جيل والتحليل الكمي من نابض التردد المنخفض الموجات فوق الصوتية لتحديد سونيك حساسية غير المعالجة أو المعالجة الخلايا السرطانية

1Department of Biology, Syracuse University
Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trendowski, M., Christen, T. D., Zoino, J. N., Acquafondata, C., Fondy, T. P. Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells. J. Vis. Exp. (101), e53060, doi:10.3791/53060 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

الموجات فوق الصوتية يشير إلى أي موجة ضغط الصوت تتأرجح مع تردد أكبر من الحد الأعلى من القدرات السمعية الإنسان (~ 20 كيلو هرتز) 1. وقد استخدمت الموجات فوق الصوتية المنخفضة التردد في نطاق 20-60 كيلو هرتز في المختبر كوسيلة لتوليد المستحلبات، وإعداد العينات الخلوية لاستخراج الحمض النووي، لتعطيل الأنسجة، ومجموعة متنوعة من الاختبارات الأخرى. كما تم تمديد فائدة منخفضة التردد الموجات فوق الصوتية إلى الإعداد الصناعي لحام، مواد التنظيف المختلفة، وتجهيز المواد. تجاريا مولدات الموجات فوق الصوتية المتاحة تأتي في ترددات تتراوح 18-60 كيلو هرتز، وعلى نطاق واسع wattages من 100-1،200 W.

على الرغم من أن الموجات فوق الصوتية طالما استخدمت في إعداد سريرية للتصوير التشخيصي، وقد تم تطبيقه كطريقة علاجية إلا في الآونة الأخيرة. الموجات فوق الصوتية ≥1 ميغاهيرتز قادر على تعطيل بأمان الحصيات البولية (حصى الكلى) وحصيات صفراوية (الحجارة في الالبريد المرارة أو في الكبد) في المرضى الذين للحد من أعراض 2،3. الآن تطبيق هذا النهج المعروف خارج الجسم وحدثت الهزة الارضية تفتيت الحصوات (ESWL) على نطاق واسع في العيادة (يتم التعامل مع أكثر من مليون مريض سنويا مع ESWL في الولايات المتحدة وحدها 4)، ويقدم طريقة يمكن من خلالها غير جراحية تفريق حسابات التفاضل والتكامل مع الحد الأدنى من الأضرار الجانبية من خلال استخدام تطبيقها خارجيا، وركزت، كثافة عالية النبضات الصوتية 2-4.

نظرا لقوات فريدة من نوعها مباشرة القص، وكذلك فقاعات التجويف الناتجة عن ارتفاع كثافة الموجات فوق الصوتية، وقد تم فحص هذه المنهجيات في علاج السرطان لعلاج مقاومة للسرطان البروستاتا والخصي غدية البنكرياس في نهج المعروفة باسم الموجات فوق الصوتية عالية الكثافة مركزة (HIFU ) 5-8. بطريقة مشابهة جدا لESWL، يستخدم HIFU أشعة الموجات فوق الصوتية المتعددة ويركز عليها في مجال التركيز المحدد إلى توليد درجات الحرارة من 60 درجة مئوية أو المهزومةلها من خلال استخدام الطاقة الصوتية، الأمر الذي أدى نخر التجلط في الأنسجة المستهدفة 5. على الرغم من أن طرائق أخرى الاجتثاث الحرارية موجودة حاليا (الاجتثاث الترددات الراديوية والاجتثاث الميكروويف)، HIFU يوفر ميزة واضحة على هذه الطرق من حيث أنه هو طريقة حموي غير الغازية الوحيدة 5. HIFU حققت نتائج متباينة في العيادة وهي الوحيدة المتاحة حاليا في التجارب السريرية 11/08. ومع ذلك، فإن النجاح المحدود الذي حققته، واعدة جدا في البيانات الجسم الحي تم الحصول عليها من نماذج الثدييات قبل السريرية أثبتت إمكانية الموجات فوق الصوتية في علاج السرطان.

في محاولة لتحسين HIFU، وقد حاول الباحثون في الجمع بين الموجات فوق الصوتية مع مضادات الأورام المناسب لإنشاء نموذج من sonochemotherapy. العلاج Sonodynamic (المعاملة الخاصة والتفضيلية) هو طريقة العلاج الجديدة الواعدة التي أثبتت النشاط الأورام مثير للإعجاب في كل من في المختبر، و 1. وقد تبين أن الموجات فوق الصوتية بشكل تفضيلي يدمر الخلايا الخبيثة على أساس الفرق بين حجم هذه الخلايا وتلك الأنسجة العادية 1،5. المعاملة الخاصة والتفضيلية تضم وكلاء المتخصصة المعروفة باسم sonosensitizers لزيادة مدى الضرر تفضيلية بواسطة الموجات فوق الصوتية تمارس ضد الخلايا الورمية. بينما التطبيقات العلاجية المعاملة الخاصة والتفضيلية درست سابقا، وأنظمة الموجات فوق الصوتية التي تستخدم عادة تستخدم الموجات فوق الصوتية العالي التردد (≥1 ميغاهيرتز)، والآثار المترتبة على انخفاض كيلوهرتز تردد الموجات فوق الصوتية لم يتم بعد استكشافها بشكل كامل. ترددات أقل من الموجات فوق الصوتية غالبا ما تكون أكثر كفاءة في إنتاج التجويف بالقصور الذاتي، وهي الظاهرة التي تؤدي إلى تدمير الخلايا بسبب المنهارة السريع لmicrobubbles، الأمر الذي أدى الأضرار الفيزيائية 12-14. ويعزى هذا الاختلاف في توليد التجويف بالقصور الذاتي بين ميغاهيرتز وانخفاض كيلو هرتز الموجات فوق الصوتية إلى حقيقة أن انخفاض ترددات موجة تمكن microbubbleق مزيد من الوقت لينمو بنسبة انتشار تصحيحه في دورة نصف التوسع، وبالتالي إنتاج انهيار أكثر عنفا خلال النصف دورة ضغط التالية 12.

لقد أظهرنا سابقا أن U937 خلايا سرطان الدم الوحيدات الإنسان حساسة لانخفاض الموجات فوق الصوتية تردد (23.5 كيلو هرتز)، وأن هذه الحساسية ويمكن زيادة بشكل ملحوظ من خلال تطبيق مضادات الأورام التي التشويش على الهيكل الخلوي 15. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن الخلايا التالفة تفضيلي على أساس الحجم، مع الخلايا الكبيرة واظهار حساسية أعلى بالموجات فوق الصوتية. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا الطبيعية البشرية المكونة للدم الجذعية (hHSCs) والكريات البيض في أحجام خلية قابلة للمقارنة هي أكثر مقاومة للصوتنة من نظرائهم الورمية 15، مما يشير مبدئيا أن المنخفض الموجات فوق الصوتية تردد يمكن أن تستخدم لتدمير الخلايا الخبيثة بشكل تفضيلي في وجود الأنسجة الطبيعية.

لمواصلة دراسة دعامة فريدة من نوعهاerties المنخفض الموجات فوق الصوتية تردد للاستخدام العلاجي محتمل، وقد طورنا إجراءات التنظيف والاستقرار لزيادة الفعالية والموثوقية واحد من أنظمة صوتنة الحالية لدينا، وبرانسون نموذج SLPe 150 W، 40 كيلو هرتز ديسروبتر الخلية، مجهزة 20 ملم القرن تركيبها الى 7.62 سم ​​الكأس. بالإضافة إلى ذلك، كنا قادرين على تحديد دقيق الطاقات عينة التجويف، وكذلك الطول الموجي متسقة والسعة ضمن نطاق 40 كيلو هرتز باستخدام متر التجويف والذبذبات مع مائي. بواسطة التكرير وتنظيم بروتوكولات لدينا، وكنا قادرين على تحقيق الاتساق في sonications التجريبية لدينا، مما يسمح لنا مقارنة كميا الحساسيات الصوتية الخلايا الورمية وطبيعية الأنساب مكون للأنسجة المختلفة. وتقدم لدينا بروتوكول لنظام 40 كيلو هرتز في التفاصيل واسعة من أجل المختبرات المهتمة لتكون قادرة على إجراء التجارب المقارنة، وتقييم النتائج التي توصلنا إليها من الآثار التي تسببها موانع الأوراممنخفض فوق الصوتية تردد. بالإضافة إلى ذلك، ندرس الجرعة الآثار تعتمد من ميثيل β-سيكلودكسترين (MeβCD؛ الشكل 1)، وكيل المستنفدة الكوليسترول في الدم، على زيادة حساسية بالموجات فوق الصوتية من U937 وTHP1 خلايا سرطان الدم الوحيدات الإنسان.

Protocol

1. تنظيف نظام خلية Sonifier

  1. تنظيف اتحاد بين القرن وتحويل استخدام الكلوروفورم ومسحة القطن. تطبيق النفط الخفيف أو الزيت المعدني إلى المواضيع من القرن وتحويل لمواصلة إزالة تراكم نجارة معدنية والصدأ، أو الأكسدة.
  2. استخدام الكلوروفورم لإزالة النفط وأي ملوثات أخرى من النقابة بعد محو المواضيع مع النفط.

2. اعادة تشكيل Sonifier خلية وإعداد النظام

  1. أعد النفير إلى تحويل. لعزم الدوران بشكل صحيح النظام، قم بإزالة تحويل تجميعها وقرن من التجمع الكأس عن طريق سحب قرن من الجزء السفلي من الكوب (الشكل 2A). وضع فتحة وجع داخل واحدة من ثلاثة ثقوب صغيرة بالقرب من الجزء العلوي من تحويل (الشكل 2B). ثم، ضع على وجع عزم الدوران مزودة القدم بوصة الغراب ½ على الجزء فترة زمنية محددة من القرن (الشكل 2B). تشديد في الصورةtandard اتجاه عقارب الساعة حتى متر من عزم الدوران يقرأ 54.23 N. م (الشكل 2C)، وعزم الدوران الموصى بها من قبل الشركة المصنعة 16. تناسب تحويل شددت والقرن مرة أخرى في الكأس، وجبل القرن وتحويل إلى موقف حلقة في وضع مستقيم. أعد تحويل إلى التيار الكهربائي قبل وضع نظام لالتجريبية نبض الجرعات.
  2. ضبط نظام لجرعات النبض باستخدام 1 ثانية من صوتنة مع 1 ثانية بين البقول. ويمكن استخدام نماذج جرعات مختلفة لظروف تجريبية أخرى. فإن العديد من المتغيرات، مثل حجم المياه وقطرها القرن يحتمل تتطلب تغييرات على هذه الجرعات. باستخدام أنواع المذكورة أعلاه عينة الخلية، وحجم، والتركيز، وأدت البيانات التجريبية والمراقبة في صياغة هذا النظام الجرعات.
  3. ضبط النظام إلى السعة المطلوبة. في هذا البروتوكول، استخدم 33٪ و 50٪ السعة لمنع تدمير الخلايا الكامل، والذي من شأنه أن يجعل فعالية sonosensitizers صعبة أو مستحيلة لقياس.
    ملاحظة: في هذه الدراسة المقارنة بين سعة.

3. تقييم شدة النظام وظيفة

  1. عقد متر التجويف في 1.5 سم، وهو مستوى العينة صوتنة. ملاحظة القراءات لتقييم أن النظام يعمل على كثافة المتوقعة. باستخدام مستويات النظام والمياه الجارية، ونتوقع بين 100-110 W / سم 2 لمدة 33٪ السعة و115-125 W / سم 2 لمدة 50٪ السعة. لاحظ التجويف قراءات العدادات من عرض متر والتي تمثل الطاقة التجويف في W / سم 2 مباشرة. تأخذ هذه القراءات على سطح الماء، وضمان عدم وجود فقاعات موجودة في وجهه لجنة التحقيق متر.
    ملاحظة: من المهم أن نلاحظ أن هذه الإجراءات تتم دون غطاء للوصول إلى أعلى قرن. ليس من الضروري أن تكرارها بعد كل صوتنة. بدلا من ذلك، ينبغي القيام بها إلا بعد التنظيف، واعادة، ووضع النظام. وضع مائي في قارورة العينة تحتوي على 12.5 مل من الماء من أجل أن تزج تماما استشعار مائي. تعليق مائي باستخدام موقف حلقة.
  2. إرفاق مائي لمدخلات الذبذبات من أجل تقييم الخصائص الموجي. دراسة الذبذبات لموجة جيبية واضحة، والموجات الشاذة يمكن أن يغير تردد النظام من مواصفات الشركة المصنعة. كل من متر التجويف والذبذبات تعطي القراءة تردد، ولكن فقط الذبذبات سوف تظهر موجات الشاذة التي تدل على نظام خلل أو التجمع غير لائق.

4. إعداد خلايا والمتوسطة

  1. إعداد المتوسطة باستخدام 240 مل Iscove في التعديل Dubecco والمتوسطة (IMDM) و 50 مل مصل بقري جنيني. لا ذوبان الجليد مصل بقري جنيني في حمام الماء الساخن، والزيادة السريعة في درجات الحرارة يمكن أن يؤدي إلى حل وسط في الاستقرار في الدم. الجمع بين 240 ميكرولتر الجنتاميسين 50 ملغ / مل و 5 مل البنسلين/ الستربتومايسين 100X في قارورة الثقافة القياسية، وإضافة إلى المتوسطة. تخزين المتوسطة في 4 ° C.
  2. الخلايا U937 البذور في ~ 4 × 10 4 خلية / مل في 25 سم 2 قارورة باستخدام المتوسطة استعداد. تقييم الخلايا للتركيز والجدوى باستخدام عداد الخلية TC20 والتريبان الأزرق الاستبعاد عن طريق وضع 15-20 ميكرولتر من الخلايا و15-20 ميكرولتر التريبان الأزرق في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة وخلط محتويات. ميكرولتر Pipette15-20 من هذا الخليط في شريحة أخذ العينات TC20، وبدء العد عن طريق وضع شريحة في مكافحة الخلايا TC20.
  3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO وتحقق لبقاء الخلية باستخدام الأزرق الاستبعاد التريبان والعداد الخلية TC20. عندما الخلايا هي في التركيز المناسب و / أو تم التعامل مع sonosensitizers لإطار زمني مناسب، ونقل 3 مل من الخلايا من قارورة الثقافة إلى 20 مل الزجاج التلألؤ القارورة. في هذا البروتوكول، وتنمو الخلايا U937 لمدة 48 ساعة، ثم علاج مع 0.5، 1،أو 5 ملم MeβCD لمدة 30 دقيقة في استنزاف بما فيه الكفاية الكوليسترول من الخلايا قبل صوتنة.

5. خلية صوتنة

  1. ديغا منزوع الأيونات، الماء المقطر باستخدام فراغ وبوخنر القارورة. نقل المياه إلى القرن الكأس، وملء لتصل إلى مستوى 15 مم فوق الجزء العلوي من قرن. تسبب عملية صوتنة مزيد من التفريغ من الماء لمدة بضع دقائق، ويمكن أن تؤدي إلى تناقضات على مدى التجربة إذا لم يتم تشغيل النظام السابق لأخذ عينات صوتنة. ولذلك، تشغيل نظام ل~ 7 دقيقة قبل عينة صوتنة.
  2. نعلق قارورة التلألؤ الذي يحتوي على الخلايا إلى عقد الجهاز. ثم، ونعلق الجهاز القابضة إلى الجزء العلوي من القرن الكأس وتعيينها إلى الارتفاع من 15 مم من الجزء العلوي من قرن (على سطح المياه باستخدام آلية انزلاق).
  3. وعادة ما يتم sonicated الخلايا باستخدام ثلاثة 1 البقول ثانية من الموجات فوق الصوتية، مع تباعد 1 ثانية بين كل من هذه النبضات. لهذابروتوكول، خلايا يصوتن في 33٪ و 50٪ السعة باستخدام النبض الجرعات المذكورة أعلاه.

