高周波超音波を用いて、マウス胚におけるコントラストイメージング

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ここでは、生きている、孤立した後期妊娠期のマウス胚に超音波マイクロバブル造影剤を注入するためのプロトコルを提示する。この方法は、灌流パラメータ及びコントラスト強調高周波超音波イメージングを用いて、胚内の血管の分子マーカーの研究を可能にする。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

造影超音波イメージングは​​、血管環境を視覚化し、特徴付けるために、マイクロバブル造影剤を利用する。これらの物質は、微小循環、血管分布および心血管機能の非侵襲的評価を可能に。また、気泡表面の改質が可能な血管イベントの分子の超音波イメージングを行う血管形成、アテローム性動脈硬化症および炎症1,2の前臨床用途で実証されるように、内皮細胞のバイオマーカーに結合する標的化マイクロバブルをもたらすことができる。造影超音波は、したがって、健康と病気の血管の状態3-5に影響与える複雑かつ多様な環境を識別するために使用することができる。

年の過去数には、マイクロバブルイメージングの有用性への関心は汎用性の高いマウス胚モデルに拡張しました。哺乳類の発生のモデルとして、胚の血管系へのマイクロバブルの導入は、生理的な強化開発循環系( 例えば 、血流量、心拍出量)およびトランスジェニック例での研究と心疾患6,7の変異マウスモデルをターゲットとは、遺伝的要因が心血管機能を変化させる方法への洞察をもたらすことができる。実際には、胚の脳血管系の定量的および定性的な二次元分析は、既に8を達成している。さらに、マウス胚は、生体内での血管マーカーに標的マイクロバブルの結合を調べるための優れたモデルとして提示します。 Bartelle 9は 、例えば、Biotag-BirAをトランスジェニック胚に結合し、血管構造を検討対象と評価するために胚心臓の心室にアビジンマイクロバブルを導入しています。診療所にこの技術を翻訳において重要なベンチマーク - ヘテロ接合およびホモ接合性マウスモデルの生成は、分子の超音波の定量的性質を規定することを目的と腫瘍モデル研究のための代用として使用することができる。

8-10を介して露出し、単一の胚に心臓内注射を経由して胎児の血液循環に導入される。 子宮内注射では 、しかし、多くの課題に直面しています。これらは、注射の指導、母親と体外胚の動きに対抗する必要性、母親における血行動態の生存率の維持および11出血による麻酔の合併症の長期的影響に対処体外胚を、含む。従って、調査の目的は、単離されたリビング後期胚12にマイクロバブルを注入するための技術を開発することであった。このオプションは、噴射制御やポジショニング、障害物のない撮像面の再現性、および単純化された画像解析と定量化の面でより多くの自由を提供しています。

本研究では、foの生きているマウスの胚にマイクロバブルを注入するための新規な手順を概説Rマイクロバブル速度論的挙動を研究するとの目的は、内因性の内皮表面マーカーに結合するマイクロバブルをターゲットに勉強。非線形コントラスト特有の超音波イメージングは​​、ピークエンハンスメント(PE)、ウォッシュアウト速度および時間孤立E17.5胚において(TTP)をピークに含む基本的な灌流パラメータの数を測定するために使用される。我々はまた、活性な血管新生13の部位で血管内皮細胞におけるその高い発現をエンドグリンは、臨床的に関連する標的で機能するトランスジェニックマウスモデルの胚グリン損失分子音波の定量的性質を評価するための胚のモデルの妥当性を実証する。エンドグリンを標的(MB E)の付着、ラットアイソタイプIgGを2コントロール(MB C)および非標的(MB U)マイクロバブルは、ヘテロ接合グリン( 工学 +/-)で評価され、ホモ接合エンドグリン( + / +)の胚を表す。目標とビンディの分析ngは、分子の超音波は、エンドグリン遺伝子型を区別し、定量化可能な分子の超音波レベルに受容体密度に関連することが可能であることを明らかにする。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

注:この研究で行った実験手順はサニーブルック研究所(トロント、オンタリオ州、カナダ)での動物実験委員会によって承認された。動物の人道的な扱いのための手順は、すべての回で観察されなければならない。これは、治験責任医師は、超音波撮像システムの基本動作の訓練を受けているものとする。このプロトコルは、2人で最適に動作。

1.動物モデル

  1. メイトCD-1雄と雌ハツカネズミ潅流研究のための野生型胚を得る。
  2. Bourdeau 14によって記載されるように、分子イメージング研究のために、129 / Olaの由来の胚性幹細胞を用いた相同組換えによって工学+/-マウスを作製する。
    1. 戻し交雑B6- 工学 +/-マウスは、親切にCD-1バックグラウンドに、博士ミシェルLetarteから取得した。使用工学 +/- CD-1戻し交配胚、ならびにそれらの工学 + / +同腹コntrols。段階胚を生成するために、マウスメイト。

