Imagem Contraste em embriões de camundongos Usando de alta freqüência ultra-som

Developmental Biology

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Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para injetar agentes de contraste de microbolhas de ultra-som de estar, isoladas de fim de gestação de embriões palco murino. Este método permite o estudo de parâmetros de perfusão e de marcadores moleculares vasculares dentro do embrião usando de alta freqüência ultra-sonografia com contraste.

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Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

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Abstract

Introduction

Ultra-sonografia com contraste faz uso de agentes de contraste de microbolhas para visualizar e caracterizar o ambiente vascular. Estes agentes permitir a avaliação não invasiva da microcirculação, vascularização e função cardiovascular. Além disso, a modificação da superfície da bolha pode resultar em microbolhas de ligação orientada para biomarcadores endoteliais, como demonstrado em aplicações pré-clínicos de angiogénese, a aterosclerose e a inflamação 1,2 fazendo imagiologia de ultra-sons molecular de eventos vasculares possíveis. Com aumento de contraste de ultra-sons pode, portanto, ser usadas para identificar os ambientes complexos e diversos que influenciam estados vasculares saudáveis ​​e doentes 3-5.

No número últimos anos, o interesse pelo utilitário de imagem de microbolhas se estendeu para o modelo do rato embrião versátil. Como um modelo de desenvolvimento de mamíferos, introdução de microbolhas para a vasculatura embrionária aumenta fisiológicoestudo do sistema circulatório em desenvolvimento (por exemplo, o fluxo de sangue, o débito cardíaco) e nos casos de transgénicos e modelos de ratos mutantes alvo de doença cardíaca 6,7, pode produzir insights sobre como os fatores genéticos que alteram a função cardiovascular. De fato, análises 2D quantitativa e qualitativa da vasculatura cerebral embrionária já foram atingidos 8. Além disso, o embrião de rato apresenta-se como um excelente modelo para examinar a ligação de microbolhas orientadas para marcadores vasculares in vivo. Bartelle et al. 9, por exemplo, introduziram microbolhas avidina em embrião ventrículos cardíacas para avaliação alvejado obrigatório em embriões transgênicos BIOTAG-Bira e examinar a anatomia vascular. A geração de modelos de heterozigotos e homozigotos do mouse pode ser também ser utilizado como um substituto para estudos de modelos tumor com o objetivo de definir a natureza quantitativa de ultra-som molecular - uma referência importante na tradução dessa técnica para a clínica.

8-10. Em injeções útero, no entanto, enfrentam uma série de desafios. Estes incluem orientação injeção, a necessidade de combater o movimento na mãe e embrião exteriorizada, a manutenção da viabilidade hemodinâmico na mãe e embriões exteriorizados, abordando os efeitos a longo prazo da anestesia e complicações devido ao sangramento 11. Portanto, o objetivo da investigação foi desenvolver uma técnica para a injeção de microbolhas em isolado de vida em estágio final de embriões 12. Esta opção oferece mais liberdade em termos de controle de injeção e posicionamento, reprodutibilidade do plano de imagem, sem obstrução, e análise de imagem simplificada e quantificação.

No presente estudo, descrevemos um novo procedimento para a injeção de microbolhas em que vivem embriões murinos for o objectivo de estudar o comportamento cinético de microbolhas e de estudar a ligação a marcadores de superfície endoteliais endógenas microbolhas alvejado. Ultra-sonografia específico contraste não-linear é usado para medir de uma série de parâmetros de perfusão básicas, incluindo intensificação de pico (PE), lave-in taxa e tempo de pico (TTP) em embriões E17.5 isoladas. Nós também demonstrar a validade do modelo de embrião para avaliar a natureza quantitativa de ultra-som molecular em uma perda endoglin embrionário de rato modelo função transgênica, onde endoglin é um alvo clinicamente relevante devido à sua elevada expressão em células endoteliais vasculares em locais de angiogênese ativo 13 . A adesão de (MB E), segmentada por endoglin isótipo rato IgG 2 controle (MB C) e não segmentados (MB U) microbolhas é avaliada em endoglin heterozigotos (Eng +/-) e endoglin homozigoto (Eng + / +) expressando embriões. Análise do bindi alvejadong revela que o ultrassom molecular é capaz de diferenciar entre os genótipos endoglina e relacionando densidade do receptor de ultra-som para níveis moleculares quantificáveis.

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Protocol

NOTA: Os procedimentos experimentais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê do Animal Care Research Institute Sunnybrook (Toronto, Ontário, Canadá). Os procedimentos para o tratamento humano dos animais devem ser observados em todos os momentos. Supõe-se que o investigador é treinado no funcionamento básico de um sistema de ultra-sonografia. Este protocolo funciona melhor com duas pessoas.

1. Modelos Animais

  1. Companheiro CD-1 macho e fêmea Mus musculus obter embriões tipo selvagem para estudos de perfusão.
  2. Para os estudos de imagem molecular, gerar Eng +/- camundongos por recombinação homóloga utilizando células-tronco embrionárias de 129 origem / Ola como descrito por Bourdeau et al. 14.
    1. Camundongos Retrocruzamento B6- Eng +/-, gentilmente adquiridos a partir Dr. Michelle Letarte, para o CD-1 de fundo. Uso Eng +/- CD-1 embriões retrocruzadas, bem como a sua Eng + / + co ninhadantrols. Companheiro os ratos para produzir embriões encenadas.

2. Experimental Preparação

  1. Iniciado o acasalamento dos ratos e verifique as fichas diariamente. Dia embrionário 0,5 é definida como o meio-dia do dia de um tampão vaginal é observada.
  2. Prepare meios embrião pela adição de 50 ml de soro bovino fetal, 5 ml de HEPES 1 M e 5 ml de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades de penicilina, 10.000 ug de estreptomicina) a 500 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com elevado teor de glucose (4500 mg / L). Enrole a garrafa em tiras e manter refrigerado a 4 ° C.
  3. Centrifugar gel de ultra-som claro em 50 ml em tubos cónicos de 140 xg durante 20 min. Desenhe gel-se em 30 ml seringas. Preencha adicionais (marcadas) 30 ml seringas com tampão fosfato salino (PBS) e reserve. Uma ninhada de embriões normalmente exigirá entre 2-3 seringas de gel de ultra-som e 4 seringas de PBS.
  4. Puxe cerca de 30 agulhas de vidro e gentilmente apertar a uma tira de plasticinaem um 100 x 20 mm de cultura de células prato. Isto assegura que as agulhas são separadas e seguro durante o manuseamento. Utilizando um extrator de vidro, use as seguintes configurações em 1 x 90 mm capilares de vidro com filamento: Aquecedor 77, Sub 55 ímã, ímã Principal 70.
  5. Preparar 10-12 placas de dissecção (o suficiente para assegurar que cada embrião dentro de uma ninhada irá receber a sua própria antena), usando uma proporção de 1: 8 do volume do agente de cura à base. Verter 40 ml de base de dentro de um tubo cónico de 50 ml. Adicionar 5-6 ml agente de cura e mexa com vara de madeira.
    1. Despeje em 60 x 15 mm pratos de cultura, enchendo cada um para cerca de metade. Deixe repousar O / N para definir.
  6. Anexar luers femininos para 400 mm de comprimento pedaços de cloreto de polivinila (PVC) tubo (diâmetro interno: 0,79 mm). A tubulação deve chegar a partir da bomba de seringa para o ultra-som estágio confortavelmente.

3. Experimental Set-up

  1. Arrume a plataforma de imagem sob o microscópio cirúrgico com um motor 3D e matriz linear 21 MHtransdutor z.
    1. Orientar a plataforma de modo a que o carril de montagem é do lado esquerdo, com a fase posicionada directamente por baixo do microscópio.
    2. Anexe o motor 3D à rótula do braço que se estende da plataforma. Parafuso do pós liberação rápida da braçadeira transdutor na liberação rápida montagem do motor, de frente para a frente, e posicionar a cabeça de transdutor na braçadeira, a fixação da trava.
    3. Fixar o conector do transdutor na porta activa no painel frontal do carrinho. Ligue o equipamento.
  2. Iniciado o transdutor de ultra-som de 21 MHz, selecionando a opção 'cardiologia' para estudos de imagem molecular, e "geral" para estudos de perfusão. Deslocar todos os sliders tempo-ganho em compensação para a posição central exata. Para 'Modo de Contraste ", defina os seguintes parâmetros: frequência: 18 MHz, potência de transmissão: 4%, (0,39 MPa), Contraste Ganho: 30 dB, Focos: 6 e 10 mm, Contraste Mode: Nonlinear, tempo de rajada: 100% a 0,1sec, Feixe width: Ampla.
  3. Alíquota de 40 ml de meio de embrião de cada um em quatro tubos de 50 ml cônico. Coloque no gelo.
  4. Aquecer 1 L de água num copo de 2 L sobre uma placa quente. Manter a 45 ° C. Adicionar uma seringa de gel de ultra-som e PBS para o copo para pré-aquecer. Manter esta temperatura por monitorização com um termómetro em todos os momentos.
  5. Separe 10-12 seringas de 1 ml e 10-12 agulhas 21 G para a injecção de microbolhas.

4. Procedimento Cirúrgico

NOTA: Tenha um assistente preparar as bolhas (Fase 5), enquanto o cirurgião inicia o procedimento cirúrgico. O protocolo descrito aqui foi adaptado a partir Whiteley et al 15.

  1. Recolha E16.5 ou E17.5 embriões de rato fêmea grávida seguintes luxação cervical.
    NOTA: Os efeitos da anestesia sobre embriões ainda não foram estudados em detalhe 16. Métodos adicionais, incluindo a decapitação, pode ser apropriado opções para o sacrifício dos camundongos grávidas.
    1. Cortar abrir o abdômen para revelar o útero e embriões. Cuidadosamente e remover rapidamente o útero por corte as pontas dos cornos uterinos (cortando os vasos do ovário e uterino) e rompendo a vagina e bexiga.
    2. Usando fórceps lasca, transferir o útero para um tubo de 40 ml de meio de embrião gelada, tão rapidamente quanto possível, sem danificar os embriões. Descarte a carcaça mouse.
  2. Mudar para microscópio e palco. Deposite o útero em um 100 x 20 mm de cultura de células prato. Transferir o útero para nova placa cheia com 50 ml de meio fresco embrião.
  3. Usando esterilizado (70% de pulverização etanol) uma pinça fina, suavemente rasgar e puxar para fora as membranas externas do útero a partir de uma extremidade. Expor a decídua placentária, parietal saco vitelino e membrana de Reichert para separar e remover do saco vitelino visceral subjacente.
  4. Dissecar os embriões, um por um, mantendo a y visceralsacos olk intactas e manipulação da placenta o mais suavemente possível 17. Tome cuidado para evitar a ruptura do saco vitelino como os embriões saem imediatamente.
    1. Utilizar a colher perfurada para mover os embriões para um outro prato mantidas em gelo com meios frescos embrião. Mantenha os embriões refrigerados até que seja necessário. Troque a mídia no prato embrião cada 1-1,5 horas. Com estas condições embriões são viáveis ​​por até 4 horas após a dissecação.

5. Preparação de microbolhas

NOTA: Execute imagem molecular com ultra-som usando as duas microbolhas direcionados e não direcionados. A única experiência pode exigir até 3 frascos separados de microbolhas: microbolhas i) de anticorpos direcionados microbolhas, ii) anticorpo controle isótipo direcionadas e iii) microbolhas não segmentados. O agente de contraste vem como um pó seco por congelação e deve ser reconstituído com solução salina antes da injecção. Existem 2 x 10 ~ 9 microbolhas em cada microb untargetedubble frasco e 8,8 x 10 ~ 8 microbolhas nos frascos prontos alvo. As microbolhas são estáveis ​​por até 3 horas após a reconstituição.

  1. Reconstituição do alvo Pronto Frascos
    NOTA: Os exemplos de alvo preparativos prontos: endoglina microbolhas específicas (MB E, com rato biotinilado MJ 18/07 anticorpo para rato endoglin; em casa facilidade hibridoma); vascular receptor do fator de crescimento endotelial 2 (VEGFR2) microbolhas direcionados (MB V, com anti-rato CD309 biotina); isótipo rato de anticorpos IgG de controlo 2 microbolhas direcionados (MB C, biotina rato isótipo IgG 2 controle visando rato IgG2a).
    1. Dilui-se a solução de anticorpo (20 ug) em 1 ml (volume final) de uma solução salina. Mantenha no gelo.
    2. Encher a seringa com 1 ml de solução salina, a remoção de todas as bolhas de ar. Anexando uma agulha G 21, injectar a solução lentamente para dentro do frasco de microbolhas.
    3. Retire lentamente o êmbolo, a remoção de 1 ml de ar, e retirar a agulha. Suavementeagitar. Deixe repousar 5 min no gelo.
      NOTA: microbolhas de ultra-som pode ser destruído em ambientes de alta pressão.
    4. Após o tempo decorrido, preencher uma nova seringa com a diluição de anticorpo e adicionar ao frasco apropriado. Agite suavemente. Deixe a mistura (agora 2 mL) repousar durante 10 min. Mantenha no gelo. Assumindo conjugação superfície completa, o número médio de ligando ligado para as microbolhas é de aproximadamente 18 7600 ligantes / mm 2.
  2. Reconstituição de untargeted Frascos
    1. Encher a seringa com 1 ml de solução salina, a remoção de todas as bolhas de ar. Anexando uma agulha G 21, injectar a solução lentamente para dentro do frasco de microbolhas.
    2. Retire lentamente o êmbolo, a remoção de 1 ml de ar, e retirar a agulha. Agite suavemente. Deixe repousar 5 min. Adicionar 1 ml de uma solução salina adicional, tal como descrito acima. Agite suavemente e deixe descansar por 10 min no gelo.
  3. Coulter Counting
    1. Agite suavemente o frasco de microbolhas desejado e desenhar ~50 ul da solução numa seringa de 1 ml com a agulha 21 G. Injectar as microbolhas num vazio 2 ml tubo de microcentrífuga.
    2. Pipetar uma amostra de 10 ul de solução de estoque de microbolhas em 10 ml de diluente.
    3. Após mistura suave, avaliar as distribuições de concentração e tamanho da população de microbolhas usando contagem Coulter (veja a lista de materiais). Contagem de um mínimo de três medições de 50 ul (por frasco de amostra), utilizando uma abertura de 30 um.
  4. Microbubbles se preparando para Injeção
    NOTA: O assistente executa este passo quando 'Injecção de microbolhas em Embriões' (passo 6) é iniciada. Cada embrião é injectado uma vez, com o tipo de microbolha escolhida para cada injecção para ser seleccionado aleatoriamente pelo assistente de modo a que todos os tipos de microbolhas estão uniformemente distribuídas em todo o processo, mas dada em uma ordem aleatória. Verifique se o cirurgião é cego para o tipo de bolha que está sendo injetado.
    1. Determine the volume de solução de estoque de bolhas necessárias para produzir uma concentração final de 1 x 10 8 MB ​​/ ml num volume de 400 ul (calcular o volume usando as concentrações banco medidos em 5.3.3). Alíquota o volume correspondente de solução salina para um tubo de microcentrifugadora vazio.
    2. Agitar suavemente o frasco para injectáveis ​​de microbolhas seleccionado e desenhar um volume em excesso (~ 50 ul maior do que a calculada acima) da solução numa seringa de 1 ml com a agulha 21 G. Injectar as microbolhas para um tubo de microcentrífuga vazio.
    3. Pipete o volume necessário de uma solução de estoque de microbolhas e adicionar à alíquota de solução salina. Misturar agitando suavemente com a ponta da pipeta.
    4. Aspirar a solução de microbolhas diluído em uma seringa limpa utilizando a agulha de 21 G. Retirar a agulha, eliminar todas as bolhas de ar da seringa e anexar o luer e tubos. Lentamente empurre a solução para o fim da tomada de tubulação certeza de não gerar bolhas de ar.
    5. Insira o Syringe numa bomba de infusão de seringa definido para dispensar as microbolhas a uma taxa de 20 ul / min para um volume total de 20 ul. Coloque uma agulha de vidro puxado para a extremidade da tubagem. Mova a bomba perto do palco injeção.

6. Injecção de microbolhas em Embriões

  1. Aleatoriamente selecionar e remover (com colher perfurada) um embrião a partir do prato media gelada. Colocar no prato de dissecação localizada na fase de ultra-sons sob a estereoscópio e remover o saco vitelino e da membrana amniótica, com a pinça fina, cortar / rasgar a partir do lado que aparece menos vascularizado (o lado antimesometrial). Isso é mais facilmente alcançado por perfuração uma área adjacente à região da cabeça.
    1. Cortar o suficiente para remover o embrião dentro, mas não mais. Estabilizar os pratos de dissecação usando pequenos pedaços de plasticina.
  2. Manobrar suavemente o saco de todo o embrião. Posição do embrião no seu lado, e com a placentavasos umbilicais na frente. Usando os pinos de insetos, fechar o saco vitelino (4 pinos recomendado) e bordas da placenta como necessário para fixar no lugar. Evite grandes vasos.
  3. Lavar o embrião com pré-aquecido a 45 ° C até que o embrião PBS revives. Identifique a veia umbilical e sua rede vascular associada. Posicionar o prato de modo a que a injecção pode ser efectuada de forma confortável.
    NOTA: Depois de aquecida, o sangue no embrião começará a fluir, visivelmente bombeamento na artéria umbilical. Quando o fluxo começa em primeiro lugar, as veias será um vermelho brilhante, com o sangue em ambos os vasos rapidamente aparecendo idênticos. Os ramos resultantes da veia umbilical geralmente sobrepor os da artéria umbilical na superfície da placenta.
  4. Uma vez que o embrião tem reavivado, cobri-lo (mas não a placenta) com gel US pré-aquecido, tendo a certeza de remover delicadamente as bolhas de ar (usando a pinça fina) de todo o embrião. Encha o prato com pré-aquecido PBS.
    NOTA: Fique de olho no nível de solutiem nas seringas PBS e gel e adicionar seringas de backup para o copo de aquecimento, conforme necessário.
  5. Montar a agulha de vidro sobre uma grande bola de plasticina na borda do prato de dissecação e inserir a agulha no final de PBS. Escolhendo uma veia na superfície coriônica do disco placentário, na medida do ramo principal como razoável, aparar a ponta com o tamanho com uma tesoura. A injeção é mais fácil se a ponta é cortada com uma ligeira inclinação. Remova todas as bordas recortadas do vidro usando a ponta da tesoura primavera.
  6. Usando a bomba da seringa, injectar-se lentamente a solução de microbolhas a 20 ul / min para dentro da agulha de vidro até que todo o ar é expelido a partir da ponta da agulha e as microbolhas pode ser visto a fluir livremente para dentro do PBS. Pare a bomba e redefinir para um volume de injeção de 20 l. Não permitir a entrada de ar do sistema vascular do embrião durante a injeção.
  7. Insira a ponta da agulha de vidro suavemente em uma das veias na placenta e garantir que ele é imóvel. Rebater o stereoscope cabeça ea posição do transdutor acima do embrião. Iniciado imagem.

7. Ultrasound Molecular Imaging

NOTA: Utilizando as condições de imagem não-lineares contraste definidos anteriormente, posicione o transdutor para que o embrião está situado igualmente entre os focos em 6 e 10 mm. Uma vez posicionado, iniciar a injecção de bolus das microbolhas. Quando a injecção estiver concluída, iniciar o temporizador.

  1. Perfusão Imagem
    1. Certifique-se que o número máximo de quadros para o modo de contraste não-linear é selecionado pressionando o botão "gestão estudo" e clicar na aba "Preferências", na parte superior do navegador do estudo. Marque a caixa apropriada na janela "Preferências".
    2. Ajuste as configurações de imagem, iniciando imagem não-linear. Pressione o botão 'modo de contraste' no painel de controle. Limitar o ganho 2D, ajustando o "ganho & #8217; discar para 30 dB, reduzir o poder de 4% utilizando o 'poder' dial, diminuir a frequência de 1 Hz usando o 'frequência' marcar e definir a largura de feixe (canto inferior esquerdo) para ampla usando a esfera / mouse.
      NOTA: Todos os controles estão localizados no painel de controle do sistema de ultra-som.
    3. Capture a todo lavagem-in e dissipação do bolo de microbolhas gravando um loop cine 20 minutos a uma taxa de quadros de 1 Hz. Imprensa varredura / freeze para iniciar a aquisição de dados.
    4. Uma vez que a sequência completa das imagens foi capturado, pressione o botão 'loja cine' localizado no painel de controle para salvar a seqüência de imagens no buffer do sistema. O sistema cria um loop de cine-carimbada data de os dados do modelo de contraste não-lineares adquiridos.
  2. Targeted microbolhas de imagem
    1. Em "Preferências", defina o tempo de rajada para 0,1 seg. Defina os parâmetros de imagem apropriados usando os controles descrita acima (7.1.2.).
    2. Iniciado imagiologia de contraste não-linear, pressionando o botão "modo de contraste 'no painel de controle. Certifique-se de que o embrião é adequadamente situado sob o transdutor e que o fluxo de agente de contraste de microbolhas por meio do embrião é visível na imagem modo de contraste não-linear.
    3. Para avaliar obrigatório durante os estudos de imagem molecular embrionárias microbolhas alvejado, permitir que as microbolhas a circular sem ser perturbado por 3 min e 40 seg após o término da injeção. Desta vez é o de permitir a retenção das microbolhas circulantes. Prima 'varredura / freeze' para deter imagem durante este tempo.
    4. Às 3 min e 40 seg, imagiologia currículo para confirmar que o embrião é ainda visível, é adequadamente cobertas com PBS, e que as microbolhas continuam a circular. Prima 'varredura / freeze' para iniciar imagem.
    5. Adquirir a sequência de interrupção / reabastecimento em 3 min e 50 seg após a injecção através da gravação de um "pré-destrucseqüência resposta acústica ção 'at 29 Hz. Prima 'varredura / freeze' para iniciar a aquisição de dados. Às 4 min após a injeção 18,19, iniciar uma explosão acústica de alta freqüência de 0,1 seg. Pressione o botão 'explosão' para implementar uma explosão.
    6. Continue a gravar quadros para o restante da sequência (até a linha de buffer está cheio) e salvar o loop cine pressionando 'loja de cine ".
    7. Recolha um loop cine adicional de microbolhas de circulação. Esta sequência de imagens subseqüente 'pós-destruição "é assumido para conter sinais de bolha só circulam que reabastecido o feixe. Prima 'varredura / freeze' para iniciar imaging e 'loja de cine' para coletar as imagens.
    8. Rotular os laços cine após imaginando cada embrião. Pressione "gestão estudo ', realce o arquivo usando a esfera eo' selecionar ', pressione o botão' label imagem" eo nome de forma adequada.

    8. Manuseamento de embriões após a injeção

    1. Imagiologia pós, mover o transdutor, desprender o embrião e a eutanásia (via decapitação, deslocamento cervical, asfixia com dióxido de carbono, ou de anestesia seguida de congelamento ou de fixação rápida) como desejado.
    2. Para cada injeção subseqüente embrião uma dissecção prato, agulha, seringa e tubulação segmento fresco deve ser utilizado, com a preparação do próximo lote de injeção de microbolhas solução a ter lugar durante a dissecção e avivamento.
    3. Guardar as amostras de tecido (por exemplo, cauda, ​​cerebrais) para análises adicionais (por exemplo, a genotipagem determinado por análise de PCR de DNA de cauda isolado, coloração lacZ, ou medidas semi-quantitativas de expressão biomarcador utilizando Western blots 21).

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Representative Results

A injecção de agentes de contraste de ultra-som em embriões de ratinho ex útero é dependente do isolamento de embriões vivos, nas fases finais-gestacionais do útero e manutenção da viabilidade ao longo do curso da injecção e imagiologia de ultra-sons correspondente. Uma vez que o embrião foi exteriorizado e posicionado, como mostrado na Figura 1, a injecção do agente de contraste cuidado na vasculatura embrionária é possível. Uma imagem de ultra-som típico de modo B de um embrião de rato E17.5 é mostrado na Figura 2A. A lavagem em microbolhas e de melhoria correspondente na veia cava inferior, o coração, o cérebro, e em todo o animal pode ser capturado utilizando métodos de imagiologia de contraste não-linear, demonstrando assim a viabilidade desta técnica. Os pontos de tempo individuais são apresentados na Figura 2B e mostra a alteração no contraste ao longo do tempo.

Ao registrar o todo de lavagem e lava-in-out of o bolus de microbolhas, é possível medir vários parâmetros de perfusão. Em uma análise off-line, a ferramenta de rastreio região contraste foi usada para criar 1,5 milímetros 2 regiões de interesse (ROI) nas embrionárias hemisférios cerebrais direito e esquerdo. A intensidade média do sinal dentro destas ROI, em seguida, foi representada graficamente como uma função do tempo e alisado usando um filtro de média de sete pontos. A partir da curva de intensidade de contraste resultante (mostrado na Figura 2C), o pico de realce cérebro foi determinada. A taxa de lavagem de, definido como o declive entre 10% e 50% do aumento máximo do pico (PE), também foi calculado. Finalmente, o tempo de pico (TTP) foi calculado a partir do início do aumento do sinal para o tempo de pico. As diferenças nos parâmetros médios de perfusão em diferentes tipos de bolhas foram testados usando t-testes separados 12. Estes resultados, resumidos na Tabela 1, demonstram que a injecção de microbolhas fornece um Valumétodo capaz de determinar parâmetros de perfusão importantes no desenvolvimento do mouse.

Introdução de microbolhas para a vasculatura embrionária também permite a utilização de embriões de ratinho como sistemas modelo para definir e caracterizar as capacidades quantitativas de imagens ultra-sónicas molecular. No exemplo a seguir, uma perda da função de modelo, em que a manipulação genética gerados padrões de expressão de heterozigotos e homozigotos de endoglina em ratinhos embrionários, foi utilizado para testar a capacidade de imagens ultra-sónicas molecular para diferenciar genótipos. Após injecção e execução de imagiologia destruição / reabastecimento de microbolhas, a razão entre a intensidade média do sinal da "pré-destruição '' a sequências de pós-destruição 'foi utilizado para produzir uma medida do sinal molecular chamado o meio de contraste razão de potência (CMPR ). Um modelo linear misto (com ajustamentos feitos de Bonferroni para comparações múltiplas) foi realizado para determinar w hether houve diferença significativa entre endoglin específica, luta e microbolhas untargeted ligação ao Eng + / + ou Eng +/- embriões (identificado injeção de pós via reação em cadeia da polimerase (PCR) de amostras de cauda). Os meios CMPR estimados (média ± 95% de intervalo de confiança (IC)) são apresentadas para cada tipo de micro-bolhas e embrião na Figura 3 e estão resumidos na Tabela 2.

Estes resultados fornecem uma demonstração concreta que a injecção de agentes de contraste de ultra-sons em embriões vivos isolado pode ser alcançado. Além disso, este protocolo facilita a avaliação dos parâmetros de perfusão e pode ser usado para comparar com microbolhas alvo de ligação em modelos de embriões de doença vascular em um esforço para elucidar as capacidades de imagiologia de ultra-sons molecular.

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Figura 1. Montagem experimental para a injecção de microbolhas em embriões isolados. Um transdutor linear de 21 MHz é posicionada acima de um embrião E16.5 estar exteriorizada como uma solução de microbolhas de 20 uL é injectado numa veia de placenta utilizando uma cânula de vidro. Barra de escala = 10 mm. De Denbeigh, JM et al. 12 com permissão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Ecografia de exteriorizado Viver E17.5 embriões. Imagem de contraste não-linear do embrião, antes e após a injecção de microbolhas de imagem de ultra-som modo-B de um embrião (A). Antes da injecção de microbolhas alvo (t = 0 seg). (B). Imagem de contraste não-linear priou a injecção de microbolhas (t = 0 seg). Somente as interfaces fortemente reflectoras (por exemplo, osso) são visíveis, com mínima de sinal a partir dos tecidos moles. A seguir, o contraste da imagem não linear das microbolhas no embrião em t = 50 s, t = 120 seg e t = 420 segundos após uma injecção de bolus. Contraste é detectada em todo o animal, incluindo o coração e cérebro. Parâmetros (C) Perfusão derivadas a partir das curvas de intensidade de tempo. Intensidade trama de microbolhas como uma função do tempo dentro de um único ROI no cérebro embrionário. Parâmetros de perfusão são identificados no gráfico, incluindo o reforço de pico (PE), lave-in taxa (inclinação), e tempo de pico (TTP). Pontas de flechas: R = costelas, Ht = coração, Br = cérebro. au, unidades arbitrárias; ROI, região de interesse; sec, segundos. Barra de escala = 3 mm. Este valor foi modificado a partir Denbeigh, JM et al. 12. Por favor, clique aqui para ver um maiorversão desta figura.

Figura 3
Figura 3. Resumo do contraste média significar relações de poder (CMPR) para endoglin alvo (MB E), controle (MB C) e não segmentados microbolhas (MB U) em Eng + / + e embriões Eng +/-. CMPRs de endoglin alvejado microbolhas foram significativamente maiores (***, p <0,001) do que os recolhidos para MB MB C e U, (não significativamente diferentes umas das outras, independentemente do genótipo). Vinculativo MB E mostrou-se significativamente maior no Eng + / + embriões (marcadores escuros) em comparação comEng +/- embriões (marcadores de luz). Resultados apresentados como média ± intervalo de confiança de 95%. n indica o número de embriões únicas em cada categoria. De Denbeigh, JM et al. 22 com permissão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tipo de microbolhas T-testes
p-valor
Perfusão Parameter MB L MB C MB V MB L vs MB C MB L vs MB V MB <sub> C vs MB V
Peak Enhancement, PE (au) 0,427 ± 0,063 0,490 ± 0,079 0,499 ± 0,064 0,19 0,06 0,81
Wash-in taxa (au / sec) 0,008 ± 0,002 0,009 ± 0,002 0,011 ± 0,002 0,18 0,01 0,09
Time to Peak, TTP (sec) 53,75 ± 7,96 51,75 ± 4,46 45,00 ± 5,33 0,55 0,03 0,03
# embriões injectados 4 4 3

Tabela 1. Resumo dos parâmetros de perfusão embrionário E17.5. A média ± desvio padrão derivados a partir de gráficos de intensidade de tempo para todos os ROIs embrião (a.u. = Unidades arbitrárias). A tabela inclui medidas para untargeted (MB U), IgG 2 controle alvo (MB C) e VEGFR2 alvo (MB V) microbolhas. T-testes separados foram realizados para comparar os grupos. Este quadro foi modificado a partir Denbeigh, JM et al. 12.

Tipo de microbolhas Genótipo CMPR Média 95% intervalo de confiança
MB E Eng + / + 9,71 9.05, 10.38
Eng +/- 5,51 4,87, 6,15
MB C Eng + / + 1,42 0,41, 2,43
Eng +/- 1.46 0,45, 2,47
MB L Eng + / + 1,7 0,65, 2,75
Eng +/- 1,76 0,67, 2,84
Linear modelo misto: entre sujeitos Effects
df F valor p
Genótipo 1 12.75 <0,001
Tipo de microbolhas 2 147,65 <0,001
Genótipo * Tipo de microbolhas 2 18.29 <0,001

Tabela 2. Resumo da análise de modelo misto linear paramicrobolhas obrigatório em embriões, com uma correção de Bonferroni para comparações múltiplas. Genótipo, tipo de microbolhas e da interação combinada (genótipo * Tipo de microbolhas) foram encontrados para ser fatores importantes na determinação CMPR. DF = graus de liberdade. De Denbeigh, JM et al. 22 com permissão.

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Discussion

Agentes de contraste de ultra-som foram injetadas em embriões em estágio final de gestação do mouse e imagens de contraste não-lineares foram adquiridos para medir parâmetros de perfusão e direcionados microbolhas vinculativo. Imagiologia bem sucedida de microbolhas no seio da vasculatura embrionária era dependente de uma série de factores, a primeira sendo a viabilidade do embrião. Todos os equipamentos e aparelhos foram preparados com antecedência, a fim de minimizar o tempo necessário para o isolamento de embriões a partir do útero para o início da injecção. Uma vez que os efeitos da exposição única ou repetida à anestesia em ratos embrionárias ainda não foram estudados em detalhe, o uso de anestesia na mãe foi evitado antes de sacrificar 16. Durante o isolamento do embrião, era importante para evitar danos no saco vitelino e para assegurar embriões foram mantidos refrigerados em todos os momentos, em meios embrião frequentemente actualizada. Quando a exteriorização do embrião, antes da injecção e durante a fixar, grandes vasos vitelinos foram evitados para limitar o likelihood de sangramento, o que poderia ser letal. Descobrimos que, quando reviver o embrião, que era melhor primeiro cobrir a placenta e, em seguida, o embrião com PBS, antes de aplicar o gel de ultra-som para o embrião em um movimento de vaivém e remover quaisquer bolhas grandes com uma pinça. O restante da placa de Petri foi então enchido com PBS. A utilização de gel de PBS e limitou a possibilidade de bolsas de ar entre o embrião e o transdutor, o que poderia influenciar a qualidade da imagem. À medida que o embrião revivido, o sangue começou a fluir, visivelmente bombeamento na artéria umbilical, enquanto as veias umbilicais apareceu vermelho brilhante 23. Para referência, os ramos que surgem a partir da veia umbilical normalmente sobrepor os da artéria umbilical na superfície da placenta. Embora fosse possível injetar nas arteríolas labirinto placentários, injetando as microbolhas na direção de fluxo reduzido de placenta e hemorragia venule injeções também permitiu que as microbolhas para passar diretamente através do embrião antes th circulantesáspera a placenta.

Devido à sua fragilidade, preparação e manuseamento de microbolhas também exigiu cuidados. Microbolhas de ultra-som pode ser destruído em ambientes de alta pressão. Por conseguinte, o mesmo procedimento foi repetido durante exacto cada concentração e reconstituição de bolhas foi medida para assegurar a consistência experimental. Um único frasco de microbolhas era tipicamente suficiente para cerca de 5-7 embriões. Uma vez que as microbolhas são estáveis ​​no interior do frasco durante até 3 horas, vários frascos foram frequentemente necessárias para uma única experiência. Para evitar rasgar o tecido, que era melhor para a ponta de vidro da agulha de injeção a ser afiada e corte em um ângulo ligeiro, enquanto se aproximando do navio em um ângulo tão pequeno quanto possível. Uma vez cortada, a ponta da agulha tinha de ser grande o suficiente para que as bolhas de fluir facilmente através da extremidade sem aglomeração, mas suficientemente pequeno para caber facilmente no interior do recipiente. O tamanho ideal era geralmente <100 um. Alguma prática em julgar o adequadotamanho era necessário. No caso em que a ponta foi cortado demasiado grande, ou tornou-se bloqueado, uma nova agulha de vidro foi aplicado. É alguns casos, foi possível para aparar a agulha ligeiramente acima do bloqueio. Era fundamental que o ar não ser autorizado a entrar no sistema vascular do embrião durante a injeção, o que poderia resultar na morte do animal e era indesejável durante o exame (bolhas de ar poderia apresentar na vasculatura do embrião e ser detectável na imagem de ultra-som , aumentando artificialmente qualquer sinal medido). Imagiologia de contraste não-linear realizada neste protocolo utilizado um estado da arte de alta freqüência (21 MHz) sistema de micro-ultra-som (Vevo2100) emparelhado com matrizes lineares projetados especificamente para pequenas imagens de animais (MS250). Micro ou alta -ultrasound frequência é uma das poucas modalidades capazes, neste momento, para fornecer imagens de alta resolução de viver embriões murinos e recém-nascidos 16. Este sistema pode alcançar resoluções axial e lateral de 75 ^ m e 165 μm respectivamente em profundidades tão grandes quanto 15 mm. Assim, foi possível a imagem de todo o embrião em resoluções muito mais elevadas do que normalmente alcançados com instrumentos clínicos e o sinal acústico de microbolhas podem ser distinguidos de tecido usando métodos de imagem contraste não-lineares (incluindo inversão de pulso e técnicas de modulação de amplitude 24). Embora, tivemos o melhor sucesso com as configurações de ultra-som são descritos aqui, é possível que algum ajuste a esses parâmetros também irá produzir resultados satisfatórios. Em todos os casos, uma baixa potência é necessária para a imagiologia de microbolhas para evitar a destruição das microbolhas indesejável antes da iniciação de uma explosão, enquanto que a rajada curta elimina apenas uma pequena fracção da população de microbolhas. Com a prática, todo o processo de um único embrião, a partir de posicionamento para a realização de imagens ultra-sónicas molecular, levou aproximadamente 15 minutos. Temos injetado com sucesso, como muitos como 12 embriões a partir de uma ninhada emuma única sessão.

Experiências de injecção foram restritas a uma janela de 4 horas devido à limitada viabilidade dos embriões. Como a distribuição de microbolhas era dependente da circulação do próprio embrião, as injeções não poderia ter lugar antes do batimento cardíaco (E8.5) e fluxo detectável na vitelino e umbilical circulação (E9.5) foi estabelecido 25. Com a maturação da placenta não está completa até E14.5, a injeção de agentes de contraste através do labirinto placentário limitou-se a embriões de médio a idade gestacional tarde. Com base em observações, os embriões mais próximas prazo eram mais resistentes e podem suportar um aumento de volume vascular melhor do que seus colegas mais jovens. Combinados, esses fatores restritos contraste melhorado ultra-sonografia da vasculatura embrionárias para estágios mais avançados de desenvolvimento e crescimento angiogênico. Isso pode afetar a disponibilidade de modelos de camundongos transgênicos, já que a manipulação de receptores envolvidos em vascdesenvolvimento e manutenção ular (por exemplo, VEGFR2, VCAM-1) pode conduzir a letalidade embrionária ou defeitos no desenvolvimento e regulação de sistemas circulatórios embrionárias 26,27. No entanto, uma série de sistemas de modelos relevantes estão disponíveis para biomarcadores vasculares de interesse, incluindo α 2 β 1 28, v α β 3 29, plaquetas molécula-1 de adesão celular endotelial de 30, e de adesão da célula vascular, a molécula de adesão intercelular-1 31 molécula -1 e -2 32 33 e P-selectina 34. O que é mais, histogénese cérebro começa depois de meados de gestação 11, fazendo a expressão de marcadores angiogênicos neste tecido provável e proporcionando assim uma excelente alternativa para o modelo de tumor tradicional para os estudos que avaliam os aspectos quantitativos da imagiologia molecular.

A natureza ex vivo das injecções faz apresentar alguns limitations. É importante notar que, após os embriões foram removidos da matriz e o labirinto placentária perfurado, que, geralmente, não foi possível (nem desejável) fazer injecções repetidas. Além disso, o isolamento do embrião, da circulação materna limita o fornecimento de nutrientes e de O2, e saúde embrionário, se deteriore com o tempo. Enquanto refrigeração e avivamento prolonga a viabilidade dos embriões, mas também pode ter impacto função cardíaca. Por exemplo, observou-se que os embriões isolados tinham uma taxa reduzida do coração (dados não apresentados, referem-se a Denbeigh 12 et al.) Em comparação com aqueles anteriormente observada in vivo 35. Por isso, é provável que os estudos que avaliam a fisiologia cardiovascular não refletir com precisão as condições in vivo. Com poucos estudos que caracterizam a hemodinâmica circulatórios no embrião de rato fase final de vida, no entanto, é difícil dizer com certeza a medida em que essas condições experimentais podem alter função fisiológica. Uma alternativa é a realização de injecções intra-útero, através de uma incisão laparoscópica 36 ou através da barriga da mãe grávida diretamente 37, embora esta abordagem pode apresentar o seu próprio conjunto de desafios 11. Em alguns casos, o isolamento e exteriorização do embrião também pode resultar em hemorragia significativa a partir do saco vitelino. Embora descobrimos que poderia inibir o fluxo de sangue com gel de ultra-som, qualquer perda significativa de sangue poderia impactar a entrega e concentração de microbolhas, e estes animais foram excluídos da análise. Finalmente, embora o isolamento faz limite materna e fontes embrionárias de movimento, movimento periódico relacionado com a atividade cardíaca é inevitável. Nós eleito para a imagem do cérebro estática para examinar diretamente o efeito da expressão do receptor de sinal de microbolhas alvo, no entanto a aplicação de tempo real movimento compensado A ultra-sonografia com contraste 38 podealargar estes estudos a outros órgãos.

Há poucas aplicações de imagem que estão atualmente capaz de avaliar a paisagem vascular do mouse embrião vivo em desenvolvimento. Alguns estudos realizados com sucesso imagens ao vivo do fluxo sanguíneo em ex vivo embriões murino usando Doppler varreu-source tomografia de coerência óptica 39,40, enquanto a ressonância magnética, corrosão vascular lança, tomografia microcomputed e tomografia projeção ótica foram implementadas postmortem 16. Isso é lamentável, uma vez que este período de crescimento embrionário pode revelar informações importantes sobre o desenvolvimento vascular precoce e função. Imaging microbolhas dentro embriões vivos poderiam, portanto, contribuir para a nossa compreensão da fisiologia do desenvolvimento. Ele também pode ser usado para visualizar a distribuição biomarcador em todo o corpo do rato feto vivo em tempo real, embora esta técnica é pouco provável para substituir os métodos existentes (incluindo histologiae imagem fluorescente) para a medição de sinal molecular no tecido embrionário. A massa em rápido desenvolvimento de vasos nos embriões, no entanto, se assemelha o crescimento do tumor, com a expressão de muitos dos mesmos receptores principais identificados na angiogénese tumoral 41,42 e pode, portanto, servir como um excelente substituto do tumor para estudos examinando a capacidade de quantitativos molecular ultra-som. Nós, portanto, antecipar que os métodos descritos serão úteis não apenas para avaliar e caracterizar modelos embrionários de saúde vascular e doença através de imagiologia funcional, mas oferece uma avenida para explorar os pontos fortes e limitações de imagiologia molecular também. Sua aplicação também pode estender-se a outras áreas interessantes de investigação, incluindo in utero terapia transferência de genes onde microbolhas foram testados como um meio de entrega de DNA nu para o tecido fetal rato 10. Alternativamente, o mapeamento vascular 3D do embrião vivo, também é possível,que pode fornecer informações valiosas quanto às alterações morfológicas em camundongos geneticamente modificados. Introdução de agentes de contraste de ultra-som em embriões vivos isolados poderiam, portanto, ser mais uma ferramenta para aumentar a nossa compreensão da doença vascular e traduzir aplicações de ultra-som de realce para a clínica.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
  • rat isotype IgG2 control
eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose
Sigma D5796
  • 50 ml Fetal Bovine Serum
ATCC 30-2020 lot # 7592456
  • Hepes
Gibco 15630 5 ml, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco 15140-122 5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 ml BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 ml Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 ml VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110 °C VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

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References

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