प्रणालीगत oxidative तनाव का एक अप्रत्यक्ष उपाय के रूप में धूमकेतु परख

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Summary

धूमकेतु परख विभिन्न कारकों से प्रेरित डीएनए टूट जाता है, उपाय। डीएनए की क्षति के कारण (oxidative तनाव को छोड़कर) सभी कारकों को स्थिर रखा जाता है, तो डीएनए की क्षति की राशि ऑक्सीडेटिव तनाव का एक अच्छा अप्रत्यक्ष पैरामीटर है। इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य oxidative तनाव के अप्रत्यक्ष माप के लिए धूमकेतु परख का उपयोग है।

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Fang, L., Neutzner, A., Turtschi, S., Flammer, J., Mozaffarieh, M. Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (99), e52763, doi:10.3791/52763 (2015).

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Abstract

ऑक्सीजन के बिना नहीं रह सकते हायर यूकेरियोटिक जीवों; अभी तक, विडंबना यह है कि ऑक्सीजन उन के लिए हानिकारक हो सकता है। यह अलग पीआई * एंटी संबंध कक्षाओं में स्थित दो अयुगल इलेक्ट्रान है क्योंकि ऑक्सीजन अणु रासायनिक अपेक्षाकृत निष्क्रिय है। इन दो इलेक्ट्रॉनों वे अपने स्वयं के कुल्हाड़ियों के बारे में एक ही दिशा में बारी बारी से है, जिसका अर्थ समानांतर है spins है। ऑक्सीजन के अणु नहीं बहुत प्रतिक्रियाशील है यही कारण है। ऑक्सीजन के एक्टिवेशन दो अलग तंत्र द्वारा हो सकता है; या तो एक समय (monovalent कमी) पर एक इलेक्ट्रॉन के माध्यम से कमी के माध्यम से, या पर्याप्त ऊर्जा के अवशोषण के माध्यम से अयुगल इलेक्ट्रान से एक की स्पिन रिवर्स करने के लिए। इस प्रतिक्रियाशील ऑक्सीडेटिव प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन में यह परिणाम है। मानव शरीर के लिए अपनी शारीरिक स्थिति में आरओएस समाप्त जिसमें तरीके के एक नंबर रहे हैं। आरओएस उत्पादन की मरम्मत की क्षमता, oxidative तनाव के परिणाम और नुकसान अलग अणुओं से अधिक है। Oxidative तनाव मुझे हो सकता है जिसके द्वारा कई अलग अलग तरीके हैंasured। इस पांडुलिपि भी डीएनए टूट की माप की अनुमति देता है जो "धूमकेतु परख 'के रूप में जाना जाता सेल जेल वैद्युतकणसंचलन, नाम तरीकों में से एक पर केंद्रित है। Oxidative तनाव के अलावा अन्य डीएनए की क्षति, कारण ज्ञात सभी कारकों को स्थिर रखा जाता है, तो धूमकेतु परख द्वारा मापा डीएनए की क्षति की राशि ऑक्सीडेटिव तनाव का एक अच्छा पैरामीटर है। सिद्धांत सरल है और डीएनए अणु नकारात्मक आरोप लगाया जाता है कि इस तथ्य पर निर्भर करता है। एक अक्षुण्ण डीएनए अणु यह वैद्युतकणसंचलन दौरान विस्थापित नहीं है कि इस तरह के एक बड़े आकार की है। डीएनए टूट जाता है, हालांकि, एनोड की दिशा में बिजली के क्षेत्र में कदम जो छोटे टुकड़ों में मौजूद परिणाम है। छोटे टुकड़ों में तेजी से पलायन। टुकड़े अलग अलग आकार है के रूप में वैद्युतकणसंचलन के अंतिम परिणाम एक स्पष्ट रेखा बल्कि एक धूमकेतु के आकार के साथ एक निरंतरता नहीं है। प्रणाली सेल में डीएनए टूट की जिसके परिणामस्वरूप "धूमकेतु" और इस तरह के एक मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है।

Introduction

धूमकेतु परख पहले स्वीडन के वैज्ञानिकों Ostling और Johanson 1 द्वारा विकसित किया गया था। डीएनए एक नकारात्मक आरोप लगाया अणु है। वैद्युतकणसंचलन के दौरान, छोटे, क्षतिग्रस्त डीएनए टुकड़े तेजी से एक सकारात्मक आरोप लगाया एनोड 2 की ओर यात्रा करते हैं। डीएनए टुकड़े छोटे, एनोड की ओर तेजी से उनके प्रवास बरकरार, undamaged डीएनए और क्षतिग्रस्त डीएनए टुकड़े 3 से बना एक "पूंछ" की रचना "सिर" के साथ एक ठेठ "धूमकेतु" के रूप में। क्षतिग्रस्त डीएनए 5 काफी संतुलित डीएनए टूट की पीढ़ी जो रखने के शरीर 4 में विभिन्न कार्यप्रणालियों के द्वारा ठीक किया जा सकता। , तथापि, शेष डीएनए टूट के पक्ष में हैं, तो टूटता जमा कर सकते हैं और अंत में एक रोग के विकास के लिए योगदान देगा।

हमारे डीएनए एक निश्चित समय 6 बजे लगभग 0.000165% क्षति ग्रस्त है। एकल असहाय डीएनए टूट डीएनए डबल हेलिक्स की दो किस्में में से एक पर एक दोष करने के लिए देखेंडीएनए डबल हेलिक्स के दोनों किस्में क्षतिग्रस्त हो रहे हैं जब डबल असहाय डीएनए टूट वजह से हैं, जबकि। इस तरह के सेल की उम्र, सिगरेट का धुआँ, विभिन्न दवाओं या oxidative तनाव 7-9 के रूप में एक निश्चित समय पर डीएनए टूट की राशि में वृद्धि हो सकती है, जो विभिन्न कारक हैं। बढ़ाया डीएनए को तोड़ता के लिए अग्रणी सभी कारकों को स्थिर रखा जाता है, तो धूमकेतु परख के माध्यम से डीएनए टूट की मात्रा का ठहराव ऑक्सीडेटिव तनाव का एक अच्छा अप्रत्यक्ष पैरामीटर है।

धूमकेतु परख की विधि नेत्र विज्ञान सहित चिकित्सा में तेजी से आज प्रयोग किया जाता है। इसका एक कारण यह oxidative तनाव और अधिक से अधिक एक विधि परोक्ष रूप से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जो oxidative तनाव के साथ है विभिन्न रोगों 8-11 और धूमकेतु परख के लिए एक विकारी तंत्र के रूप में मान्यता प्राप्त है।

Protocol

बेसल विश्वविद्यालय में प्रदर्शन किया धूमकेतु परख पर अध्ययन, नेत्र विज्ञान विभाग बासेल के स्थानीय नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया

अभिकर्मकों के 1. तैयारी

  1. है Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) (सीए ++ मिलीग्राम ++ मुक्त) पीबीएस (1 एल पैकेट) और मीडिया के लिए DH 2 ओ की 990 मिलीलीटर जोड़कर समाधान तैयार है। 7.4 पीएच को समायोजित करें। आरटी पर स्टोर।
  2. Lysing समाधान तैयार: 1,000 मिलीलीटर DH 2 ओ में 2.5 एम NaCl (146.1 जी), 100 मिमी EDTA (37.2 ग्राम) और 10 मिमी Trizma आधार (1.2 ग्राम) जोड़ने के लिए तैयार करने के लिए
  3. 1,500 मिलीलीटर DH 2 ओ के लिए 10 एम NaOH के 30 मिलीग्राम और 7.5 मिलीलीटर की 0.2M EDTA, क्यु जोड़कर वैद्युतकणसंचलन बफर (300 मिमी NaOH के / 1 मिमी EDTA) तैयार है और अच्छी तरह मिला लें। कुल मात्रा जेल बॉक्स क्षमता पर निर्भर करता है। पहले> 13 साल की एक पीएच सुनिश्चित करने के लिए बफर का पीएच को मापने, उपयोग करने के लिए।
  4. 0.4 एम Tris युक्त निराकरण बफर तैयार (& # केंद्रित, (48.5 ग्राम ~ 800 मिलीलीटर DH 2 हे, 7.5 पीएच को समायोजित करने के लिए जोड़ा)62; DH 2 ओ के साथ 10 एम एचसीएल) 1000 में मिलीलीटर आरटी पर समाधान स्टोर।
  5. धुंधला समाधान तैयार है। Ethidium ब्रोमाइड (EtBr; 10X शेयर, 20 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए आरटी पर 50 मिलीलीटर DH 2 हे और दुकान में EtBr की 10 मिलीग्राम जोड़ें। 1x स्टॉक के लिए - 9 मिलीलीटर DH 2 ओ के साथ 1 मिलीलीटर मिश्रण सावधान! यह एक ज्ञात कैसरजन के रूप में पर्याप्त एहतियात के साथ EtBr संभाल लेना।

