שביט Assay כאמצעי עקיף של מתח מערכתי חמצוני

Biology
 

Summary

assay שביט מודד הפסקות DNA, הנגרמות על ידי גורמים שונים. אם כל הגורמים (מלבד סטרס חמצונים) גורמים נזק לדנ"א נשמרים קבועים, הסכום של נזק לדנ"א הוא פרמטר עקיף טוב של סטרס חמצונים. המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש assay שביט למדידה עקיפה של סטרס חמצונים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fang, L., Neutzner, A., Turtschi, S., Flammer, J., Mozaffarieh, M. Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (99), e52763, doi:10.3791/52763 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אורגניזמים אוקריוטים גבוהים לא יכול לחיות ללא חמצן; עדיין, באופן פרדוקסלי, חמצן יכול להזיק להם. מולקולת החמצן כימית אדישה יחסית כי יש לו שני אלקטרונים מזווגים ממוקמים באורביטלים אנטי-מליטה * pi שונים. יש שני אלקטרונים אלה ספינים מקבילים, כלומר הם לסובב באותו הכיוון על הצירים שלהם. זו הסיבה שמולקולת החמצן היא לא מאוד תגובתי. הפעלה של חמצן עלולה להתרחש על ידי שני מנגנונים שונים; בין אם באמצעות הפחתה באמצעות אלקטרון אחד בכל פעם (הפחתה חד ערכי), או באמצעות קליטת אנרגיה מספיקה כדי להפוך את הספין של אחד האלקטרונים מזווגים. התוצאה היא הייצור של מינים תגובתי חמצוני (ROS). יש מספר דרכים שבה גוף האדם מבטל ROS במצב הפיזיולוגי שלה. אם ייצור ROS עולה על קיבולת התיקון, תוצאות סטרס חמצונים ונזקי מולקולות שונות. ישנן שיטות רבות ושונות שבי סטרס חמצונים יכולים להיות ליasured. כתב יד זה מתמקד באחת מהשיטות בשם ג'ל אלקטרופורזה התא, המכונית גם "assay שביט" המאפשר מדידה של הפסקות DNA. אם כל הגורמים ידועים כגורמים לניזק לדנ"א, מלבד סטרס חמצונים נשמרים קבועים, הסכום של נזק לדנ"א שנמדד על ידי assay שביט הוא פרמטר טוב של סטרס חמצונים. העיקרון הוא פשוט ומסתמך על העובדה שמולקולות ה- DNA טעונות שלילית. יש מולקולת הדנ"א שלמה גודל כה גדול שזה לא להעביר באלקטרופורזה. הפסקות DNA, עם זאת, אם תוצאה הנוכחית בשברי קטנים שנעים בשדה החשמלי כלפי האנודה. שברים קטנים יותר להעביר מהר יותר. כמו שיש לי שברים בגדלים שונים התוצאה הסופית של אלקטרופורזה היא לא קו ברור אלא רצף עם הצורה של כוכב שביט. המערכת מאפשרת כימות של "השביט" וכתוצאה מכך וכך של הפסקות DNA בתא.

Introduction

assay שביט היה ראשון שפותח על ידי מדענים שוודי אוסטלינג ו1 ג'והנסון. ה- DNA הוא מולקולה טעונה שלילי. במהלך אלקטרופורזה, שברים קטנים, שנפגעו DNA לנסוע מהר יותר לכיוון האנודה טעונה חיובי 2. שברי DNA קטנים יותר, ההגירה שלהם מהר יותר לכיוון האנודה ליצירת "כוכב שביט" טיפוסי עם "ראש" המורכב מ- DNA שלם, שלא נפגע ו" זנב "המורכב מקטעי דנ"א פגומים 3. דנ"א פגום ניתן לתיקון על ידי מנגנונים שונים בגוף 4, אשר לשמור את הדור של הפסקות DNA מאוזנות למדי 5. אם, לעומת זאת, המאזן הוא לטובת הפסקות DNA, ההפסקות יכולות לצבור וסופו של דבר לתרום להתפתחות של מחלה.

ה- DNA שלנו סובל כ 0.000165 נזק% בזמן נתון 6. הפסקות DNA חד גדילים מתייחסות לפגם באחד משני הגדילים של הסליל הכפול ה- DNAואילו הפסקות פעמיים גדילי דנ"א נגרמות כאשר שני הגדילים של הסליל הכפול DNA פגומים. ישנם גורמים שונים אשר עשוי לשפר את כמות הפסקות DNA בכל זמן נתון, כגון גיל של התא, עשן סיגריות, תרופות שונות או סטרס חמצונים 7-9. אם כל הגורמים שהובילו להפסקות DNA משופרות נשמרים קבועים, אז כימות של הפסקות DNA באמצעות assay השביט היא פרמטר עקיף טוב של סטרס חמצונים.

השיטה של ​​assay השביט משמשת יותר ויותר היום ברפואה, כולל רפואת עיניים. אחת סיבות לכך היא שעקה חמצונית היא יותר ויותר מוכר כמנגנון pathogenetic למחלות שונות 8-11 וassay השביט הוא אחת שיטות שבי חמצוני לחץ עקיף ניתן לכמת.

Protocol

מחקרים על assay שביט שבוצעו באוניברסיטת באזל, מחלקת העיניים אושרו על ידי ועדת אתיקה המקומית באזל

1. הכנת ריאגנטים

  1. הכן בופר פוספט של Dulbecco (PBS) (Ca ++, Mg ++ חינם) פתרון על ידי הוספה (L 1 שקית) PBS ו990 מיליליטר של DH 2 O לתקשורת. התאם את ה- pH 7.4. אחסן בRT.
  2. הכן פתרון lysing: כדי להכין 1,000 מיליליטר להוסיף 2.5 M NaCl (146.1 גר '), 100 מ"מ EDTA (37.2 גר') ו -10 מ"מ בסיס Trizma (1.2 גרם) ב DH 2 O.
  3. הכן חיץ אלקטרופורזה (300 מ"מ NaOH / 1 mM EDTA) על ידי הוספת 30 מיליליטר של 10 M NaOH ו 7.5 מיליליטר של 0.2M EDTA, QS למיליליטר 1500 DH 2 O ומערבבים היטב. הנפח הכולל תלוי ביכולת תיבת ג'ל. לפני השימוש, למדוד את ה- pH של המאגר כדי להבטיח pH של> 13.
  4. הכן חיץ נטרול המכיל 0.4 M טריס (48.5 גר 'הוסיף ל~ מיליליטר 800 DH 2 O, להתאים את ה- pH 7.5), מרוכז (& #62; 10 M HCl) ב1,000 מיליליטר עם DH 2 א ' אחסן את הפתרון בRT.
  5. הכן פתרון מכתים. לethidium ברומיד (EtBr; מניית 10x, 20 מיקרוגרם / מיליליטר) להוסיף 10 מ"ג של EtBr ב 50 מיליליטר DH 2 O וחנות ב RT. למאגר 1x - לערבב 1 מיליליטר עם 9 מיליליטר DH 2 א ' זהיר! ידית EtBr עם אמצעי זהירות נאות כפי שהוא חומר מסרטן ידוע.

2. בידוד של לויקוציטים

  1. להשיג דגימות דם אנושיות (20 מיליליטר) עם נוגדת קרישה כגון הפרין באמצעות ניקור ורידים.
  2. הפרד את ימפוציטים באמצעות מפריד תא שיפוע צפיפות כגון Histopaque.
    1. בקצרה, לדלל דם ב 1: 1 יחס עם PBS או RPMI (ללא FBS) ושכבה מעל 600 נוזלי מפריד תא μl.
    2. צנטריפוגה XG 1800 במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוב את המעיל 'באפי' ל3-5 מיליליטר של PBS / RPMI וcentrifuged XG ב 300 במשך 10 דקות עד גלולה לימפוציטים.
    3. אחזר לימפוציטים מבדיוק מעל הגבול בין PBS (RPMI) ונוזל מפריד תא, באמצעות pipettor. הסר את להקות יקוציט מהממשק בין הפלזמה ושכבות נוזל מפריד תא של כל צינור ולאסוף לתוך שפופרת 50 מיליליטר אחד.
  3. תביא את הנפח הכולל 50 מיליליטר עם הנשר בינוני של Dulbecco הקר השתנה (DMEM). שטוף את ההשעיה תא שלוש פעמים עם DMEM XG ב 300 במשך 10 דקות.
  4. לספור את המספר הכולל של תאים באמצעות haemocytometer. להשעות את תאי PBS וaliquote לתוך צינורות microcentrifuge ב 10 7 תאים / צינור.
  5. Pipet 0.4 מיליליטר של תאים לתוך צינור פלסטיק חד פעמי 5 מיליליטר. להוסיף 1.2 מיליליטר 1% agarose-gelling בטמפרטורה נמוכה ב 40 מעלות צלזיוס. מערבבים במהירות וpipet 1.2 מיליליטר של השעיה תא על פני השטח מכוסה agarose של שקופית מצופה מראש. הימנע לייצר בועות.
  6. אפשר agarose לג'ל לכ -2 דקות. להיות עקבי עם הזמן וטמפרטורה המשמש לgelling, ולהבטיח כי agarose מוגדר באופן מלא לפני הצללה בפתרון תמוגה. לאחר מלא שלאח, לצלול לתוך lysing פתרון ב ~ 4 מעלות צלזיוס.

