Comet Assay als ein indirektes Maß für Systemische Oxidativer Stress

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Summary

Comet Assay misst DNA-Brüche, durch verschiedene Faktoren hervorgerufen. Wenn alle Faktoren (außer oxidativer Stress) DNA-schädigenden konstant gehalten werden, die Menge an DNA-Schädigung ist eine gute indirekte Parameter von oxidativem Stress. Das Ziel des Protokolls ist es, Comet-Assay zur indirekten Messung von oxidativem Stress zu verwenden.

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Fang, L., Neutzner, A., Turtschi, S., Flammer, J., Mozaffarieh, M. Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (99), e52763, doi:10.3791/52763 (2015).

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Abstract

Höheren eukaryotischen Organismen nicht ohne Sauerstoff leben; Paradoxerweise kann Sauerstoff für sie schädlich sein. Das Sauerstoffmolekül chemisch relativ inert, weil es zwei ungepaarten Elektronen in verschiedenen pi * Anti-Bindungsorbitalen entfernt. Diese beiden Elektronen parallel Spins, das heißt sie in der gleichen Richtung um ihre eigenen Achsen drehen. Deshalb ist die Sauerstoffmoleküls ist nicht sehr reaktiv. Aktivierung von Sauerstoff kann durch zwei verschiedene Mechanismen auftreten; entweder durch Reduktion über ein Elektron zu einem Zeitpunkt (monovalent Reduktion) oder durch die Absorption von genügend Energie, um den Spin eines der ungepaarten Elektronen umzukehren. Dies resultiert in der Produktion von reaktiven oxidativen Spezies (ROS). Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten, wie der menschliche Körper eliminiert ROS in seinen physiologischen Zustand. Wenn ROS-Produktion übersteigt die Reparaturkapazität, oxidativer Stress Ergebnisse und Schäden unterschiedlichen Molekülen. Es gibt viele verschiedene Methoden, mit denen oxidativer Stress kann mich seingesicherter. Diese Handschrift konzentriert sich auf eine der Methoden namens Zell Gelelektrophorese, die auch als "Comet Assay", die Messung der DNA-Brüche ermöglicht bekannt. Wenn alle Faktoren bekannt, DNA-Schädigung, ausgenommen oxidativen Stress verursachen konstant gehalten werden, die Menge an DNA-Schädigung durch Comet-Assay gemessen wird, ein guter Parameter für oxidativen Stress. Das Prinzip ist einfach und beruht auf der Tatsache, dass DNA-Moleküle, sind negativ geladen. Ein intakter DNA-Molekül hat eine so große Größe, die nicht während der Elektrophorese nicht migrieren. DNA-Brüche, jedoch falls vorhanden führen zu kleineren Fragmenten, die im elektrischen Feld zur Anode hin bewegen. Kleinere Fragmente wandern schneller. Die Fragmente unterschiedliche Größen für das Ergebnis der Elektrophorese ist keine klare Linie, sondern ein Kontinuum mit der Form eines Kometen. Das System ermöglicht eine Quantifizierung der resultierenden "Komet" und damit der DNA-Brüche in der Zelle.

Introduction

Comet Assay wurde zuerst von schwedischen Wissenschaftlern Ostling und Johanson 1 entwickelt. DNA ist ein negativ geladenes Molekül. Während der Elektrophorese, kleiner, beschädigte DNA-Fragmente zu reisen schneller zu einer positiv geladenen Anode 2. Je kleiner die DNA-Fragmente, desto schneller wird die Migration in Richtung der Anode eine typische "Komet" mit einem "Kopf" von intakten, unbeschädigte DNA und einem "Schwanz" der beschädigten DNA-Fragmente 3 zusammengesetzt, um zu bilden. Beschädigte DNA kann durch verschiedene Mechanismen im Körper 4, der die Erzeugung von DNA-Brüchen relativ ausgewogen 5 halten repariert werden. Wenn jedoch das Gleichgewicht zugunsten der DNA Pausen können die Brüche ansammeln und wird schließlich zu der Entwicklung einer Krankheit beitragen.

Unsere DNA leidet etwa 0.000165% Schädigung zu einer gegebenen Zeit 6. Einzelsträngige DNA-Brüche beziehen sich auf einen Defekt an einem der beiden Stränge der DNA-Doppelhelixwohingegen doppelsträngige DNA-Brüche verursacht werden, wenn beide Stränge der DNA-Doppelhelix beschädigt sind. Es gibt verschiedene Faktoren, die die Menge an DNA-Brüche zu einem gegebenen Zeitpunkt wie das Alter der Zelle, Zigarettenrauch, verschiedene Medikamente oder oxidativen Stress 7-9 erhöhen kann. Wenn alle Faktoren, die zu einer verbesserten DNA-Brüche konstant gehalten werden, dann wird die Quantifizierung von DNA-Brüchen mittels Comet-Assay ist eine gute indirekte Parameter des oxidativen Stresses.

Das Verfahren zur Comet-Assay wird heute zunehmend in der Medizin einschließlich der Augenheilkunde eingesetzt. Ein Grund dafür ist, dass oxidativer Stress mehr als Pathomechanismus für verschiedene Krankheiten, 8-11 und Comet-Assay erfasst ist eine Methode, mit der oxidativen Stress indirekt quantifiziert werden kann.

Protocol

Studien über Comet-Assay in der Universität Basel durchgeführt, Augenklinik wurden von der lokalen Ethikkommission genehmigt Basel

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Vorbereitung Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (Ca ++, Mg ++ frei) Lösung durch Zugabe von PBS (1 L-Paket) und 990 ml dH 2 O zu den Medien. Den pH-Wert auf 7,4. Lagern bei RT.
  2. Bereiten Lyselösung: So bereiten 1.000 ml hinzuzufügen 2,5 M NaCl (146,1 g), 100 mM EDTA (37,2 g) und 10 mM Trizma Base (1,2 g) in dH 2 O
  3. Vorbereitung Elektrophoresepuffer (300 mM NaOH / 1 mM EDTA) durch Zugabe von 30 ml 10 M NaOH und 7,5 ml 0,2 M EDTA, qs bis 1.500 ml dH 2 O und gut mischen. Das Gesamtvolumen hängt von der Gelbox Kapazität. Vor der Verwendung wird Den pH des Puffers auf einen pH-Wert von> 13 zu gewährleisten.
  4. Vorbereitung Neutralisierungspuffer, enthaltend 0,4 M Tris (48,5 g zugegeben, um ~ 800 ml dH 2 O, Einstellen des pH auf 7,5), eingeengt (& #62; 10 M HCl) in 1.000 ml mit dH 2 O Bewahren Sie die Lösung bei RT.
  5. Bereiten Färbelösung. Um Ethidiumbromid (EtBr; 10x Lager, 20 ug / ml) in 10 mg EtBr in 50 ml dH 2 O und Speicher bei RT. Für 1x Lager - mischen 1 ml mit 9 ml dH 2 O VORSICHTIG! Griff EtBr mit ausreichender Vorsicht, da es ein bekanntes Karzinogen.