2.実験の準備

  1. マウスの交配を開始し、毎日のプラグを確認してください。胎生0.5膣栓が観察された日の正午と定義される。
  2. 500にウシ胎児血清50mlの5 1 M HEPES mlのペニシリン - ストレプトマイシンを5ml(10,000単位のペニシリン10,000μgのストレプトマイシン)を添加することにより、胚培地を調製mlのダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース(DMEM)(4500 mgの/ L)。ホイルで瓶をラップし、4℃で冷やしておく。
  3. 20分間140×gで50ミリリットルコニカルチューブで遠心し明確な超音波ゲル。 30ミリリットル注射器にゲルを上に描画します。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で(マーク)は、追加の30ミリリットル注射器を記入し、取っておく。胚の1リットルは一般的に、超音波ゲルの2-3注射器とPBSの4の注射器との間で必要になります。
  4. 約30ガラス針を引き、優しく粘土のストリップに固定します100×20mmの細胞培養皿で。これは針が取り扱い中に分離し、安全であることを保証します。ヒーター77、サブマグネット55、主磁石70:ガラスの引き手を使用して、フィラメントと1×90ミリメートルのガラスキャピラリーに次の設定を使用します。
  5. ベースに硬化剤の8体積比:1を使用して、(自身の一品を受け取るごみ内の各胚を確保するのに十分な)十一時五十解剖プレートを準備します。を50mlコニカルチューブに塩基を40mlを注ぐ。 5〜6ミリリットル硬化剤を追加し、木製の棒でかき混ぜる。
    1. 約半分にそれぞれ充填し、60×15mmの培養皿に注ぐ。スタンドO / Nが設定してみましょう。
  6. (:0.79ミリメートル内径)ポリ塩化ビニル(PVC)チューブの400ミリメートル長い作品にメスルアーを取り付けます。チューブは快適に超音波ステージにシリンジポンプから到達しなければならない。

3.実験の設定

  1. 3Dモーターとリニアアレイ21 MHで手術用顕微鏡下でのイメージングプラットフォームを配置Z変換器。
    1. オリエントレールマウントするようなプラットフォームは、顕微鏡の真下に位置してステージと、左側にあります。
    2. プラットフォームの延びるアームのボールジョイントに3Dモーターを取り付けます。前方を向いた、モーターにマウントクイックリリースへの変換器クランプのクイックリリースポストをねじ込み、ラッチを固定するクランプでトランスデューサヘッドを配置します。
    3. カートのフロントパネル上のアクティブポートにトランスデューサ·コネクタを固定します。マシンをオンにします。
  2. 分子イメージング研究のために「心臓病」設定を選択、21 MHzの超音波トランスデューサを開始し、潅流研究のための「全般」。正確な中間の位置にすべての時間利得補償スライダーをシフトします。周波数::18 MHzの、動力を伝達:4%、(0.39 MPa)を、ゲインコントラスト:30デシベル、巣:6&10ミリメートル、モードコントラスト:非線形、バースト時間:100% 'をコントラストモード」の場合は、次のパラメータを設定0.1で秒、ビーム幅:ワイド。
  3. アリコート40ミリリットル胚メディア4 50ミリリットルコニカルチューブにそれぞれ。氷の上に置きます。
  4. ホットプレート上で2リットルのビーカーに1Lの水を加熱する。 45℃で維持する。予熱するビーカーに超音波ゲルとPBSの1注射器を追加します。すべての回で温度計を監視することで、この温度を維持する。
  5. 十二1ミリリットル注射器とマイクロバブルを注入するための10 21〜12のG針に脇十設定してください。

4.手術手順

注:外科医が手術手順を開始しながら、アシスタントは、気泡(ステージ5)を調製持っている。プロトコルは、ここで説明するホワイトリーから適応されています。15

  1. 頸椎脱臼以下の妊娠雌マウスからE16.5またはE17.5胚を収集します。
    注:胎児への麻酔の効果はまだ詳細16で検討されていない。断頭含むさらなる方法は、適切なオペアンプとすることができる妊娠マウスの犠牲のためション。
    1. 子宮&胚を明らかにするために腹部を切開し。慎重かつ迅速(卵巣と子宮の血管を切断する)子宮角の先端に切断し、膣と膀胱で切断することによって子宮を取り除く。
    2. 破片の鉗子を使用して、胚を損傷することなく、可能な限り迅速に氷冷した胚培地を40mlのチューブに子宮に移す。マウスの死体を捨てる。
  2. 顕微鏡とステージに再配置します。 100×20ミリメートルの細胞培養皿に子宮を堆積させる。 50ミリリットル新鮮胚メディアで満たされた新しい皿に子宮を転送します。
  3. 滅菌した(70%エタノールスプレー)微細鉗子を用いて、静かに一端で始まり、子宮の外膜を引き裂くと引き離す。胎盤の脱落膜、壁側卵黄嚢と分離し、基盤となる内臓卵黄嚢から削除するライヘルト膜を公開します。
  4. 内臓Yを保ち、一つ一つの胚を解剖OLK嚢無傷として優しく17できるだけ胎盤を扱う。胚はすぐに飛び出しとして卵黄嚢の破裂を避けるように注意してください。
    1. 新鮮胚メディアに氷上に維持し、別の皿に胚を移動するために穴のあいたスプーンを使用してください。必要になるまで冷やした胚を保管してください。胚皿にすべての1〜1.5時間後にメディアを変更します。これらの条件では胚は解剖後に最大4時間のために実行可能である。