6. تقييم الخلايا عن الأضرار بعد صوتنة

  1. تقييم الخلايا مع وقف التنفيذ لأضرار والجدوى باستخدام التريبان الأزرق والعداد الخلية TC20. وبالإضافة إلى ذلك، وتحليل عينة باستخدام عداد Z2. لZ2 تحليل مضادة، ماصة تعليق خلية 100 ميكرولتر في 20 مل المالحة متساوي التوتر (200: 1 نسبة). قبل التحليل، تدفق الفتحة من الجسيمات محلل Z2 مرتين على الأقل باستخدام المياه المالحة متساوي التوتر. ضع عينة Z2 في حامل مضادة، ورفع النظام الأساسي إلى الفتحة قبل الشروع في التهم الموجهة إليه.
  2. الحصول على البيانات من عدادات TC20 وZ2 باستخدام البرامج المقدمة من قبل الشركة المصنعة. تحليل هذه البيانات لتلف الخلايا، والسلامة، وإنشاء الحطام الخلوي من صوتنة.

7. XTT الفحص لتحديد بقاء الخلية والميتوكوندريا آخر من U937 المعالجة وTHP1 الخلايا

  1. PRIOr لفحوصات XTT، وتنمو U937 وTHP1 الخلايا تحت نفس الظروف. يمهد للمعالجة الخلايا مع مجموعة تركيز نفسه من MeβCD لمدة 30 دقيقة قبل صوتنة. استخدام المعلمات الموجات فوق الصوتية نفسها كما كانت من قبل إلا أن الخلايا sonicated الآن باستخدام مجموعة من 3/1 واحدة البقول ثانية واحدة ثانية متباعدة عن بعضها البعض للتطوير مجموعة من الضرر لعدة XTT لتقييم.
    ملاحظة: يتم اتخاذ العديد من الخطوات مباشرة من دليل عدة XTT وتتكرر فقط للراحة المختبرات المهتمة.
  2. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة. بيليه الخلية resuspend في وسط النمو الموصوفة سابقا. Resuspend الخلايا في ~ 1 × 10 5 خلية / مل. الخلايا U937 البذور على 100 ميكرولتر لكل بئر في وحة microtiter 96-جيدا مسطحة القاع في ثلاث نسخ، ثم تتكرر لTHP1 الخلايا باستخدام لوحة 96-جيدا منفصلة. وتشمل 3 آبار المراقبة التي تحتوي على 100 ميكرولتر من متوسط ​​النمو الكامل وحده كما قراءات الامتصاصية فارغة. ثم، واحتضان لوحات الملقحة ل24 ساعة.
  3. تذويب اثنين aliquots من كاشف XTT وكاشف تفعيل عند 37 درجة مئوية قبل استخدامها. قسامات دوامة بلطف حتى يتم الحصول على حلول واضحة. إضافة 0.1 مل من كاشف تنشيط إلى 5.0 مل من كاشف XTT، والذي يشكل ما يكفي من حل XTT تفعيلها للواحد 96-جيدا وحة microtiter فحص. تكرار هذه العملية لوحة أخرى.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من محلول تنشيط XTT إلى كل بئر. العودة إلى لوحة خلية ثقافة CO 2 الحاضنة لمدة 2 ساعة. يهز لوحة بعد فترة الحضانة لتوزيعها بالتساوي على اللون البرتقالي في الآبار إيجابية بلطف. قياس الامتصاصية من آبار فحص تحتوي على خلايا وآبار المراقبة الخلفية فارغة في الطول الموجي بين 450-500 نانومتر الطول الموجي باستخدام قارئ وحة microtiter.
  5. إما الصفر القارئ وحة microtiter باستخدام آبار المراقبة فارغة أو طرح متوسط ​​قيمتها من نتائج محددة. قياس الامتصاصية من جميع الآبار الفحص مرة أخرى في wavelengعشر بين 630-690 نانومتر، وطرح قيم من قيم نانومتر 450-500 الحصول عليها. ملاحظة: هذا تقرير الامتصاصية الثاني يساعد في القضاء على قراءات غير محددة من نتائج الفحص. وتكرر الفحص XTT أربع مرات لكل من خطوط الخلايا.

Representative Results

استقرار النظام هو الهدف الأسمى في الحصول على نتائج قابلة للتكرار وموثوق بها. مواصفات عزم الدوران المناسبة من 54.23 N. م حققت اقتران الصحيح للمحول وsonotrode مع اتساق الموجي التي يجري تقييمها من خلال استخدام الذبذبات ومائي (الشكل 3A). الشكل 3B يصور القياسات داخل عينة قارورة، و الرقم 3C يقيم الاستقرار داخل قرن الكأس. كما هو متوقع، تم تخفيض السعة قليلا بسبب بعض الطاقة التي تمتصها الزجاج. ومع ذلك، لم يستسلم الموجي أو مشوهة في أي لوحة B أو C، وهو أمر ضروري لتسليم موثوق بها من الطاقة الصوتية للعينة. A الموجي التي لا تبدو وكأنها موجة جيبية المفرد واضحة إلى وجود محول خلل أو الإعداد غير لائق. هذا ما يعبر عنه في شكل 3D مما يدل على الموجات الشاذة متعددة، وغياب واضح للموجة جيبية، وتردد قراءة أير المتوقع مع النظام يعمل بشكل صحيح. متر التجويف يستخدم لقياس الطاقة المتولدة التجويف (الشكل 4) وجد شدة الصوت لتكون 100-110 W / سم 2 عند 33٪ السعة، و125-130 W / سم 2 عند 50٪ السعة.

مرة واحدة تم معايرة نظام 40 كيلو هرتز مناسب وتجميعها في مجملها (الشكل 5)، وقد حققت تدمير الخلايا يمكن الاعتماد عليها بسهولة، على النحو الذي يحدده كل من TC20 وZ2 عدادات (الشكل 6). كما هو متوقع، وقد لوحظ تلف الخلايا أكثر اتساعا في السكان الخلية sonicated بنسبة 50٪ بدلا من 33٪ في السعة. ومع ذلك، 33٪ السعة مفيدة كنقطة انطلاق للكشف عن الآثار الصوتية توعية المحتملة وكلاء يديرها، كما أنها تنتج أضرار ملحوظة، ولكن يترك مجالا لمزيد من الضرر ليتم الكشف عن عندما يتم تطبيق وكلاء لتقييم التقوية حساسيتها بالموجات فوق الصوتية. ويتجلى هذا في الشكل 7A، حيثيتم تقديم جرعة الآثار تعتمد من MeβCD على بالتالي يؤدي إلى حساسية بالموجات فوق الصوتية للخلايا U937. على الرغم من غير sonicated خلايا MeβCD المعاملة كانت متشابهة جدا في البقاء على الخلايا غير sonicated، غير المعالجة، والجدوى انخفض بشكل ملحوظ بعد ثلاثة نبضات من 1 ثانية 40 كيلو هرتز الموجات فوق الصوتية وتطبيقها. وبالإضافة إلى ذلك، يظهر انخفاضا في جدوى بعد صوتنة أنه قد تم الجرعة تعتمد، كما أنتجت 5 ملي MeβCD أكبر انخفاض في عدد خلايا، تليها 1 ملم، ومن ثم 0.5 ملي MeβCD.

وقد لوحظت آثار مماثلة على بقاء الخلية والنشاط الميتوكوندريا في كل U937 وTHP1 الخلايا التي كانت تعامل مع تركيزات مختلفة من MeβCD قبل صوتنة، وفقا لتقييم مع عدة XTT (7B الشكل). على الرغم من أن THP1 خلايا يبدو أن قليلا من مقاومة الخلايا U937 أكثر الصوتية، وتلف أي من الخطين اللوكيميا الإنسان بطريقة تعتمد على الجرعة. تركيزات أعلى من MeβCD والمزيد من نبضات من الموجات فوق الصوتية همزuced أدنى الحد من XTT إلى مشتق القابلة للذوبان، ذات الألوان الزاهية البرتقال لكلا U937 وTHP1 الخلايا، المقابلة لخفض بقاء الخلية والنشاط الميتوكوندريا.

الشكل 1
الشكل 1. التركيب الجزيئي للميثيل β-سيكلودكسترين. (A) بنية كاملة من ميثيل β-سيكلودكسترين (MeβCD). (B) MeβCD هو بوليمر من سبع وحدات تكرار مع مجموعة R إما H أو CH 3. الصيغة الجزيئية: C 56 H 98 O 35. الوزن الجزيئي = 1331.36.

الرقم 2
الشكل 2. صحيح torqueing نظام الموجات فوق الصوتية 40 كيلو هرتز. (A) تتم إزالة قرن والمحول من الحزب الثوري المؤسسي الكأسأو لtorqueing. (B) ضع وجع فتحة وعزم الدوران وجع في مواقفها. (C) تطبيق 54.23 N. م من عزم الدوران في اتجاه عقارب الساعة قبل اعادة ربط البوق والمحول إلى الكأس.

الشكل (3)
الرقم 3. استخدام الذبذبات لتوصيف الموجي للنظام الموجات فوق الصوتية. (A) الذبذبات مع مائي يمكن استخدامها لتقييم الاتساق السعة والموجي. (B) A تسجيل تؤخذ مع كوب مباشرة فوق قرن في 1.5 سم وضعت في 33٪ السعة. (C) والموجي في الصورة هنا هو من القراءة المكتسبة عند وضع مائي داخل 20 مل الزجاج التلألؤ القارورة. يتم وضع القارورة في 1.5 سم فوق قرن، ومرة ​​أخرى وضعت في 33٪ السعة. (D) الذبذبات قطة شاشة سنظام كرة القدم مع الترددات الشاذة كما هو متوقع مع نظام خلل أو اقتران غير لائق للاتحاد تحويل قرن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. استخدام جزء من المتر التجويف لتوصيف شدة الصوت لنظام الموجات فوق الصوتية. ويستخدم المقياس التجويف ينظر هنا لتمثيل الطاقة التجويف في W / سم 2. هذا هو أداة هامة جدا لتقييم اتساق الطاقة فيما يتعلق العينة.

الرقم 5
الرقم 5. المكونات الرئيسية للنظام الموجات فوق الصوتية 40 كيلو هرتز. ويبين نظام الموجات فوق الصوتية كاملة مع كوب القرن ( (B)، وتحويل (C)، وآلية عينة لتحديد المواقع (D). هذا التصميم يسمح لتحديد المواقع سهلة من العينة (E) أعلاه القرن (F).

الشكل (6)
الرقم 6. تأثير مستويات مختلفة من السعة على تحلل بالموجات فوق الصوتية من الخلايا U937 باستخدام عدادات TC20 وZ2. تم sonicated الخلايا التي تحتوي على dismembrator 40 كيلو هرتز الخلية في 33٪ السعة (100-110 W / سم 2) أو 50٪ السعة (125-130 W / سم 2) باستخدام ثلاثة 1 البقول ثانية من الموجات فوق الصوتية، مع تباعد 1 ثانية بين كل هذه النبضات. (A) لقطة من برنامج مكافحة Z2 يوضح تأثير صوتنة على الخلايا U937. (B) بيانات من العداد TC20 جمعت في الرسم البياني للتدليل على استنساخ نتيجةالصورة. وتشمل هذه البيانات الإجمالية وعدد الخلايا الحية، وكذلك تقييم التريبان الأزرق بقاء الخلية. الحانات تعكس الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) لمدة 4 السكان خلية مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. آثار ميثيل β-سيكلودكسترين على بالتالي يؤدي إلى حساسية بالموجات فوق الصوتية من U937 وTHP1 الخلايا. وعولج (A) خلايا U937 مع اختلاف تركيز MeβCD لمدة 30 دقيقة قبل أن يتم sonicated مع 40 كيلو هرتز الموجات فوق الصوتية (105 واط / سم 2 ) باستخدام ثلاثة 1 البقول ثانية متباعدة 1 ثانية على حدة. تم تجميع السكان الخلية إلى ≥12 ميكرون و≥17 ميكرون. (B) U937 أو THP1 خلايا يعاملون مرة أخرى مع تناسق متفاوتةحصص MeβCD لمدة 30 دقيقة قبل أن يتم sonicated مع نظام 40 كيلو هرتز باستخدام 1-3 نبضات من الموجات فوق الصوتية 1 ثانية متباعدة 1 ثانية على حدة. تم تقييم سلامة الخلية والنشاط الميتوكوندريا مع عدة XTT. وكانت المصنفة 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر في 96-جيدا وحة microtiter مسطحة القاع. وقد حضنت لوحة لمدة 24 ساعة قبل إضافة حل XTT. ثم تم تحضين الخلايا ل2 ساعة إضافية قبل قراءة الطول الموجي. الحانات تعكس SEM لمدة 4 السكان خلية مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

لتحقيق أفضل النتائج، ينبغي إيلاء عناية خاصة لوضع بعناية العينة وتنظيف اتحاد المحول قرن. وضع العينة في القرن مهم للحصول على تدمير الخلايا ثابت، وتغيير المسافة من القرن سوف يغير البؤر الصوتية، وبالتالي تغيير الطاقة تتعرض العينة ل. الطاقة الصوتية في القرن كوب يمكن تعيين باستخدام متر التجويف للعثور على موقف الأقصى التجويف. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التجويف متر، جنبا إلى جنب مع الذبذبات حيوية لتحديد شدة الصوت وتتعرض الخلايا ل، وكذلك تجانس الموجي. ولذلك، ينبغي أن تستخدم هذه الأدوات للكشف عن المشاكل مع النظام، وتساعد على تحديد ما قد تكون هناك حاجة إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتصحيح عدم استقرار النظام.

كما ذكر سابقا، فإن نظام التردد المنخفض قد تعمل على مزيد من ديغا المياه في كافة مراحل التجربة إذا لم يرشح نفسه لقبل عدة دقائق لأخذ عينات صوتنة. يجب أن يتم تنفيذ هذا المدى الأولي أن تسفر عن نتائج بالتالي تتفق المتوسطة صوتنة نزع الغاز نسبيا وخلال التجارب. بالإضافة إلى ذلك، لا ينبغي أن sonicated الخلايا في أو بالقرب من الحد الأقصى لسعة عند تقييم فعالية sonosensitizers، حيث أن الحجم الحقيقي للتوعية سيكون من الصعب تقييم. باستخدام 33٪ السعة على النظام كيلو هرتز 40 هو المكان المثالي، كما أنها تنتج ضرر ملحوظ، ولكنها توفر sonosensitizers مجالا واسعا لإثبات فعاليتها، كما هو موضح مع MeβCD ضد U937 والخلايا THP1 (الشكل 7). تؤكد هذه البيانات أيضا أن MeβCD محسس خطوط اللوكيميا متعددة لمنخفض فوق الصوتية تردد بطريقة تعتمد على الجرعة.

كان هناك عدد من التجارب القيام به مع ارتفاع وتيرة في حدود 0.75 ميغاهيرتز إلى 8 ميغاهيرتز تظهر أدلة على فقاعات التجويف intramembrane التي يتم توليدها من خلال صوتنة 17-19. ومع ذلك، سؤال فيNS لا تزال في ما يخص الآلية الدقيقة التي يسببها الموجات فوق الصوتية المحمولة تحلل 18. لقد أظهرنا وجود صلة بين fluidizing الهيكل الخلوي وزيادة الحساسية الصوتية باستخدام الموجات فوق الصوتية ذات التردد المنخفض 15، وهي ظاهرة أبداه غيرها من المختبرات 20، 21. وبالإضافة إلى ذلك، فقد وجدنا أن عوامل تعطيل خييط مثل مثبط حركة الخلايا B تحفيز حساسية بالموجات فوق الصوتية في اللوكيميا متعددة خطوط، ولكن ليس hHSCs أو الكريات البيض 22، مما يدل على أن تثبيط الأكتين البلمرة قد تكون آلية sonosensitizing ذات أهمية خاصة. وقد لاحظنا أيضا أن فينكريستين، وكيل المخل أنيبيب الذي يمنع تويولين البلمرة 23، 24، ويزيد بشكل ملحوظ حساسية بالموجات فوق الصوتية من أنواع سرطان الدم في المختبر المختلفة بما في ذلك سرطان الدم النخاعي الحاد وسرطان الدم النخاعي المزمن، وسرطان الدم الليمفاوي الحاد. على النقيض من ذلك، وكلاء الموجه هيكل الخلية التي استقرار مكونات هيكل الخلية (باكليتاكسيل لد jasplakinolide) تظهر لجعل خلايا مقاومة للصوتنة، التي تعكسها معدلات أقل من خلية تحلل 22. أخذت معا، وهذه البيانات تدعم الفرضية القائلة بأن fluidizing مكونات هيكل الخلية من الخلايا الورمية هي في الواقع عاملا مهما في زيادة فعالية المعاملة الخاصة والتفضيلية 25. يوضح هذه الدراسة أيضا أن نضوب الكولسترول قد تكون طريقة أخرى يمكن من خلالها زيادة تحفيز حساسية الخلايا الورمية بالموجات فوق الصوتية، وتوعية الخلايا U937 MeβCD معاملتهم بشكل ملحوظ إلى 40 كيلو هرتز الموجات فوق الصوتية.

بينما البروتوكولات صوتنة لدينا وقد أثبتت النشاط الأورام ملحوظ في المختبر، والمنهجية الحالية تقتصر على العمل في مجال الثقافة والفقاريات الصغيرة النماذج التي هي قادرة على احتواء في قارورة تستخدم لصوتنة. لقد أظهرنا أنه الزرد يمكن sonicated بأمان باستخدام نابض الموجات فوق الصوتية ذات التردد المنخفض (20 كيلو هرتز)، والتي تحملهم إلى وكلاء العلاج الكيميائي للمقارنة كميا لجرعة التسامح التي كتبها نماذج الفئران 26، مما يوحي بأن الزرد الورم الحاملة يمكن أن تستخدم في التحقيقات الأولية لتقييم النشاط في الجسم الحي الأورام من هذه البروتوكولات. ومع ذلك، وإدارة وكلاء العلاج الكيميائي قبل صوتنة نماذج الثدييات تم الإبلاغ في نطاق ميغاهيرتز ويمكن على الأرجح هذه البروتوكولات أن تمتد إلى دمج منخفض فوق الصوتية تردد، وكذلك الكوليسترول للأوزون وكلاء الموجه هيكل الخلية.

التطبيقات السريرية المحتملة لهذا النوع من المعاملة الخاصة والتفضيلية قد تنطوي صوتنة الدم خارج الجسم والتي تدار مضادات الأورام عن طريق الوريد (IV) قبل الدم يتم إزالتها لصوتنة 25. يزيل هذا الأسلوب حواجز الصوت التي يمكن أن تمثلها تشريح جسم الإنسان، ويمكن أن يكون وسيلة فعالة لتدمير التفجيرات اللوكيميا، وكذلك الانبثاث من الأورام الصلبة. ومن الممكن أيضا أن الكولسترول للأوزون وكلاء الموجه هيكل الخلية يمكناستخدامها في بروتوكولات HIFU التي هي بالفعل يجري بحثها في العيادة في محاولة لتحسين فعالية هذا النمط من المعالجة.

الطرق الموضحة في هذه الدراسة هي القادرة على تقدير قيمة sonosensitizers المحتملة، وإلى مزيد من الصقل النظام قد تعزيز هذه الأداة. ومع ذلك، هناك العديد من المتغيرات التي سيتم أخذها في الاعتبار عند استخدام هذه تستنبط بالموجات فوق الصوتية، بما في ذلك الطاقة جودة العرض، بؤر الصوتية، وجود فروق فردية بين المحولات. لذلك، سوف تركز البحوث المستقبلية على الرؤية والموجات الصوتية وفهم تأثيرها على النتائج. وقد أظهرت المعاملة الخاصة والتفضيلية لتعزيز تحلل الخلايا في المختبر، وقد تكون قابلة للحياة سريريا إذا كان أكثر في البيانات الجسم الحي في نماذج الثدييات يتم الحصول عليها. ولا تزال التجارب دراسة الخصائص الأخرى تجعلهم عرضة للاستغلال من الخلايا الخبيثة، فضلا عن مختلف طرائق مشتركة تنطوي على عوامل متعددة والموجات فوق الصوتية في مختبرنا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes  Life Technologies 12440079
Amphotericin B Solution  Sigma-Aldrich A2942 
Penicillin/Streptomycin 100x Solution  Life Technologies 10378-016
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12105
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn Branson Ultrasonics 101-063-726 sonication device
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000 ml Beaker Heater Brisk Heat SDCJF1A-GBH1000-1 heater used for temperature control
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software Beckman-Coulter 6605700
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0102
Gentamicin 50 mg/ml Sigma-Aldrich G1397 
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
Falcon 50 ml & 25 ml Vented Culture Flasks Fisher Scientific 353082
Lonza L-Glutamine 200 mM 0.85% NaCl Lonza 17-605C 
Seal-Rite 1.5 ml Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Vials and caps Beckman-Coulter  A35473
AccuJet Pro Auto Pipet  BrandTech Scientific 26330
USA Scientific 10 ml Disposable Serological Pipets USA Scientific 1071-0810
Tip One 100 μl and 1,000 μl Filter Tips USA Scientific 1120-1840, 1126-7810
100 μl Micropipette  Wheaton 851164
1,000 μl Micropipette Wheaton 851168
BioRad Dual Chamber Counting Slides Bio-Rad 145-0015
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator Forma Scientific 3131
Tektronix  DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope Tektronix DPO2002B used to measure the ultrasonic waveform
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter PPB Megasonics PB-500  used to assess the sound intensity in W/cm2
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone Teledyne TC4013-1  connects to the oscilloscope 
Wheaton 250 ml Flasks Sigma-Aldrich Z364827
20 ml Glass Scintillation Vials  Sigma-Aldrich Z190527
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution  Beckman-Coulter N/A diluent for Z2 counter
Chloroform 99% Sigma-Aldrich C2432
Ethanol 200 Proof Anhydrous  Sigma-Aldrich 459836
Mineral Oil N/A
XTT Cell Proliferation Assay Kit ATCC 30-1011K
96-Well Microplate Reader Cole-Palmer  EW-13055-54
U937 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC CRL­1593.2
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC TIB-202

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trendowski, M. The promise of sonodynamic therapy. Cancer Metastasis Rev. 33, (1), 143-160 (2014).
  2. Semins, M. J., Trock, B. J., Matlaga, B. R. The effect of shock wave rate on the outcome of shock wave lithotripsy: A meta-analysis. J Urol. 179, (1), 194-197 (2008).
  3. Pace, K. T., Ghiculete, D., Harju, M., Honey, R. J. Shock Wave Lithotripsy at 60 or 120 shocks per minute: A randomized, double-blind trial. J Urol. 174, (2), 595-599 (2005).
  4. McClain, P. D., Lange, J. N., Assimos, D. G. Optimizing shock wave lithotripsy: a comprehensive review. Rev Urol. 15, (2), 49-60 (2013).
  5. Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nat Rev Drug Discov. 4, (3), 255-260 (2005).
  6. Cordeiro, E. R., Cathelineau, X., Thüroff, S., Marberger, M., Crouzet, S., de la Rosette, J. J. High-intensity focused ultrasound (HIFU) for definitive treatment of prostate cancer. BJU Int. 110, (9), 1228-1242 (2012).
  7. Li, P. Z., et al. High-intensity focused ultrasound treatment for patients with unresectable pancreatic cancer. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 11, (6), 655-660 (2012).
  8. Xiaoping, L., Leizhen, Z. Advances of high intensity focused ultrasound (HIFU) for pancreatic cancer. Int J Hyperthermia. 29, (7), 678-682 (2013).
  9. Lukka, H., et al. High-intensity focused ultrasound for prostate cancer: a systematic review. Clin Oncol (R Coll Radiol). 23, (2), 117-127 (2011).
  10. So, A. I. HIFU ablation is not a proven standard treatment for localized prostate cancer). Can Urol Assoc J. 5, (6), 424-426 (2011).
  11. Crouzet, S., et al. Whole-gland ablation of localized prostate cancer with high-intensity focused ultrasound: oncologic outcomes and morbidity in 1002 patients. Eur Urol. 65, (5), 907-914 (2014).
  12. Tezel, A., Mitragotri, S. Interactions of inertial cavitation bubbles with stratum corneum lipid bilayers during low-frequency sonophoresis. Biophys J. 85, 3502-3512 (2003).
  13. Tang, H., Wang, C. C., Blankschtein, D., Langer, R. An investigation of the role of cavitation in low-frequency ultrasound-mediated transdermal drug transport. Pharm Res. 19, (8), 1160-1169 (2002).
  14. Ueda, H., Mutoh, M., Seki, T., Kobayashi, D., Morimoto, Y. Acoustic cavitation as an enhancing mechanism of low-frequency sonophoresis for transdermal drug delivery. Biol Pharm Bull. 32, (5), 916-920 (2009).
  15. Trendowski, M., Yu, G., Wong, Y., Aquafondata, C., Christen, T., Fondy, T. P. The real deal: Using cytochalasin B in sonodynamic therapy to preferentially damage leukemia cells. Anticancer Res. 34, (5), 2195-2202 (2014).
  16. Sonifier Cell Disrupter Model SLPeEDP. Branson Ultrasonics Corporation. Available from: http://www.emersonindustrial.com/en-US/documentcenter/BransonUltrasonics/Sonifier_Brochure.pdf (2010).
  17. Lagneaux, L., et al. Ultrasonic low-energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells. Exp Hematol. 30, (11), 1293-1301 (2002).
  18. Krasovitskia, B., Frenkelb, V., Shohama, S., Kimmel, K. Intramembrane cavitation as a unifying mechanism for ultrasound-induced bioeffects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, (8), 3258-3263 (2011).
  19. Sundaram, J., Mellein, B. R., Mitragotri, S. An experimental and theoretical analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes. Biophys J. 84, (5), 3087-3101 (2003).
  20. Mizrahi, N., et al. Low intensity ultrasound perturbs cytoskeleton dynamics. Soft Matter. 8, (8), 2438-2443 (2012).
  21. Chen, X., Leow, R. S., Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Single-site sonoporation disrupts actin cytoskeleton organization. J R Soc Interface. 11, (95), 20140071 (2014).
  22. Trendowski, M., et al. Preferential enlargement of leukemia cells using cytoskeletal-directed agents and cell cycle growth control parameters to induce sensitivity to low frequency ultrasound. Cancer Lett. In press, (2015).
  23. Dumontet, C., Sikic, B. I. Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents: Microtubule dynamics, drug transport, and cell death. J Clin Oncol. 17, (3), 1061-1070 (1999).
  24. Verrills, N. M., Kavallaris, M. Improving the targeting of tubulin-binding agents: lessons from drug resistance studies. Curr Pharm Des. 11, (13), 1719-1733 (2005).
  25. Trendowski, M. The inherent metastasis of leukaemia and its exploitation by sonodynamic therapy. Crit Rev Oncol Hematol. In press, (2014).
  26. Trendowski, M., Wong, V., Wellington, K., Hatfield, S., Fondy, T. P. Tolerated doses in zebrafish of cytochalasins and jasplakinolide for comparison with tolerated doses in mice in the evaluation of pre-clinical activity of microfilament-directed agents in tumor model systems in vivo. In Vivo. 28, (6), 1021-1031 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics