Kontrast Imaging i museembryoer Brug højfrekvent ultralyd

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at injicere ultralyd mikrobobler kontrastmidler i levende, isolerede sene drægtighedsstalde stadie murine embryoer. Denne metode gør det muligt at studiet af perfusion parametre og vaskulære molekylære markører i embryo ved hjælp af kontrast-forstærket højfrekvente ultralydsscanning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Kontrast-forstærket ultralydsscanning gør brug af mikrobobler kontrastmidler at visualisere og karakterisere det vaskulære miljø. Disse midler gør det muligt invasiv vurdering af mikrocirkulationen, vaskularisering og kardiovaskulær funktion. Desuden kan ændring af boblen overflade resultere i målrettet mikroboble binding til endotelceller biomarkører, som vist i prækliniske anvendelser af angiogenese, aterosklerose og inflammation 1,2 gør molekylær ultralydsscanning af vaskulære hændelser mulige. Kontrastforbedret ultralyd kan derfor anvendes til at identificere de komplekse og forskelligartede miljøer, der påvirker sunde og syge vaskulære tilstande 3-5.

I de seneste mange år, har interessen for nytten af ​​mikrobobler imaging udvides til alsidig museembryo model. Som model for udvikling pattedyr, indførelse af mikrobobler i den embryoniske vaskulatur forbedrer fysiologiskundersøgelse af udviklingen kredsløbssygdomme (f.eks blodgennemstrømning, cardiac output) og i tilfælde af transgene og målrettede mutante musemodeller for hjertesygdom 6,7, kan give indsigt i, hvordan genetiske faktorer ændrer kardiovaskulær funktion. Faktisk kvantitativ og kvalitativ 2D analyser af embryonale hjernen vaskulaturen er allerede nået 8. Endvidere musen embryo præsenterer som en fremragende model for behandlingen af bindingen af målrettede mikrobobler til vaskulære markører in vivo. Bartelle et al. 9, for eksempel, har indført avidin mikrobobler i embryo hjerte- hjertekamrene til at vurdere målrettet bindende i Biotag-Bira transgene embryoner og undersøge vaskulær anatomi. Frembringelsen af ​​heterozygote og homozygote musemodeller kan også bruges som et surrogat for tumor modelstudier til formål at definere kvantitative karakter af molekylær ultralyd - en vigtig benchmark i at omsætte denne teknik til klinikken.

8-10. i livmoderen injektioner står imidlertid over for en række udfordringer. Disse omfatter injektion vejledning, at det er nødvendigt at imødegå bevægelse i mor og eksterioriseret embryo, vedligeholdelse af hæmodynamisk levedygtighed i moderen og blotlagt embryoner, behandling af langsigtede virkninger af anæstesi og komplikationer på grund af blødning 11. Derfor er målet med undersøgelsen var at udvikle en teknik til at injicere mikrobobler i isolerede levende sene embryoner 12. Denne indstilling giver mere frihed i form af indsprøjtning kontrol og positionering, reproducerbarhed afbildningsplanet uden obstruktion, og forenklet billedanalyse og kvantificering.

I den foreliggende undersøgelse har vi skitsere en hidtil ukendt fremgangsmåde til injektion af mikrobobler i levende murine embryoer for med henblik på at studere mikroboble kinetisk adfærd og for at studere målrettet mikroboble binding til endogene endotheloverflade markører. Ikke-lineær kontrast specifik ultralydsscanning bruges til at måle på en række grundlæggende perfusion parametre, herunder peak ekstraudstyr (PE), vask-i sats og tid til peak (TTP) i isolerede E17.5 embryoer. Vi viser også gyldigheden af embryo model til vurdering af kvantitativ natur molekylær ultralyd i en embryonisk endoglin tab af funktion transgen musemodel, hvor endoglin er et klinisk relevant mål på grund af sin høje ekspression i vaskulære endotelceller på steder med aktiv angiogenese 13 . Adhæsionen af endoglin målrettet (MB E), rotte isotype IgG 2 kontrol (MB C) og ikke-målrettede (MB U) mikrobobler evalueres i heterozygot endoglin (Eng +/-) og homozygot endoglin (Eng + / +), der udtrykker embryoner. Analyse af det målrettede binding afslører, at molekylær ultralyd er i stand til at skelne mellem endoglin genotyper og vedrører receptor tætheder til kvantificerbare molekylære ultralyd niveauer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: De eksperimentelle procedurer udføres i denne undersøgelse blev godkendt af Animal Care udvalget på Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada). Procedurer for human behandling af dyr skal overholdes på alle tidspunkter. Det antages, at investigator er uddannet i den grundlæggende betjening af et ultralydsscanning system. Denne protokol fungerer bedst med to personer.

1. Dyremodeller

  1. Mate CD-1 mandlige og kvindelige Mus musculus at opnå vildtype embryoner til perfusion studier.
  2. For molekylære billeddiagnostiske undersøgelser, generere Eng +/- mus ved homolog rekombination hjælp embryonale stamceller af 129 / Ola oprindelse som beskrevet af Bourdeau et al. 14.
    1. Tilbagekrydsning B6- Eng +/- mus, venligt erhvervet fra Dr. Michelle Letarte, at CD-1 baggrund. Brug Eng +/- CD-1 tilbagekrydses embryoner, samt deres Eng + / + kuld controls. Parre mus til at producere trinvis embryoner.