5.マイクロバブルの準備

注:両方のターゲットと非標的マイクロバブルを用いた超音波との分子イメージングを実行します。 I)抗体標的マイクロバブル、II)対照アイソタイプ抗体標的マイクロバブル及びiii)非標的マイクロバブル:単一の実験は、最大3としてマイクロバブルの別々のバイアルを必要とすることができます。造影剤は、乾燥凍結粉末として来て、注射の前に生理食塩水で再構成する必要があります。各非標的がMicroBで〜2×10 9マイクロバブルがありますubbleバイアルと〜ターゲット準備バイアル中で8.8×10 8マイクロバブル。マイクロバブルは、再構成後最大3時間安定である。

  1. ターゲットレディバイアルの再構成
    注:ターゲット準備製剤の例:グリン標的マイクロバブル(マウスエンドグリンにビオチン化ラットMJ 7/18抗体を用いたMB E;家のハイブリドーマ施設で);血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)標的マイクロバブル(MB V、ビオチン抗マウスCD309を有する);ラットアイソタイプIgGの2コントロール抗体標的マイクロバブル(MB C、ビオチンラットアイソタイプIgGを2コントロールマウスIgG2aをターゲット)。
    1. 1mlの生理食塩水に抗体溶液(20μg)を(最終体積)に希釈する。氷の上に保管してください。
    2. すべての気泡を除去、1ミリリットルの生理食塩水で注射器を埋める。 21 G針を取り付け、マイクロバブルバイアルにゆっくりとソリューションを注入する。
    3. ゆっくりと空気の1ミリリットルを除去し、プランジャーを撤回し、針を撤回。優しく攪拌する。氷上で5分間放置してみましょう。
      注:超音波マイクロバブルは、高圧環境下で破壊することができる。
    4. 経過時間後、抗体希釈新しいシリンジに充填し、適切なバイアルに加える。静かに攪拌する。混合物(現在2ml)を10分間放置する。氷の上に保管してください。完全な表面結合を仮定すると、マイクロバブルのための結合リガンドの平均数は約18 7600リガンド/μm2である。
  2. 非標的バイアルの再構成
    1. すべての気泡を除去、1ミリリットルの生理食塩水で注射器を埋める。 21 G針を取り付け、マイクロバブルバイアルにゆっくりとソリューションを注入する。
    2. ゆっくりと空気の1ミリリットルを除去し、プランジャーを撤回し、針を撤回。静かに攪拌する。 5分間放置してみましょう。上記のように、さらに1ミリリットルの生理食塩水を加える。静かに攪拌し、氷上に10分間放置。
  3. コー​​ルターカウンティング
    1. 静かに希望マイクロバブルバイアルを攪拌し、描く〜21 Gの針を用いて1ミリリットル注射器に溶液50​​μl。空の2ミリリットルのマイクロチューブにマイクロバブルを注入します。
    2. 希釈剤の10ミリリットルにマイクロバブル原液10μlのサンプルをピペットで。
    3. 穏やかに混合した後、コールターカウント(材料のリストを参照)を使用して、マイクロバブルの人口集中とサイズ分布を評価する。 30μmのアパーチャーを用いて(バイアルサンプルあたり)350μlの測定値の最小値をカウントします。
  4. 注射用マイクロバブルの準備
    注:「胚にマイクロバブルの注入を「時のアシスタントは、この手順を実行する(ステップ6)が開始される。各胚をランダムにマイクロバブルのすべてのタイプが均等手順全体に分布が、ランダムな順序で示されているようにアシスタントによって選択される各噴射のために選択されたマイクロバブルの種類、一回注射する。外科医が注入されて、バブルのタイプに盲目であることを確認してください。
    1. 目を決定します400μlの1×10 8メガバイト/ mlの最終濃度を生成するのに必要な株式バブル溶液の電子ボリューム(5.3.3で測定ストック濃度を使用して体積を計算する)。空のマイクロ遠心チューブに生理食塩水の対応するボリュームを分注し。
    2. 静かに選択されたマイクロバブルバイアルを攪拌し、21 Gの針を用いて1ミリリットル注射器に液の過剰量(上記の計算されたものよりも〜50μL以上)を描く。空のマイクロ遠心チューブにマイクロバブルを注入します。
    3. マイクロバブル原液必要な容積をピペット生理食塩水のアリコートに加える。ピペットの先端で穏やかに撹拌することにより混合します。
    4. 21 G針を使用してクリーンなシリンジに希釈されたマイクロバブルソリューションを描画します。針を取り外す、シリンジから気泡を排除し、ルアーやチューブを取り付けます。ゆっくりと気泡を発生させないことを確認チューブ作りの最後にソリューションをプッシュ。
    5. syrinを挿入20μlの総容積のために20μl/分の速度でマイクロバブルを分配するように設定されたシリンジ注入ポンプに葛。チューブの端に引っ張らガラス針を取り付けます。噴射ステージに近いポンプを移動します。