Leukocytes की 2. अलगाव

  1. शिरापरक पंचर का उपयोग करते हुए इस तरह के हेपरिन के रूप में विरोधी कौयगुलांट के साथ मानव रक्त के नमूने (20 मिलीग्राम) प्राप्त करते हैं।
  2. ऐसे Histopaque के रूप में एक घनत्व ढाल सेल विभाजक का उपयोग लिम्फोसाइटों अलग करें।
    1. 600 μl सेल विभाजक तरल पर 1 पीबीएस या (एफ बी एस) के बिना RPMI के साथ अनुपात और परत: संक्षेप में, 1 में रक्त पतला।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 1,800 XG। पीबीएस / RPMI के 3-5 मिलीलीटर में 'बफी' कोट Aspirate और लिम्फोसाइटों गोली करने के लिए 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifuged।
    3. (बस पीबीएस के बीच की सीमा से ऊपर से RPMI लिम्फोसाइटों निकालते हैंएक pipettor का उपयोग) और सेल विभाजक तरल,। प्लाज्मा और प्रत्येक ट्यूब के सेल विभाजक तरल परतों के बीच इंटरफेस से ल्युकोसैट बैंड निकालें और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा।
  3. ठंड Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के साथ 50 मिलीलीटर की कुल मात्रा लाओ। 10 मिनट के लिए 300 XG पर सेल निलंबन DMEM के साथ तीन बार धोएं।
  4. एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना। पीबीएस में कोशिकाओं को सस्पेंड और 10 7 कोशिकाओं / ट्यूब पर microcentrifuge ट्यूबों में aliquote।
  5. Pipet एक 5 मिलीलीटर की प्लास्टिक डिस्पोजेबल ट्यूब में कोशिकाओं के 0.4 मिलीलीटर। 40 डिग्री सेल्सियस पर 1.2 मिलीलीटर 1% कम-बीच बढ़िया तालमेल तापमान agarose जोड़ें। मिक्स और तेजी से और एक पूर्व लेपित स्लाइड के agarose से ढके सतह पर सेल निलंबन के 1.2 मिलीलीटर pipet। बुलबुले का निर्माण करने से बचें।
  6. Agarose के बारे में 2 मिनट के लिए जेल की अनुमति दें। बीच बढ़िया तालमेल के लिए इस्तेमाल समय और तापमान के साथ लगातार हो, और कहा कि agarose पूरी तरह से lysis समाधान में जलमग्न होने से पहले सेट है सुनिश्चित करते हैं। पूरी तरह से करने के बादएट, ~ 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान lysing में डूब।

3. lysis और वैद्युतकणसंचलन

नोट: वर्णित प्रक्रिया पीएच> 13 क्षारीय शर्तों के तहत वैद्युतकणसंचलन के लिए है।

  1. ~ 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 घंटे के बाद, धीरे lysing समाधान से स्लाइड्स निकालें। प्लेस संभव के रूप में उन्हें एक साथ करीब के रूप में रपट, एक छोर के निकट क्षैतिज जेल बॉक्स पर कंधे से कंधा मिलाकर स्लाइड।
  2. तरल स्तर पूरी तरह से स्लाइड (agarose अधिक बुलबुले से बचने) को शामिल किया गया है जब तक ताजा बना पीएच> 13 वैद्युतकणसंचलन बफर के साथ बफर जलाशयों भरें।
  3. 20 मिनट के डीएनए के unwinding और क्षार अस्थिर क्षति की अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देने के लिए के लिए स्लाइड क्षारीय बफर में बैठते हैं।
  4. 25 वोल्ट (~ 0.75 वी / सेमी) करने के लिए बिजली की आपूर्ति चालू करें और ऊपर उठाने या बफर स्तर को कम करके 300 milliamperes के लिए वर्तमान समायोजित करें। 30 मिनट के लिए स्लाइड Electrophorese।
  5. बिजली बंद करें। धीरे बफर और पी से स्लाइड लिफ्टएक नाली ट्रे पर फीता। बुद्धिमान कोट निराकरण बफर के साथ स्लाइड्स गिरा। स्लाइड्स में कम से कम 5 मिनट के लिए बैठने की अनुमति। स्लाइड्स नाली और दो बार दोहराएँ।
  6. 80 μl 1x ethidium ब्रोमाइड (EtBr) के साथ स्लाइड दाग और 5 मिनट के लिए छोड़ दें और फिर अतिरिक्त दाग को दूर करने के लिए ठंडा आसुत जल में डुबकी। फिर स्लाइड पर एक coverslip जगह है और उन्हें तुरंत दुकान। स्टोर सूखे की स्थिति में आरटी पर एक माह के लिए स्लाइड।
    नोट: अन्य डीएनए दाग (जैसे, SYBR-हरा) का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। सावधानी! सबसे रंजक उत्परिवर्तजन के रूप में सुरक्षात्मक दस्ताने पहनते हैं।

डीएनए को तोड़ता 4. मात्रा

  1. डीएनए की क्षति की कल्पना करने के लिए, एक 40x उद्देश्य फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे EtBr से सना हुआ डीएनए स्लाइड निरीक्षण करते हैं।
  2. डीएनए प्रवास की लंबाई और माइग्रेट डीएनए (चित्रा 1 ए) के प्रतिशत को मापने के द्वारा कोशिकाओं में मात्रात्मक डीएनए की क्षति का आकलन करें। Tail- पल और जैतून के mome द्वारा डीएनए की क्षति (चित्रा 1 बी) योंNT। तेल-पल और जैतून का -Moment की परिभाषाओं पहले से 8-10 दिया गया है।
    नोट: हमारे अनुभव में यह मानकों में से एक द्वारा छड़ी के लिए काफी है। कोशिकाओं को माइक्रोस्कोप स्लाइड और तस्वीरें कोशिकाओं पर स्कैन करता है कि स्वचालित उपकरण की स्थापना द्वारा फोटो खिंचवाने कर रहे हैं। डीएनए टूट की मात्रा छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर संकुल के द्वारा किया जा सकता है। कस्टम कोशिकाओं की छवि पर कब्जा करने और डीएनए की क्षति यों के लिए किया जाता है कि कई अलग अलग सॉफ्टवेयर संकुल रहे हैं। हम प्रयोग भर में एक ही सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करने की सलाह देते हैं। प्रयोगशाला तकनीशियन बरकरार सेल या धूमकेतु कंप्यूटर पर रन बनाए जा करने के लिए की पहचान करता है और उस पर माउस के साथ क्लिक करता है। धूमकेतु या बरकरार सेल तो स्वचालित रूप से रन बनाए है।

Representative Results

धूमकेतु परख की विधि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों renders हालांकि, यह कारकों की एक किस्म से प्रभावित किया जा सकता है। ऐसा ही एक पहलू ल्यूकोसाइट्स से पहले सेल और जेल वैद्युतकणसंचलन करने के लिए या इस कदम के हौसले से तैयार ल्यूकोसाइट्स पर किया जाता है कि क्या cryopreserved कर रहे हैं या नहीं। पता चलता है 2 आंकड़ा है कि ल्यूकोसाइट्स सेल और जेल वैद्युतकणसंचलन ss- डीएनए के लिए पहले cryopreserved गया जहां समूह 2 में टूटता सेल और जेल -electrophoresis हौसले से तैयार की कोशिकाओं पर किया गया था, जहां ग्रुप 1 में, की तुलना में काफी अधिक थे।

परख भी परोक्ष रूप से प्रणालीगत oxidative तनाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 1 टेबल धूम्रपान करने वालों और स्वस्थ विषयों में Tail- पल और जैतून पल के लिए वर्णनात्मक आँकड़े को दर्शाता है। डेटा की तुलना में दैनिक अधिक सिगरेट के आधे से एक पैकेट से धूम्रपान परिसंचारी ल्यूकोसाइट्स 9 में ssDNA टूटता डबल्स कि पता चलता है।

चित्रा 1 ए

चित्रा 1 बी
चित्रा 1 (ए) धूमकेतु परख विश्लेषण के दौरान इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप दर्शाया गया है। (बी) Δ एक उज्ज्वल सिर और पूंछ (छोटे डीएनए टुकड़े क्षतिग्रस्त) के साथ एक ठेठ "धूमकेतु" दर्शाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
ल्यूकोसाइट्स हौसले से तैयार ल्यूकोसाइट्स सेल और जेल वैद्युतकणसंचलन करने से पहले इस्तेमाल किया गया, जब की तुलना में (समूह) 2 cryopreserved गया जब चित्रा 2. ssDNA टूटता काफी अधिक थे।

तालिका 1. धूम्रपान करने वालों ssDNA के दोगुने से भी अधिक संख्या स्वस्थ धूम्रपान न करने वालों का मिलान नहीं हुआ उम्र और लिंग की तुलना में टूट जाता था।

Discussion

स्वीडन के वैज्ञानिकों Ostling और Johanson कोशिकाओं 1 में डीएनए की क्षति यों के लिए धूमकेतु परख का उपयोग करने के लिए अपने क्षेत्र में पहले थे। तटस्थ शर्तों दो वैज्ञानिकों का इस्तेमाल किया है, तथापि, केवल डबल असहाय डीएनए टूट जाता है का पता लगाने के लिए अनुमति दी। सिंह एट अल। बाद में डबल और एकल असहाय डीएनए टूट आकलन और क्षार अस्थिर साइटों 12 का पता लगा सकता है कि एक संवेदनशील संस्करण का उत्पादन किया जो क्षारीय परिस्थितियों में उपयोग के लिए परख, रूपांतरित किया। अपनी प्रारंभिक विकास के बाद से, परख विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 13-15 में डीएनए की क्षति के प्रकार का आकलन करने के लिए उपयुक्त बनाने के लिए विभिन्न चरणों में संशोधित किया गया है।

सभी तकनीकों के साथ के रूप में, तकनीकी जानकारी के लिए कठोर ध्यान दे सटीक परिणाम 16 प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। हमारे अनुभव के आधार पर, सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं अगर हर पद्धति कदम-से-मात्रा का ठहराव है विशेषज्ञ प्रयोगशाला techn के द्वारा धूमकेतु का प्रदर्शन करने के लिए समाधान की तैयारीicians। ताजा और सही ढंग से तैयार मीडिया, पर्याप्त pipetting तकनीक, सही समय और हौसले से तैयार leukocytes की (पहले परिणाम अनुभाग में उल्लेख है) उपयोग के उपयोग के सटीक परिणाम 17 प्राप्त करने के लिए सेल और जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए आदेश में जरूरी है।

इस परख के सभी अलग अलग चरणों विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए समान रूप से महत्वपूर्ण हैं। सामान्य सबसे अच्छा परिणाम में 16 प्राप्त कर रहे हैं धूमकेतु मात्रा का ठहराव तक समाधान तैयार करने से हर एक पद्धति कदम विशेषज्ञ प्रयोगशाला technicians.Important द्वारा किया जाता है यदि लगते ताजा और सही ढंग से तैयार मीडिया के उपयोग पर्याप्त pipetting तकनीक, सही समय और के रूप में पहले से ही परिणाम अनुभाग परख 17 से पर्याप्त परिणाम प्राप्त करने के लिए सेल और जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए हौसले से तैयार leukocytes के प्रयोग में करने के लिए भेजा।

अन्य तरीके में करते हैं, धूमकेतु परख तकनीक अपने लाभ हैtages और कमियां। एक संवेदनशील तरीका होने के नाते, परख डीएनए टूट बढ़ाने और इस तरह के परिणाम को प्रभावित कर सकता है जो कारकों (जैसे, यूवी प्रकाश) की चपेट में है। शोध किया जा रहा है जो, सिवाय इसके कि oxidative तनाव बढ़ाने सकता है किसी भी कारक है, बचा जाना चाहिए। तनाव ऑक्सीडेटिव तनाव ल्यूकोसाइट्स में बल्कि अन्य सभी रक्त माध्यमों और लिम्फोसाइटों में न केवल के स्तर को बढ़ा सकते हैं। जैसा कि पहले उल्लेख ऑक्सीडेटिव तनाव 18,19 मापने के कई अलग और अधिक प्रत्यक्ष तरीके हैं। धूमकेतु परख कुछ फायदे हैं, जो कई तरीकों में से एक है। ये उसके रिश्तेदार कम लागत, (<10,000 कोशिकाओं) आवश्यक कोशिकाओं के छोटे संख्या और रोगी के प्रति आवश्यक खून की इस प्रकार छोटे नमूने, कोशिकाओं (लगभग 3 दिन) में डीएनए की क्षति यों के लिए आवश्यक समय के रिश्तेदार छोटी अवधि, इसकी संवेदनशीलता शामिल और अलग अलग सेल-प्रकार में गधे डीएनए की क्षति के लिए अपनी व्यापक प्रसार प्रयोज्यता। हम इस के साथ अनुभव था, क्योंकि अतीत में हम ल्यूकोसाइट्स के साथ काम करने का चयनसेल प्रकार और यह योजना बनाई विशेष रूप से अध्ययन के लिए लागू किया गया था। धूमकेतु परख का एक अन्य लाभ यह है कि विभिन्न प्रकार के और डीएनए की क्षति के स्तर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इस तरह इस तरह के डीएनए की मरम्मत का अध्ययन, पूरकता परीक्षण या genotoxicity अध्ययन के रूप में oxidative तनाव के अलावा पढ़ाई के विभिन्न अन्य क्षेत्रों में लागू किया जा सकता है।

ऑक्सीडेटिव तनाव अब कई बीमारियों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है के रूप में मान्यता प्राप्त है। धूमकेतु परख विधि, oxidative तनाव 18,19 मापने के कई तरीकों में से एक है, जबकि अपेक्षाकृत सरल, बहुमुखी और सस्ती है। महारत हासिल करते हैं, तो इस विधि ऑक्सीडेटिव तनाव भूमिका 8-10,20,21 निभाता है, जिसमें दवा के सभी क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Disclosures

नहीं।

Acknowledgments

हम आर्थिक रूप से ऑक्सीडेटिव तनाव पर हमारे शोध का समर्थन करने के लिए, Triesen लिकटेंस्टीन में, LHW Stiftung को धन्यवाद देना चाहूंगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethylsulfoxide (DMSO) Qualigens (CPW59)
Disodium EDTA HiMedia (RM1370)
Ethidium Bromide Sigma (E-8751)
Histopaque Sigma (1077-1)
Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) HiMedia (TS1006)
Sodium Chloride (NaCl) Ranbaxy Rankem (S0160)
Sodium Hydroxide (NaOH) BDH-Merck (89021)
Triton X-100 HiMedia (RM 845)
Trizma Base Spectrochem
Materials required for gel electrophoresis
Normal Melting Agarose (NMA) HiMedia (RM273)
Low Melting Point Agarose (LMPA) Sigma (A9414)
Methanol - Qualigens
Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) Blue Star
Microcentrifuge Tubes Tarsons (500010)
Micropipettor and Tips Tarsons
Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides

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References

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