2. Isolierung von Leukozyten

  1. Erhalten Humanblutproben (20 ml) mit Anti-Koagulationsmittel, wie Heparin mittels Venenpunktion.
  2. Trennen Sie die Lymphozyten mit einem Dichtegradienten Zellseparator wie Histopaque.
    1. Kurz, verdünnte Blut in Verhältnis 1: 1 mit PBS oder RPMI (ohne FBS) und die Schicht mehr als 600 & mgr; l Zelltrennflüssigkeit.
    2. Zentrifuge 1.800 xg für 20 min bei 4 ° C. Saugen Sie das 'Buffy' Mantel in 3-5 ml PBS / RPMI und bei 300 g für 10 min zentrifugiert, um die Lymphozyten zu pelletieren.
    3. Abrufen Lymphozyten von knapp über Grenze zwischen PBS (RPMI) Und Zelltrennflüssigkeit, mit einem Pipette. Entfernen Sie die Leukozyten-Bands aus der Schnittstelle zwischen Plasma und den Zellseparator Flüssigkeitsschichten von jedem Röhrchen sammeln und in einen 50-ml-Tube.
  3. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 50 ml mit kaltem Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM). Dreimal mit DMEM Waschen der Zellsuspension bei 300 × g für 10 min.
  4. Zählen der Gesamtzahl von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Die Zellen in PBS und Aliquot in Mikrozentrifugenröhrchen auf 10 7 Zellen / Röhrchen.
  5. Pipette 0,4 ml der Zellen in einem 5 ml-Einweg-Kunststoffrohr. In 1,2 ml 1% niedriger Temperaturen gelierender Agarose bei 40 ° C. Mischen und schnell und pipettieren 1,2 ml der Zellsuspension auf das Agarose-bedeckten Oberfläche einer vorbeschichteten Folie. Vermeiden Sie Blasen entstehen.
  6. Ermöglichen die Agarose ca. 2 min gelieren. Im Einklang mit der Zeit und Temperatur zum Gelieren verwendet, und sicherzustellen, dass Agarose vollständig vor Eintauchen in Lyse-Lösung eingestellt. Nach voll set, tauchen in Lyse-Lösung bei ca. 4 ° C.

3. Lysis und Elektrophorese

HINWEIS: Die beschriebene Vorgehensweise ist für die Elektrophorese unter pH> 13 alkalischen Bedingungen.

  1. Nach mindestens 2 Stunden bei ca. 4 ° C, entfernen Sie vorsichtig Folien aus der Lyselösung. Die Objektträger nebeneinander auf der horizontalen Elektrophoresekammer nahe einem Ende, verschiebbar sie so nahe wie möglich beieinander.
  2. Füllen Sie die Pufferbehälter mit frisch zubereiteten pH> 13 Elektrophoresepuffer, bis der Flüssigkeitspegel die Folien vollständig (zu vermeiden, Blasen über die Agarose) abdeckt.
  3. Lassen Folien sitzen im alkalischen Puffer für 20 min bis zum Abwickeln der DNA und die Expression von alkalilabilen Schäden.
  4. Stromversorgung einschalten, um 25 Volt (~ 0,75 V / cm), und stellen Sie den Strom auf 300 mA durch Anheben oder Absenken der Pufferstufe. Elektrophorese der Objektträger für 30 Minuten.
  5. Schalten Sie das Gerät. Heben Sie die Folien aus dem Puffer und pSpitze auf einem Auffangwanne. Tropfenweise Beschichtung der Folien mit Neutralisationspuffer. Lassen Sie die Objektträger für mindestens 5 min zu sitzen. Ablassen Rutschen und zwei weitere Male wiederholen.
  6. Färben die Objektträger mit 80 ul 1x Ethidiumbromid (EtBr) und lassen Sie für 5 Minuten und dann tauchen in gekühltes destilliertes Wasser, um überschüssige Fleck zu entfernen. Dann legen Sie ein Deckglas über den Objektträger und sofort speichern. Shop gleitet für einen Monat bei Raumtemperatur in trockener Umgebung.
    Hinweis: andere DNA Flecken (zB SYBR-Grün), können ebenfalls verwendet werden. Achtung! Schutzhandschuhe tragen, da die meisten Farbstoffe sind mutagen.

4. Quantifizierung der DNA-Brüche

  1. Um die DNA-Schäden zu visualisieren, beobachten die EtBr-gefärbten DNA Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop 40X-Objektiv.
  2. DNA-Schädigung zu beurteilen quantitativ in den Zellen durch Messen der Länge der DNA-Migration und der Prozentsatz der migrierten DNA (1A). DNA-Schäden zu quantifizieren (1B) von der Schwanz Moment und Olive-moment. Definitionen von Schwanz-Moment und Olive -Moment eine effektvolle wurden bislang 8-10 gegeben.
    HINWEIS: Nach unserer Erfahrung ist es genug, um von einer der Parameter bleiben. Die Zellen werden durch Setzen des automatisiertes Tool, das über dem Objektträger und Fotografien Zellen scannt fotografiert. Die Quantifizierung der DNA-Brüche können durch Bildanalyse-Software-Pakete durchgeführt werden. Es gibt mehrere verschiedene Softwarepakete, die nach Maß sind, um das Bild der Zellen zu erfassen und zu quantifizieren, DNA-Schäden. Wir empfehlen, mit der gleichen Software-Paket während des Experiments. Die Labor-Techniker identifiziert der intakten Zelle oder Kometen auf dem Computer erzielt werden, und klickt mit der Maus auf sie. Der Komet oder intakte Zelle wird dann automatisch erzielt.

Representative Results

Obwohl das Verfahren der Comet-Assay macht reproduzierbare Ergebnisse, kann es durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst werden. Ein solcher Faktor ist, ob die Leukozyten vor der Lyse und Gelelektrophorese oder ob dieser Schritt auf frisch hergestellten Leukozyten geführt kryokonserviert. 2 zeigt, dass in der Gruppe 2, wobei Leukozyten wurden vor der Lyse und Gelelektrophorese ss- DNA kryokonserviert Pausen waren signifikant höher als in Gruppe 1, wo die Lyse und Gel -electrophoresis wurde auf frisch zubereitete Zellen durchgeführt.

Der Assay kann auch verwendet werden, um indirekt zu beurteilen systemischen oxidativen Stress. Tabelle 1 zeigt die deskriptiven Statistiken für Schwanz Moment und Oliven Moment bei Rauchern und gesunden Probanden. Die Daten zeigen, dass das Rauchen eine halbe Packung Zigaretten täglich mehr als verdoppelt ssDNA Brüche in den zirkulierenden Leukozyten 9.

1A

1B
Abbildung 1 (a) zeigt das Mikroskop während der Comet-Assay-Analyse verwendet. (B) Δ zeigt eine typische "Komet" mit einem hellen Kopf und Schwanz (beschädigt kleiner DNA-Fragmente). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. ssDNA Pausen waren signifikant höher als Leukozyten wurden (Gruppe 2) kryokonserviert als frisch hergestellt Leukozyten wurden vor der Lyse und Gelelektrophorese verwendet.

Tabelle 1. Raucher hatten mehr als die doppelte Anzahl von ssDNA bricht im Vergleich zu Alter und Geschlecht gesunden Nichtrauchern.

Discussion

Schwedische Wissenschaftler Ostling und Johanson als erste in ihrem Bereich zu Comet-Assay verwenden, um DNA-Schäden in Zellen 1 zu quantifizieren. Die neutralen Bedingungen, dass die beiden Wissenschaftler nutzten jedoch nur erlaubt den Nachweis von doppelsträngigen DNA-Brüche. Singh et al. Später angepasst den Test für den Einsatz unter alkalischen Bedingungen, die eine empfindliche Version, die Doppel- und Einzelstrang-DNA-Brüche zu bewerten und erkennen alkalilabile Websites 12 könnte hergestellt. Seit der ersten Entwicklung hat der Assay bei verschiedenen Schritten verändert wurde, um für die Bewertung Arten von DNA-Schädigung in verschiedenen Zelltypen 13-15 geeignet zu machen.

Wie bei allen Techniken ist wichtig, zahlen viel Liebe zum technischen Details, um genaue Ergebnisse zu erhalten 16. Basierend auf unserer Erfahrung, die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn jeder Verfahrensschritt-Lösung von der Vorbereitung bis zur Kometen-Quantifizierung von Experten Labor techn geführticians. Die Verwendung von frischen und richtig vorbereitet Medien, angemessene Pipettiertechniken, exaktes Timing und (wie zuvor im Ergebnisteil erwähnt) die Verwendung von frisch zubereiteten Leukozyten sind von wesentlicher Bedeutung, um für die Lyse und Gelelektrophorese, um genaue Ergebnisse zu erhalten 17.

All die einzelnen Schritte in diesem Test sind für den Erhalt zuverlässige Ergebnisse ebenso wichtig. 16 In der Regel die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn jeder einzelne Verfahrensschritt aus der Lösung Vorbereitung bis Kometen Quantifizierung wird von Experten Labor technicians.Important geführt scheint die Verwendung von frischen und richtig vorbereitet Medien , angemessene Pipettiertechniken, exaktes Timing und wie bereits im Ergebnisteil der Einsatz von frisch zubereiteten Leukozyten für die Lyse und Gelelektrophorese, angemessene Ergebnisse aus dem Test 17 ​​zu erhalten bezeichnet.

Wie andere Methoden, hat die Comet-Assay-Technik seine ADVANteile und Nachteile. Als eine empfindliche Methode ist der Test anfällig für Faktoren (zB UV-Licht), die DNA-Brüche ergänzen und beeinflussen so Ergebnisse könnten. Jeder Faktor, erhöhen kann oxidativer Stress, außer der, die erforscht wird, sollte vermieden werden. Stressoren können Niveau von oxidativem Stress nicht nur in Leukozyten, sondern auch in allen anderen Blut Medien und Lymphozyten zu erhöhen. Wie bereits erwähnt gibt es viele verschiedene und direktere Methoden zur Messung der oxidativen Stress 18,19. Comet-Assay ist einer der vielen Methoden, die bestimmte Vorteile hat. Dazu gehören ihre relativ geringen Kosten, der geringen Anzahl von Zellen erforderlich ist (<10.000 Zellen) und damit die kleine Proben von Blut pro Patient benötigt, die relativ kurze Zeitdauer erforderlich ist, um DNA-Schäden in Zellen (etwa 3 Tage) zu quantifizieren, dessen Empfindlichkeit und seine weit verbreitete Anwendbarkeit auf Eseln DNA-Schäden in verschiedenen Zelltypen. In der Vergangenheit wählen wir mit Leukozyten zu arbeiten, da wir hatten Erfahrung mit diesemZelltyp und es war zutreffend für den jeweiligen geplanten Studie. Ein weiterer Vorteil der Comet-Assay ist, dass es verwendet werden kann, um verschiedene Arten und Mengen an DNA-Schäden zu erkennen und kann somit in verschiedenen anderen Bereichen des Studiums neben oxidativen Stress, wie DNA-Reparatur Studien Supplementierung Versuche oder Genotoxizität Studien angewendet werden.

Oxidativer Stress gilt heute als spielen eine kritische Rolle bei der Pathogenese mehrerer Krankheiten erkannt. Comet-Assay-Methode, wobei eine von vielen Möglichkeiten der Messung von oxidativem Stress 18,19, ist relativ einfach, vielseitig und kostengünstig. Wenn beherrscht, kann dieses Verfahren in allen Bereichen der Medizin, bei denen oxidativer Stress eine Rolle spielt 8-10,20,21 verwendet werden.

Disclosures

Keine.

Acknowledgments

Wir möchten die LHW Stiftung zu danken, in Triesen Liechtenstein, für die finanzielle Unterstützung unserer Forschung auf oxidativen Stress.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethylsulfoxide (DMSO) Qualigens (CPW59)
Disodium EDTA HiMedia (RM1370)
Ethidium Bromide Sigma (E-8751)
Histopaque Sigma (1077-1)
Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) HiMedia (TS1006)
Sodium Chloride (NaCl) Ranbaxy Rankem (S0160)
Sodium Hydroxide (NaOH) BDH-Merck (89021)
Triton X-100 HiMedia (RM 845)
Trizma Base Spectrochem
Materials required for gel electrophoresis
Normal Melting Agarose (NMA) HiMedia (RM273)
Low Melting Point Agarose (LMPA) Sigma (A9414)
Methanol - Qualigens
Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) Blue Star
Microcentrifuge Tubes Tarsons (500010)
Micropipettor and Tips Tarsons
Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides

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References

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