胚にマイクロバブルの6インジェクション

  1. ランダムに選択し、チルドメディア皿から(あきスプーンで)1胚を削除します。ステレオスコープの下で超音波ステージ上に位置して解剖皿に置き、少なくとも血管化表示側(antimesometrial側)から引き裂く/切断、細かい鉗子で卵黄嚢と羊膜を取り除く。これは、最も簡単に頭部領域に隣接する領域を穿孔することによって達成される。
    1. 内から胚を除去するのに十分、しかしそれ以上をカットします。粘土の小片を使って解剖料理を安定させます。
  2. 静かに胚の周囲から嚢を操縦。胎盤と、その側に胚を置き、前の臍帯血管。卵黄嚢を突き止める、虫ピンを使用して、(4ピンが推奨)し、必要に応じて、胎盤のエッジが所定の位置に固定する。主要な血管を避けてください。
  3. 胚が復活するまで予め温め、45℃のPBSで胚を洗ってください。臍帯静脈とその関連する血管ネットワークを識別します。注射が快適に行うことができるように、料理を置きます。
    注:一度温め、胚における血液が目に見えて臍動脈にポンピング、流動し始める。流れが最初に開始すると、静脈が両方の容器内の血はすぐに同一の登場で、鮮やかな赤になります。臍帯静脈から生じる枝は通常、胎盤表面上の臍動脈からのものを重ねる。
  4. 胚が復活したら、微妙に胚の周りから(細かい鉗子を使用して)すべての気泡を除去するようにしてくださいされて、予め温め米国ゲルでそれ(ただし、胎盤)をカバー。予め温めておいたPBSで皿を補充する必要があります。
    注:solutiのレベルに目が離せないPBSおよびゲル注射器内に、必要に応じて加熱ビーカーにバックアップ注射器を追加します。
  5. 解剖皿の縁​​に粘土の大ボールにガラス針をマウントし、PBS中に針の端を挿入します。限り合理的なように、メインブランチから、胎盤ディスクの絨毛表面の静脈の選択、ハサミを使ってサイズに先端をトリミング。先端がわずかな角度で切断された場合の注入が最も簡単です。春のはさみの刃を用いて、ガラスのいずれかのギザギザを削除します。
  6. 全ての空気が針先端から放出されるマイクロバブルはPBS中に自由に流れることが分かるまで、シリンジポンプを用いて、ゆっくりとガラス針に20μlの/分でマイクロバブル液を注入する。ポンプを停止し、20μLの注入量のためにリセットする。空気が注入中に胚の血管系に入らないようにしてください。
  7. 胎盤における静脈の一つにそっとガラス針の先端を挿入し、それが不動であることを確認。 Stereのを離れてスイングoscopeヘッドと位置胚上記トランスデューサ。イメージングを開始します。

7.超音波分子イメージング

注:胚6における焦点から10mmの間で均等に位置するように予め設定されたコントラストの非線形撮影条件を使用して、トランスデューサを位置付ける。一度に配置、マイクロバブルのボーラス注射を開始します。注入が完了したら、タイマーを開始する。

  1. 灌流イメージング
    1. 非線形のコントラストモードのための最大フレーム数が「 研究管理 」ボタンを押して、研究·ブラウザの上部にある[ 環境設定 ]タブをクリックすることで選択されていることを確認。 「 設定 」ウィンドウで、適切なチェックボックスをオンにします。
    2. 非線形イメージングを開始することによって画像化設定を調整します。コントロールパネルの「 コントラストモード 」ボタンを押します。 「 ゲイン &#を調整することにより、2次元ゲインを絞り込み8217。 、30デシベルにダイヤル「 電源 」ダイヤルを使用して4%に電力を低減、「 周波数 」にダイヤルし、広いローラーボール/マウスを使用してビーム幅(左下隅)に設定を使用して、1 Hzに周波数を下げる。
      注:すべてのコントロールは、超音波システムのコントロールパネルにあります。
    3. 1 60Hzのフレームレートで20分シネループを記録することによって、マイクロバブルボーラスの全体の洗浄、および散逸をキャプチャ。データ収集を開始するキーを押してスキャン/フリーズ。
    4. 画像の全配列が捕捉されると、システムバッファに画像のシーケンスを保存するために、コントロールパネル上に位置する「 シネストア 」ボタンを押す。システムは、取得した非線形のコントラストモデルデータの日付スタンプ付きシネループを作成します。
  2. ターゲットマイクロバブルイメージング
    1. 環境設定 」の下で、0.1秒にバースト時間を設定します。コントロールDESを使用して、適切な撮像パラメータを設定します。上記cribed(7.1.2。)。
    2. コントロールパネル上の「 コントラストモード 」ボタンを押すことにより、非線形コントラスト撮影を開始する。胚が正しく変換器の下に位置し、胚を経てマイクロバブル造影剤の流れが非線形コントラストモード画像に表示されていることをされていることを確認。
    3. 胚性分子イメージング研究の間に結合ターゲットを絞ったマイクロバブルを評価するために、マイクロバブル注入が完了した後に3分40秒のために邪魔されずに循環させることができます。この時間は、循環するマイクロバブルの保持を可能にすることである。プレスこの間に画像化を停止するには、 'スキャン/フリーズ」。
    4. 3分40秒で、胚は、まだ表示されている十分にPBSで覆われており、マイクロバブルを循環し続けていることを確認するために撮影を再開する。プレスイメージングを開始するために「スキャン/フリーズ」。
    5. 「事前にdestrucを記録することによって、3分50秒のポスト噴射で破壊/補充シーケンスを取得するる「29 Hzの音響応答シーケンス。プレスデータ収集を開始するために「スキャン/フリーズ」。 4分後に注射18,19で、0.1秒の高周波音響バーストを開始する。バーストを実装するために「バースト」ボタンを押します。
    6. (バッファラインが一杯になるまで)シーケンスの残りのフレームを記録し、「シネストア」を押すことで、シネ·ループを保存し続けます。
    7. 循環するマイクロバブルの追加のシネループを収集します。これ以降の「ポスト破壊 'イメージングシーケンスは、ビームを補充した場合のみ、循環バブル信号を含むと仮定される。プレス画像を収集するために画像化し、「シネストア」を開始するために「スキャン/フリーズ」。
    8. 各胚を画像化した後にシネループにラベルを付けます。プレス「研究マネジメント」、ローラーボールを使用してファイルを強調表示し、適切にボタンを押して「画像のラベル」と名前を「選択」。

    注入後の胚の8取り扱い

    1. ポストイメージング、必要に応じて(断頭、頸椎脱臼、二酸化炭素窒息、または急速凍結または固定が続く麻酔を介して)、変換器を移動する胚の固定を解除し、安楽死させる。
    2. 後続の各胚注入新鮮な解剖皿のために、注射針、注射器とチューブセグメントは解剖と復活の間に起こるマイクロバブル注射液の次のバッチの準備を、使用する必要があります。
    3. さらなる分析のための組織サンプル( 例えば 、尾、脳)を保存( 例えば 、単離された尾DNA、LacZ染色、またはウェスタンブロット21を使用してバイオマーカー発現の半定量的尺度のPCR解析により決定遺伝子型決定)。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

子宮外でのマウス胚への超音波造影剤の注入は、注入および関連する超音波撮像にわたって生存能力の子宮およびメンテナンスから後期妊娠期胚生活の正常な分離に依存する。胚体外に位置決めされた後、図1に示すように、胚の血管系への造影剤の慎重な注入が可能である。 E17.5マウス胚の典型的なBモード超音波画像は、 図2Aに示されている。マイクロバブルのウォッシュイン及び対応するエンハンスメント下大静脈内、心臓、脳、全動物において、それにより、この手法の実現可能性を実証し、非線形コントラスト撮像法を用いて捕捉することができる。個々の時間点は、 図2Bに示されており、経時的なコントラストの変化を示している。

全体ウォッシュインとウォッシュアウトOを記録することにより、マイクロバブルボーラスfは、様々な灌流パラメータを測定することができる。オフライン分析では、コントラスト領域トレースツールは、胚、左右の脳半球に関心1.5mmの2つの領域(ROI)を作成するために使用された。これらのROI内の平均信号強度は、時間の関数としてプロット七点メディアンフィルタを用いて平滑化した。 ( 図2Cに示されている)を得られたコントラスト強度曲線から、脳のピーク増強を決定した。 10%最大ピーク増強(PE)の50%の間の傾きとして定義されるウォッシュイン率もまた計算した。最後に、ピークまでの時間(TTP)は、ピーク時間に信号エンハンスメントの発症から計算した。異なる気泡タイプにわたる平均灌流パラメータの差は、別個のt検定12を用いて試験した。 表1にまとめたこれらの結果は、マイクロバブルの注入がバリューを提供することを実証発達のマウスに重要灌流パラメータを確認するための可能方法。

胚の脈管構造への微小気泡の導入は、分子の超音波イメージングの定量的な能力を定義し、特徴付けるためのモデル系としてマウス胚の使用を可能にする。次の例では、遺伝子操作マウス胎児におけるエンドグリンのヘテロ接合及びホモ接合発現パターンを生成した関数モデルの損失は、遺伝子型を区別するための分子の超音波イメージングの能力を試験するために使用した。破壊/補充画像のマイクロバブル注入及び実装後、「ポスト破壊 '配列に「事前破壊'は分子シグナルの測定値を生成するために使用された平均信号強度の比は、コントラストが電力比(CMPR平均呼ば)。 (多重比較のために作らボンフェローニ調整付き)線形混合モデルは、ワットを確認するために行った hether + / +または工学 +/-胚(尾サンプルのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を介して同定されたポスト噴射)に結合エンドグリンを標的、制御および非標的マイクロバブルの間に有意差があった。推定CMPR手段(95%信頼区間(CI)±平均値) を図3に、各マイクロバブルおよび胚タイプのために提示されると、表2に要約する。

これらの知見は、単離された生きている胚における超音波造影剤の注入を達成することができる具体的な実証を提供する。さらに、このプロトコルは、灌流パラメータの評価を容易にし、分子の超音波イメージングの能力を解明する目的で血管疾患の胚モデルにおける結合標的マイクロバブルを比較するために使用することができる。

.jpgの "/>
単離された胚へのマイクロバブルを注入するための、図1の実験のセットアップ。20μlのマイクロバブル溶液をガラスカニューレを使用して、胎盤静脈に注射される21 MHzのリニアアレイトランスデューサは、体外生体E16.5胚の上方に位置している。スケールバー= 10ミリメートル。許可を得てDenbeigh、JM から。12。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2.体外生活E17.5胚の超音波画像。 (A)胚のBモードの超音波画像先立ち標的マイクロバブルた(t = 0秒)の注入。(B)の前にマイクロバブルの注入後の胚の非線形コントラスト画像。非線形コントラスト画像のpriまたは注射(トン= 0秒)マイクロバブルする。だけ強く反映インターフェース( 例えば、骨)が軟組織からの最小の信号と、表示されている。以下、ボーラス注射後の時刻t = 50秒で、時刻t = 120秒であり、t = 420秒で胚内の微小気泡の非線形コントラスト画像。コントラストは、心臓および脳を含む、動物全体で検出される。時間強度曲線から導出(C)灌流パラメータ。胚の脳内の単一のROI内の時間の関数としてのマイクロバブルの強度プロット。灌流パラメータは、ピークエンハンスメント(PE)、ウォッシュアウト率(傾き)、及び(TTP)のピークまでの時間を含む、グラフ上で識別される。矢頭:R =リブ、​​Htを=心臓、Brを=脳。 auの、任意の単位; ROI、関心領域。秒、秒。スケールバー= 3ミリメートル。この図は、Denbeigh、JM から変更されている。12。 で拡大表示するには、ここをクリックしてくださいこの図のバージョン。

図3
平均コントラストの図3.まとめ + / +および工学 +/-胚におけるコントロール(MB C)および非標的マイクロバブル(MB U)、エンドグリンターゲット(MB E)のための電力比(CMPR)を意味する。グリンからCMPRSが目標マイクロバブル(かかわらず、遺伝子型の、互いに有意差がない)、(*** はp <0.001)MB CおよびMB Uのために収集したものよりも有意に高かった。 MB E結合は、と比較して、 工学 + / +胚(暗いマーカ)において有意に高いことが見出されたENG +/-胚(光マーカ)。結果は平均値±95%信頼区間として示した。 nは、各カテゴリの一意の胚の数を示す。許可を得てDenbeigh、JM から。22。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

マイクロバブルタイプ T検定
p値
灌流パラメータ MB U MB C MB V MB C対MB U MB V VS MB U MB <MB V VSサブ> C
ピーク強化、PE(AU) 0.427±0.063 0.490±0.079 0.499±0.064 0.19 0.06 0.81
ウォッシュイン率(AU /秒) 0.008±0.002 0.009±0.002 0.011±0.002 0.18 0.01 0.09
ピーク、TTP(秒)までの時間 53.75±7.96 51.75±4.46 45.00±5.33 0.55 0.03 0.03
#胚を注入された 4 4 3

E17.5胚の灌流パラメータの表1.概要。すべての胚のROIのための時間の強度プロットから得られ±標準偏差(平均。U。 =任意の単位)。テーブルは、非標的(MB U)の測定が含まれるターゲットのIgG 2コントロール(MB C)およびVEGFR2は、(MB V)マイクロバブルをターゲットに。別個のt検定は、群を比較するために行った。このテーブルはDenbeigh、JM 12から変更されている。

マイクロバブルタイプ 遺伝子型 CMPR平均 95%信頼区間
MB E ENG + / + 9.71 9.05、10.38
工学+/- 5.51 4.87、6.15
MB C ENG + / + 1.42 0.41、2.43
工学+/- 1.46 0.45、2.47
MB U ENG + / + 1.7 0.65、2.75
工学+/- 1.76 0.67、2.84
線形混合モデル:被験者間効果
DF F p値
遺伝子型 1 12.75 <0.001
マイクロバブルタイプ 2 147.65 <0.001
遺伝子型*マイクロバブルタイプ 2 18.29 <0.001

のための線形混合モデル分析の表2.概要マイクロバブルは、多重比較のためのボンフェローニ補正して、胚の結合。遺伝子型、マイクロバブルのタイプおよび組み合わせの相互作用(遺伝子型*マイクロバブル型)CMPRを決定する上で重要な要因であることが見出された。自由のDFは=度。 Denbeigh、JM 22の許可を得て。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

超音波造影剤は、後期妊娠マウス胚および非線形コントラスト画像に注射し、灌流パラメータを測定するために取得し、結合マイクロバブルを標的とした。胚の血管系内のマイクロバブルの成功イメージングは​​、多くの要因、最初のもの胚の生存率に依存していた。すべての機器および装置は、注入の開始に子宮から胚を単離するために必要な時間を最小にするために、事前に調製した。胚性マウスに麻酔への単一または反復暴露の影響が詳細に研究されていないため、母親で麻酔の使用は犠牲16の前に回避された。胚単離の間には、卵黄嚢の損傷を防止し、胚を頻繁にリフレッシュ胚培地中で、常に冷蔵保管したことを確認することが重要であった。注射の前にし、ピン止め中に胚を視るときに、主要な卵黄船はlikelihooを制限することが回避された致死可能性出血のD、。我々は、胚を回復するとき、それは最初に前後に動いて胚に超音波ジェルを塗布し、ピンセットを用いて任意の大きな気泡を除去する前に、PBSで胎盤、次いで胚をカバーするために最善であることがわかった。ペトリ皿の残りの部分は、次いでPBSで満たした。ゲル及びPBSの使用は、画像品質に影響を与える可能性がある胚と変換器との間のエアポケットの可能性を制限した。胚が復活したように、血液は臍帯静脈が23赤い鮮やかに見えた目に見えて臍動脈にポンピング、流れ始めました。参考までに、臍帯静脈から生じる枝は通常、胎盤表面上の臍動脈からのものを重ねる。それは胎盤迷路動脈に注入することが可能であったが、流れの方向にマイクロバブルを注入し、胎盤出血や小静脈注射はまた、マイクロバブルが目を循環させる前に、胚を直接通過することができ縮小ラフ胎盤。

それらの脆弱性に、マイクロバブルの準備と取り扱いも注意が必要。超音波マイクロバブルは、高圧環境下で破壊することができる。各再構成およびバブル濃度は実験的一貫性を保証するために測定された時に、したがって、正確に同じ手順を繰り返した。マイクロバブルの単一バイアルは、約5-7の胚のために一般的に十分だった。マイクロバブルは、最大3時間、バイアル内で安定しているので、複数のバイアルは、多くの場合、単一の実験のために必要であった。組織を引き裂く回避するためには、注射針のガラスチップのための最も鋭くなると、できるだけ小さい角度で血管に接近しながら、わずかな角度で切断することであった。一度トリミング、針の先端は、気泡が凝集することなく、最後まで流れやすくするために十分な大きさでなければならなかったが、血管内に簡単に収まるほど小さい。理想的なサイズは、<一般的に100であった。適切な判断で、いくつかの練習サイズが必要であった。先端が大きすぎるカットされた、またはブロックされたようになった場合には、新しいガラス針を適用した。それはいくつかの場合、それはわずかに閉塞の上に針をトリミングすることが可能であった。これは、動物の死亡につながる可能性のように、空気が注入中の胚の血管系に入ることを許可されないことが重要であり、気泡は胚の血管系内に留まり超音波画像において検出可能であり得る(撮像中に望ましくないでし、人工的に)すべての測定された信号を増加。このプロトコルで行われる非線形コントラストイメージングは​​、特に小動物イメージング(MS250)用に設計されたリニアアレイと対になって技術の高周波数(21 MHz)のマイクロ超音波システム(Vevo2100)の状態を使用していました。マイクロまたは高周波-ultrasoundは、この時点で、マウスの胚および新生児16生きた高解像度画像を提供することができるいくつかの様式の一つである。このシステムは、75ミクロンと165μの軸方向と横方向の解像度を達成することができます15ミリメートルのように偉大な深さでそれぞれメートル。それは、典型的には、臨床計測器を使用して達成したマイクロバブルからの音響信号(パルス反転、振幅変調技術24を含む)は、非線形コントラスト撮像法を用いて組織から区別することができるよりもはるかに高い解像度で、したがって、画像全体の胚に可能であった。ここで説明した超音波設定で最高の成功を収めたが、これらのパラメータのいくつかの調整はまた、満足な結果を生む可能性がある。全ての場合において、低電力、短いバーストがマイクロバブルの集団のわずかな部分を排除しつつ、バーストの開始前にマイクロバブルの望ましくない破壊を回避するために、マイクロバブル造影のために必要とされる。実際に、単一の胚全体の手順は、分子の超音波撮像の完了に位置決めするから、約15分を要した。我々が正常に1リットルから12胚として多くのとして注入している単一のセッション。

注入実験に起因胚の限定された生存能力に4時間ウィンドウに限定されていた。マイクロバブルの分布は胚自体の循環に依存していたので、注射は卵黄と臍帯循環(E9.5)でハートビート(E8.5)と検出可能な流れの前に場所を取ることができなかった25を設立しました。 E14.5までに完了しない胎盤の成熟に、胎盤迷路を通して造影剤の注入が遅れて妊娠期間半ばの胚に限られていた。観察に基づいて、言葉に近い胚が丈夫だったと彼らの若い対応よりもより自分の血管容積の増加に耐えることができた。組み合わせることで、これらの要因は、開発と血管新生増殖の後期に胎児の血管系の造影超音波イメージングを制限された。これはVASCに関与する受容体を操作するので、トランスジェニックマウスモデルの利用可能性に影響を与える可能性ウラル開発と保守( 例えば、VEGFR2、VCAM-1)は、胚循環系26,27の開発と規制における胚致死や欠陥につながる可能性があります。それにもかかわらず、関連するモデルシステムの数は、αVβ3と 29、血小板内皮細胞接着分子-1 30、および血管細胞接着分子-1 31、細胞間接着分子α2β1 28を含む関心のある血管のバイオマーカーのために利用可能である-1 32と-2 33とPセレクチン34。しかも、脳の組織形成は、おそらく、この組織では血管新生マーカーの発現を作り、それによって分子イメージングの定量的な側面を評価する研究のための伝統的な腫瘍モデルに優れた代替手段を提供し、妊娠中期11後に始まる。

注射のex vivo性質は、いくつかのlimitatioを提示しないNS。これは、胚は母親とパンクした胎盤迷路から削除された後に、それは繰り返し注射を行うことが一般的に可能(NOR望ましい)ではないことに注意することが重要である。また、母体循環から胚を単離する栄養素およびO 2の供給を制限し、胚の健康状態を経時的に劣化することが予想される。冷却および復活は胚の生存を延長するが、それはまた、心臓機能に影響を与える可能性がある。例えば、我々は、単離された胚は、以前に、生体内 35 観察されたものと比較して減少した心拍数(データは含まれていない、Denbeigh 12を参照)を有していたことを観察した。それは、心血管生理学を評価する研究が正確にインビボ条件下反映されないこと、したがって可能性があります。生き後期マウス胚における循環血行動態を特徴付けるいくつかの研究では、しかしながら、これらの実験条件は、ALTができるどの程度確信を持って言うことは困難であるER生理機能。一つの代替は、このアプローチが課題に11の独自のセットを提示するかもしれないが、腹腔鏡切開36を介して、または直接37妊娠中の母親の腹のいずれかを介して、 子宮内注射を行うことである。いくつかの例では、胚の単離および具象も卵黄嚢からの有意な出血をもたらし得る。我々は、超音波ゲルで血流を阻害することが分かっているが、血の有意な損失はマイクロバブルの送達および濃度に影響を与える可能性があり、そしてこれらの動物は、分析から除外した。アイソレーションが運動の限界母体と胎児のソースをしながら最後に、心臓活動に関連した定期的な運動は避けられない。我々は、標的マイクロバブル信号上の受容体発現の効果、リアルタイム運動補償された造影超音波イメージング38は一方の実装を検討するために、画像に静的脳を選出他の臓器にこれらの研究を拡張します。

現在住んでいる発展途上のマウス胚の血管の景観を評価することができますいくつかの画像処理アプリケーションがあります。磁気共鳴イメージングは、血管腐食キャスト、microcomputed断層撮影及び投影光学トモ16死後実装されているが、いくつかの研究では、正常に、ドップラースウェプトソース光コヒーレンストモグラフィー39,40を用いてex vivoでのマウス胚における血流のライブイメージングを行った。胚の成長のこの期間は初期の血管の発達と機能に関する重要な情報を明らかにすることができますので、これは、残念なことです。生きている胚内のマイクロバブルイメージングは​​、したがって、発達生理学の我々の理解に貢献する可能性があります。この技術は、既存の方法を置き換えるためにそうであるが、それはまた、リアルタイムで生体マウス胎児の全身におけるバイオマーカーの分布を可視化するために使用され得る(含む組織学胚組織における分子シグナルの測定のための蛍光イメージング)。胚における血管の急速に発展して質量が、しかし、密接に腫瘍血管41,42で識別された同じキーの受容体の多くの発現と、腫瘍の成長に似ており、従って、分子の定量的な能力を調べる研究のための優れた腫瘍の代理として機能することができる超音波。したがって、我々は、記載の方法は、機能イメージングを通じて血管の健康と病気の胚のモデルを評価し、特徴付けるためだけでなく、有用であることを予想したが、同様に分子イメージングの長所と限界を探索するための手段を提供しています。そのアプリケーションは、マイクロバブルが胎児のマウス組織10に裸のDNAを送達する手段として試験された子宮内遺伝子導入療法含め、調査の他の興味深い領域に拡張することがあります。代替的に、生きている胚の3D血管のマッピングも可能であるその遺伝的に改変マウスにおける形態異常についての貴重な情報を提供することができる。孤立生き胚への超音波造影剤の導入は、したがって、血管疾患の我々の理解を高め、診療所に造影超音波アプリケーションを変換するための別のツールである可能性があります。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
  • rat isotype IgG2 control
eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose
Sigma D5796
  • 50 ml Fetal Bovine Serum
ATCC 30-2020 lot # 7592456
  • Hepes
Gibco 15630 5 ml, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco 15140-122 5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 ml BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 ml Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 ml VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110 °C VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48, (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47, (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37, (S1), 65 (2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260, (2), 581 (2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images - Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242, (1), 162 (2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26, (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. IEEE. New York, NY. (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110, (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5, (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48, (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40, (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, ten, P,, Hawinkels, L. J. A. C. Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17, (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10, (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121, (121), Humana Press. Totowa, NJ. 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47, (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51, (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258, (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26, (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18, (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. Angiogenesis. Press. (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36, (12), 2097 (2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20, (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre,, Y,, et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17, (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13, (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Live imaging of mouse embryos. 4, (4), Cold Spring Harbor. 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103, (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3, (8), (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics