Imágenes de contraste en embriones de ratón Uso de alta frecuencia de ultrasonido

Developmental Biology

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Summary

A continuación, presentamos un protocolo para inyectar medios de contraste de microburbujas de ultrasonidos en la vida, aislados finales de la gestación de embriones murinos etapa. Este método permite el estudio de los parámetros de perfusión y de marcadores moleculares vasculares dentro del embrión utilizando imágenes de ultrasonido de alta frecuencia con contraste.

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Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

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Abstract

Introduction

La ecografía con contraste hace uso de agentes de contraste de microburbujas de visualizar y caracterizar el ambiente vascular. Estos agentes permiten la evaluación no invasiva de la microcirculación, la vascularización y la función cardiovascular. Además, la modificación de la superficie de la burbuja puede resultar en microburbujas específica de unión a los biomarcadores endoteliales, como se ha demostrado en aplicaciones preclínicos de la angiogénesis, la aterosclerosis y la inflamación 1,2 toma de imágenes por ultrasonido molecular de eventos vasculares posibles. Por lo tanto, un mayor contraste de ultrasonido puede ser usado para identificar los entornos complejos y diversos que influyen en los estados vasculares sanas y enfermas 3-5.

En el último número de años, el interés en la utilidad de las imágenes de microburbujas se ha extendido al modelo de embrión de ratón versátil. Como modelo de desarrollo de los mamíferos, la introducción de microburbujas en la vasculatura embrionaria mejora fisiológicaestudio del desarrollo del sistema circulatorio (por ejemplo, el flujo sanguíneo, el gasto cardíaco) y en casos de transgénicos y dirigidos modelos de ratones mutantes de la enfermedad cardíaca 6,7, puede ayudar a comprender cómo los factores genéticos alterar la función cardiovascular. De hecho, los análisis 2D cuantitativa y cualitativa de la vasculatura del cerebro embrionario ya se han logrado 8. Además, el embrión de ratón se presenta como un modelo excelente para examinar la unión de microburbujas dirigidas a los marcadores vasculares in vivo. Bartelle et al. 9, por ejemplo, han introducido microburbujas avidina en embrión ventrículos cardíaco para evaluar dirigido específicamente vinculante en Biotag-Bira embriones transgénicos y examinar la anatomía vascular. La generación de modelos heterocigotos y homocigotos ratón también puede ser utilizado como un sustituto de los estudios de modelos tumorales con el objetivo de definir la naturaleza cuantitativa de ultrasonido molecular - un punto de referencia importante en la traducción de esta técnica a la clínica.

8-10. En inyecciones útero, sin embargo, se enfrentan a una serie de desafíos. Estos incluyen la orientación de la inyección, la necesidad de contrarrestar el movimiento en la madre y el embrión exteriorizada, el mantenimiento de la viabilidad de hemodinámica en la madre y embriones exteriorizados, abordando los efectos a largo plazo de la anestesia y las complicaciones por sangrado 11. Por lo tanto, el objetivo de la investigación fue desarrollar una técnica para la inyección de microburbujas en aislados de vida embriones en etapa tardía 12. Esta opción ofrece más libertad en términos de control de la inyección y el posicionamiento, la reproducibilidad del plano de formación de imágenes sin obstrucción, y análisis de imagen simplificada y cuantificación.

En el presente estudio, se describe un nuevo procedimiento para la inyección de microburbujas en que viven los embriones murinos FOr los efectos de estudiar el comportamiento cinético de microburbujas y de estudiar la unión a marcadores de superficie endoteliales endógenos de microburbujas dirigidas. Ecografía específica contraste no lineal se utiliza para medir una serie de parámetros de perfusión básicos, incluyendo la mejora de pico (PE), lavandería en la tasa y el tiempo hasta el pico (TTP) en aislados embriones E17.5. También demuestran la validez del modelo de embrión para evaluar la naturaleza cuantitativa de la ecografía molecular en una pérdida de la endoglina embrionario de modelo de ratón transgénico función, donde la endoglina es una diana clínicamente relevante debido a su alta expresión en las células endoteliales vasculares en los sitios de angiogénesis activa 13 . La adhesión de isotipo IgG de rata de control de la endoglina 2-dirigida (MB E), (MB C) y (U) MB microburbujas no focalizados se evalúa en la endoglina heterocigotos (Esp +/-) y homocigotos endoglina (Eng + / +) que expresan embriones. Análisis del bindi apuntadong revela que el ultrasonido molecular es capaz de diferenciar entre los genotipos endoglina y relacionando densidad de los receptores a los niveles cuantificables de ultrasonido moleculares.

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Protocol

NOTA: Los procedimientos experimentales realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales del Instituto de Investigación Sunnybrook (Toronto, Ontario, Canadá). Los procedimientos para el tratamiento humanitario de los animales deben ser observados en todo momento. Se supone que el investigador está entrenado en la operación básica de un sistema de imágenes de ultrasonido. Este protocolo funciona mejor con dos personas.

1. Modelos Animales

  1. Casamata del CD-1 macho y hembra Mus musculus para obtener embriones de tipo salvaje para los estudios de perfusión.
  2. Para los estudios de imagen molecular, generar ratones Ing +/- mediante recombinación homóloga utilizando células madre embrionarias de origen 129 / Ola como se describe por Bourdeau et al. 14.
    1. Ratones Retrocruzamiento B6- Eng +/-, amablemente adquiridos de la doctora Michelle Letarte, el CD-1 fondo. Uso Ing +/- CD-1 embriones backcrossed, así como su Ing + / + littermate controls. Mate de los ratones para producir embriones escenificados.

2. Preparación Experimental

  1. Iniciar el apareamiento de los ratones y comprobar tapones diaria. Día embrionario 0.5 se define como el mediodía del día se observa un tapón vaginal.
  2. Preparar los medios de comunicación de embriones mediante la adición de 50 ml de suero fetal bovino, 5 ml de 1 M HEPES y 5 ml de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades de penicilina, 10.000 mg de estreptomicina) a 500 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con alta glucosa (4500 mg / L). Envuelva la botella en papel de aluminio y mantener refrigerados a 4 ° C.
  3. Centrifugar gel de ultrasonido claro en 50 ml en tubos cónicos de 140 xg durante 20 min. Dibuja gel para arriba en 30 ml jeringas. Rellene adicionales (marcados) 30 ml jeringas con tampón fosfato salino (PBS) y reservar. Una camada de embriones requerirá generalmente entre 2-3 jeringas de gel de ultrasonido y 4 jeringas de PBS.
  4. Tire unos 30 agujas de vidrio y fijar con suavidad a una tira de plastilinaen un 100 x 20 mm placa de cultivo celular. Esto asegura que las agujas se separan y seguro durante la manipulación. Con un extractor de vidrio, utilice los siguientes ajustes en 1 x 90 mm capilares de vidrio con filamento: Calentador de 77, Sub 55 de imán, imán principal 70.
  5. Preparar once y cincuenta placas de disección (lo suficiente para asegurar que cada embrión dentro de una camada recibirá su propio plato), usando una proporción de 1: 8 volumen de agente de curado a la base. Verter 40 ml de la base en un tubo cónico de 50 ml. Añadir agente de curado 5.6 ml y se agita con un palo de madera.
    1. Vierta la mezcla en 60 x 15 mm cultura platos, llenando cada uno de aproximadamente la mitad. Deje reposar O / N para ajustar.
  6. Adjuntar luers femeninos y 400 mm piezas largas de cloruro de polivinilo (PVC) tubo (diámetro interior: 0,79 mm). El tubo debe llegar desde la bomba de jeringa a la etapa de ultrasonidos cómodamente.

3. Estructura de ensayo

  1. Organizar la plataforma de imágenes en el microscopio quirúrgico con un motor 3D y disposición lineal 21 MHtransductor z.
    1. Oriente la plataforma de manera que el carril de montaje está a la izquierda, con la etapa de posicionado directamente debajo del microscopio.
    2. Una el motor 3D para la articulación de rótula del brazo que se extiende de la plataforma. Atornille el poste de liberación rápida de la abrazadera transductor en la liberación rápida de montaje en el motor, mirando hacia adelante, y la posición de la cabeza del transductor en la pinza, la fijación del pestillo.
    3. Asegure el conector del transductor en el puerto activo en el panel frontal del carro. Encienda la máquina.
  2. Iniciar el transductor de ultrasonidos 21 MHz, de seleccionar el ajuste 'Cardiología' para los estudios de imagen molecular, y "general" para los estudios de perfusión. Shift todos los deslizadores de tiempo de ganancia de compensación a la posición media exacta. Para 'Modo Contraste', establecer los siguientes parámetros: Frecuencia: 18 MHz, la potencia de transmisión: 4%, (0,39 MPa), Contrast Ganancia: 30 dB, focos: 6 y 10 mm, Modo de Contraste: no lineal, el tiempo de rotura: 100% en 0,1ancho seg, haz: Amplia.
  3. Alícuota de 40 ml de medio de embrión de cada uno en cuatro tubos de 50 ml cónicos. Coloque sobre hielo.
  4. Calentar 1 L de agua en un vaso de precipitados de 2 L en una placa caliente. Mantener a los 45 ° C. Añadir una jeringa de gel de ultrasonido y PBS en el mismo vaso para precalentar. Mantener esta temperatura mediante el control con un termómetro en todo momento.
  5. Ponga a un lado once y cincuenta 1 ml jeringas y once y cincuenta 21 agujas G para la inyección de microburbujas.

4. Procedimiento Quirúrgico

NOTA: Tienes una asistente preparar las burbujas (fase 5), mientras que el cirujano comienza el procedimiento quirúrgico. El protocolo descrito aquí ha sido adaptada de Whiteley et al. 15

  1. Recoger E16.5 E17.5 o embriones de ratón hembra gestante siguientes dislocación cervical.
    NOTA: Los efectos de la anestesia en los embriones no han sido estudiados en detalle 16. Los métodos adicionales, incluyendo la decapitación, pueden ser op apropiadociones para el sacrificio de los ratones preñados.
    1. Cortar abrir el abdomen para revelar el útero y los embriones. Cuidadosa y rápidamente se extrae el útero mediante el corte en las puntas de los cuernos uterinos (cortando los vasos ováricos y uterinos) y corte en la vagina y la vejiga.
    2. El uso de pinzas en astilla, transferir el útero a un tubo de 40 ml de helado medios embrión tan rápidamente como sea posible sin dañar los embriones. Deseche la carcasa del ratón.
  2. Reubicar a microscopio y el escenario. Depositar el útero en un 100 x 20 mm placa de cultivo celular. Transferir el útero en un nuevo plato lleno con 50 ml de medio de embriones frescos.
  3. Utilizando esterilizada (70% aerosol etanol) pinzas finas, rasga suavemente y apartó las membranas externas de útero a partir de un extremo. Exponer la decidua de la placenta, saco vitelino parietal y la membrana de Reichert para separar y retirar del saco vitelino visceral subyacente.
  4. Diseccionar los embriones uno por uno, y manteniendo el visceralsacos olk intactas y manejo de la placenta lo más suavemente posible 17. Tenga cuidado de evitar la ruptura del saco vitelino como los embriones se salgan inmediatamente.
    1. Use la cuchara perforada para mover los embriones a otro plato mantenido en hielo con medios de embriones frescos. Mantener los embriones refrigerados hasta que se necesite. Cambie los medios de comunicación en el plato embrión cada 1-1,5 horas. Con estas condiciones embriones son viables para un máximo de 4 hr después de la disección.

5. Preparación de microburbujas

NOTA: Realice la imagen molecular con ultrasonidos utilizando tanto microburbujas dirigidas y no dirigidas. Un solo experimento puede requerir hasta 3 viales separados de microburbujas: microburbujas i) de anticuerpos dirigidos microburbujas, ii) anticuerpo isotipo de control específicas y iii) microburbujas no focalizados. El agente de contraste se presenta como un polvo seco por congelación y debe reconstituirse con solución salina antes de la inyección. Hay ~ 2 x 10 9 microburbujas en cada microb no directovial ubble y ~ 8.8 x 10 8 microburbujas en los viales listos objetivo. Las microburbujas son estables durante un máximo de 3 horas después de la reconstitución.

  1. Reconstitución de Ready objetivo Viales
    NOTA: Los ejemplos de preparaciones listas de destino: microburbujas dirigidas endoglina (MB E, con rata biotinilado MJ 7/18 de anticuerpos a la endoglina ratón; en instalaciones hibridoma casa); factor de crecimiento endotelial vascular del receptor 2 (VEGFR2) microburbujas dirigidas (MB V, con biotina anti-ratón CD309); isotipo de anticuerpos IgG de rata 2 Control de microburbujas dirigidas (MB C, isotipo de rata biotina IgG 2 de control centrado IgG2a de ratón).
    1. Diluir la solución de anticuerpo (20 mg) en 1 ml (volumen final) de solución salina. Mantener en hielo.
    2. Llene la jeringa con 1 ml de solución salina, la eliminación de todas las burbujas de aire. Colocación de una aguja de calibre 21, inyecte la solución lentamente en el vial de microburbujas.
    3. Retire lentamente el émbolo, la eliminación de 1 ml de aire y retire la aguja. Suavementeagitar. Dejar reposar 5 minutos en hielo.
      NOTA: microburbujas de ultrasonidos pueden ser destruidos en ambientes de alta presión.
    4. Después del tiempo transcurrido, llenar una nueva jeringa con la dilución de anticuerpo y añadir al vial apropiado. Agitar suavemente. Deje que la mezcla (ahora 2 ml) reposar durante 10 min. Mantener en hielo. Suponiendo Conjugación superficie completa, el número promedio de ligando unido para las microburbujas es de aproximadamente 18 7,600 ligandos / m 2.
  2. Reconstitución de los viales no focalizados
    1. Llene la jeringa con 1 ml de solución salina, la eliminación de todas las burbujas de aire. Colocación de una aguja de calibre 21, inyecte la solución lentamente en el vial de microburbujas.
    2. Retire lentamente el émbolo, la eliminación de 1 ml de aire y retire la aguja. Agitar suavemente. Dejar reposar 5 min. Añadir un adicional de 1 ml de solución salina, como se describe anteriormente. Agitar suavemente y dejar reposar 10 minutos en hielo.
  3. Coulter Conteo
    1. Agitar suavemente el vial de microburbujas deseada y dibujar ~50 l de la solución en una jeringa de 1 ml usando la aguja 21 G. Inyectar las microburbujas en un tubo de microcentrífuga de 2 ml vacía.
    2. Pipetear una muestra de 10 l de solución de microburbujas caldo en 10 ml de diluyente.
    3. Después de mezclar suavemente, evaluar la concentración y el tamaño de las distribuciones de la población de microburbujas mediante conteo de siembra (ver Lista de Materiales). Contar con un mínimo de tres mediciones de 50 mu l (por muestra vial) con una abertura de 30 micras.
  4. Microburbujas Preparación para inyección
    NOTA: El asistente realiza este paso cuando "La inyección de microburbujas en embriones '(paso 6) se inicia. Cada embrión se inyecta una vez, con el tipo de microburbujas elegido para cada inyección para ser seleccionado al azar por el asistente de tal manera que todos los tipos de microburbujas se distribuyen uniformemente por todo el procedimiento, pero dan en un orden aleatorio. Asegúrese de que el cirujano es ciego para el tipo de burbuja que se inyecta.
    1. Determinar ªe volumen de solución madre de burbujas requerida para producir una concentración final de 1 x 10 8 MB ​​/ ml en un volumen de 400 l (calcular el volumen utilizando las concentraciones de valores medidos en 5.3.3). Alícuota el volumen correspondiente de solución salina en un tubo de microcentrífuga vacío.
    2. Agitar suavemente el vial de microburbujas seleccionado y dibujar un volumen en exceso (~ 50 l mayor que el calculado anteriormente) de la solución en una jeringa de 1 ml usando la aguja 21 G. Inyectar las microburbujas en un tubo de microcentrífuga vacía.
    3. Pipetear el volumen necesario de solución madre de microburbujas y añadir a la alícuota de solución salina. Mezclar agitando suavemente con la punta de la pipeta.
    4. Dibuje la solución de microburbujas diluida en una jeringa limpia utilizando la aguja 21 G. Retirada de la aguja, eliminar las burbujas de aire de la jeringa y fijar la luer y la tubería. Empuje lentamente la solución al final de la toma de la tubería seguro de no generar burbujas de aire.
    5. Inserte el Syringe en una bomba de infusión de jeringa configurar para dispensar las microburbujas a una velocidad de 20 l / min para un volumen total de 20 l. Adjuntar una aguja de vidrio arrastrado hasta el final de la tubería. Mueva la bomba cerca de la etapa de inyección.

6. La inyección de microburbujas en embriones

  1. Aleatoriamente seleccionar y eliminar (con cuchara perforada) de un embrión desde el plato medios refrigerados. Coloque en un plato de la disección se encuentra en la etapa de ultrasonidos bajo el estereoscopio y quitar el saco vitelino y membranas amnióticas con las pinzas finas, cortar / desgarro desde el lado que aparece menos vascularizado (el lado antimesometrial). Esto se logra más fácilmente por la perforación de un área adyacente a la región de la cabeza.
    1. Cortar suficiente para eliminar el embrión desde el interior, pero no más. Estabilizar los platos de disección utilizando pequeños trozos de plastilina.
  2. Maniobrar con cuidado el saco de todo el embrión. Coloque el embrión en su lado, con la placenta yvasos umbilicales en el frente. El uso de los pasadores de insectos, precisar el saco vitelino (4 pasadores recomendado) y bordes de la placenta como necesario colocar en su lugar. Evite los grandes vasos.
  3. Lave el embrión con pre-calentado a 45 ° C PBS hasta que el embrión revive. Identificar la vena umbilical y su red vascular asociada. Coloque el plato de manera que la inyección se puede hacer cómodamente.
    NOTA: Una vez calentada, la sangre en el embrión comenzará a fluir, visiblemente bombeo en la arteria umbilical. Cuando el flujo comienza en primer lugar, las venas serán un color rojo brillante, con la sangre en los dos buques que aparezcan rápidamente idénticos. Las ramas derivadas de la vena umbilical generalmente se superponen los de la arteria umbilical en la superficie de la placenta.
  4. Una vez que el embrión ha revivido, cúbralo (pero no la placenta) con pre-calentado gel de EE.UU., asegurándose de remover delicadamente las burbujas de aire (utilizando las pinzas finas) de todo el embrión. Completar el plato con PBS precalentado.
    NOTA: Mantenga un ojo en el nivel de solutien en las jeringas de PBS y de gel y añadir jeringas de copia de seguridad al vaso de precipitados de calentamiento según sea necesario.
  5. Montar la aguja de vidrio en una gran bola de plastilina en el borde del plato disección e inserte el extremo de la aguja en el PBS. La elección de una vena en la superficie del disco coriónica placentaria, tan lejos de la rama principal como razonable, recortar la punta a medida con tijeras. La inyección es más fácil si la punta se corta en un ligero ángulo. Retire los bordes dentados de vidrio utilizando el borde de las tijeras de primavera.
  6. Uso de la bomba de jeringa, inyectar lentamente la solución de microburbujas en 20 l / min en la aguja de vidrio hasta que todo el aire es expulsado de la punta de la aguja y las microburbujas se puede ver a fluir libremente en el PBS. Parar la bomba y restablezca para un volumen de inyección de 20 microlitros. No permita que el aire entre en el sistema vascular del embrión durante la inyección.
  7. Inserte la punta de la aguja de vidrio suavemente en una de las venas en la placenta y asegúrese de que está inmóvil. Oscilación lejos del estéreooscope cabeza y la posición del transductor sobre el embrión. Iniciar formación de imágenes.

7. Ecografía Imagen Molecular

NOTA: El uso de las condiciones de contraste de imagen no lineales fijados anteriormente, coloque el transductor de manera que el embrión se encuentra en partes iguales entre los focos a los 6 y 10 mm. Una vez colocado, iniciar la inyección en bolo de las microburbujas. Cuando la inyección se ha completado, iniciar el temporizador.

  1. Imagen de perfusión
    1. Asegúrese de que el número máximo de fotogramas para el modo de contraste no lineal se selecciona pulsando el botón "gestión estudio 'y haciendo clic en la pestaña' Preferencias 'en la parte superior del navegador estudio. Marque la casilla correspondiente en la ventana de "Preferencias".
    2. Ajuste la configuración de imagen mediante el inicio de imagen no lineal. Pulse el botón 'modo de contraste "en el panel de control. Refinar la ganancia 2D ajustando la 'ganancia & #8217; marcar a 30 dB, reducir el poder de 4% a través del "poder" marcar, disminuir la frecuencia de 1 Hz utilizando la "frecuencia" marcar y establecer el ancho de haz (esquina inferior izquierda) para todo el uso de la bolilla / ratón.
      NOTA: Todos los controles se encuentran en el panel de control del sistema de ultrasonido.
    3. Capturar la totalidad de lavado-in y la disipación del bolo de microburbujas mediante la grabación de un bucle de cine 20 min a una velocidad de 1 Hz. Presione exploración / congelación para iniciar la adquisición de datos.
    4. Una vez que la secuencia completa de las imágenes ha sido capturado, pulse el botón de 'tienda de cine' se encuentra en el panel de control para guardar la secuencia de imágenes en el buffer del sistema. El sistema crea un cine loop sellada con la fecha de los datos del modelo de contraste no lineales adquiridos.
  2. Dirigida microburbujas Imaging
    1. En 'Preferencias', establecer el tiempo de ráfaga a 0,1 seg. Establezca los parámetros de imagen apropiadas usando los controles descrito anteriormente (7.1.2.).
    2. Iniciado imágenes de contraste no lineal pulsando el botón 'modo de contraste "en el panel de control. Asegúrese de que el embrión está correctamente situado bajo el transductor y que el flujo de agente de contraste de microburbujas a través de la embrión es visible en la imagen de modo de contraste no lineal.
    3. Para evaluar microburbujas específica vinculante durante los estudios de imagen molecular embrionarias, permiten que las microburbujas que circulan en reposo durante 3 minutos y 40 segundos después de la finalización de la inyección. Este tiempo es para permitir la retención de las microburbujas circulantes. Pulse 'scan / congelar "para detener la imagen durante este tiempo.
    4. En 3 min y 40 seg, imágenes curriculum vitae para confirmar que el embrión es aún visible, está cubierto adecuadamente con PBS, y que las microburbujas continúan circulando. Pulse 'scan / congelar "para iniciar la imagen.
    5. Adquirir la secuencia de interrupción / reposición después de la inyección de 3 minutos y 50 segundos mediante el registro de un "pre-destrucciónsecuencia respuesta acústica ción 'a los 29 Hz. Pulse 'scan / congelación' para iniciar la adquisición de datos. A los 4 minutos después de la inyección 18,19, iniciar una explosión acústica de alta frecuencia 0,1 seg. Pulse el botón 'explosión' de implementar una ráfaga.
    6. Continuar registrando marcos para el resto de la secuencia (hasta la línea de buffer está lleno) y guardar el cine loop pulsando 'tienda de cine'.
    7. Recoger un bucle de cine adicional de microburbujas circulante. Se supone que esta secuencia de imágenes posterior 'post-destrucción "para contener sólo circulan las señales de burbujas que se repone la viga. Pulse 'scan / congelar "para iniciar de imágenes y' tienda de cine 'para recoger las imágenes.
    8. Etiquetar los bucles de cine tras explorar cada embrión. Pulse 'gestión de estudio', resalte el archivo con la bolilla y el 'select', pulse el botón 'etiqueta de imagen' y el nombre apropiado.

    8. Manipulación de los embriones después de la inyección

    1. Formación de imágenes Post, mover el transductor, desanclar el embrión y la eutanasia (a través de la decapitación, la dislocación cervical, asfixia con dióxido de carbono, o anestesia seguido por congelación rápida o fijación) como se desee.
    2. Para cada inyección posterior de embriones debe ser utilizado un plato de disección, aguja, jeringa y tubo segmento fresco, con la preparación del siguiente lote de inyección de microburbujas toma de solución durante la disección y el renacimiento.
    3. Guardar muestras de tejido (por ejemplo, cola, cerebrales) para análisis adicionales (por ejemplo, la genotipificación determinado por análisis de PCR de ADN aislado de la cola, la tinción lacZ, o medidas semi-cuantitativa de la expresión de biomarcadores utilizando Western blots 21).

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Representative Results

La inyección de agentes de contraste de ultrasonido en el útero los embriones de ratón ex depende del éxito en el aislamiento de la vida, embriones en fase tardía de la gestación del útero y el mantenimiento de la viabilidad en el transcurso de la inyección y de formación de imágenes de ultrasonido relacionada. Una vez que el embrión se ha exteriorizado y posicionado, como se muestra en la Figura 1, la inyección cuidadosa de agente de contraste en la vasculatura embrionaria es posible. Una imagen de ultrasonidos en modo B típico de un embrión E17.5 de ratón se muestra en la Figura 2A. El lavado-in de microburbujas y la mejora correspondiente en la vena cava inferior, el corazón, el cerebro, y en todo el animal pueden ser capturados utilizando métodos de formación de imágenes de contraste no lineales, lo que demuestra la viabilidad de esta técnica. Puntos de tiempo individuales se representan en la Figura 2B y muestran el cambio en contraste con el tiempo.

Mediante el registro de todo el lavado y el lavado del of el bolo de microburbujas, es posible medir diversos parámetros de perfusión. En un análisis fuera de línea, se utilizó la herramienta de rastreo región contraste para crear 1,5 mm 2 regiones de interés (ROI) en los hemisferios cerebrales derecho e izquierdo embrionarias. A continuación, la intensidad media de la señal dentro de estas ROIs se representará gráficamente como una función del tiempo y se alisó usando un filtro de mediana de siete puntos. De la curva de intensidad de contraste resultante (mostrado en la Figura 2C), el pico de realce cerebro se determinó. La tasa de lavado-in, que se define como la pendiente entre 10% y 50% de la mejora de pico máximo (PE), también se calculó. Finalmente, el tiempo de pico (TTP) se calculó a partir del inicio de la mejora de la señal a la hora punta. Las diferencias en los parámetros medios de perfusión a través de diferentes tipos de burbujas fueron probados mediante pruebas t independientes 12. Estos resultados, resumidos en la Tabla 1, demuestran que la inyección de microburbujas proporciona un Valumétodo capaz de determinar los parámetros de perfusión importantes en el ratón del desarrollo.

Introducción de microburbujas en la vasculatura embrionaria también permite el uso de embriones de ratón como sistemas modelo para definir y caracterizar las capacidades cuantitativas de imágenes de ultrasonido molecular. En el siguiente ejemplo, un modelo de pérdida de función, donde la manipulación genética genera patrones de expresión heterocigotos y homocigotos de la endoglina en embriones de ratones, se utilizó para probar la capacidad de la ecografía molecular para diferenciar entre genotipos. Después de la inyección y la aplicación de formación de imágenes destrucción / reposición de microburbujas, se utilizó la relación de la intensidad media de la señal de la "pre-destrucción '' a secuencias de post-Destruction 'para producir una medida de la señal molecular llamada el contraste de relación de potencia media (CMPR ). Un modelo lineal mixto (con ajustes de Bonferroni para comparaciones múltiples realizadas) se realizó para determinar w anto hubo ninguna diferencia significativa entre la endoglina el control específico, y no directo de microburbujas de unión al Ing + / + o embriones Eng +/- (identificado después de la inyección a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de muestras de la cola). Los medios CRPM estimados (media ± 95% intervalo de confianza (IC)) se presentan para cada uno de microburbujas y embrión tipo en la Figura 3 y se resumen en la Tabla 2.

Estos resultados proporcionan una demostración concreta de que la inyección de agentes de contraste de ultrasonido en embriones vivos aislados se puede lograr. Además, este protocolo facilita la evaluación de los parámetros de perfusión y puede ser utilizado para comparar la unión específica de microburbujas en los modelos de embrión de enfermedad vascular en un esfuerzo por dilucidar las capacidades de formación de imágenes de ultrasonido molecular.

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Figura 1. Estructura de ensayo para la inyección de microburbujas en embriones aislados. Un transductor lineal de 21 MHz se coloca encima de un exteriorizada embrión E16.5 vida como se inyecta una solución de microburbujas 20 l en una vena de la placenta usando una cánula de vidrio. Barra de escala = 10 mm. Desde Denbeigh, JM et al. 12 con permiso. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Ultrasonido Exteriorizada Living E17.5 embriones. (A) imagen de ultrasonidos en modo B de un embrión. Antes de la inyección de microburbujas dirigidas (t = 0 seg). (B) Imagen de contraste no lineal del embrión antes y después de la inyección de microburbujas. Contraste no lineal imagen prio para la inyección de microburbujas (t = 0 seg). Sólo las interfaces fuertemente reflectantes (por ejemplo, hueso) son visibles, con la señal mínima por parte de los tejidos blandos. A continuación, imagen de contraste no lineal de microburbujas dentro del embrión en t = 50 seg, t = 120 segundos y t = 420 seg después de una inyección de bolo. El contraste se detecta en todo el animal, incluyendo el corazón y el cerebro. Parámetros (C) de perfusión derivados de curvas de intensidad de tiempo. Intensidad parcela de microburbujas como una función del tiempo dentro de un solo ROI en el cerebro embrionario. Parámetros de perfusión se identifican en el gráfico, incluyendo la mejora de pico (PE), lavandería en la tasa (pendiente), y tiempo hasta el pico (TTP). Puntas de flecha: R = costillas, Ht = corazón, Br = cerebro. au, unidades arbitrarias; ROI, región de interés; seg, segundo. La barra de escala = 3 mm. Esta cifra ha sido modificado desde Denbeigh, JM et al. 12. Haga clic aquí para ver una mayorversión de esta figura.

Figura 3
Figura 3. relaciones de potencia Resumen de contraste promedio significar (CRPM) para endoglina dirigida (MB E), control (MB C) y no focalizados microburbujas (MB U) en Ing + / + y embriones Eng +/-. CMPRs de endoglina dirigidos microburbujas fueron significativamente mayores (***, p <0,001) que los de recogida para C MB y MB U, (no significativamente diferentes entre sí, independientemente del genotipo). MB E unión resultó ser significativamente mayor en Eng + / + embriones (marcadores oscuros) en comparación conEmbriones Eng +/- (marcadores de luz). Resultados presentan como media ± intervalo de confianza del 95%. n indica el número de embriones únicos en cada categoría. Desde Denbeigh, JM et al. 22 con permiso. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tipo de microburbujas T-pruebas
p-valor
Perfusión Parámetro MB U MB C MB V MB U vs MB C MB U vs MB V MB <sub> C vs MB V
Pico Mejora, PE (au) 0,427 ± 0,063 0,490 ± 0,079 0,499 ± 0,064 0.19 0.06 0.81
Tasa Wash-in (au / seg) 0,008 ± 0,002 0,009 ± 0,002 0,011 ± 0,002 0.18 0.01 0.09
Es hora de pico, TTP (seg) 53,75 ± 7,96 51,75 ± 4,46 45,00 ± 5,33 0.55 0.03 0.03
# embriones inyectados 4 4 3

1. Resumen de E17.5 parámetros de perfusión embrionario Tabla. La media ± desviación estándar derivados de parcelas de intensidad de tiempo para todas las regiones de interés de embriones (a.u. = Unidades arbitrarias). La tabla incluye mediciones para no directo (MB U), IgG2 de control dirigido (MB C) y VEGFR2 dirigido (MB V) microburbujas. Se realizaron pruebas t para comparar grupos separados. Esta tabla ha sido modificado desde Denbeigh, JM et al. 12.

Tipo de microburbujas Genotipo CRPM Mean Intervalo de confianza del 95%
MB E Ing + / + 9.71 9.05, 10.38
Ing +/- 5.51 4.87, 6.15
MB C Ing + / + 1.42 0,41, 2,43
Ing +/- 1.46 0.45, 2.47
MB U Ing + / + 1.7 0.65, 2.75
Ing +/- 1.76 0.67, 2.84
Modelo Lineal Mixto: entre sujetos Efectos
df F valor p
Genotipo 1 12.75 <0,001
Tipo de microburbujas 2 147.65 <0,001
Genotipo * Tipo de microburbujas 2 18.29 <0,001

Tabla 2. Resumen de análisis del modelo lineal mixto paramicroburbujas vinculante en los embriones, con una corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. genotipo, tipo de microburbujas y la interacción combinada (genotipo * Tipo de microburbujas) resultaron ser factores importantes en la determinación CRPM. df = grados de libertad. Desde Denbeigh, JM et al. 22 con permiso.

