E9.5) הוקמה 25. עם התבגרות של השליה לא שלמה עד E14.5, ההזרקה של חומר ניגוד במבוך השליה הייתה מוגבלת לעוברים של אמצע לגיל הריון מאוחר. בהתבסס על תצפיות, עוברים קרובים יותר לטווח היו קשוחים ויכולים לעמוד בעלייה בנפח כלי הדם שלהם טובה יותר מעמיתיהם הצעירים. בשילוב, גורמים אלה מוגבלים הדמיה אולטרסאונד ניגודיות המשופרת של כלי הדם העובריים לשלבים מאוחרים של התפתחות וצמיחת angiogenic. זה עשוי להשפיע על הזמינות של מודלים של עכברים מהונדסים, שכן מניפולציה של הקולטנים מעורבים בvascפיתוח רגילה ותחזוקה (למשל, VEGFR2, VCAM-1) עלול להוביל לקטלני עובריים או פגמים בפיתוח והסדרה של מערכות מחזור הדם עובריים 26,27. עם זאת, מספר מערכות מודל הרלוונטיים זמין עבור סמנים ביולוגיים של כלי דם של עניין, ובכלל זה α β 2 28 1, β α v 3 29, מולקולת 1-טסיות הידבקות תא אנדותל 30, והידבקות תא כלי דם, מולקולת הידבקות אינטר מולקולה 1-31 -1 32 ו-2 33 ו- P-selectin 34. מה הוא יותר, histogenesis המוח מתחיל אחרי אמצע הריון-11, מה שהופך את הביטוי של סמני angiogenic ברקמה זו סבירה וכך לספק אלטרנטיבה מצוינת למודל הגידול המסורתי ללימודי הערכת ההיבטים הכמותיים של הדמיה מולקולרית.

טבע vivo לשעבר של הזריקות עושה להציג כמה limitations. חשוב לציין כי לאחר העוברים הוצאו מהאם ומבוך השליה ניקב, זה היה בדרך כלל לא אפשרי (וגם לא רצוי) לעשות הזרקות חוזרות. בנוסף, בידוד העובר ממחזור אימהי מגביל את האספקה ​​של חומרים מזינים וO 2, ובריאות עוברית צפויה להתדרדר עם זמן. בעוד מצמרר ותחייה מאריכה את הכדאיות של העוברים, זה עלול להשפיע גם על תפקוד לב. לדוגמא, שם לב שהיו לי עוברים מבודדים קצב לב מופחת (הנתונים אינם כלולים, מתייחס לDenbeigh et al. 12) בהשוואה לאלו שנצפו בעבר בvivo 35. לכן זה סביר להניח כי מחקרי הערכת פיזיולוגיה לב וכלי דם לא משקפים במדויק בתנאי vivo. עם כמה מחקרים המאפיינים פרמטרים המודינמיים דם בעובר עכבר שלב מאוחר בחיים, לעומת זאת, קשה לומר בודאות את המידה שבי תנאי ניסוי אלה עשויים Altאה תפקוד פיסיולוגי. חלופה אחת היא לבצע זריקות ברחם, או דרך חתך לפרוסקופי 36 או דרך הבטן של האמא בהריון באופן ישיר 37, למרות שגישה זו עשויה להציג סט של אתגרים 11 משלו. במקרים מסוימים, הבידוד וההחצנה של העובר עלולים גם לגרום לדימום משמעותי מצק החלמון. למרות שמצאנו שאנחנו יכולים לעכב את זרימת הדם עם ג'ל אולטרסאונד, כל אובדן משמעותי של דם יכול להשפיע על האספקה ​​וריכוז של microbubbles, ובעלי החיים אלה הוצאו מניתוח. לבסוף, תוך בידוד עושה אימהי גבול ומקורות עובריים של תנועה, תנועה מחזורית הקשורות לפעילות לב היא בלתי נמנעת. אנחנו נבחרתי לתמונה סטטית המוח במטרה לבחון את ההשפעה של ביטוי הקולטן על אות microbubble ממוקדת, אולם היישום של תנועת הדמיה בזמן אמת פיצוי חומר ניגוד אולטרסאונד 38 רשאי ישירותלהאריך מחקרים אלה לאיברים אחרים.

ישנם כמה יישומי הדמיה שכרגע מסוגל להעריך את נוף כלי הדם של עובר עכבר החיים מתפתחים. מספר מחקרים שבוצעו בהצלחה הדמיה חיה של זרימת דם בעוברים לשעבר עכבריים vivo באמצעות טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית נסחף-מקור דופלר 39,40, תוך הדמיה בתהודה מגנטית, קורוזיה כלי דם מטילה, טומוגרפיה microcomputed וטומוגרפיה הקרנה האופטית יושמו לאחר המוות 16. זה מצער, שכן בתקופה זו של צמיחה עוברית יכולה לחשוף מידע חיוני בנוגע להתפתחות כלי דם מוקדמת ותפקוד. הדמיה Microbubble בתוך עוברי חיים ולכן יכולה לתרום להבנה של פיזיולוגיה התפתחותית שלנו. גם זה יכול לשמש כדי לחזות הפצת סמן ביולוגי בכל הגוף של עובר העכבר החי בזמן אמת, למרות שטכניקה זו היא סבירה להחליף שיטות קיימות (היסטולוגיה כוללוהדמיה ניאון) למדידת אות מולקולרית ברקמה עוברית. המסה המתפתחת במהירות של כלי שיט בעוברים, לעומת זאת, דומה מאוד את צמיחת גידול, עם ביטוי של רבים מאותם רצפטורים עיקריים שזוהו באנגיוגנזה גידול 41,42, ולכן יכולה לשמש כפונדקאי גידול מצוין למחקרים שבדוק את היכולות הכמותיות של מולקולרי אולטרסאונד. לפיכך, אנו צופים כי השיטות שתוארו תהיה שימושיות לא רק להערכה ואפיון מודלים עובריים של בריאות ומחלות של כלי דם באמצעות הדמיה תפקודית, אך מציעים שדרת על מנת לחקור את נקודות החוזק ואת המגבלות של הדמיה מולקולרית, כמו גם. יישומה עשוי גם להרחיב לאזורים מעניינים אחרים של חקירה, לרבות בטיפול העברת גנים ברחם שבי microbubbles נבדקה כאמצעי לאספקת DNA עירום לרקמת עכבר עוברי 10. לחלופין, מיפוי של כלי דם 3D של העובר החי הוא גם אפשרי,אשר עשוי לספק מידע רב ערך לגבי חריגות מורפולוגיות בעכברים מהונדסים גנטי. מבוא של סוכנים בניגוד לאולטרסאונד מבודדים עוברי חיים יכול אפוא להיות כלי נוסף להגברת ההבנה של מחלת כלי דם שלנו ותרגום יישומי אולטרסאונד חומר ניגוד למרפאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
  • rat isotype IgG2 control
eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose
Sigma D5796
  • 50 ml Fetal Bovine Serum
ATCC 30-2020 lot # 7592456
  • Hepes
Gibco 15630 5 ml, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco 15140-122 5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 ml BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 ml Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 ml VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110 °C VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48, (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47, (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37, (S1), 65 (2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260, (2), 581 (2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images - Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242, (1), 162 (2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26, (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. IEEE. New York, NY. (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110, (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5, (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48, (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40, (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, ten, P,, Hawinkels, L. J. A. C. Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17, (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10, (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121, (121), Humana Press. Totowa, NJ. 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47, (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51, (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258, (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26, (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18, (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. Angiogenesis. Press. (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36, (12), 2097 (2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20, (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre,, Y,, et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17, (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13, (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Live imaging of mouse embryos. 4, (4), Cold Spring Harbor. 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103, (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3, (8), (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics