Contrast Imaging in embrioni di topo Utilizzo ad alta frequenza Ultrasound

Developmental Biology

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Summary

Qui, vi presentiamo un protocollo per iniettare mezzi di contrasto ecografici microbolle in vita, isolata tardo-gestazione di embrioni murini stage. Questo metodo consente lo studio dei parametri di perfusione e di marcatori molecolari vascolari all'interno dell'embrione con mdc alta frequenza ecografica.

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Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

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Abstract

Introduction

Mdc ecografia fa uso di mezzi di contrasto microbolle di visualizzare e caratterizzare l'ambiente vascolare. Questi agenti consentono la valutazione non invasiva del microcircolo, vascolarizzazione e la funzione cardiovascolare. Inoltre, la modifica della superficie bolla può provocare microbolle mirate legame biomarker endoteliali, come dimostrato in applicazioni preclinici di angiogenesi, aterosclerosi e infiammazione 1,2 rendendo molecolare ecografico di eventi vascolari possibili. Ultrasuoni può quindi essere utilizzato per identificare gli ambienti complessi e diversi che influenzano gli stati vascolari sani e malati 3-5.

Nel numero ultimi anni, l'interesse per l'utilità dell'imaging microbolle ha esteso il modello di topo embrione versatile. Come un modello di sviluppo dei mammiferi, l'introduzione di microbolle nel sistema vascolare embrionale migliora fisiologicostudio del sistema circolatorio in via di sviluppo (ad esempio, il flusso di sangue, la gittata cardiaca) e in caso di transgenici e mirati modelli mutanti murini di malattie cardiache 6,7, può produrre intuizioni come i fattori genetici alterare la funzione cardiovascolare. In realtà, 2D quantitativa e qualitativa di analisi vascolare cerebrale embrionale sono già stati raggiunti 8. Inoltre, l'embrione del mouse presenta come un ottimo modello per esaminare il legame di microbolle mirati ai marcatori vascolari in vivo. Bartelle et al. 9, per esempio, hanno introdotto microbolle avidina in embrione ventricoli cardiaci per valutare bersaglio 'vincolante Biotag-Bira embrioni transgenici ed esaminare l'anatomia vascolare. La generazione di modelli eterozigoti e omozigoti mouse può essere utilizzato anche come un surrogato per studi su modelli tumore volti a definire la natura quantitativa degli ultrasuoni molecolare - un punto di riferimento importante nel tradurre questa tecnica per la clinica.

8-10. In iniezioni utero, tuttavia, affrontare una serie di sfide. Questi includono una guida di iniezione, la necessità di contrastare il movimento nella madre ed embrione esteriorizzato, manutenzione della viabilità emodinamica nella madre ed embrioni esteriorizzato, affrontando gli effetti a lungo termine di anestesia e complicazioni dovute al sanguinamento 11. Pertanto, l'obiettivo della ricerca è stato quello di sviluppare una tecnica per l'iniezione di microbolle in isolato di vita in fase avanzata di embrioni 12. Questa opzione offre maggiore libertà in termini di controllo dell'iniezione e posizionamento, riproducibilità del piano di imaging senza ostacoli, e analisi di immagine semplificata e quantificazione.

Nel presente studio, si delineano una nuova procedura per l'iniezione di microbolle in vita embrioni murini for fini di studio del comportamento cinetico microbolle e di studiare legame marcatori di superficie endoteliali endogeni microbolle mirati. Contrasto non lineare specifica ecografia viene utilizzato per misurare una serie di parametri di perfusione di base tra cui la valorizzazione di picco (PE), lavare-in rate e il tempo di picco (TTP) in isolati embrioni E17.5. Abbiamo inoltre dimostrato la validità del modello dell'embrione per valutare la natura quantitativa degli ultrasuoni molecolare in una perdita endoglin embrionale di modello di topo transgenico funzione, dove endoglin è un obiettivo clinicamente rilevante a causa della sua elevata espressione in cellule endoteliali vascolari in siti di angiogenesi attiva 13 . L'adesione di endoglin mirati (MB E), topo IgG 2 di controllo (MB C) e non mirati (MB U) microbolle viene valutato in endoglin eterozigoti (Eng +/-) e endoglin omozigote (Ita + / +) esprimendo embrioni. Analisi della bindi miratang rivela che gli ultrasuoni molecolare è in grado di distinguere tra genotipi endoglina e relativa densità dei recettori per i livelli quantificabili ultrasuoni molecolare.

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Protocol

NOTA: Le procedure sperimentali eseguite in questo studio sono stati approvati dal Comitato per animali al Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada). Procedure per il trattamento umano degli animali devono essere rispettate in ogni momento. Si presume che il ricercatore è addestrato nel funzionamento di base di un sistema di imaging ad ultrasuoni. Questo protocollo funziona meglio con due persone.

1. Modelli animali

  1. Mate CD-1 maschile e femminile Mus musculus di ottenere embrioni wild type per gli studi di perfusione.
  2. Per gli studi di imaging molecolare, generare Eng +/- topi per ricombinazione omologa utilizzando cellule staminali embrionali di 129 / Ola origine come descritto da Bourdeau et al. 14.
    1. Topi backcross B6- Eng +/-, gentilmente acquisiti dal Dr. Michelle Letarte, il CD-1 di sfondo. Uso Eng +/- CD-1 embrioni reincrociata, nonché la loro Eng + / + littermate controls. Mate i topi di produrre embrioni in scena.

Preparazione 2. sperimentale

  1. Iniziato accoppiamento di topi e verificare spine quotidiana. Giorno embrionale 0.5 è definito come ore del giorno un tappo vaginale è osservata.
  2. Preparare i media embrione aggiungendo 50 ml di siero fetale bovino, 5 ml di 1 M HEPES e 5 ml di penicillina-streptomicina (10.000 unità di penicillina, 10.000 mg di streptomicina) per 500 ml modificata mezzo di Eagle di Dulbecco (DMEM) con alte concentrazioni di glucosio (4.500 mg / L). Avvolgere la bottiglia in alluminio e mantenere refrigerati a 4 ° C.
  3. Centrifuga chiaro gel per ultrasuoni in 50 ml provette coniche a 140 xg per 20 min. Disegna gel up in 30 ml siringhe. Riempire supplementari (contrassegnati) 30 ml siringhe con tampone fosfato salino (PBS) e mettere da parte. Una cucciolata di embrioni generalmente richiederà tra 2-3 siringhe di gel per ultrasuoni e 4 siringhe di PBS.
  4. Tirare circa 30 aghi di vetro e fissare delicatamente per una striscia di plastilinain un piatto di coltura cellulare 100 x 20 mm. Questo assicura che gli aghi vengono separati e sicura durante la movimentazione. Utilizzando un estrattore di vetro, utilizzare le seguenti impostazioni su 1 x 90 mm capillari di vetro con filamento: Heater 77, Sub magnete 55, magnete principale 70.
  5. Preparare 11:50 piastre dissezione (sufficienti a garantire che ogni embrione all'interno di una cucciolata riceverà il proprio piatto), con un rapporto di 1: 8 volume di agente indurente alla base. Versare 40 ml di base in una provetta conica da 50 ml. Aggiungere 5-6 ml agente indurente e mescolare con bastone di legno.
    1. Versare in 60 x 15 mm piatti della cultura, riempiendo ogni a circa la metà. Lasciate riposare O / N per impostare.
  6. Attaccare Luers femminili a 400 mm lunghi pezzi di cloruro di polivinile (PVC) tubo (diametro interno: 0,79 millimetri). Il tubo deve raggiungere dalla pompa siringa al palco ultrasuoni comodamente.

3. set-up sperimentale

  1. Disporre la piattaforma di imaging sotto il microscopio operatorio con un motore 3D e lineare 21 MHtrasduttore z.
    1. Posizionare la piattaforma in modo che la rotaia di montaggio è a sinistra, con la fase posizionato direttamente sotto il microscopio.
    2. Fissare il motore 3D al giunto sferico del braccio della piattaforma allungabile. Avvitare il posto sgancio rapido del morsetto trasduttore nella sgancio rapido montaggio sul motore, rivolto in avanti, e posizionare la testina del trasduttore nel morsetto, fissare il fermo.
    3. Fissare il connettore del trasduttore nella porta attiva sul pannello frontale del carrello. Accendere la macchina.
  2. Avviare il 21 MHz trasduttore ad ultrasuoni, selezionando l'impostazione 'Cardiologia' per gli studi di imaging molecolare, e 'generale' per gli studi di perfusione. Maiusc tutti i cursori guadagno indennizzo tempo in posizione centrale esatta. Per 'la modalità di contrasto', impostare i seguenti parametri: Frequenza: 18 MHz, la potenza di trasmissione: 4%, (0,39 MPa), contrasto Guadagno: 30 dB, Foci: 6 e 10 mm, contrasto Modalità: Nonlinear, tempo di Burst: 100% a 0.1larghezza sec, Larghezza: largo.
  3. Aliquota mezzi embrione 40 ml ciascuno in quattro 50 ml provette coniche. Mettere in ghiaccio.
  4. Riscaldare 1 L di acqua in un becher 2 L su una piastra calda. Mantenere a 45 ° C. Aggiungere una siringa di ultrasuoni gel e PBS al becher per preriscaldare. Mantenere questa temperatura per monitoraggio con un termometro in ogni momento.
  5. Mettere da parte dieci a dodici 1 ml siringhe e dieci a dodici 21 aghi G per l'iniezione di microbolle.

4. Procedura chirurgica

NOTA: Avere un assistente preparare le bolle (fase 5) mentre il chirurgo inizia la procedura chirurgica. Il protocollo qui descritto è stato adattato da Whiteley et al. 15

  1. Raccogliere E16.5 E17.5 embrioni o dalla femmina incinta del mouse seguenti dislocazione cervicale.
    NOTA: Gli effetti dell'anestesia sugli embrioni non sono ancora stati studiati in dettaglio 16. Metodi aggiuntivi, tra cui la decapitazione, può essere appropriato opzioni per il sacrificio dei topi in gravidanza.
    1. Taglio aperto l'addome per rivelare l'utero e gli embrioni. Accuratamente e rapidamente rimuovere l'utero tagliando le punte delle corna uterine (recisione dei vasi ovarici e uterini) e recidere alla vagina e vescica.
    2. Utilizzando pinze scheggia, trasferire l'utero in una provetta da 40 ml di ghiacciata embrione supporti più rapidamente possibile senza danneggiare gli embrioni. Eliminare la carcassa del mouse.
  2. Spostare al microscopio e stage. Deposito dell'utero in un piatto di coltura cellulare 100 x 20 mm. Trasferire l'utero in un nuovo piatto pieno di 50 ml di mezzi di embrioni freschi.
  3. Utilizzando sterilizzati (70% di etanolo a spruzzo) pinza sottile, strappare delicatamente e tirare via le membrane esterne dell'utero partire da una estremità. Esporre il decidua placentare, parietale sacco vitellino e la membrana di Reichert per separare e rimuovere dal sottostante viscerale sacco vitellino.
  4. Sezionare gli embrioni uno per uno, mantenendo la y visceralesac olk intatti e movimentazione la placenta più delicatamente possibile 17. Fare attenzione ad evitare la rottura del sacco vitellino, come gli embrioni pop fuori immediatamente.
    1. Utilizzare il cucchiaio forato per spostare gli embrioni di un altro piatto tenuti in ghiaccio con i media embrione fresco. Mantenere gli embrioni refrigerate fino a quando necessario. Modificare i media nel piatto embrione ogni 1-1,5 ore. Con queste condizioni embrioni sono vitali per un massimo di 4 ore dopo la dissezione.

5. microbolle Preparazione

NOTA: eseguire l'imaging molecolare con ultrasuoni con entrambe le microbolle mirati e non mirati. Un singolo esperimento può richiedere fino a 3 fiale separate di microbolle: microbolle i) anticorpo mirato microbolle, ii) l'anticorpo controllo isotipico mirati e iii) microbolle non mirati. L'agente di contrasto si presenta come una polvere secca antigelo e deve essere ricostituito con soluzione salina prima dell'iniezione. Ci sono ~ 2 x 10 9 microbolle in ogni MicroB non mirativial ubble e ~ 8.8 x 10 8 microbolle nei destinazione fiale pronte. Le microbolle sono stabili per un massimo di 3 ore dopo la ricostituzione.

  1. Ricostituzione del target pronti Fiale
    NOTA: Esempi di bersaglio preparati pronti: endoglina microbolle mirati (MB E, con topo biotinilato MJ 7/18 anticorpi di topo endoglin, in casa struttura ibridoma); fattore di crescita vascolare endoteliale recettore 2 (VEGFR2) microbolle mirati (MB V, con biotina anti-topo CD309); topo isotipo anticorpi IgG 2 di controllo mirati microbolle (MB C, biotina topo IgG 2 di controllo di targeting del mouse IgG2a).
    1. Diluire la soluzione di anticorpi (20 mg) in 1 ml (volume finale) di soluzione salina. Mantenere su ghiaccio.
    2. Riempire la siringa con 1 ml di soluzione fisiologica, rimuovendo tutte le bolle d'aria. Collegamento di un G 21 ago, iniettare la soluzione lentamente nel flaconcino di microbolle.
    3. Lentamente ritirare lo stantuffo, eliminando 1 ml di aria, ed estrarre l'ago. Delicatamenteagitate. Lasciate riposare 5 minuti in ghiaccio.
      NOTA: microbolle ultrasuoni possono essere distrutti in ambienti ad alta pressione.
    4. Dopo il tempo trascorso, riempire una nuova siringa con la diluizione degli anticorpi e aggiungere alla fiala appropriata. Agitare delicatamente. Lasciate che la miscela (ora 2 ml) riposare per 10 min. Mantenere su ghiaccio. Assumendo completa coniugazione di superficie, il numero medio di ligando legato per le microbolle è di circa 18 7.600 ligandi / micron 2.
  2. Ricostituzione di non mirato Fiale
    1. Riempire la siringa con 1 ml di soluzione fisiologica, rimuovendo tutte le bolle d'aria. Collegamento di un G 21 ago, iniettare la soluzione lentamente nel flaconcino di microbolle.
    2. Lentamente ritirare lo stantuffo, eliminando 1 ml di aria, ed estrarre l'ago. Agitare delicatamente. Lasciate riposare 5 min. Aggiungere un ulteriore 1 ml di soluzione salina, come descritto sopra. Agitare delicatamente e lasciare riposare 10 minuti in ghiaccio.
  3. Coulter Conteggio
    1. Agitare delicatamente il flacone microbolle desiderato e disegnare ~50 microlitri della soluzione in una siringa da 1 ml con l'ago 21 G. Iniettare le microbolle in un 2 ml provetta vuota.
    2. Pipettare un campione di 10 microlitri di microbolle soluzione madre in 10 ml di diluente.
    3. Dopo miscelazione delicata, di valutare le distribuzioni di concentrazione e le dimensioni della popolazione di microbolle utilizzando conteggio Coltro (vedi elenco dei materiali). Contare un minimo di tre misurazioni 50 microlitri (per campione flaconcino) utilizzando un diaframma 30 micron.
  4. Le microbolle Preparazione per iniezione
    NOTA: L'assistente esegue questo passaggio quando 'iniezione di microbolle in embrioni' (punto 6) è iniziata. Ogni embrione viene iniettato una volta, con il tipo di microbolle scelto per ogni iniezione per selezionare casualmente dal assistente tale che tutti i tipi di microbolle sono distribuiti uniformemente in tutta la procedura ma dato in un ordine casuale. Assicurarsi che il chirurgo è cieco al tipo di bolla viene iniettato.
    1. Determinare the volume della soluzione madre bolla richiesto per produrre una concentrazione finale di 1 x 10 8 MB ​​/ ml in un volume di 400 microlitri (calcolare il volume utilizzando le concentrazioni misurate in archivi 5.3.3). Aliquotare il corrispondente volume di soluzione salina in una provetta vuota.
    2. Agitare delicatamente il flaconcino microbolle selezionato e disegnare un volume in eccesso (~ 50 microlitri maggiore di quello calcolato sopra) della soluzione in una siringa da 1 ml con l'ago 21 G. Iniettare le microbolle in una provetta vuota.
    3. Pipettare il volume necessario di microbolle soluzione madre e aggiungere alla aliquota di soluzione salina. Mescolare agitando delicatamente con la punta della pipetta.
    4. Aspirare la soluzione di microbolle diluita in una siringa pulita utilizzando l'ago 21 G. Rimuovere l'ago, eliminare eventuali bolle d'aria dalla siringa e collegare il luer e il tubo. Lentamente spingere la soluzione alla fine del processo tubo sicuro non generare eventuali bolle d'aria.
    5. Inserire il Syringe in una pompa a siringa per infusione impostato per erogare le microbolle ad una velocità di 20 ml / min per un volume totale di 20 microlitri. Attaccare un ago di vetro tirato alla estremità del tubo. Spostare la pompa vicino alla fase di iniezione.

6. Iniezione di microbolle in embrioni

  1. Casualmente selezionare e rimuovere (con il cucchiaio forato) un embrione dal piatto mezzi refrigerati. Mettere nel piatto dissezione situato sul palco ultrasuoni sotto lo stereoscopio e rimuovere il sacco vitellino e membrane amniotiche con le belle pinze, taglio / strappo dal lato che appare almeno vascolarizzato (lato antimesometrial). Questo è più facilmente ottenibile dalla perforazione un'area adiacente alla regione della testa.
    1. Tagliare sufficiente per rimuovere l'embrione all'interno, ma non di più. Stabilizzare i piatti dissezione utilizzando piccoli pezzi di plastilina.
  2. Manovrare delicatamente la sacca da tutto l'embrione. Posizionare l'embrione su un lato, con la placenta evasi ombelicali di fronte. Utilizzando i perni di insetti, fissare il sacco vitellino (4 pin consigliato) e bordi della placenta se necessario per apporre sul posto. Evitare grossi vasi.
  3. Lavare l'embrione con pre-riscaldato a 45 ° C fino a quando l'embrione PBS ravviva. Identificare la vena ombelicale e la sua rete vascolare associata. Posizionare il piatto in modo che l'iniezione può essere fatto comodamente.
    NOTA: Una volta riscaldato, il sangue nell'embrione inizierà a fluire, visibilmente pompaggio nell'arteria ombelicale. Quando il flusso inizia prima, le vene sarà un rosso brillante, con il sangue in entrambe le navi che appare rapidamente identici. I rami derivanti dalla vena ombelicale solito sovrappongono quelli ombelicale sulla superficie placentare.
  4. Una volta che l'embrione ha fatto rivivere, coprirla (ma non la placenta) con il gel US pre-riscaldato, avendo cura di rimuovere delicatamente eventuali bolle d'aria (utilizzando le belle pinze) provenienti da tutto il embrione. Riempire il piatto con pre-riscaldato PBS.
    NOTA: Tenete d'occhio il livello di solutiin in siringhe PBS e gel e aggiungere siringhe backup bicchiere di riscaldamento, se necessario.
  5. Montare l'ago di vetro su una grande palla di plastilina sul bordo del piatto dissezione e inserire l'estremità ago nel PBS. La scelta di una vena sulla superficie corionica del disco placentare, come lontano dal ramo principale ragionevole, tagliare la punta di dimensione con le forbici. Injection è più facile se la punta è tagliato con una leggera angolazione. Rimuovere eventuali bordi frastagliati del vetro con il bordo delle forbici primavera.
  6. Utilizzando la pompa a siringa, iniettare lentamente la soluzione microbolle a 20 microlitri / min nel ago di vetro fino a quando tutta l'aria viene espulsa dalla punta dell'ago e microbolle può essere visto di fluire liberamente nel PBS. Fermare la pompa e ripristinare un volume di iniezione di 20 ml. Non lasciare entrare aria sistema vascolare dell'embrione durante l'iniezione.
  7. Inserire la punta dell'ago bicchiere delicatamente in una delle vene nella placenta e assicurarsi che sia immobile. Scivoli via il steretesta oscope e la posizione del trasduttore sopra l'embrione. Avviare imaging.

7. Ultrasound Imaging Molecolare

NOTA: Utilizzando le condizioni di contrasto di imaging non lineari stabilite in precedenza, posizionare il trasduttore in modo che l'embrione si trova in modo uniforme tra i fuochi a 6 e 10 mm. Una volta posizionato, avviare il bolo delle microbolle. Quando l'iniezione è completa, avviare il timer.

  1. Perfusion Imaging
    1. Assicurarsi che il numero massimo di fotogrammi per la modalità di contrasto non lineare viene selezionato premendo il tasto 'di gestione di studio' e cliccando sulla scheda 'Preferenze "nella parte superiore del browser studio. Selezionare la casella appropriata nella finestra 'Preferenze'.
    2. Regolare le impostazioni di imaging avviando immagini non lineare. Premere il pulsante 'modalità di contrasto' sul pannello di controllo. Affinare il guadagno 2D regolando il 'guadagno & #8217; quadrante a 30 dB, ridurre la potenza di 4% con il 'potere' dial, diminuire la frequenza di 1 Hz utilizzando la 'frequenza' dial e impostare la larghezza del fascio (in basso a sinistra) al largo usando il rullo / mouse.
      NOTA: Tutti i comandi sono situati sul pannello di controllo del sistema a ultrasuoni.
    3. Cattura l'intero wash-in e dissipazione del bolo microbolle registrando un ciclo cine 20 minuti a un frame rate di 1 Hz. Premere scan / freeze per avviare l'acquisizione dei dati.
    4. Una volta che l'intera sequenza di immagini è stata catturata, premere il tasto 'negozio cine' situato sul pannello di controllo per salvare la sequenza di immagini nel buffer del sistema. Il sistema crea un cine loop di data-timbrata delle lineari dati del modello di contrasto acquisiti.
  2. Mirata microbolle Imaging
    1. Sotto 'Preferenze', impostare il tempo di scatto di 0,1 sec. Impostare i parametri di imaging appropriati utilizzando i controlli desCribed sopra (7.1.2.).
    2. Avviare l'imaging contrasto non lineare premendo il pulsante 'modalità di contrasto' sul pannello di controllo. Verificare l'embrione è situato correttamente sotto il trasduttore e che il flusso del mezzo di contrasto microbolle attraverso l'embrione è visibile l'immagine in modalità di contrasto non lineare.
    3. Per valutare vincolante durante gli studi di imaging molecolare embrionali microbolle mirato, permettono le microbolle di circolare indisturbato per 3 min e 40 sec dopo il completamento dell'iniezione. Questa volta è consentire mantenimento delle microbolle circolanti. Premere 'scan / freeze' per fermare l'imaging in questo periodo.
    4. A 3 min e 40 sec, imaging curriculum per confermare che l'embrione è ancora visibile, è adeguatamente coperto con PBS, e che microbolle continuano a circolare. Premere 'scan / freeze' per avviare l'imaging.
    5. Acquisire la sequenza di interruzione / rifornimento a 3 min e 50 sec dopo l'iniezione registrando un 'pre-distruzioneSequenza risposta acustica ne 'a 29 Hz. Premere 'scan / freeze' per avviare l'acquisizione dei dati. A 4 minuti dopo l'iniezione 18,19, avviare un 0.1 sec ad alta frequenza acustica raffica. Premere il pulsante 'raffica' di attuare una raffica.
    6. Continuare a registrare fotogrammi per il resto della sequenza (fino a quando la linea di buffer è pieno) e salvare il ciclo cine premendo 'archivio cine'.
    7. Raccogliere un ciclo cine supplementare di microbolle circolanti. Questo successiva sequenza di imaging 'post-distruzione' si assume che contenere solo circolanti segnali bolla che hanno rifornito la trave. Premere 'scan / freeze' per avviare l'imaging e 'negozio cine' per raccogliere le immagini.
    8. Etichettare i loop cine dopo l'imaging ogni embrione. Premere 'gestione studio', evidenziare il file usando il rullo e la 'selezionare', premere il pulsante 'etichetta immagine' e il nome appropriato.

    8. Gestione di embrioni dopo iniezione

    1. Immagini Post, spostare il trasduttore, sbloccare l'embrione e l'eutanasia (via decapitazione, dislocazione cervicale, anidride carbonica asfissia, o anestesia seguita da congelamento rapido o fissazione) come desiderato.
    2. Per ogni successiva iniezione embrione un piatto dissezione, aghi, siringhe e tubi segmento fresco deve essere utilizzato, con la preparazione del prossimo gruppo di iniezione microbolle soluzione che si svolgono durante la dissezione e la rinascita.
    3. Salva campioni di tessuto (ad esempio, la coda, cervello) per analisi supplementari (ad esempio, la genotipizzazione determinata mediante analisi PCR di coda DNA isolato, lacZ colorazione, o misure semi-quantitative di espressione biomarker con macchie occidentali 21).

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Representative Results

L'iniezione di mezzi di contrasto ad ultrasuoni nella ex utero embrioni di topo dipende l'isolamento successo viventi, embrioni fase tardiva gestazionale dall'utero e manutenzione della redditività nel corso dell'iniezione e relativo ecografica. Una volta che l'embrione è stato esteriorizzato e posizionato, come mostrato in Figura 1, è possibile accurata iniezione di mezzo di contrasto nel sistema vascolare embrionale. Una immagine ecografica B-mode tipiche di un embrione di topo E17.5 è mostrato in Figura 2A. Il wash-in di microbolle e corrispondente miglioramento nella vena cava inferiore, cuore, cervello, e in tutta animale possono essere acquisite utilizzando metodi di imaging contrasto non lineari, dimostrando così la fattibilità di questa tecnica. Punti di tempo individuali sono descritte nella Figura 2B e mostrano la variazione di contrasto nel tempo.

Registrando l'intero wash-in e wash-out of bolo microbolle, è possibile misurare vari parametri di perfusione. In un'analisi non in linea, lo strumento traccia regione contrasto è stato utilizzato per creare 1,5 mm 2 regioni di interesse (ROI) nelle embrionali emisferi cerebrali destro e sinistro. L'intensità media del segnale all'interno di questi ROI è stato quindi tracciata in funzione del tempo e filtrata usando un filtro mediano sette punti. Dalla curva di intensità contrasto risultante (Figura 2C), il miglioramento picco cervello è stato determinato. Il tasso di wash-in, definita come la pendenza tra il 10% e il 50% del massimo picco di enhancement (PE), è stato anche calcolato. Infine, il tempo di picco (TTP) è stata calcolata dalla comparsa di valorizzazione segnale al tempo di picco. Le differenze di parametri di perfusione medio di tutti i diversi tipi di bolla sono stati testati con t-test separati 12. Questi risultati riassunti nella Tabella 1, dimostrano che l'iniezione di microbolle fornisce un valuMetodo grado per l'accertamento di importanti parametri di perfusione nel topo sviluppo.

Introduzione di microbolle nel sistema vascolare embrionale permette anche l'utilizzo di embrioni di topo, come sistemi modello per definire e caratterizzare le capacità quantitative di imaging ad ultrasuoni molecolare. Nel seguente esempio, una perdita di modello di funzione, dove la manipolazione genetica ha generato modelli di espressione eterozigoti ed omozigoti di endoglin nei topi embrionali, è stato utilizzato per testare la capacità di ecografia molecolare per distinguere tra genotipi. Dopo l'iniezione e l'attuazione di immagini distruzione / rifornimento microbolle, il rapporto tra l'intensità media del segnale di 'pre-distruzione' sequenze 'post-distruzione "è stato utilizzato per produrre una misura del segnale molecolare chiamato contrasto significa rapporto di potenza (CMPR ). Un modello misto lineare (con correzioni di Bonferroni fatte per confronti multipli) è stata eseguita per accertare w he non vi era alcuna differenza significativa tra endoglin mirate, di controllo e di microbolle non mirati vincolante Eng + / + o embrioni Ita +/- (iniezione posto che tramite reazione a catena della polimerasi (PCR) dei campioni di coda). I mezzi CMPR stimate (media ± 95% intervallo di confidenza (CI)) sono presentati per ogni microbolle e embrione tipo in figura 3 e sono riassunti nella tabella 2.

Questi risultati forniscono una dimostrazione concreta che l'iniezione di mezzi di contrasto ecografici a isolate embrioni di vita può essere raggiunto. Inoltre, questo protocollo facilita la valutazione dei parametri di perfusione e può essere usato per confrontare vincolante in modelli embrioni di malattia vascolare, nel tentativo di spiegare le capacità di imaging ad ultrasuoni molecolare microbolle mirate.

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Figura 1. set-up sperimentale per l'iniezione di microbolle in embrioni isolati. A 21 MHz lineare trasduttore è posizionato sopra una esteriorizzato E16.5 vita dell'embrione come soluzione microbolle 20 l viene iniettato in una vena placentare con una cannula di vetro. Barra di scala = 10 mm. Da Denbeigh, JM et al. 12 con il permesso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Ecografia di esteriorizzato Living E17.5 embrioni. (A) B-mode ultrasuoni immagine di un embrione. Prima dell'iniezione di microbolle mirate (t = 0 sec). (B) contrasto immagine non lineare dell'embrione prima e dopo l'iniezione di microbolle. Contrasto non lineare immagine prio microbolle iniezione (t = 0 sec). Solo le interfacce fortemente riflettenti (ad esempio, osso) sono visibili, con il segnale minima dai tessuti molli. Qui di seguito, l'immagine non lineare contrasto di microbolle all'interno dell'embrione a t = 50 sec, t = 120 sec e t = 420 sec dopo una iniezione in bolo. Contrasto viene rilevato durante l'animale, compreso il cuore e il cervello. Parametri (C) perfusione derivate da curve intensità di tempo. Intensità trama di microbolle in funzione del tempo all'interno di una singola ROI nel cervello embrionale. Parametri di perfusione sono identificati sul grafico, tra cui il miglioramento di picco (PE), lavare-in rate (pendenza), e il tempo di picco (TTP). Frecce: R = costole, Ht = cuore, Br = cervello. au, unità arbitrarie; ROI, regione di interesse; sec, secondi. Barra di scala = 3 mm. Questo dato è stato modificato da Denbeigh, JM et al. 12. Cliccate qui per vedere una più grandeversione di questa figura.

Figura 3
Figura 3. rapporti di potenza Sintesi del contrasto media media (CRPM) per endoglin mirato (MB E), di controllo (MB C) e non mirati microbolle (MB U) in Eng + / + e embrioni Eng +/-. CMPRs da endoglin mirati microbolle erano significativamente più alti (***, p <0.001) rispetto a quelli raccolti per MB C e MB U, (non significativamente diversi tra loro, indipendentemente dal genotipo). MB E vincolante è risultato essere significativamente più alto in Ita + / + embrioni (marcatori scuro) rispetto aEmbrioni Eng +/- (marcatori di luce). I risultati presentati come media ± intervallo di confidenza del 95%. n indica il numero di embrioni unici in ciascuna categoria. Da Denbeigh, JM et al. 22 con il permesso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Microbolle Type T-test
p-value
Perfusion Parametro MB U MB C MB V MB U vs MB C MB U vs MB V MB <sub> C vs MB V
Peak Enhancement, PE (au) 0,427 ± 0,063 0,490 ± 0,079 0,499 ± 0,064 0.19 0.06 0.81
Lavaggio a rate (au / sec) .008 ± .002 .009 ± .002 0,011 ± .002 0.18 0.01 0.09
Time to Peak, TTP (sec) 53.75 ± 7.96 51.75 ± 4.46 45.00 ± 5.33 0.55 0.03 0.03
# embrioni iniettati 4 4 3

Tabella 1. Sintesi della E17.5 parametri di perfusione embrionale. Media ± deviazioni standard derivati ​​da terreni intensità di tempo per tutte le ROI embrione (a.u. = Unità arbitrarie). La tabella include misure per non mirati (MB U), IgG 2 di controllo mirato (MB C) e VEGFR2 mirata (MB V) microbolle. T-test separati sono stati eseguiti per confrontare gruppi. Questa tabella è stata modificata da Denbeigh, JM et al. 12.

Tipo di microbolle Genotipo CMPR Media 95% Intervallo di confidenza
MB E Eng + / + 9.71 9.05, 10.38
Eng +/- 5.51 4.87, 6.15
MB C Eng + / + 1.42 0.41, 2.43
Eng +/- 1.46 0.45, 2.47
MB U Eng + / + 1.7 0.65, 2.75
Eng +/- 1.76 0.67, 2.84
Modello lineare mista: tra i soggetti Effects
df F valore p
Genotipo 1 12.75 <0.001
Tipo di microbolle 2 147.65 <0.001
Genotipo * Tipo di microbolle 2 18.29 <0.001

Tabella 2. Sintesi di analisi lineare modello misto permicrobolle vincolante embrioni, con una correzione di Bonferroni per confronti multipli. Genotype, digitare microbolle e l'interazione combinata (genotipo * Tipo di microbolle) sono risultati essere fattori importanti nel determinare CMPR. df = gradi di libertà. Da Denbeigh, JM et al. 22 con il permesso.

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Discussion

Mezzi di contrasto ecografici sono state iniettate in fase tardo-embrioni di topo di gestazione e le immagini di contrasto non lineari sono stati acquisiti per misurare parametri di perfusione e mirato microbolle vincolanti. Immagini di successo di microbolle all'interno di vasi embrionali era dipendente da una serie di fattori, il primo embrione di essere redditività. Tutte le attrezzature ed apparecchi sono stati preparati in anticipo in modo da minimizzare il tempo necessario per l'isolamento di embrioni dall'utero all'inizio dell'iniezione. Poiché gli effetti di esposizione singola o ripetuta all'anestesia sui topi embrionali non sono stati studiati in dettaglio, l'uso di anestesia nella madre è stata evitata prima del sacrificio 16. Durante isolamento embrione, era importante evitare di danneggiare il sacco vitellino e di garantire gli embrioni sono stati refrigerati ad ogni momento, nei media embrione frequentemente aggiornati. Quando esteriorizzando l'embrione prima dell'iniezione e durante pinning, grandi vasi vitellina sono stati evitati per limitare la likelihood di sanguinamento, che potrebbe essere letale. Abbiamo scoperto che quando rivivere l'embrione, che era meglio per coprire prima la placenta e quindi l'embrione con PBS, prima di applicare il gel ultrasuoni per l'embrione in un movimento avanti e indietro e la rimozione di tutte le grandi bolle con una pinza. Il resto della piastra di Petri è stata poi riempito con PBS. L'uso di gel e PBS limitata la possibilità di sacche d'aria tra l'embrione e il trasduttore, che possono influire qualità dell'immagine. Come l'embrione rianimato, il sangue ha cominciato a scorrere, visibilmente pompaggio nell'arteria ombelicale, mentre le vene ombelicali apparsi rosso brillante 23. Per riferimento, i rami derivanti dalla vena ombelicale solito sovrappongono quelli ombelicale sulla superficie placentare. Anche se era possibile iniettare nelle arteriole labirinto placentari, iniettando le microbolle in direzione di iniezioni flusso ridotto placentare sanguinamento e venule anche permesso ai microbolle di passare direttamente attraverso l'embrione prima th circolantiruvida la placenta.

A causa della loro fragilità, la preparazione e la manipolazione di microbolle inoltre richiesto la cura. Microbolle ultrasuoni possono essere distrutti in ambienti ad alta pressione. Pertanto, esattamente la stessa procedura è stata ripetuta durante ogni bolla ricostituzione e la concentrazione è stata misurata per garantire la coerenza sperimentale. Una singola fiala di microbolle era tipicamente sufficiente per circa 5-7 embrioni. Poiché le microbolle sono stabili nel flaconcino fino a 3 ore, più flaconi sono spesso necessari per un singolo esperimento. Per evitare di strappare il tessuto, era meglio per la punta di vetro dell'ago iniezione per essere forte e tagliato su una leggera angolazione, mentre si avvicina la nave al più piccolo un angolo il più possibile. Una volta tagliata, la punta dell'ago doveva essere abbastanza grande per le bolle di fluire facilmente attraverso alla fine senza grumi, ma abbastanza piccolo da entrare facilmente all'interno del vaso. La dimensione ideale era generalmente <100 micron. Alcune pratiche a giudicare appropriatodimensione era necessario. Nel caso in cui la punta è stato tagliato troppo grande, o divenne bloccato, un nuovo ago vetro è stato applicato. Esso alcuni casi, è stato possibile tagliare l'ago leggermente sopra il blocco. Era fondamentale che l'aria non sia permesso di entrare sistema vascolare dell'embrione durante l'iniezione, in quanto ciò potrebbe causare la morte dell'animale ed era indesiderabile durante l'imaging (bolle d'aria potrebbero alloggiare in vascolare dell'embrione ed essere rilevabile l'immagine ecografica in , aumentando artificialmente qualsiasi segnale misurato). L'imaging contrasto non lineare eseguita in questo protocollo utilizzato uno stato dell'arte ad alta frequenza (21 MHz) sistema di micro-ultrasuoni (Vevo2100) in coppia con gli array lineari specificamente progettati per le piccole immagini animali (MS250). Micro o ad alta frequenza -Ultrasuoni è una delle poche modalità in grado, in questo momento, per fornire immagini ad alta risoluzione di vivere embrioni murini e neonati 16. Questo sistema può ottenere risoluzioni assiali e laterali di 75 micron e 165 μm rispettivamente a profondità grandi come 15 mm. E 'stato quindi possibile per l'immagine dell'intero embrione molto più alti risoluzioni di genere raggiunto con strumenti clinici e il segnale acustico di microbolle può essere distinto dal tessuto con metodi di imaging contrasto non lineari (tra cui l'inversione di impulso e di tecniche di modulazione di ampiezza 24). Anche se abbiamo avuto il miglior successo con le impostazioni ultrasuoni qui descritte, è possibile che alcune aggiustamento a questi parametri anche produrre risultati soddisfacenti. In tutti i casi, è richiesta una bassa potenza per l'imaging microbolle per evitare la distruzione delle microbolle indesiderabili prima dell'inizio di una raffica, mentre il breve raffica elimina solo una piccola frazione della popolazione di microbolle. Con la pratica, l'intera procedura per un singolo embrione, dal posizionamento della realizzazione ecografica molecolare, ha circa 15 min. Abbiamo iniettato con successo ben 12 embrioni da una cucciolata inuna singola sessione.

Esperimenti iniezione sono state limitate ad una finestra 4 ore a causa della limitata redditività degli embrioni. Poiché la distribuzione di microbolle dipendeva la circolazione dell'embrione stesso, le iniezioni non potrebbe avvenire prima del battito cardiaco (E8.5) e il flusso rilevabile nel vitellina e della circolazione ombelicale (E9.5) è stato istituito 25. Con la maturazione della placenta non è completa fino a quando E14.5, l'iniezione di mezzi di contrasto attraverso il labirinto placentare è stata limitata agli embrioni di metà alla tarda età gestazionale. Sulla base di osservazioni, embrioni più vicini a termine erano più resistenti e possono sopportare un aumento del loro volume vascolare meglio rispetto ai loro colleghi più giovani. Insieme, questi fattori ristrette contrasto migliori ecografia di imaging del sistema vascolare embrionale alle successive fasi di sviluppo e di crescita angiogenico. Questo potrebbe influire sulla disponibilità di modelli di topi transgenici, in quanto la manipolazione dei recettori coinvolti in Vascsviluppo lare e la manutenzione (ad esempio, VEGFR2, VCAM-1) può portare a letalità embrionale o difetti nello sviluppo e la regolamentazione dei sistemi circolatorio embrionali 26,27. Tuttavia, un certo numero di sistemi modello sono disponibili per biomarcatori vascolari di interesse, tra cui α 2 β 1 28, v α β 3 29, piastrine di adesione delle cellule endoteliali molecola-1 30, e l'adesione delle cellule vascolari molecola-1 31, molecola di adesione intercellulare -1 32 -2 e 33 e P-selectina 34. Per di più, istogenesi cervello comincia dopo la metà della gestazione 11, rendendo l'espressione di marcatori angiogenici in questo tessuto probabile e fornendo così una valida alternativa al modello tradizionale di tumore per gli studi che valutano gli aspetti quantitativi imaging molecolare.

La natura ex vivo delle iniezioni non presentare alcuni limitations. È importante notare che dopo che gli embrioni sono stati rimossi dalla madre e il labirinto placentare forato, non è stato generalmente possibile (né auspicabile) fare iniezioni ripetute. Inoltre, isolando l'embrione dalla circolazione materna limita l'apporto di nutrienti e di O 2, e la salute embrionale dovrebbe deteriorarsi con il tempo. Mentre agghiacciante e rilancio prolunga la vitalità degli embrioni, essa può anche avere un impatto funzione cardiaca. Ad esempio, abbiamo osservato che gli embrioni isolati avevano una frequenza cardiaca ridotta (dati non inclusi, fare riferimento a Denbeigh et al. 12) rispetto a quelli precedentemente osservati in vivo 35. E 'quindi probabile che gli studi che valutano la fisiologia cardiovascolare non riflettere accuratamente le condizioni in vivo. Con pochi studi che caratterizzano l'emodinamica circolatori vivente del mouse fase tardiva embrionale, tuttavia, è difficile dire con certezza in che misura queste condizioni sperimentali possono alter funzione fisiologica. Una alternativa è quella di effettuare iniezioni in utero, sia attraverso una incisione laparoscopica 36 o attraverso il ventre della madre incinta direttamente 37, anche se questo approccio può presentare la propria serie di sfide 11. In alcuni casi, l'isolamento e l'esteriorizzazione dell'embrione possono anche provocare sanguinamento significativa dal sacco vitellino. Anche se abbiamo scoperto che potevamo inibire il flusso di sangue con gel per ultrasuoni, qualsiasi perdita significativa di sangue potrebbe influire la consegna e la concentrazione di microbolle, e questi animali sono stati esclusi dall'analisi. Infine, mentre l'isolamento fa limite materna e fonti embrionali di moto, moto periodico correlato all'attività cardiaca è inevitabile. Abbiamo deciso di immagine statica cervello al fine di esaminare direttamente l'effetto di espressione dei recettori segnale di microbolle mirata, ma l'attuazione di real-time motion compensato con mdc ecografia 38 maggioestendere gli studi ad altri organi.

Ci sono poche applicazioni di imaging che sono attualmente in grado di valutare il paesaggio vascolare dei vivi sviluppo embrione di topo. Alcuni studi hanno eseguito con successo l'imaging dal vivo del flusso sanguigno in ex vivo embrioni murini mediante Doppler spazzato-source tomografia a coerenza ottica 39,40, mentre la risonanza magnetica, la corrosione vascolare getta, tomografia microcomputed e la proiezione tomografia ottica sono stati realizzati postmortem 16. Questo è un peccato, dal momento che questo periodo di crescita embrionale può rivelare informazioni cruciali riguardanti precoce sviluppo e la funzione vascolare. Imaging microbolle all'interno di embrioni vivi potrebbe quindi contribuire alla nostra comprensione della fisiologia dello sviluppo. Potrebbe anche essere utilizzato per visualizzare la distribuzione biomarker in tutto il corpo del feto topo vivente in tempo reale, anche se questa tecnica è improbabile che sostituire i metodi esistenti (compresa l'istologiae di imaging fluorescente) per la misura del segnale molecolare in tessuto embrionale. La massa in rapida evoluzione delle navi in embrioni, tuttavia, ricorda da vicino la crescita del tumore, con l'espressione di molti degli stessi recettori chiave identificati in tumorale 41,42 e può quindi servire come un ottimo surrogato di tumore per gli studi che esaminano le capacità quantitative di molecolare ultrasuoni. Pertanto prevediamo che i metodi descritti saranno utili non solo per valutare e caratterizzare modelli embrionali di salute vascolare e malattie attraverso imaging funzionale, ma offre una strada per esplorare i punti di forza ei limiti di imaging molecolare pure. La sua applicazione potrebbe anche estendersi ad altre zone interessanti di indagine, tra cui la terapia in utero trasferimento genico dove microbolle sono stati testati come un mezzo per fornire DNA nudo fetale tessuti del mouse 10. In alternativa, la mappatura vascolare 3D dell'embrione vivente è anche possibile,che possono fornire informazioni preziose per le anomalie morfologiche in topi geneticamente modificati. L'introduzione di mezzi di contrasto ecografici in isolati embrioni vivi potrebbe dunque essere un altro strumento per aumentare la nostra comprensione delle malattie vascolari e traducendo applicazioni ultrasuoni con intensificazione di contrasto alla clinica.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
  • rat isotype IgG2 control
eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose
Sigma D5796
  • 50 ml Fetal Bovine Serum
ATCC 30-2020 lot # 7592456
  • Hepes
Gibco 15630 5 ml, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco 15140-122 5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 ml BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 ml Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 ml VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110 °C VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

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References

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