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Discussion

Los agentes de contraste de ultrasonido fueron inyectadas en la última etapa de la gestación de embriones de ratón y las imágenes de contraste no lineales fueron adquiridos para medir parámetros de perfusión y microburbujas dirigidos vinculante. El éxito de formación de imágenes de microburbujas dentro de la vasculatura embrionaria era dependiente de una serie de factores, siendo el primero la viabilidad del embrión. Todo el equipo y el aparato se prepararon de antemano con el fin de minimizar el tiempo requerido para el aislamiento de los embriones desde el útero hasta el inicio de la inyección. Dado que los efectos de la exposición única o repetida a la anestesia en embriones de ratones no han sido estudiados en detalle, el uso de anestesia en la madre se evitó antes del sacrificio 16. Durante el aislamiento de embriones, que era importante para evitar daños en el saco vitelino y garantizar embriones se mantenga refrigerado en todo momento, en medios embrión frecuentemente renovado. Cuando exteriorizar el embrión antes de la inyección y durante el fijar, se evitaron los principales vasos vitelinos para limitar la likelihood de sangrado, lo que podría ser letal. Hemos encontrado que cuando la reactivación del embrión, lo mejor era cubrir primero la placenta y luego el embrión con PBS, antes de aplicar el gel de ultrasonido para el embrión en un movimiento de vaivén y la eliminación de cualquier burbujas grandes con pinzas. El resto de la placa de Petri se llenó a continuación con PBS. El uso de gel de PBS y limita la posibilidad de bolsas de aire entre el embrión y el transductor, que podrían afectar la calidad de imagen. A medida que el embrión revivió, la sangre comenzó a fluir, visiblemente bombeo en la arteria umbilical, mientras que las venas umbilicales aparecieron rojo brillante 23. Para referencia, las ramas derivadas de la vena umbilical generalmente se superponen los de la arteria umbilical en la superficie de la placenta. También Aunque era posible inyectar en las arteriolas de laberinto de la placenta, la inyección de las microburbujas en la dirección de flujo reducido de hemorragia placentaria y venule inyecciones permitido que las microburbujas para pasar directamente a través del embrión antes ésimo que circulaáspera la placenta.

Debido a su fragilidad, la preparación y manipulación de microburbujas también requieren atención. Microburbujas de ultrasonidos pueden ser destruidos en ambientes de alta presión. Por lo tanto, exactamente el mismo procedimiento se repitió durante cada concentración de la reconstitución y la burbuja se midió para asegurar la consistencia experimental. Un único vial de microburbujas era típicamente suficiente para alrededor de 5-7 embriones. Dado que las microburbujas son estables dentro del vial para un máximo de 3 hr, múltiples viales se requiere a menudo para un solo experimento. Para evitar que se rompa el tejido, lo que era mejor para la punta de vidrio de la aguja de inyección para ser fuerte y cortar en un ángulo leve mientras se aproximaba a la embarcación con el menor ángulo posible. Una vez recortado, la punta de la aguja tenía que ser lo suficientemente grande para que las burbujas que fluyen fácilmente a través del extremo sin la formación de grumos, pero lo suficientemente pequeño para caber fácilmente dentro del recipiente. El tamaño ideal era generalmente <100 micras. Algunas prácticas a juzgar la adecuadatamaño era necesario. En el caso de que la punta se corta demasiado grande, o se bloqueó, se aplicó una nueva aguja de vidrio. Es algunos casos, fue posible recortar la aguja ligeramente por encima de la obstrucción. Era fundamental que el aire no se permitirá la entrada del sistema vascular del embrión durante la inyección, ya que esto podría resultar en la muerte del animal y no era deseable durante la exploración (burbujas de aire podrían alojan en el sistema vascular del embrión y ser detectable en la imagen de ultrasonido , el incremento artificial de cualquier señal medida). Imágenes de contraste no lineal realizado en este protocolo utiliza un estado de la técnica de alta frecuencia (21 MHz) sistema de micro-ultrasonido (Vevo2100) emparejado con matrices lineales diseñados específicamente para las imágenes de pequeños animales (MS250). Micro o una sonda de ultrasonido de alta frecuencia es una de las pocas modalidades capaces, en este momento, para proporcionar imágenes de alta resolución de vivir embriones murinos y los recién nacidos 16. Este sistema puede lograr resoluciones axiales y laterales de 75 micras y 165 μm respectivamente a profundidades tan grandes como 15 mm. Por tanto, era posible tomar imágenes de todo el embrión a resoluciones mucho más altas que logra típicamente usando instrumentos clínicos y de la señal acústica de microburbujas podían distinguirse de tejido utilizando métodos de imagen de contraste no lineales (incluyendo la inversión de pulsos y técnicas de modulación de amplitud 24). Aunque teníamos el mejor éxito con los ajustes de ultrasonido que se describen aquí, es posible que algunos ajustes en estos parámetros también producirá resultados satisfactorios. En todos los casos, se requiere una baja potencia para formación de imágenes de microburbujas para evitar la destrucción indeseable de las microburbujas antes de la iniciación de una ráfaga, mientras que la corta ráfaga elimina sólo una pequeña fracción de la población de microburbujas. Con la práctica, todo el procedimiento de un solo embrión, desde el posicionamiento a la realización de la ecografía molecular, tomó aproximadamente 15 min. Hemos inyectado con éxito a todos los que 12 embriones a partir de una camada enuna sola sesión.

Experimentos de inyección se restringieron a una ventana de 4 horas debido a la limitada viabilidad de los embriones. Dado que la distribución de microburbujas dependía de la circulación del propio embrión, las inyecciones no podría tener lugar antes de que el latido del corazón (E8.5) y el flujo detectable en la vitelino y la circulación umbilical (E9.5) se constituyó el 25. Con la maduración de la placenta no completa hasta E14.5, la inyección de agentes de contraste a través del laberinto de la placenta se limitó a embriones de mediados o finales de la edad gestacional. Basándose en las observaciones, los embriones más cercanos a plazo eran más resistentes y pueden soportar aumentos en su volumen vascular mejor que sus contrapartes más jóvenes. Combinados, estos factores restringidos mayor contraste de imágenes por ultrasonido de la vasculatura embrionaria a etapas posteriores del desarrollo y el crecimiento angiogénico. Esto puede afectar a la disponibilidad de modelos de ratones transgénicos, ya que la manipulación de receptores implicados en Vascdesarrollo ular y mantenimiento (por ejemplo, VEGFR2, VCAM-1) puede conducir a la letalidad embrionaria o defectos en el desarrollo y la regulación de los sistemas circulatorios embrionarias 26,27. Sin embargo, un número de sistemas de modelos pertinentes están disponibles para los biomarcadores vasculares de interés, incluyendo α 2 β 1 28, α v β 3 29, plaquetas molécula de adhesión de células endoteliales-1 30, y la molécula de adhesión celular vascular-1 31, molécula de adhesión intercelular -1 y -2 32 33 y P-selectina 34. Lo que es más, histogénesis cerebro empieza después de mediados de la gestación 11, por lo que la expresión de marcadores angiogénicos en este tejido probable y proporcionando así una excelente alternativa para el modelo de tumor tradicional para estudios de evaluación de los aspectos cuantitativos de imagen molecular.

La naturaleza ex vivo de las inyecciones presenta algunos limitations. Es importante tener en cuenta que después de los embriones fueron retirados de la madre y el laberinto de la placenta perforado, generalmente no era posible (ni deseable) para hacer inyecciones repetidas. Además, el aislamiento del embrión a partir de la circulación materna limita el suministro de nutrientes y O 2, y se espera que la salud embrionaria a deteriorarse con el tiempo. Mientras que la refrigeración y la reactivación prolonga la viabilidad de los embriones, sino que también puede afectar a la función cardíaca. Por ejemplo, hemos observado que los embriones aislados tenían una frecuencia cardiaca reducida (datos no incluidos, consulte Denbeigh et al. 12) en comparación con los observados previamente en vivo 35. Por tanto, es probable que los estudios de evaluación de la fisiología cardiovascular no reflejar con precisión las condiciones in vivo. Con pocos estudios que caracterizan la hemodinámica circulatorios en la que viven embrión de ratón etapa tardía, sin embargo, es difícil decir con certeza el grado en que estas condiciones experimentales pueden alter función fisiológica. Una alternativa es realizar inyecciones en el útero, ya sea a través de una incisión laparoscópica 36 oa través del vientre de la madre embarazada directamente 37, aunque este enfoque puede presentar su propio conjunto de desafíos 11. En algunos casos, el aislamiento y la exteriorización del embrión también pueden dar lugar a un sangrado significativo desde el saco vitelino. Aunque encontramos que podíamos inhibir el flujo de sangre con gel de ultrasonido, cualquier pérdida significativa de sangre podría afectar el suministro y la concentración de microburbujas, y estos animales fueron excluidos del análisis. Por último, mientras que el aislamiento hace materna límite y fuentes embrionarias de movimiento, movimiento periódico en relación con la actividad cardíaca es inevitable. Nos elegido para la imagen del cerebro estática con el fin de examinar directamente el efecto de la expresión del receptor en la señal de microburbujas dirigidas, sin embargo la aplicación de tiempo real de movimiento compensado de imágenes por ultrasonido con contraste 38 puedeextender estos estudios a otros órganos.

Hay pocas aplicaciones de imagen que actualmente se encuentran en condiciones de evaluar el paisaje vascular de los vivos desarrollo embrión de ratón. Algunos estudios han realizado con éxito la imagen en vivo de flujo sanguíneo en ex vivo embriones murinos utilizando Doppler-fuente barrida tomografía de coherencia óptica 39,40, mientras que la resonancia magnética, la corrosión vascular arroja, microtomografía computarizada y la tomografía de proyección óptica se han implementado 16 postmortem. Esto es lamentable, ya que este período de crecimiento embrionario puede revelar información crucial sobre el desarrollo vascular temprano y función. Por lo tanto, la imagen de microburbujas en embriones vivos podría contribuir a nuestra comprensión de la fisiología del desarrollo. También podría utilizarse para visualizar la distribución de biomarcadores en todo el cuerpo del feto ratón vivo en tiempo real, aunque es poco probable que esta técnica para reemplazar los métodos existentes (incluyendo la histologíay formación de imágenes fluorescentes) para la medición de la señal molecular en el tejido embrionario. La masa de rápido desarrollo de los vasos en los embriones, sin embargo, se asemeja estrechamente el crecimiento del tumor, con la expresión de muchos de los mismos receptores clave identificados en la angiogénesis tumoral 41,42 y por lo tanto puede servir como un excelente sustituto del tumor para los estudios que examinan las capacidades cuantitativas de molecular ultrasonido. Por lo tanto, anticipamos que los métodos descritos serán útiles no sólo para evaluar y caracterizar modelos embrionarios de la salud vascular y la enfermedad a través de la imagen funcional, sino que ofrece una vía para explorar las fortalezas y limitaciones de imagen molecular también. Su aplicación también podría extenderse a otras zonas de interés de la investigación, incluyendo en la terapia de transferencia génica in utero donde microburbujas se han probado como un medio de entrega de ADN desnudo en el tejido fetal ratón 10. Alternativamente, el mapeo vascular 3D del embrión vivo también es posible,que puede proporcionar información muy valiosa sobre las anomalías morfológicas en ratones modificados genéticamente. Introducción de agentes de contraste de ultrasonido en embriones vivos aislados, por lo tanto podría ser una herramienta más para aumentar nuestra comprensión de la enfermedad vascular y la traducción de las aplicaciones de la ecografía con contraste a la clínica.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
  • rat isotype IgG2 control
eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose
Sigma D5796
  • 50 ml Fetal Bovine Serum
ATCC 30-2020 lot # 7592456
  • Hepes
Gibco 15630 5 ml, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco 15140-122 5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 ml BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 ml Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 ml VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110 °C VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

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References

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