2. Eksperimentel Forberedelse

  1. Indled parring af mus og tjek stik dagligt. Fosterdag 0.5 defineres som middagstid på dagen observeres en vaginal prop.
  2. Forbered embryo medier ved tilsætning af 50 ml føtalt bovint serum, 5 ml 1 M HEPES og 5 ml penicillin-streptomycin (10.000 enheder penicillin, 10.000 pg streptomycin) til 500 ml Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med højt glucoseindhold (4.500 mg / L). Pak flasken i folie og holde afkølet ved 4 ° C.
  3. Centrifuge klar ultralyd gel i 50 ml koniske rør ved 140 xg i 20 min. Tegn gel op i 30 ml sprøjter. Fyld yderligere (markeret) 30 ml sprøjter med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og der er afsat. Et kuld af embryoner generelt vil kræve mellem 2-3 sprøjter med ultralyd gel og 4 sprøjter med PBS.
  4. Træk ca. 30 glas nåle og forsigtigt fastgøre en strimmel modellervoksi en 100 x 20 mm cellekultur skål. Dette sikrer, at nåle er adskilt og sikker under håndteringen. Ved hjælp af et glas aftrækker, skal du bruge følgende indstillinger på 1 x 90 mm glas kapillærer med glødetråd: Radiator 77, Sub magnet 55, Main magnet 70.
  5. Forbered 10-12 dissektion plader (nok til at sikre, at hver embryo i et kuld får sin egen skål) under anvendelse af en 1: 8 volumenforhold af hærdningsmiddel til basen. Hæld 40 ml base i et 50 ml konisk rør. Tilføj 5-6 ml hærder og rør med træpind.
    1. Hæld i 60 x 15 mm dyrkningsskåle, påfyldning hver til omtrent halvdelen. Lad stå O / N for at indstille.
  6. Fastgør kvindelige Luers til 400 mm lange stykker af polyvinylchlorid (PVC) rør (indvendig diameter: 0,79 mm). Slangen skal nå fra sprøjtepumpen til ultralyd fase komfortabelt.

3. forsøgsopstilling

  1. Arranger imaging platform under det kirurgiske mikroskop med en 3D-motor og lineært array 21 MHz transducer.
    1. Orient platformen, således at skinnen mount er til venstre, med scenen placeret direkte under mikroskop.
    2. Fastgør 3D motoren til kugleled af udskydningsarmen af ​​platformen. Skru quick release stillingen af ​​transduceren klemme ind i quick release montere på motoren, der vender fremad, og placere transduceren hovedet i klemme, fastgørelse af låsen.
    3. Fastgør transducerstikket i den aktive port på frontpanelet af vognen. Tænd for maskinen.
  2. Indled 21 MHz ultralyd transducer, vælge indstillingen "kardiologi" for molekylær billeddannelse undersøgelser, og »generel« til perfusion undersøgelser. Skift alle tid-gain-kompensation skydere til den nøjagtige midterstilling. For 'Kontrast Mode', skal du indstille følgende parametre: Frekvens: 18 MHz, sendeeffekt: 4%, (0,39 MPa), kontrast Gain: 30 dB, Foci: 6 & 10 mm, Kontrast Mode: Nonlinear, Burst tid: 100% 0.1sek, Bredde bredde: Bred.
  3. Alikvote 40 ml embryo medier hver i fire 50 ml koniske rør. Sted på is.
  4. Varm 1 L vand i et 2 liters bægerglas på en varm plade. Holdes ved 45 ° C. Tilsæt en sprøjte af ultralyd gel og PBS til bægerglasset at forvarme. Denne temperatur holdes ved overvågning med et termometer på alle tidspunkter.
  5. Braklægning 10-12 1 ml sprøjter og 10-12 21 G kanyler til injektion af mikrobobler.

4. Kirurgisk Procedure

BEMÆRK: Har du en assistent forberede boblerne (fase 5), mens kirurgen begynder det kirurgiske indgreb. Den her beskrevne protokol er blevet tilpasset fra Whiteley et al. 15

  1. Saml E16.5 eller E17.5 embryoner fra den gravide hunmus efter cervikal dislokation.
    BEMÆRK: Virkningerne af anæstesi i embryoner er endnu ikke blevet undersøgt nærmere 16. Yderligere metoder, herunder halshugning, kan være hensigtsmæssigt opserne for ofringen af ​​de gravide mus.
    1. Skær åbne maven at afsløre livmoderen & embryoner. Omhyggeligt og hurtigt at fjerne livmoderen ved at skære på spidserne af uterine horn (overskæring af æggestokkene og livmoderen skibe) og overskæring ved skeden og blæren.
    2. Brug flossefri pincet overføres livmoderen til et rør på 40 ml iskold embryo medier så hurtigt som muligt uden at beskadige embryoner. Kassér musen slagtekroppen.
  2. Flyt til mikroskop og scene. Deponere uterus i en 100 x 20 mm cellekultur skål. Overfør uterus i en ny skål fyldt med 50 ml frisk embryo medier.
  3. Brug steriliseret (70% ethanol spray) fin pincet forsigtigt rive og trække sig væk de ydre membraner af livmoderen begyndende ved den ene ende. Expose placenta decidua, parietal blommesækken og Reichert membran til at adskille og fjerne fra den underliggende visceral blommesækken.
  4. Dissekere de embryoner én efter én, holde visceral yOlk sacs intakte og håndtering moderkagen så skånsomt som muligt 17. Sørg for at undgå brud på blommesækken som embryonerne pop ud med det samme.
    1. Brug den perforerede skeen til at flytte embryoner til en anden skålen holdt på is med friske embryo medier. Hold embryoner kølet indtil det skal bruges. Skift medierne i embryoet skål hver 1-1,5 time. Med disse betingelser embryoner er levedygtige i op til 4 timer efter dissektion.

5. Mikroboble Forberedelse

BEMÆRK: Udfør molekylær billeddannelse med ultralyd ved hjælp af både målrettede og ikke-målrettede mikrobobler. En enkelt eksperiment kan kræve så mange som 3 separate hætteglas med mikrobobler: i) antistof rettet mikrobobler, ii) kontrol isotype antistof målrettede mikrobobler og III) målrettede mikrobobler. Kontrastmidlet kommer som en tør-freeze pulver og skal rekonstitueres med saltvand før injektion. Der er ~ 2 x 10 9 mikrobobler i hver målrettede Microbubble hætteglas og ~ 8,8 x 10 8 mikrobobler i målet klar hætteglas. De mikrobobler er stabile i op til 3 timer efter rekonstitution.

  1. Rekonstituering af Target Ready Hætteglas
    Note: Eksempler på mål-klar præparater: endoglin målrettede mikrobobler (MB E, med biotinyleret rotte MJ 7/18 antistof til mus endoglin, i hus hybridoma facilitet); vaskulær endotel vækstfaktor receptor 2 (VEGFR2) målrettede mikrobobler (MB V, med biotin-anti-muse CD309); rotte isotype IgG 2 kontrol antistof rettet mikrobobler (MB C, biotin rotte isotype IgG 2 kontrol målretning muse-IgG2a).
    1. Antistof opløsning (20 ug) i 1 ml (endelig volumen) saltopløsning fortyndes. Hold på is.
    2. Fyld sprøjten med 1 ml saltvand, fjerne alle luftbobler. Montering en 21 G kanyle, injicere opløsningen langsomt ind i mikroboblen hætteglasset.
    3. Langsomt trække stemplet, fjerner 1 ml luft og trække nålen. Forsigtigtagitere. Lad det stå 5 min på is.
      BEMÆRK: Ultralyd mikrobobler kan blive ødelagt under højt tryk miljøer.
    4. Efter den forløbne tid, fylder en ny sprøjte med antistoffet fortynding og føje til passende hætteglas. Agitere forsigtigt. Lad blandingen (nu 2 ml) stå i 10 min. Hold på is. Antages hele overfladen konjugation, det gennemsnitlige antal bundne ligand for mikroboblerne er cirka 18 7.600 ligander / um 2.
  2. Rekonstituering af ikke-målrettede Hætteglas
    1. Fyld sprøjten med 1 ml saltvand, fjerne alle luftbobler. Montering en 21 G kanyle, injicere opløsningen langsomt ind i mikroboblen hætteglasset.
    2. Langsomt trække stemplet, fjerner 1 ml luft og trække nålen. Agitere forsigtigt. Lad stå 5 min. Tilføj en yderligere 1 ml saltvand, som beskrevet ovenfor. Ryst forsigtigt og lad stå 10 minutter på is.
  3. Coulter Counting
    1. Ryst forsigtigt den ønskede mikrobobler hætteglasset og trække ~50 pi af opløsning i en 1 ml sprøjte under anvendelse af 21 G nål. Injicer mikrobobler i en tom 2 ml mikrocentrifugerør.
    2. Pipette en 10 pi prøve af mikrobobler stamopløsning i 10 ml fortyndingsmiddel.
    3. Efter forsigtig blanding, vurdere koncentrations- og størrelse fordelinger af mikroboblen befolkning ved hjælp af skær tælling (se liste over materialer). Tæl mindst tre 50 målinger pi (per hætteglas prøve) ved anvendelse af en 30 um åbning.
  4. Forberedelse Mikrobobler for Injection
    BEMÆRK: assistent udfører dette trin, når 'Injektion af mikrobobler i embryoner «(trin 6) påbegyndes. Hvert embryon injiceres én gang, med den type mikroboble valgt til hver injektion for at blive tilfældigt udvalgt af assistent, således at alle typer af mikroboble jævnt fordelt i hele proceduren, men givet i tilfældig rækkefølge. Sørg kirurgen er blind for den type boble der injiceres.
    1. Bestem the volumen på lager boble løsning kræves for at producere en slutkoncentration på 1 x 10 8 MB ​​/ ml i et volumen på 400 pi (beregne lydstyrken ved hjælp bestanden koncentrationer målt i 5.3.3). Alikvot den tilsvarende volumen saltvand ind i et tomt mikrocentrifugerør.
    2. Ryst forsigtigt den valgte mikrobobler hætteglas og tegne et overskud volumen (~ 50 pi større end beregnet ovenfor) af opløsningen i en 1 ml sprøjte ved hjælp af 21 G nål. Injicer mikrobobler i en tom mikrocentrifugerør.
    3. Pipette den nødvendige volumen af ​​mikrobobler stamopløsning og føje til prøve af saltvand. Bland ved omrøring forsigtigt med spidsen af ​​pipetten.
    4. Tegn den fortyndede mikrobobler opløsning i en ren sprøjte ved hjælp af 21 G nål. Fjernelse af nålen, fjerne eventuelle luftbobler fra sprøjten og fastgør luer og slange. Skub langsomt løsningen på enden af ​​slangen og sørg for ikke at generere eventuelle luftbobler.
    5. Sæt Syringe ind i en infusionspumpe indstillet til dispensere mikrobobler med en hastighed på 20 ul / min for et totalt volumen på 20 pi. Vedhæft en løftes glas nål til enden af ​​slangen. Flyt pumpen tæt injektionen fase.

6. Injektion af mikrobobler i embryoner

  1. Tilfældigt vælge og fjerne (med perforeret ske) et embryon fra den kølede medier skålen. Placer i dissektion skål placeret på ultralyd fase under stereoskop og fjern blommesækken og fostervand membraner med fin pincet, skæring / rive fra siden, der vises mindst vaskulariseret (den antimesometrial side). Det er nemmest opnås ved piercing et område støder op til hovedet region.
    1. Skær nok til at fjerne embryo indefra, men ikke mere. Stabiliser dissektion retter ved hjælp af små stykker af modellervoks.
  2. Forsigtigt manøvrere sac fra hele embryo. Placer embryo på sin side, med placenta ognavlestrengen skibe i front. Brug af insekt ben, pin ned blommesækken (4 ben anbefales) og kanter efter behov moderkagen at anbringe på plads. Undgå større fartøjer.
  3. Vask foster med forvarmet 45 ° C PBS indtil embryo genopstår. Identificer navlestrengsvenen og dens tilhørende vaskulære netværk. Placer skålen, således at injektionen kan udføres komfortabelt.
    BEMÆRK: Når opvarmet, vil blod i embryoet begynder at flyde, synligt pumpning i navlestrengen arterie. Når strømmen først begynder, vil venerne være en rød, med blod i begge skibe hurtigt vises identiske. Grenene følger navlestrengen vene normalt overlay dem fra navlestrengen arterie på placenta overflade.
  4. Når fosteret har genoplivet, dække den (men ikke placenta) med forvarmet amerikanske gel, og sørg for at forsigtigt fjerne eventuelle luftbobler (Brug af fine tænger) fra hele embryo. Fyld skålen med forvarmet PBS.
    OBS: Hold øje med niveauet for solutipå i PBS og gel sprøjter og tilføje backup sprøjter til opvarmning bægerglas efter behov.
  5. Monter glasset nål på en stor kugle af modellervoks på kanten af ​​dissektion fad og stik nålen ende i PBS. At vælge en blodåre på chorion overflade placenta skive, så langt fra den vigtigste gren som rimelige, trimme spidsen til størrelse med en saks. Injektion er nemmest hvis spidsen er skåret i en lille vinkel. Fjern eventuelle takkede kanter glasset ved hjælp af kanten af ​​foråret saks.
  6. Brug sprøjtepumpen langsomt injicere mikroboble opløsning ved 20 ul / min i glasset nålen, indtil al luft udstødes fra nålespidsen og mikrobobler kan ses at strømme frit ind i PBS. Stop pumpen og nulstille en indsprøjtning på 20 pi. Lad ikke luft at komme ind i embryo vaskulære system under injektion.
  7. Sæt glasset nålespidsen forsigtigt ind i en af ​​venerne i moderkagen og sikre, at det er immobile. Sving væk Stereoscope hoved og position transduceren over embryoet. Indled billeddannelse.

7. Ultrasound Molecular Imaging

BEMÆRK: Brug af kontrast lineære imaging betingelser tidligere, placere transduceren, så fosteret ligger jævnt mellem foci efter 6 og 10 mm. Når placeret, starte bolusinjektion af mikrobobler. Når injektionen er fuldført, starter timeren.

  1. Perfusion Imaging
    1. Sørg for, at det maksimale antal billeder for ikke-lineær kontrast tilstand vælges ved at trykke på knappen 'studieledelsen "og klikke på fanen' Prefs" i toppen af undersøgelsen browser. Tjek den relevante boks i 'Indstillinger' vindue.
    2. Juster de billeddannende indstillingerne ved at indlede lineær afbildning. Tryk på "kontrast mode 'knappen på kontrolpanelet. Præciser 2D gevinst ved at justere "gain & #8217; ringe til 30 dB, reducere strømmen til 4% ved hjælp af »power« dial, nedsætte hyppigheden til 1 Hz ved hjælp af 'frekvens' dial og indstil strålebredden (nederste venstre hjørne) til bred anvendelse af rullekugle / mus.
      BEMÆRK: Alle knapper er placeret på kontrolpanelet på ultralydssystemet.
    3. Fang hele vask i og spredning af mikrobobler bolus ved at optage et 20 min cine loop med en frame rate på 1 Hz. Tryk på Scan / fryse for at starte købet dataene.
    4. Når den fulde sekvens af billeder er blevet fanget, skal du trykke på 'cine butikken' knappen på kontrolpanelet for at gemme sekvens af billeder i systemet buffer. Systemet opretter en datostemples cine loop af den ikke-lineære kontrast model data erhvervet.
  2. Målrettet Mikroboble Imaging
    1. Under 'Prefs «, indstille burst tid til 0,1 sek. Indstil de relevante billeddiagnostiske parametre ved hjælp af kontrollerne described ovenfor (7.1.2.).
    2. Indled ikke-lineær kontrast imaging ved at trykke på knappen 'kontrast mode' på kontrolpanelet. Sørg embryoet er korrekt placeret under transduceren, og at strømmen af ​​mikroboble kontrastmiddel gennem embryo er synlig i den ulineære kontrasttilstand billede.
    3. For at vurdere målrettet mikroboble binding under embryonale molekylære billeddiagnostiske undersøgelser, tillade mikrobobler at cirkulere uforstyrret i 3 min og 40 sek efter afslutningen af ​​injektionen. Denne gang er at tillade opbevaring af de cirkulerende mikrobobler. Tryk på 'scan / fryse "for at standse billeddannelse i løbet af denne tid.
    4. På 3 min og 40 sek, at genoptage billeddannelse bekræfte, at fosteret er stadig synlige, er tilstrækkeligt dækket med PBS, og at mikrobobler fortsat cirkulere. Tryk på 'scan / fryse "for at indlede billeddannelse.
    5. Anskaf afbrydelsen / opfyldning sekvens på 3 min og 50 sek efter injektion ved at optage en "pre-destruktiontion 'akustisk sekvens respons ved 29 Hz. Tryk på 'scan / fryse' for at starte købet dataene. Ved 4 minutter efter injektion 18,19, indleder en 0,1 sek højfrekvente akustiske burst. Tryk på knappen "burst" at gennemføre en burst.
    6. Fortsæt med at optage rammer for den resterende del af sekvensen (indtil bufferen linje er fuld) og gem cine loop ved at trykke "cine butikken '.
    7. Saml en yderligere cine løkke af cirkulerende mikrobobler. Denne efterfølgende "post-ødelæggelse 'imaging sekvens antages at indeholde kun cirkulerer boble signaler, der genopfyldes strålen. Tryk på 'scan / fryse "for at indlede billedbehandling og» cine butik' til at indsamle billederne.
    8. Mærk Cine sløjfer efter billeddannelse hver foster. Tryk på 'undersøgelse management «, markere filen med rullen bolden og" vælge "-knappen, skal du trykke på' image label" og navn korrekt.

    8. Håndtering af embryoner efter injektion

    1. Indlæg billedbehandling, flytte transduceren, frigøre fosteret og aflive (via halshugning, cervikal dislokation, kuldioxid kvælning eller anæstesi efterfulgt af hurtig frysning eller fiksering) som ønsket.
    2. For hvert efterfølgende embryo injektion en frisk dissektion fad, nål, sprøjte og slange segment skal anvendes, med forberedelsen af ​​den næste batch af mikrobobler injektion løsning finder sted under dissektion og genoplivning.
    3. Gem vævsprøver (f.eks hale, hjerne) til yderligere analyser (f.eks genotypebestemmelse bestemt ved PCR-analyse af isoleret hale-DNA, lacZ-farvning eller semi-kvantitative mål for biomarkør ekspression anvendelse af Western blots 21).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Injektionen af ultralyd-kontrastmidler til ex utero musefostre er afhængig af den vellykkede isolering af levende, sen-gestational embryoer fra livmoderen og vedligeholdelse af levedygtighed i løbet af injektionen og relaterede ultralydsscanning. Når fosteret er blotlagt og placeret som vist i figur 1, omhyggelig injektion af kontrastmiddel i det embryoniske vaskulatur er mulig. En typisk B-mode ultralyd billede af en E17.5 museembryo er vist i figur 2A. Vask-i af mikrobobler og tilsvarende forbedring i inferior vena cava, hjertet, hjernen og i hele dyret kan opfanges ved hjælp af ikke-lineære kontrast billeddannende metoder, hvilket viser gennemførligheden af ​​denne teknik. Individuelle tidspunkter er afbildet i figur 2B og viser ændringen i modsætning over tid.

Ved at registrere hele vask i og udvaskning of mikroboblen bolus, er det muligt at måle forskellige perfusion parametre. I en offline analyse blev kontrasten region trace værktøj, der anvendes til at skabe 1,5 mm 2 regioner af interesse (ROI) i embryonale venstre og højre hjernehalvdel. Den gennemsnitlige signalintensitet inden for disse ROI'er blev derefter afbildet som en funktion af tid og udglattes ved hjælp af en syv point median filter. Fra den resulterende kontrast intensitet kurve (vist i figur 2C), blev hjernen forstærkningsfaktor bestemt. Vask-i, defineret som hældningen mellem 10% og 50% af det maksimale forstærkning (PE), blev også beregnet. Endelig blev tid til top (TTP) beregnes fra begyndelsen af ​​forbedringen signal til spidsbelastning. Forskelle i gennemsnitlige perfusion parametre på tværs af forskellige boble typer blev testet ved hjælp af separate t-test 12. Disse resultater, som er opsummeret i tabel 1, viser, at injektion af mikrobobler tilvejebringer et værdifuldtstand metode til at bestemme vigtige perfusion parametre i den udviklingsmæssige mus.

Indførelse af mikrobobler i den embryoniske vaskulatur muliggør også anvendelsen af ​​musefostre som modelsystemer til at definere og karakterisere de kvantitative kapacitet molekylær ultralydsscanning. I det følgende eksempel, et tab af funktion model, hvor genmanipulation genereret heterozygote og homozygote ekspressionsmønstre for endoglin i embryoniske mus, blev anvendt til at teste evnen af ​​molekylært ultralydsscanning at skelne mellem genotyper. Efter mikroboble indsprøjtning og implementering af destruktion / opfyldning billeddannelse, blev forholdet mellem den gennemsnitlige signal intensitet »præ-ødelæggelse« til »post-destruktion« sekvenser anvendes til fremstilling af et mål for den molekylære signal kaldet kontrasten betyde power ratio (CMPR ). En lineær mixed model (med Bonferroni justeringer for flere sammenligninger) blev udført for at fastslå w hether der var nogen signifikant forskel mellem endoglin målrettet, kontrol og upræcise mikroboble binding til Eng + / + eller Eng +/- embryoner (identificeret efter injektion via polymerasekædereaktion (PCR) af hale prøver). De estimerede CMPR midler (gennemsnit ± 95% konfidensinterval (CI)) præsenteres for hver mikroboble og embryo typen i figur 3 og er opsummeret i tabel 2.

Disse resultater giver et konkret eksempel, at injektion af ultralyd-kontrastmidler i isolerede levende embryoner kan opnås. Desuden er denne protokol letter vurdering af perfusion parametre og kan anvendes til at sammenligne målrettet mikroboble bindende i embryo modeller af vaskulær sygdom i et forsøg på at belyse kapacitet molekylær ultralydsscanning.

.jpg "/>
Figur 1. Eksperimentel set-up til injektion af mikrobobler i isolerede embryoner. En 21 MHz lineær transducer er anbragt over en eksterioriseret levende E16.5 embryo som en 20 pi mikroboble opløsning indsprøjtes i en placental vene ved hjælp af et glas kanyle. Scale bar = 10 mm. Fra Denbeigh, JM et al. 12 med tilladelse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Ultrasound Imaging af blotlagt Living E17.5 embryoer. (A) B-mode ultralyd billede af et foster. Før injektion af målrettede mikrobobler (t = 0 sec). (B) Ikke-lineære kontrast billede af embryoet før og efter injektion af mikrobobler. Nonlinear kontrast billede prieller mikroboble injektion (t = 0 sec). Kun de stærkt reflekterende grænseflader (f.eks knogler) er synlige, med minimal signal fra det bløde væv. Nedenfor lineær kontrast billede af mikrobobler i embryoet ved t = 50 sek, t = 120 sek og t = 420 sek efter en bolusinjektion. Contrast detekteres hele dyret, herunder hjerte og hjerne. (C) Perfusion parametre udledt fra tid intensitetskurver. Intensitet plot af mikrobobler som en funktion af tid i en enkelt ROI i embryonale hjerne. Perfusion parametre identificeres på grafen, herunder peak ekstraudstyr (PE), vask i sats (hældning), og tid til peak (TTP). Pilespidser: R = ribben, Ht = hjerte, Br = hjernen. au, arbitrære enheder; ROI, region af interesse; sek sekunder. Scale bar = 3 mm. Dette tal er blevet ændret fra Denbeigh, JM et al. 12. Klik her for at se et størreversion af denne figur.

Figur 3
Figur 3. Resumé af gennemsnitlig kontrast betyder magt forhold (CMPR) for endoglin målrettet (MB E), kontrol (MB C) og ikke-målrettede mikrobobler (MB U) i Eng + / + og Eng +/- embryoner. CMPRs fra endoglin målrettet mikrobobler var signifikant højere (*** p <0,001) end dem, der indsamles for MB C og MB U (ikke signifikant forskellige fra hinanden, uanset genotype). MB E binding viste sig at være betydeligt højere i Eng + / + embryoner (mørke markører) sammenlignet medEng +/- embryoner (lyse markører). Resultater præsenteres som gennemsnit ± 95% konfidensinterval. n angiver antallet af unikke embryoer i hver kategori. Fra Denbeigh, JM et al. 22 med tilladelse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Mikroboble Type T-test
p-værdi
Perfusion Parameter MB U MB C MB V MB U vs MB C MB U vs MB V MB <sub> C vs MB V
Peak Enhancement, PE (AU) 0,427 ± 0,063 0,490 ± 0,079 0,499 ± 0,064 0,19 0,06 0,81
Wash-in sats (AU / sek) 0,008 ± 0,002 0,009 ± 0,002 0,011 ± 0,002 0,18 0.01 0,09
Tid til Peak, TTP (sek) 53,75 ± 7,96 51,75 ± 4,46 45.00 ± 5.33 0,55 0.03 0.03
# embryoner injiceret 4 4 3

Tabel 1. Oversigt over E17.5 embryoniske perfusion parametre. Middelværdi ± standardafvigelser afledt fra tid intensitet plots for alle embryo ROI'er (a.U. = Arbitrære enheder). Tabellen omfatter målinger for irrelevante (MB U), IgG 2 kontrol målrettet (MB C) og VEGFR2 målrettet (MB V) mikrobobler. Separate t-tests blev udført for at sammenligne grupper. Denne tabel er blevet ændret fra Denbeigh, JM et al. 12.

Mikroboble typen Genotype CMPR Mean 95% konfidensinterval
MB E Eng + / + 9,71 9,05, 10,38
Eng +/- 5,51 4,87, 6,15
MB C Eng + / + 1,42 0,41, 2,43
Eng +/- 1,46 0,45, 2,47
MB U Eng + / + 1.7 0,65, 2,75
Eng +/- 1.76 0,67, 2,84
Linear Mixed Model: Mellem-underlagt Effects
df F p-værdi
Genotype 1 12,75 <0,001
Mikroboble typen 2 147,65 <0,001
Genotype * Mikroboble typen 2 18.29 <0,001

Tabel 2. Oversigt over lineær mixed model analyse formikroboble bindende i embryoner, med en Bonferroni korrektion for multiple sammenligninger. genotype, mikroboble type og den kombinerede interaktion (genotype * mikrobobler type) viste sig at være væsentlige faktorer ved bestemmelse CMPR. DF = frihedsgrader. Fra Denbeigh, JM et al. 22 med tilladelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ultralydskontrastmidler blev injiceret i sene drægtighed museembryoer og ikke-lineære kontrast billeder blev erhvervet for at måle perfusion parametre og målrettet mikrobobler bindende. Vellykket billeddannelse af mikrobobler i embryonisk vaskulatur var afhængig af en række faktorer, hvor den første er levedygtighed embryo. Alt udstyr og apparater blev fremstillet på forhånd for at minimere den tid, der kræves til isolering af embryoner fra uterus til starten af ​​injektionen. Da virkningerne af en enkelt eller gentagen eksponering for anæstesi på embryonale mus ikke er blevet undersøgt i detaljer, blev brugen af anæstesi hos moderen undgås før ofre 16. Under embryo isolation, var det vigtigt at forhindre skade på blommesækken og sikre embryoner blev holdt afkølet på alle tidspunkter, i hyppigt opdateres embryo medier. Når exteriorizing embryonet inden injektion og under pinning, blev store vitelline fartøjer undgås for at begrænse likelihood af blødning, som kan være dødelige. Vi fandt, at når genoplive embryonet, var det bedst først dække placenta og derefter embryonet med PBS før påføring af ultralyd gel til embryo i en bevægelse frem og tilbage og fjerne eventuelle store bobler med en pincet. Resten af ​​petriskålen blev derefter fyldt med PBS. Brugen af ​​gel og PBS begrænsede muligheden for luftlommer mellem foster og transduceren, hvilket kan påvirke billedkvaliteten. Som embryonet genoplivet, begyndte blodet at flyde, synligt pumpning i navlestrengen arterie mens umbilical årer optrådte lyse rødt 23. For reference, grenene følger navlestrengen vene normalt overlay dem fra navlestrengen arterie på placenta overflade. Selv om det var muligt at tilføre de placentale labyrint arterioler, indsprøjtning af mikrobobler i strømningsretningen reduceret placenta blødning og venulen injektioner også tilladt mikroboblerne at passere direkte gennem embryoet før cirkulerende thru placenta.

På grund af deres skrøbelighed, mikroboble forberedelse og håndtering kræves også pleje. Ultralyd mikrobobler kan blive ødelagt under højt tryk miljøer. Derfor blev nøjagtig den samme procedure gentages under hver rekonstitution og boble blev målt for at sikre eksperimentel sammenhæng. En enkelt hætteglas med mikrobobler var typisk nok for omkring 5-7 embryoner. Da mikroboblerne er stabile inden for hætteglasset i op til 3 timer, blev flere hætteglas ofte kræves for et enkelt eksperiment. For at undgå at rive det væv, det var bedst for glas spidsen af ​​kanylen for at være skarpe og skære på en lille vinkel, mens nærmer sig skibet på så lille en vinkel som mulig. Når trimmet, spidsen af ​​nålen skulle være stor nok til boblerne til at flyde let gennem udgangen uden sammenklumpning, men små nok til at passe nemt inden i beholderen. Den ideelle størrelse var generelt <100 um. Nogle praksis dømme den passendestørrelse var nødvendig. I tilfælde af, at spidsen blev skåret for stor, eller blev blokeret, blev et nyt glas nål anvendt. Det nogle tilfælde var det muligt at trimme nålen lidt over blokeringen. Det var afgørende, at luften ikke få lov til at komme ind i embryo vaskulære system under injektion, da dette kan resultere i dyrets død og var uønsket under billedbehandling (luftbobler kunne indgive i vaskulaturen af ​​embryonet og kunne spores i ultralydsbilledet kunstigt at øge enhver målte signal). Nonlinear kontrast imaging udført i denne protokol, der bruges en state of the art højfrekvente (21 MHz) mikro-ultralyd-system (Vevo2100) parret med lineære arrays specielt designet til små dyr imaging (MS250). Mikro- eller høj frekvens -ultrasound er en af de få modaliteter stand, på dette tidspunkt, for at give billeder i høj opløsning af levende murine embryoner og nyfødte 16. Dette system kan opnå aksiale og laterale beslutninger af 75 um og 165 μm henholdsvis på dybder så stor som 15 mm. Det var derfor muligt at afbilde hele embryo ved meget højere opløsninger end typisk opnået ved anvendelse af kliniske instrumenter og det akustiske signal fra mikrobobler kunne skelnes fra væv ved hjælp af ikke-lineære kontrast imaging metoder (herunder puls inversion og amplitude modulation 24). Selvom vi havde den bedste succes med ultralyd indstillingerne er beskrevet her, er det muligt, at en vis tilpasning til disse parametre også vil give tilfredsstillende resultater. I alle tilfælde kræves der en lav effekt for mikroboble billeddannelse for at undgå uønsket ødelæggelse af mikroboblerne før initiering af en burst, mens den korte burst fjerner kun en lille brøkdel af mikrobobler befolkning. Med praksis hele proceduren for en enkelt embryo, fra positionering til afslutningen af ​​molekylær ultralydsscanning, tog ca. 15 min. Vi har med succes injiceret så mange som 12 embryoner fra et kuld påen enkelt session.

Injektion eksperimenter blev begrænset til en 4 timers vindue grund af den begrænsede levedygtighed embryoner. Da fordelingen af mikrobobler var afhængig af cirkulation af selve embryo, kunne injektioner ikke finde sted, før hjerteslag (E8.5) og påviselig flow i vitelline og umbilical cirkulation (E9.5) blev oprettet 25. Med modning af moderkagen ikke afsluttet, før E14.5 blev injektion af kontrastmidler gennem placenta labyrint begrænset til embryoner af midten til slutningen af ​​gestationsalder. Baseret på observationer, embryoner tættere på sigt var mere hårdføre og kan tåle stigninger i deres vaskulære volumen bedre end deres yngre kolleger. Kombineret, disse faktorer begrænsede kontrastforbedret ultralydsscanning af embryonale kar til senere faser af udvikling og angiogen vækst. Dette kan påvirke tilgængeligheden af ​​transgene musemodeller, da manipulation af receptorer involveret i Vascular udvikling og vedligeholdelse (f.eks VEGFR2, VCAM-1) kan føre til embryonale dødelighed eller defekter i udviklingen og reguleringen af embryonale kredsløbssystemet 26,27. Alligevel en række relevante modelsystemer er tilgængelige for vaskulære biomarkører af interesse, herunder α 2 β 1 28 α V β 3 29, blodpladeafledt endotelcelle-adhæsionsmolekyle-1 30, og vaskulært celleadhæsionsmolekyle-1 31, intercellulært adhæsionsmolekyle -1 32 og -2 33 og P-selectin 34. Hvad mere er, hjerne histogenese begynder efter midten af drægtighedsperioden 11, hvilket gør udtryk for angiogene markører i dette væv sandsynligt og dermed giver et glimrende alternativ til den traditionelle tumor model for undersøgelser, der vurderer de kvantitative aspekter af molekylær billeddannelse.

Den ex vivo karakter injektionerne ikke præsentere nogle limitations. Det er vigtigt at bemærke, at efter at embryonerne blev fjernet fra moderen og placenta labyrint punkteret, var det generelt ikke muligt (eller ønskeligt) at gøre gentagne injektioner. Desuden isolerer embryo fra moderens cirkulation begrænser udbuddet af næringsstoffer og O 2, og forventes embryonale helbred forværres med tiden. Mens nedkøling og genoplivning forlænger levedygtighed embryoner, kan det også påvirke hjertefunktionen. For eksempel har vi observeret, at isolerede embryoner havde en reduceret hjertefrekvens (data ikke inkluderet, se Denbeigh et al. 12) sammenlignet med dem, der tidligere er observeret in vivo 35. Det er derfor sandsynligt, at undersøgelser, der vurderer kardiovaskulær fysiologi ikke præcist afspejler in vivo betingelser. Med få undersøgelser, der karakteriserer kredsløbssygdomme hæmodynamik i levende sent tidspunkt museembryo, er det imidlertid svært at sige med sikkerhed, i hvilket omfang disse eksperimentelle betingelser kan ALTER fysiologisk funktion. Et alternativ er at foretage injektioner i livmoderen, enten gennem en laparoskopisk indsnit 36 eller gennem bugen af gravide mor direkte 37, selv om denne fremgangsmåde kan præsentere sit eget sæt af udfordringer 11. I nogle tilfælde kan isolering og eksteriorisering af embryonet også resultere i signifikant blødning fra blommesækken. Selvom vi fundet, at vi kunne hæmme blodgennemstrømningen med ultralyd gel, kan enhver signifikant tab af blod påvirke levering og koncentrationen af ​​mikrobobler, og disse dyr blev udelukket fra analysen. Endelig mens isolation gør grænse mødres og embryonale kilder til bevægelse, periodisk bevægelse relateret til hjerte-aktivitet er uundgåelig. Vi har valgt at afbilde statiske hjerne for at direkte undersøge effekten af receptor ekspression på målrettet mikroboble signal dog gennemførelse af real-time bevægelseskompenserede kontrast-forstærket ultralydsscanning 38 kanudvide disse undersøgelser til andre organer.

Der er få billedbehandlingsprogrammer, der aktuelt kan vurdere den vaskulære landskab af levende udvikler mus embryo. Nogle undersøgelser har med succes udført direkte billedvisning af blodgennemstrømningen i ex vivo murine embryoner med Doppler fejet source optisk kohærens tomografi 39,40, mens magnetisk resonans, vaskulær korrosion kaster har MikroCT tomografi og optisk projektion tomografi blevet gennemført obduktion 16. Dette er uheldigt, da denne periode med embryonale vækst kan afsløre vigtige oplysninger om tidlig vaskulær udvikling og funktion. Mikroboble billeddannelse i levende fostre kan derfor bidrage til vores forståelse af udviklingsmæssige fysiologi. Det kan også anvendes til at visualisere biomarkør fordeling i hele kroppen af ​​den levende mus foster i real-tid, selv om denne teknik er usandsynligt at erstatte eksisterende metoder (herunder histologiog fluorescerende imaging) til måling af molekylære signal i fostervæv. Den rivende udvikling masse af fartøjer i embryonerne dog ligner tumorvækst, med udtryk for mange af de samme centrale receptorer identificeret i tumorangiogenese 41,42 og kan derfor tjene som en glimrende tumor surrogat for studier af kvantitative evner molekylær ultralyd. Vi forventer derfor, at de beskrevne metoder vil være nyttigt, ikke kun for at vurdere og karakterisere embryonale modeller for vaskulær sundhed og sygdom gennem funktionel billeddannelse, men tilbyder en vej til at udforske de styrker og begrænsninger af molekylær billeddannelse samt. Anvendelsen kan også udvides til andre interessante områder af undersøgelsen, herunder i livmoderen genoverførsel terapi, hvor mikrobobler er blevet testet som et middel til at levere nøgent DNA til føtalt mus væv 10. Alternativt 3D vaskulær kortlægning af levende embryo er også muligt,som kan give uvurderlige oplysninger om de morfologiske abnormiteter i genmodificerede mus. Indførelse af ultralydskontrastmidler i isolerede levende fostre kunne derfor være et andet værktøj til at øge vores forståelse af vaskulær sygdom og oversætte kontrast-forstærkede ultralyd applikationer til klinikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
  • rat isotype IgG2 control
eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose
Sigma D5796
  • 50 ml Fetal Bovine Serum
ATCC 30-2020 lot # 7592456
  • Hepes
Gibco 15630 5 ml, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco 15140-122 5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 ml BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 ml Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 ml VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110 °C VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48, (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47, (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37, (S1), 65 (2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260, (2), 581 (2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images - Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242, (1), 162 (2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26, (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. IEEE. New York, NY. (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110, (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5, (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48, (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40, (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, ten, P,, Hawinkels, L. J. A. C. Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17, (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10, (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121, (121), Humana Press. Totowa, NJ. 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47, (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51, (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258, (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26, (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18, (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. Angiogenesis. Press. (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36, (12), 2097 (2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20, (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre,, Y,, et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17, (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13, (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Live imaging of mouse embryos. 4, (4), Cold Spring Harbor. 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103, (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3, (8), (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics