の種特異的検出のためのLAMP法(LAMP)アッセイ

Immunology and Infection
 

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Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens. J. Vis. Exp. (96), e52552, doi:10.3791/52552 (2015).

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Abstract

Introduction

グローバル鶏の生産は、発展途上国は、先進国で目撃4倍近く拡大ホスティングで最後の50年間で10倍に増加している(www.faostat.orgを) 。世界の食料安全保障への鶏肉生産の関連性もそう成長したようにニワトリで重大な病気を引き起こす可能性が病原体のプロフィールを有する。一典型的な例アイメリア種 、腸疾患のコクシジウム症1を引き起こす可能性がありますユビキタス寄生原虫である。どこ鶏は、一つ以上のアイメリア種が共通2-4である可能性が高いで飼育されている。開発された世界ではアイメリアは、主に抵抗5の影響を最小限に抑えるために、シャトルや回転プログラムを採用し、予防的化学療法によって制御されます。生ワクチンはまた、鳥の値がコストを正当化するのに十分なシステムで使用される( 例えば、株式、層、およびいくつかのブロイラー5繁殖 )。 RESUとしてサブ臨床感染は5一般的ですが、これらの措置のLT臨床コクシジウム症は、多くの場合、十分に制御される。発展途上国のワクチン接種ではまれであり、薬物のアプリケーションが頻繁にあまり知らさ。その結果、サブ臨床および臨床のコクシジウム症は、より一般的であり、重大な経済的影響3を発揮する。

最も広く使用されているスコアリングシステムのさえ著者はいくつかの種のために「それはそのような手順は、任意のが、適度に重篤な感染で試みすべきかどうかは疑わしいようだ」とコメントしたがeimerian感染の診断は、伝統的に、死後に得点病変に依存してきた6。形態をオーバーラップすると、すべてが、専門家6,7を混乱することができますが、補足的証拠は、糞便やごみのサンプルで耐環境性オーシストのライフサイクルステージの顕微鏡検出を通じて収集することができます。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ランダムamplificatioを用いた分子の代替多型DNA PCR(RAPD-PCR)および定量PCR技術のnは最大20年8月10日のために利用されているが、現在までに、彼らは一般的になってすることができなかった。相対費用と専門実験装置や処理のための要件は、古いpathology-と顕微鏡ベースの、多くの場合、主観的かつ技術的に要求の厳しい自然が10,11近づくにもかかわらず、それらの取り込みを制限している。このような制限は、貧困にコクシジウム症の影響は12比例して大きくすることができるような東南アジアなど世界の貧困地域の多くでは誇張することができます。これに応答して、 アイメリア種特異的診断アッセイ新しい簡単で敏感が、コスト効果の明確な要求がある。

LAMP法(LAMP)は、大量のDNAを増幅することができるDNAポリメラーゼドリブン技術を準備することは容易である。最も重要なのは、LAMP BST DNA polymeraを使用していますそれに代えて、熱サイクル13,14を必要とすることなく、単一の一定温度でDNA増幅を促 ​​進する一般的PCRで使用したTaq DNAポリメラーゼ。 LAMPは、最も初歩的な実験室でするか、フィールドにアプリケーションに適用可能であり得る。多くのPCR阻害物質、高い感度と特異性に対する抵抗性に特徴、LAMPアッセイは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、 ウェルシュ菌及びクリプトスポリジウム 15-17を含む病原体の広い範囲のために開発されている。応答では、鶏に感染する7 アイメリア種のそれぞれに固有のLAMPアッセイのパネルが18を開発された新たな費用対効果のアイメリア種固有の診断のために要求する。新しいアッセイのためのアプリケーションは、そのような貧しい経済のPEとのEimeriaマキシマアイメリア·ネカトリックスとして種の関連付けを与えられた特定の値の監視寄生虫の発生を含み、rformance 3,4。他のアプリケーションは、ファームの抗コクシジウム戦略、サブ臨床感染または臨床疾患の診断とファームにアイメリアによるリスクの評価の有効性を評価する含まれています。

Protocol

1.テンプレートの調製

注:ニワトリに感染7 アイメリア種のうちの1つに由来するDNAを含有することが疑われる任意のゲノムDNA鋳型は、LAMPベースのアイメリア種同定のための鋳型として使用することができる。ここで説明したように、フィールド診断解析のための腸組織サンプルは、ルーチン、死後の間に収集されるべきである。

  1. 試験対象の腸のセクション(またはセクション)を選択します。サンプルサイトの選択へのガイド、サンプリング部位の分布と場所の種特異的な範囲のための18に存在し、 図1である可能性が最も高いアイメリア種については、表1を参照してください。
    NOTE: アイメリアは、特にホストサイト特異的であるので、これは極めて重要である。鶏に感染するそれぞれの種は、それが19を対象と腸の地域によって定義されます。決定は、1つまたはカ月の前の農場の経験、関心によって影響され得る特定のアイメリア種または他の診断指標6再。
  2. 物品5cm以上のEimeria滅菌ハサミ又は外科用メスを使用してテストするために選択された腸の部分(単数または複数)のより長い長さ。必要に応じて、そのようなRNAlaterで18または95%エタノール中で例えばとして固定液中でその後の分析のためのサンプルを格納。
    注:サンプルは使用前に無菌トリス - エチレンジアミン四酢酸(TE)バッファーで十分に洗浄する必要があり、エタノールに保存します。
  3. 縦方向に開いた試料を切断、ほとんどの腸の内容(存在する場合)を削除し、滅菌ガラス顕微鏡スライドまたはエタノール/火炎滅菌した鋏ブレードのエッジのいずれかを使用して、粘膜層を無料から細胞をこすり取る。必要に応じてプールしたサンプルのための単一のチューブ内で種特異的腸内のすべてのサイト4からの細胞を含む。
  4. 1を含む100μlの滅菌TE緩衝液を含む無菌の1.5ミリリットルのスクリュートップマイクロ遠心チューブに掻き材料を入れる0%(w / v)のキレックス100樹脂。
  5. 1分間激しく、各サンプルを振る。スクリュートップがしっかりと閉じていることを確認した後、10分間沸騰水浴中でインキュベートする。
  6. 煮沸後、各サンプルは、1~2分間、周囲温度で冷却する。
  7. 1分間遠心操作し、最高速度( 例えば、〜を10,000×g)でのマイクロ遠心を使用して、各サンプル。
  8. 各LAMPアッセイにおけるテンプレートが着手されるように得られた上清2μlのを収集します。必要に応じて、マルチサイト試験を提供するために、単一のチューブで複数の腸の部位をプールする。

2. アイメリア LAMPプライマーの準備(プリ検定)

  1. 100アッセイ用の適切なアイメリア LAMPプライマーの株式を準備します。
    1. (製造業者で指定された)、100μMの濃度に分子グレードの水を添加することにより、各凍結乾燥アイメリア LAMPプライマーを再構成する。指定しない場合、分子グレードの水必要な使うの体積を計算グラム各プライマーの物理的および分子量。
    2. アイメリア種ごとに個別の0.5ミリリットルフリップトップのマイクロ遠心チューブにピペットで60μlの分子グレードの水をアッセイする。
    3. 追加のプライマーFIP、BIP、F3、B3、7種特異的プライマーミックスのシリーズを作成し、表2に示したボリュームを用いて水に目標アイメリア種に特異的なLF及びLB、。
    4. 簡単に言えば渦はその後、プライマー溶液を混ぜてマイクロフュージをパルスし、必要になるまで凍結。
  2. アッセイすべき各アイメリア種のためのLAMP反応マスターミックスを準備します。サンプル数で、表3に示すボリュームを乗算し、陽性対照、陰性対照及びピペットスペア3つの追加。 0.5または1.5ミリリットル中にピペットフリップトップマイクロ遠心チューブ。

3. アイメリア LAMPアッセイ

  1. ピペット23μlのアイメリア種特異的のBst DNAポリメラーゼ/ LAMPマスターミックス0に。5ミリリットルマイクロ遠心チューブ。
  2. 25μlの最終反応容量を作る、(セクション1で調製した)2μlのDNAテンプレートを追加します。
  3. 一つの反応(陽性対照)に2μlのアイメリア種特異的ゲノムDNAを追加します。反応(ネガティブコントロール)に2μlの分子グレードの水を追加します。
    NOTE:種特異的ゲノムDNAが使用できない場合、以前の正のLAMPまたは標準的なPCR産物を代わりに使用してもよい。
  4. 30分間62°Cのの水浴またはヒートブロックでインキュベートする。反応はすぐに読み取られるつもりはない場合は、必要に応じて、10分間、80°Cのに加熱することにより、Bst DNAポリメラーゼを非活性化する。

4. LAMPアッセイ読み取りアウト

  1. インキュベーションの終わりには、室内光下での目による各反応の色を評価する。陰性の結果は、陽性の結果が空20青く見える色で紫色ピンク色に見える。
  2. 任意に、laboratにおけるLAMPアッセイ結果を確認1×トリス/ホウ酸塩/ EDTA(TBE)緩衝液中の2%アガロースゲルを用いたアガロースゲル電気泳動のための1μlのDNAのゲルローディング緩衝液と5μlのLAMP反応生成物を混合することによりモリ(51μl当たり核酸染色を用いて事前に染色アガロース50ml)で。フラグメントサイズの計算を可能にするために、ゲルの1レーンが1KB分子サイズのDNAラダーの5μlを添加する。

Representative Results

アッセイの検証

検証中に各アイメリア種特異的LAMPアッセイは、ホスト制御ニワトリ、ならびにニワトリのゲノムDNAを感染させる7つ全てのアイメリア種を表す純粋なDNAサンプルのパネルを用いて試験した。アガロースゲル電気泳動は、各アッセイを解決するために使用しないホスト交差反応性18絶対種特異性を実証した。次に、10倍連続希釈系列は、精製されたニワトリ盲腸コクシジウムゲノムDNAを使用して調製18 1〜10ゲノムコピーのアッセイの感度限界を明らかにした。上限は最高濃度(100,000ゲノムコピー)18を含む正まで達成された結果として決定しなかった。

フィールドサンプルを使用したアプリケーション

アイメリア試験ために収集されたサンプルは、pの結果として淘汰死んでいるのが見つかったニワトリに由来する可能性が高いOOR健康または1〜3の可能性が高いサンプルサイズを示す、センチネル健康監視のために淘汰時ルーチンの一部。サーベイランスプログラムの一環として、米国のブロイラー農場から収集三鳥のテストは、腸のサンプルを3組が得られた。各アイメリア種表1)のための好ましい腸の部位に優先順位を、種特異的LAMPアッセイのアプリケーションをターゲットと、指示薬として青色hydroxynaphthol( 図2A)を使用して試験したすべての鳥eimerian感染の視覚的識別を可能にした。 hydroxynaphtholブルーを使用した場合、負のLAMP反応を達成色がピンクに紫の範囲であるが、常に正の結果によって達成青と区別されることができる。アガロースゲル電気泳動による確認は、比較結果( 図2B)を得た。電界印加時にはユーザーが全7種に対してフルスクリーンを適用することを選択、またはとしての優先順位のみ種を標的にすることができる重要またはファームまたは周辺地域に循環していることが知られ。

アイメリアの発生のための診断法として確立するためのPCRベースのアプローチの失敗は、新しいテストを簡単にするための要件を強調している。 LAMPは、PCRよりも簡単準備と処理を提供していますが、鳥ごとに複数の腸のサイトをテストするための要件は、落胆のまま。 1つ以上のLAMPアッセイを用いて試験することができる鳥ごとに単一のプールされたDNA試料の製造は、より魅力的である可能性が高い。すべての7つのLAMPアッセイでテストするために、表1に記載した前のDNA調製物をプール特定の腸の部位のそれぞれから収集材料を表す鳥ごとに1つのプールされたサンプルを処理して各腸部位が別々に処理された( 図2と同じ結果を提供図3)と比較した。

図1 鶏に感染するアイメリア種の寄生虫のLAMP検出のための図1.腸サンプリングサイトは。アイメリア種の標的と腸の領域は、E。(点線黒線の間の数で示されたサンプリングの好ましい部位で、色付きの線で強調表示されているアセルブリナ :黄色/ 1、 イー·ブルネッティ :ピンク/ 2、E。マキシマ :ブルー/ 3、 イー·ミティス :赤/ 5、E.早発 :オレンジ/ 4、 大腸菌necatrixグリーン/ 6およびE.テネラ :グレー/ 7)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
あちこちeimerian感染の図2. LAMP診断mは3種の市販のブロイラー鶏。LAMP反応は(A)hydroxynaphtholブルーを使用して解決、水色反応が陽性であったピンクの反応に紫色が負であり、(B)アガロースゲル電気泳動。各寄生種は、表1に示すように、サンプリングされた腸の部位であった。 = E.アセルブリナ 、B = E。ブルネッティ 、馬= E.マキシマ 、ミ= E.ミチス 、N = E. necatrix、P = E.早発とT = E.テネラ 。レーン1は、GeneRuler 1KbのDNAラダーを含んでいた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
3つの別々のコマーシャルブロイラーからプールされたサンプルを使用してeimerian感染の図3. LAMP診断。LAMPのREACンはピンクの反応にhydroxynaphtholスカイブルーの反応が陽性であった青、紫を使用して解決陰性であった。 = E.アセルブリナ 、B = E。ブルネッティ 、馬= E.マキシマ 、ミ= E.ミチス 、N = E. necatrix、P = E.早発とT = E.テネラこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

サンプルサイト アイメリア種アッセイ(最も可能性が高い)
十二指腸(D) E.アセルブリナ、E。早発
空腸/回腸*(J / I) E.マキシマ、E。necatrix
盲腸(C) 大腸菌necatrix、E。テネラ
回腸末端(TI) E.ブルネッティ、E。ミチス プールされた試料(P) E.アセルブリナ、E。ブルネッティ、E。マキシマ、E。ミチス、大腸菌necatrix、E。早発、E.テネラ

候補アイメリア種アッセイの表1.腸地域固有の選択。図1に示すように、サンプリングされる領域の選択は、各アイメリア種によって異なります。プールされたサンプルは、その後DNA調製のために組み合わされたすべての4つの特定のサイトから収集した材料を含む。

プライマー* ストック濃度(μM) 容量(μL)
- 60
フォワードインナープライマー(FIP) 100 40
後方インナーぷりメール(BIP) 100 40
フォワードアウタープライマー(F3) 100 10
後方外側プライマー(B3) 100 10
ループフォワード(LF) 100 20
後方ループ(LB) 100 20
合計 200

LAMPプライマープレミックスの表2.準備。LAMP用プライマーミックスを準備するために必要なコンポーネントとの比率。示さボリュームは100 LAMP反応のためである。材料とBarkway (2011)18に示すように*プライマーアイデンティティ。

株式の濃n 最終的な反応を濃n 反応あたり容量(μL)
DDW - - 10.1
ThermoPolバッファ 10× 2.5
MgSO 4 100 mMの 2 mMの 0.5
プライマーミックス* 表2 2.5
のdNTP 25 mMの 400μmの 0.4
ベタイン 5 M 1 M 5
Hydroxynaphtholブルー 3 mMの 120μM 1
Bst DNAポリメラーゼ 8000 U / mlの 8 U 1
合計 23

LAMの表3.準備P反応マスターミックス。* アイメリア種特異的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNAlater Ambion AM7024
Ethanol VWR Chemicals 20821.321 Caution, highly flammable
100 x Tris-EDTA (TE) buffer concentrate Sigma-Aldrich T9285
Chelex 100 resin Bio-Rad 142-1253
Molecular grade water Invitrogen 10977035
E. acervulina F3 Sigma-Aldrich VC00021 *CCTAACATTTCGCTTCACGGAC
E. acervulina B3 Sigma-Aldrich VC00021 *ATGAGCAAGTGGAACACCTTG
E. acervulina FIP Sigma-Aldrich VC00021 *AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT
E. acervulina BIP Sigma-Aldrich VC00021 *GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG
E. acervulina LB Sigma-Aldrich VC00021 *TAAGGTTACACCCGTGGAGG
E. acervulina LF Sigma-Aldrich VC00021 *GCCATGCACAAAGCGACTT
E. brunetti F3 Sigma-Aldrich VC00021 *GGCCATCAAGTTCCATGAGC
E. brunetti B3 Sigma-Aldrich VC00021 *TCAACCTCCTGAGTGTGGTT
E. brunetti FIP Sigma-Aldrich VC00021 *GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGAGCGTCTT
E. brunetti BIP Sigma-Aldrich VC00021 *TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCGCCTC
E. brunetti LB Sigma-Aldrich VC00021 *GAAACGCTCGAACATGGC
E. brunetti LF Sigma-Aldrich VC00021 *CTTCTCCACAGACCCAGAGGT
E. maxima F3 Sigma-Aldrich VC00021 *ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT
E. maxima B3 Sigma-Aldrich VC00021 *CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG
E. maxima FIP Sigma-Aldrich VC00021 *GAGTCACTGCTGATGTACCAAA
AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG
E. maxima BIP Sigma-Aldrich VC00021 *AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA
E. maxima LB Sigma-Aldrich VC00021 *CAAGCCTACGCGGACATC
E. maxima LF Sigma-Aldrich VC00021 *TTATGCAGCTGGGTCAACG
E. mitis F3 Sigma-Aldrich VC00021 *ACGATAGCCAAGACACGTAAGG
E. mitis B3 Sigma-Aldrich VC00021 *CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA
E. mitis FIP Sigma-Aldrich VC00021 *CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT
AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT
E. mitis BIP Sigma-Aldrich VC00021 *GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA
GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG
E. mitis LB Sigma-Aldrich VC00021 *TCCATGCATCCCCTTGTT
E. mitis LF Sigma-Aldrich VC00021 *CGTGGGCACAGATTGATTC
E. necatrix F3 Sigma-Aldrich VC00021 *TGGCTTTCCCGCGTACC
E. necatrix B3 Sigma-Aldrich VC00021 *CGGCCCAACACAAAGACTG
E. necatrix FIP Sigma-Aldrich VC00021 *CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA
CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA
E. necatrix BIP Sigma-Aldrich VC00021 *CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC
E. necatrix LB Sigma-Aldrich VC00021 *GTCTGTAACTTGGGACGTTGT
E. necatrix LF Sigma-Aldrich VC00021 *GAACAGCCGGAGCCTCTC
E. praecox F3 Sigma-Aldrich VC00021 *GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT
E. praecox B3 Sigma-Aldrich VC00021 *GCGCACGAATCTGAATCACAC
E. praecox FIP Sigma-Aldrich VC00021 *ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT
A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG
E. praecox BIP Sigma-Aldrich VC00021 *GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT
E. praecox LB Sigma-Aldrich VC00021 *GAATAGCATTGCCAGGTGG
E. praecox LF Sigma-Aldrich VC00021 *GTCCACTGTCATTAATATTGC
TGC
E. tenella F3 Sigma-Aldrich VC00021 *GCTTGTGAAGGTCAGCGTG
E. tenella B3 Sigma-Aldrich VC00021 *GCTGAGTCCATACGTACTTCCT
E. tenella FIP Sigma-Aldrich VC00021 *GCCACTGCTATGGAAAGTCAC
AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT
E. tenella BIP Sigma-Aldrich VC00021 *GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA
GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT
E. tenella LB Sigma-Aldrich VC00021 *CGCATGTGCAGTTGAAGACA
E. tenella LF Sigma-Aldrich VC00021 *CCAAATGTATCTGCTAGTTATA
TTAACAAG
10 x ThermoPol reaction buffer New England Biolabs B9004S
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
dNTPs Promega U1330
Betaine solution (5 M) Sigma-Aldrich B0300
Bst polymerase New England Biolabs M0275S
Hydroxynaphthol blue Sigma-Aldrich 33936 Dissolved in molecular grade water.
UltraPure agarose Invitrogen 16500-500
10 x Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer Invitrogen AM9863
Blue/Orange DNA loading dye (x6) Promega G1881
GeneRuler 1Kb DNA ladder Thermo Scientific SM0313
SafeView nucleic acid stain NBS Biologicals NBS-SV

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References

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