3. תמוגה ואלקטרופורזה

הערה: ההליך המתואר היא אלקטרופורזה בתנאי pH> 13 אלקליין.

  1. אחרי לפחות שעת 2 ​​ב ~ 4 המעלות צלזיוס, בעדינות להסיר שקופיות מפתרון lysing. מקום מחליק לצד זה על תיבת ג'ל האופקי ליד קצה אחד, מחליק אותם כקרוב זה לזה ככל האפשר.
  2. מלא את מאגרי חיץ עם חיץ pH> 13 אלקטרופורזה טריה עד רמת הנוזל מכסה את השקופיות (למנוע בועות על agarose) לחלוטין.
  3. בואו שקופיות לשבת במאגר בסיסי במשך 20 דקות כדי לאפשר להתרה של ה- DNA והביטוי של נזק אלקלי-יציב.
  4. הפעל אספקת חשמל ל -25 וולט (~ 0.75 V / סנטימטר) ולהתאים את נוכחי 300 milliamperes על ידי העלאה או הורדת רמת החיץ. Electrophorese השקופיות למשך 30 דקות.
  5. כבה את הכח. רם בעדינות את השקופיות מהחיץ ועמ 'תחרה על מגש ניקוז. זרוק מעיל חכם השקופיות עם נטרול מאגר. אפשר השקופיות לשבת במשך לפחות 5 דקות. מסננים שקופיות ולחזור עוד פעמיים.
  6. כתם השקופיות עם 80 μl 1x ethidium ברומיד (EtBr) ולהשאיר למשך 5 דקות ולאחר מכן לטבול במים מזוקקים מצוננים כדי להסיר כתם עודף. אז במקום coverslip על השקופית ולאחסן אותם באופן מיידי. חנות מחליקה לחודש ב RT בתנאים יבשים.
    הערה: כתמי DNA אחרים (למשל, SYBR-ירוק) עשויה לשמש גם. זהירות! ללבוש כפפות מגן כמו רוב הצבעים הם mutagenic.

4. כימות Breaks DNA

  1. כדי להמחיש את הנזק לדנ"א, להתבונן שקופית DNA המוכתמת-EtBr תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי האובייקטיבי 40X.
  2. להעריך כמותית נזק לדנ"א בתאים על ידי מדידת האורך של הגירת DNA ואחוז DNA היגר (איור 1 א). לכמת נזק לדנ"א (איור 1) מהרגע לרגע וזנב הזית-momeNT. הגדרות של זנב-רגע והזית -Moment בעבר ניתנו 8-10.
    הערה: מניסיוננו זה מספיק כדי להישאר באחד מהפרמטרים. התאים מצולמים על ידי הגדרת הכלי האוטומטי שסורק על תאי שקופיות מיקרוסקופ ותצלומים. כימות של הפסקות DNA יכולה להיעשות על ידי חבילות תוכנת ניתוח תמונה. ישנן מספר חבילות תוכנה שונות כי הם עשו מותאמים אישית כדי ללכוד את התמונה של התאים ולכמת נזק לדנ"א. אנו ממליצים על שימוש באותה חבילת תוכנה לאורך כל הניסוי. טכנאי המעבדה מזהה את התא או השביט שלם שקלע במחשב ולוחץ עם העכבר על זה. תא השביט או שלם לאחר מכן הבקיע באופן אוטומטי.

Representative Results

למרות שהשיטה של ​​assay השביט הופכת תוצאות לשחזור, ניתן להשפיע עליו על ידי מגוון גורמים. גורם אחד כזה הוא אם לויקוציטים הם cryopreserved לפני תמוגה וג'ל אלקטרופורזה-או אם צעד זה מבוצע על כדוריות דם לבנות מוכנים טרי. איור 2 מראה כי בקבוצה 2, שבו כדוריות דם לבנות היו cryopreserved לפני DNA תמוגה וג'ל אלקטרופורזה ס"ס הפסקות היו גבוהות יותר באופן משמעותי, מאשר בקבוצת 1 שבי -electrophoresis תמוגה וג'ל נעשה בתאים מוכנים טרי.

גם assay יכול לשמש כדי להעריך סטרס חמצונים מערכתיים בעקיפין. טבלה 1 מציגה את סטטיסטיקת תאורית לרגע זנב ורגע אוליב במעשנים ונבדקים בריאים. הנתונים מגלים כי עישון מחצית חפיסת סיגריות מדי יום יותר מ מכפיל הפסקות ssDNA בלויקוציטים מחזור 9.

איור 1 א

איור 1
איור 1. (א) מתאר את מיקרוסקופ שימוש במהלך ניתוח assay שביט. (ב) Δ מתאר "שביט" טיפוסי עם ראש וזנב (קטעי דנ"א פגום קטנים יותר) בהירים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
2. הפסקות ssDNA איור היו גבוהות יותר באופן משמעותי כאשר כדוריות דם לבנות היו cryopreserved (הקבוצה 2) מאשר כאשר כדוריות דם לבנות מוכנים טרי שמשו לפני תמוגה וג'ל אלקטרופורזה-.

היו מעשנים 1. שולחן יותר מכפול מספר ssDNA שובר בהשוואה לגיל ומין מותאם שאינם מעשנים בריאים.

Discussion

מדענים שוודי אוסטלינג וג'והנסון היו הראשון בתחומם להשתמש assay השביט לכמת נזק לדנ"א בתאי 1. התנאים ניטראליים ששני המדענים השתמשו, לעומת זאת, רק אפשרו זיהוי של הפסקות פעמיים גדילי דנ"א. סינג et al. מאוחר יותר מותאם assay לשימוש תחת תנאים בסיסיים, אשר הפיק גרסה רגישה שיכול להעריך הפסקות כפולות וחד-גדילי דנ"א ולזהות אתרי אלקלי-יציב 12. מאז הפיתוח הראשוני שלה, assay השתנה בצעדים שונים על מנת להפוך אותו מתאים להערכת סוגים של נזק לדנ"א בתאים מסוגים שונים 13-15.

כמו בכל הטכניקות, תשומת לב קפדנית לפרטים טכניים חשוב להשיג תוצאות מדויקות 16. בהתבסס על הניסיון שלנו, התוצאות הטובות ביותר מתקבלות אם כל צעד-ממתודולוגיים הכנת פתרון לשביט כימות-מבוצע על ידי המעבדה techn מומחהicians. השימוש בתקשורת טרי ומוכנה בצורה נכונה, טכניקות pipetting נאותות, תזמון מדויק ו( כאמור בסעיף התוצאות) השימוש של לויקוציטים מוכן הטרי הם חיוני על מנת שתמוגה וג'ל אלקטרופורזה כדי להשיג תוצאות מדויקות 17.

כל הצעדים הבודדים בassay זה חשובים באותה מידה לקבלת תוצאות אמינות. 16 באופן כללי התוצאות הטובות ביותר מתקבלים אם כל צעד מתודולוגית מהכנת פתרון עד כימות שביט מבוצע על ידי המעבדה technicians.Important מומחה נראים את השימוש בתקשורת טרי ומוכנה בצורה נכונה , טכניקות נאותות pipetting, תזמון מדויק וכפי שכבר התייחסו בסעיף תוצאות השימוש של לויקוציטים מוכן הטרי לתמוגה וג'ל אלקטרופורזה-כדי להשיג תוצאות מספקות מassay 17.

כלעשות מתודולוגיות אחרות, יש טכניקת assay שביט advanTages וחסרונות. להיות שיטה רגישה, assay הוא פגיע לגורמים (לדוגמא, אור UV) אשר יכולה להגדיל את הפסקות DNA ובכך להשפיע על תוצאות. כל גורם שעשוי לשפר את לחץ חמצוני, חוץ מזה שבו נחקר, יש להימנע. גורמי לחץ יכול להעלות את הרמה של סטרס חמצונים לא רק בכדוריות דם לבנות, אלא גם בכל המדיומים הדם האחרים ולימפוציטים. כפי שהוזכר קודם לכן יש דרכים שונות וישירים יותר רבות של מדידת לחץ חמצוני 18,19. Assay השביט הוא אחת משיטות רבות שבו יש יתרונות מסוימים. אלה כוללים את העלות שלה נמוכה יחסית, במספר הקטן של תאים הנדרשים (<10,000 תאים) ובכך הדגימות הקטנות של דם הנדרשת לחולה, בתקופה היחסית הקצרה של זמן הנדרש כדי לכמת נזק לדנ"א בתאים (כ 3 ימים), הרגישות שלה והתחולה רחבת התפשטותו לנזק לדנ"א ישבנים בתא-סוגים שונים. בעבר אנו בוחרים לעבוד עם כדוריות דם לבנות מאז שהיו לנו ניסיון עם זהתאים מסוג וזה היה רלוונטי למחקר המסוים המתוכנן. יתרון נוסף של assay השביט הוא שזה יכול לשמש כדי לזהות סוגים ורמות של נזק ל- DNA שונים ולכן יכול להיות מיושם בתחומים שונים של לימודים מלבד סטרס חמצונים כגון מחקרי תיקון DNA, ניסויי תוספים או לימודי genotoxicity.

סטרס חמצונים מוכר כיום כמשחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של מחלות רבות. שיטת assay השביט, בעוד אחת מדרכים רבות למדידת לחץ חמצוני 18,19, היא יחסית פשוטה, תכליתית וזולה. כאשר שולטים, בשיטה זו ניתן להשתמש בכל תחומי הרפואה שבסטרס החמצונים משחק התפקיד 8-10,20,21.

Disclosures

אין.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לStiftung LHW, בTriesen ליכטנשטיין, לתמיכה במחקר כלכלי שלנו על סטרס חמצונים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethylsulfoxide (DMSO) Qualigens (CPW59)
Disodium EDTA HiMedia (RM1370)
Ethidium Bromide Sigma (E-8751)
Histopaque Sigma (1077-1)
Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) HiMedia (TS1006)
Sodium Chloride (NaCl) Ranbaxy Rankem (S0160)
Sodium Hydroxide (NaOH) BDH-Merck (89021)
Triton X-100 HiMedia (RM 845)
Trizma Base Spectrochem
Materials required for gel electrophoresis
Normal Melting Agarose (NMA) HiMedia (RM273)
Low Melting Point Agarose (LMPA) Sigma (A9414)
Methanol - Qualigens
Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) Blue Star
Microcentrifuge Tubes Tarsons (500010)
Micropipettor and Tips Tarsons
Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123, (1), 291-298 (1984).
  2. Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. Electromagnetic fields and DNA damage. Pathophysiology. 16, (2-3), 79-88 (2009).
  3. Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell Biol Toxicol. 25, (1), 5-32 (2009).
  4. Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity. Cell Biol Toxicol. 25, (4), 393-402 (2009).
  5. Bartsch, H., Nair, J. Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair. Langenbecks Arch Surg. 391, (5), 499-510 (2006).
  6. Martin, L. J. DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 67, (5), 377-387 (2008).
  7. Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure. Photochem Photobiol. 81, (3), 493-497 (2005).
  8. Mozaffarieh, M., et al. Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients. Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).
  9. Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes. Tob Induc Dis. 8, (14), (2010).
  10. Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration. Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).
  11. Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women. Reprod Sci. (2014).
  12. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells). Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).
  13. Gaivão, I., Sierra, L. M. Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives. Front Genet. 5, 304 (2014).
  14. Zhang, J., et al. DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients. Ophthalmic Res. 51, (3), 124-128 (2014).
  15. Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesné, C., Fessard, V. Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity. Toxicol Sci. 138, (2), 300-309 (2014).
  16. Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial. Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).
  17. Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group. Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).
  18. Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress. BioMed Res Int. 157-547 (2013).
  19. Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus. Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).
  20. Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station. Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).
  21. Cabarkapa, A., et al. Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes. Toxicol In Vitro. 28, (3), 451-456 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics