Generación y Análisis Cuantitativo de pulsos de baja frecuencia de ultrasonido para determinar la sensibilidad de Sonic de tratados y no tratados células neoplásicas

Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trendowski, M., Christen, T. D., Zoino, J. N., Acquafondata, C., Fondy, T. P. Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells. J. Vis. Exp. (101), e53060, doi:10.3791/53060 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Ultrasonido se refiere a cualquier onda de presión de sonido oscilante con una frecuencia mayor que el límite superior de la capacidad auditiva humana (~ 20 kHz) 1. Ultrasonido de baja frecuencia en el intervalo de 20-60 kHz se ha utilizado en el laboratorio como un medio de generación de emulsiones, la preparación de muestras celulares para la extracción de ácido nucleico, para la interrupción del tejido, y para una variedad de otras pruebas. La utilidad de ultrasonido de baja frecuencia se ha extendido también a la configuración industrial para la soldadura, la limpieza de diversos materiales, y en el procesamiento de materiales. Comercialmente generadores de ultrasonido disponibles vienen en frecuencias que van desde 18 hasta 60 kHz, y en gran escala de potencias 100-1,200 W.

Aunque la ecografía ha sido utilizado en el ámbito clínico para diagnóstico por imagen, se ha aplicado como una modalidad terapéutica sólo recientemente. Ultrasonido ≥1 MHz es capaz de interrumpir de forma segura los cálculos urinarios (piedras en el riñón) y cálculos biliares (piedras en ªe vesícula biliar o en el hígado) en pacientes para reducir los síntomas 2,3. Este enfoque conocido como litotricia extracorpórea (ESWL) actualmente se aplica ampliamente en la clínica (más de un millón de pacientes son tratados anualmente con ESWL en los Estados Unidos solamente 4), y ofrece una modalidad por la cual no invasiva romper los cálculos con daño colateral mínimo a través del uso de pulsos acústicos aplicado externamente, enfocado, de alta intensidad 2-4.

Debido a las fuerzas de cizallamiento únicas directos, así como burbujas de cavitación generados por ultrasonidos de alta intensidad, estas metodologías han sido examinados en la terapia del cáncer para el tratamiento de carcinoma de próstata resistente a la castración y el adenocarcinoma de páncreas en un enfoque conocido como ultrasonido enfocado de alta intensidad (HIFU ) 5-8. De una manera muy similar a la LEOC, HIFU utiliza múltiples haces de ultrasonidos y los concentra en una esfera de actividad seleccionada para generar temperaturas de 60 ° C o higella a través de la utilización de la energía acústica, la inducción de necrosis coagulativa en el tejido diana 5. Aunque en la actualidad existen otras modalidades de ablación térmica (ablación por radiofrecuencia y la ablación por microondas), HIFU ofrece una clara ventaja sobre estos métodos en que es la única modalidad de hipertermia no invasiva 5. HIFU ha logrado resultados mixtos en la clínica y en la actualidad sólo está disponible en los ensayos clínicos 8-11. Sin embargo, el escaso éxito que ha logrado, y el muy prometedor datos in vivo adquiridos a partir de modelos de mamíferos preclínicos han demostrado el potencial de la ecografía en la terapia del cáncer.

En un esfuerzo por mejorar HIFU, los investigadores han intentado combinar ultrasonido con agentes antineoplásicos apropiados para generar una forma de sonochemotherapy. Terapia Sonodynamic (SDT) es una novela modalidad de tratamiento prometedor que ha demostrado impresionante actividad antineoplásica en tanto in vitro como 1. Se ha demostrado que el ultrasonido preferentemente daños células malignas basados ​​en el tamaño diferencial entre tales células y los de histología normal 1,5. SDT incorpora agentes especializados conocidos como sonosensitizers para aumentar la extensión del daño preferencial ejercida por ultrasonido contra las células neoplásicas. Mientras que las aplicaciones terapéuticas de SDT se han examinado anteriormente, los sistemas ultrasónicos utilizados normalmente emplean más alta frecuencia de ultrasonido (≥1 MHz), y los efectos de baja frecuencia kHz ultrasonido aún no se ha explorado a fondo. Las frecuencias más bajas de ultrasonido a menudo son más eficientes en la producción de cavitación inercial, un fenómeno que resulta en la destrucción de las células debido al rápido colapso de microburbujas, la inducción de daño físico-12-14. Esta diferencia en la generación de cavitación inercial entre MHz y ultrasonido de baja kHz se ha atribuido al hecho de que las frecuencias de onda inferiores permiten microburbujass más tiempo para crecer por difusión rectificada en el ciclo de expansión media, en consecuencia producir colapsos más violentos durante el ciclo medio tras la compresión 12.

Hemos demostrado previamente que las células de leucemia monocítica humana U937 son sensibles a los ultrasonidos de baja frecuencia (23,5 kHz), y que esta sensibilidad se puede incrementar notablemente mediante la aplicación de agentes antineoplásicos que perturban el citoesqueleto 15. Además, hemos demostrado que las células preferentemente se dañan basan en el tamaño, con células más grandes que exhiben una mayor sensibilidad ultrasónica. Además, las células humanas normales madre hematopoyéticas (hHSCs) y leucocitos en tamaños de celda comparables son mucho más resistentes a sonicación que sus contrapartes neoplásicas 15, lo que sugiere que tentativamente ultrasonido de baja frecuencia se puede utilizar para dañar preferentemente a las células malignas en la presencia de tejido normal.

Para examinar más a fondo la hélice únicapropie- de ultrasonido de baja frecuencia para uso terapéutico potencial, se han desarrollado procedimientos de limpieza y de estabilización para aumentar la eficacia y la fiabilidad de uno de nuestros sistemas de sonicación actuales, el Branson Modelo SLPe 150 W, 40 kHz Cell Disrupter, equipado con un cuerno de 20 mm equipado en una taza de 7,62 cm. Además, hemos sido capaces de determinar las energías precisas muestra de cavitación, así como formas de onda consistentes y amplitud dentro del rango de 40 kHz usando un medidor de cavitación y el osciloscopio con hidrófono. Por refinación y sistematizar nuestros protocolos, hemos sido capaces de establecer la coherencia de nuestros sonicaciones experimentales, lo que nos permite comparar cuantitativamente las sensibilidades sonoras de las células neoplásicas y normales de diferentes linajes histogenéticos. Nuestro protocolo para el sistema de 40 kHz se presenta en extenso detalle para que los laboratorios interesados ​​para ser capaz de realizar experimentos comparables, y evaluar nuestros resultados de los efectos antineoplásicos provocados porultrasonido de baja frecuencia. Además, se examinan los efectos de dosis dependientes de metil-β-ciclodextrina (MeβCD; Figura 1), un agente de colesterol de ozono, en el aumento de la sensibilidad de ultrasonidos de U937 y THP1 células de leucemia monocítica humana.

Protocol

1. Sistema Sonifier Limpieza celular

  1. Limpie la unión entre el cuerno y el convertidor utilizando cloroformo y un hisopo de algodón. Aplicar un aceite ligero o aceite mineral a las roscas de la bocina y el convertidor para eliminar aún más la acumulación de virutas de metal, óxido, o la oxidación.
  2. Utilice cloroformo para eliminar el aceite y otros contaminantes de la unión después de limpiar las roscas con aceite.

2. Montaje de la célula Sonifier y Configuración del Sistema

  1. Vuelva a colocar la bocina para el convertidor. Para apretar adecuadamente el sistema, quitar el convertidor de ensamblado y el cuerno desde el conjunto de taza tirando de la bocina de la parte inferior de la copa (Figura 2A). Coloque una llave de ranura dentro de uno de los tres pequeños agujeros cerca de la parte superior del convertidor (Figura 2B). Entonces, posicionar una llave dinamométrica equipado con un pie de cuervo ½ pulgada en la parte ranurada de la bocina (Figura 2B). Apriete en standard sentido horario hasta que el medidor de par lee 54.23 N. m (Figura 2C), el par de apriete recomendado por el fabricante 16. Montar el convertidor apretado y cuerno de nuevo en la copa, y montar la bocina y el convertidor a un soporte de anillo en una posición vertical. Vuelva a conectar el convertidor a la fuente de alimentación antes de ajustar el sistema para la dosificación de pulso experimental.
  2. Ajuste el sistema para la dosificación de pulso utilizando 1 seg de sonicación con 1 seg entre pulsos. Diferentes modelos de dosificación se pueden usar para otras condiciones experimentales. Muchas variables, como el volumen de agua y el diámetro del cuerno serían potencialmente requerir cambios en esta dosificación. Uso de los tipos antes mencionados muestra de células, el volumen y la concentración, los datos empíricos y la observación han llevado a la formulación de este régimen de dosificación.
  3. Ajustar el sistema a la amplitud deseada. En este protocolo, utilizar 33% y el 50% de la amplitud para prevenir la destrucción celular completa, que haría la eficacia de sonosensitizers difíciles o imposibles de medir.
    NOTA: En este estudio se comparan las amplitudes.

3. La evaluación de la intensidad del sistema y Función

  1. Mantenga el medidor de cavitación en 1,5 cm, que es el nivel de la sonicación muestra. Tenga en cuenta las lecturas de evaluar que el sistema está funcionando a una intensidad esperada. Utilizando los niveles del sistema y de agua corriente, esperar entre 100 a 110 W / cm 2 para 33% de la amplitud y 115-125 W / cm 2 para 50% de la amplitud. Tenga en cuenta las lecturas de los contadores de cavitación de la pantalla del medidor, que representa la energía de cavitación en W / cm2 directamente. Tome estas lecturas en la superficie del agua, y aseguran no hay burbujas están presentes en la superficie de la sonda metros.
    NOTA: Es importante tener en cuenta que estos procedimientos se realizan sin la tapa para el acceso por encima de la bocina. No es necesario repetir después de cada tratamiento con ultrasonidos. Más bien, deben ser realizados después de la limpieza, volver a montar, y la configuración del sistema. Coloque el hidrófono en un vial de muestra que contiene 12,5 ml de agua para sumergir completamente el sensor del hidrófono. Suspender el hidrófono utilizando el soporte de anillo.
  2. Una el hidrófono a la entrada del osciloscopio con el fin de evaluar las características de forma de onda. Examine el osciloscopio para una onda sinusoidal clara, como ondas aberrantes pueden alterar la frecuencia del sistema de las especificaciones del fabricante. Tanto el metro cavitación y osciloscopio dan una lectura de frecuencia, pero sólo el osciloscopio mostrará olas aberrantes que son indicativos de un sistema defectuoso o montaje incorrecto.

4. Preparación de las células y Medio

  1. Preparar el medio mediante el uso de 240 ml de Iscove Modified Medio de Dulbecco (IMDM) y 50 ml de suero fetal bovino. No descongele suero fetal bovino en un baño de agua caliente, ya que los aumentos bruscos de temperatura pueden dar lugar a un compromiso en la estabilidad en suero. Combinar 240 l de gentamicina 50 mg / ml y 5 ml de penicilina/ Estreptomicina 100x en un matraz de cultivo estándar, y añadir al medio. Guarde el medio a 4 ° C.
  2. Células U937 Seed a ~ 4 x 10 4 células / ml en un matraz de 25 cm 2 utilizando el medio preparado. Evaluar las células para la concentración y la viabilidad usando un contador de células TC 20 y exclusión azul tripán mediante la colocación de 15-20 l de células y 15-20 l de azul de tripano en un tubo de microcentrífuga y mezclar el contenido. L Pipette15-20 de esta mezcla en una diapositiva de muestreo TC 20, e iniciar el recuento mediante la colocación de la diapositiva en el contador de células TC 20.
  3. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2, y compruebe si la viabilidad celular mediante exclusión de azul de tripano y el contador de células TC 20. Cuando las células se encuentran en una concentración apropiada y / o han sido tratados con sonosensitizers para un plazo apropiado, la transferencia de 3 ml de células del frasco de cultivo a 20 ml vial de centelleo de vidrio. En este protocolo, crecer células U937 durante 48 horas, y luego tratar con 0,5, 1,o MeβCD 5 mM durante 30 min para agotar suficientemente el colesterol de las células antes de la sonicación.

5. celular Sonicación

  1. Degas desionizada, agua destilada utilizando un vacío y matraz de Buchner. Transferir el agua para el cuerno taza, y llenar a un nivel de 15 mm por encima de la parte superior de la bocina. El proceso de sonicación causa más desgasificación del agua durante un período de unos pocos minutos, y puede conducir a inconsistencias en el transcurso del experimento si el sistema no se ejecuta antes de muestrear sonicación. Por lo tanto, el funcionamiento del sistema de ~ 7 minutos antes de muestrear sonicación.
  2. Coloque el vial de centelleo que contiene las células en el dispositivo de retención. A continuación, conecte el dispositivo de sujeción de la parte superior del cuerno taza y ajustado a una altura de 15 mm desde la parte superior de la bocina (en la superficie del agua utilizando el mecanismo de deslizamiento).
  3. Las células se sometieron a ultrasonidos típicamente utilizando tres pulsos de 1 seg de ultrasonido, con 1 seg espaciamiento entre cada uno de estos pulsos. Para estoprotocolo, las células sonicado en 33% y 50% de la amplitud de pulso utilizando la dosificación mencionada.

6. La evaluación de células para daños post-tratamiento con ultrasonidos

  1. Evaluar las células suspendidas por daños y viabilidad utilizando azul de tripano y el contador de células TC 20. Además, analizar la muestra utilizando un contador Z2. Para el análisis de contador Z2, pipetear una suspensión celular 100 l en 20 ml de solución salina isotónica (200: 1). Antes del análisis, lave la abertura del analizador de partículas Z2 al menos dos veces utilizando solución salina isotónica. Coloque la muestra Z2 en el soporte de venta libre, y elevar la plataforma para la apertura antes de iniciar el recuento.
  2. Adquirir los datos de los contadores de TC 20 y Z2 utilizando el software proporcionado por el fabricante. Analizar estos datos para el daño celular, la viabilidad y la creación de los restos celulares de ultrasonidos.

7. XTT Ensayo para determinar la viabilidad celular y mitocondrial Actividad de U937 tratadas y células THP1

  1. Príor para los ensayos XTT, crecer U937 y THP1 células bajo las mismas condiciones. Pretratar las células con el mismo intervalo de concentración de MeβCD durante 30 min antes de la sonicación. Utilice los mismos parámetros de ultrasonido como antes, excepto que las células están sonicaron utilizando un rango de 1-3 una pulsos por segundo espaciados uno seg, aparte de desarrollar una serie de daños para el kit de XTT para evaluar.
    Nota: Muchas de estas medidas se toman directamente del manual del kit XTT y sólo se repiten para la comodidad de los laboratorios interesados.
  2. Recoger las células por centrifugación a 200 xg durante 10 min. Resuspender el sedimento celular en el medio de crecimiento descrito anteriormente. Resuspender las células en ~ 1 x 10 5 células / ml. Células U937 de semillas en 100 l por pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano, por triplicado, y luego repiten para las células THP1 utilizando una placa de 96 pocillos separada. Incluya 3 pocillos de control que contenían 100 l de medio de crecimiento completo solo como lecturas de absorbancia en blanco. A continuación, se incuban las placas inoculadas a 24 hr.
  3. Descongelar dos alícuotas del reactivo XTT y el reactivo de activación a 37 ° C antes de su uso. Alícuotas Remolino suavemente hasta que se obtienen soluciones claras. Añadir 0,1 ml de reactivo de activación a 5,0 ml del reactivo XTT, que forma suficiente solución XTT activado por un ensayo de 96 pocillos de placas de microtitulación. Repita el proceso para la otra placa.
  4. Añadir 50 l de la solución de XTT activado a cada pocillo. Devuelva la placa para el cultivo celular incubadora de CO 2 durante 2 horas. Agitar la placa suavemente tras el período de incubación para distribuir uniformemente el color naranja en los pocillos positivos. Medir la absorbancia de los pocillos de ensayo que contienen las células y los pocillos de control de fondo en blanco a una longitud de onda entre 450-500 nm de longitud de onda usando un lector de placa de microtitulación.
  5. Cualquiera de cero el lector de placas de microtitulación utilizando los pocillos de control en blanco o restar su valor medio de los resultados específicos. Medir la absorbancia de todos los pocillos de ensayo de nuevo en una wavelengº entre 630 a 690 nm y restar los valores de los valores de 450 a 500 nm obtenidos. Nota: Esta segunda determinación absorbancia ayuda a eliminar las lecturas no específicos de los resultados del ensayo. El ensayo XTT se repitió cuatro veces para ambas líneas celulares.

Representative Results

La estabilidad del sistema es de suma importancia en la obtención de resultados repetibles y confiables. La especificación de par de apriete correcto de 54,23 N. M logra acoplamiento adecuado del transductor y sonotrodo 2, con la consistencia de la forma de onda que se evalúa mediante el uso de un osciloscopio y hidrófono (Figura 3A). Figura 3B representa las mediciones en el interior del vial de muestra, y Figura 3C evalúa la estabilidad dentro de la trompa taza. Como era de esperar, la amplitud se redujo ligeramente debido a un poco de energía sea absorbida por el vidrio. Sin embargo, la forma de onda no fue perturbado o distorsionada, ya sea en el panel B o C, que es necesaria para la entrega fiable de energía sónica a la muestra. Una forma de onda que no aparece como una onda sinusoidal singular clara indica un transductor defectuoso o instalación incorrecta. Esto se expresa en la figura 3D que muestra múltiples olas aberrantes, una clara ausencia de una onda sinusoidal, y una frecuencia de lectura sint espera con un sistema que funcione correctamente. El medidor de cavitación utilizado para medir la energía de cavitación generada (Figura 4) encontró la intensidad del sonido a ser 100-110 W / cm 2 a 33% de la amplitud, y 125-130 W / cm 2 a 50% de la amplitud.

Una vez que el sistema de 40 kHz fue calibrado y montado en su totalidad (Figura 5) apropiadamente, la destrucción de células fiable se logró fácilmente, como se determina tanto por los contadores de TC 20 y Z2 (Figura 6). Como era de esperar, se observó más extenso daño celular en las poblaciones de células sonicadas a 50%, en lugar de a 33% de la amplitud. Sin embargo, 33% de la amplitud es útil como punto de partida para detectar posibles efectos sensibilizadores sónica de agentes administrados, ya que produce daño notable, pero deja espacio para más daño a ser detectada cuando se aplican agentes para evaluar su potenciación de la sensibilidad ultrasónica. Esto se demuestra en la Figura 7A, donde else presentan los efectos dependientes de la dosis de MeβCD en la potenciación de la sensibilidad de ultrasonidos de células U937. Aunque las células tratadas con MeβCD no sonicados fueron muy similares en la viabilidad de las células no sonicado, no tratados, la viabilidad se redujo marcadamente después de tres pulsos de 1 seg 40 kHz ultrasonido fue aplicado. Además, la disminución de la viabilidad después de la sonicación parece haber sido dependiente de la dosis, como 5 mM MeβCD produjo la mayor caída en el recuento de células, seguido de 1 mM, y luego mM MeβCD 0.5.

Se observaron efectos similares sobre la viabilidad celular y la actividad mitocondrial en las células U937 y THP1 que fueron tratados con concentraciones variables de MeβCD antes de la sonicación, tal como se evaluó con el kit de XTT (Figura 7B). Aunque THP1 células parecen ser ligeramente más resistente que las células U937 sonic, ambas líneas de leucemia humana se dañan en una manera dependiente de la dosis. Las concentraciones más altas de MeβCD y más pulsos de ultrasonido produced la menor reducción de XTT a un derivado soluble de naranja, colores brillantes tanto para U937 y THP1 células, correspondiente a reducir la viabilidad celular y la actividad mitocondrial.

Figura 1
Figura 1. Estructura molecular de metil- β-ciclodextrina. (A) estructura completa de metil-β-ciclodextrina (MeβCD). (B) MeβCD es un polímero de siete unidades de repetición con un grupo R de H o CH 3. Fórmula molecular: C 56 H 98 O 35. Peso molecular = 1331.36.

Figura 2
Figura 2. torqueing correctamente el sistema de ultrasonido 40 kHz. (A) El cuerno y el convertidor se eliminan de la pri tazao para torqueing. (B) Coloque la llave de la ranura y la llave de torsión en sus respectivas posiciones. (C) Aplicar 54.23 N. M de par motor en sentido horario antes de volver a colocar la bocina y el convertidor a la taza.

Figura 3
Figura 3. Uso de un osciloscopio para caracterizar la forma de onda del sistema ultrasónico. (A) Un osciloscopio con hidrófono se puede utilizar para evaluar la consistencia de amplitud y forma de onda. De grabación (B) Un tomada con la copa directamente por encima de la bocina en 1,5 cm y se fijó en 33% de la amplitud. (C) La forma de onda se muestra aquí es de una lectura adquirida cuando el hidrófono se coloca dentro de la 20 ml vial de centelleo de vidrio. El vial se sitúa en 1,5 cm por encima de la bocina y de nuevo ha fijado en 33% de la amplitud. (D) Un osciloscopio pantalla osistema de fa con frecuencias aberrantes como cabría esperar de un sistema defectuoso o acoplamiento incorrecto de la unión convertidor bocina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. El uso de un medidor de cavitación para caracterizar la intensidad del sonido del sistema ultrasónico. El metro cavitación se ve aquí se utiliza para representar la energía cavitación en W / cm2. Este es un instrumento muy importante para evaluar la consistencia de la energía con respecto a la muestra.

Figura 5
Figura 5. Los componentes clave del sistema de ultrasonido 40 kHz. El sistema ultrasónico se muestra completa con el cuerno taza ( (B), el convertidor (C), y el mecanismo de posicionamiento de la muestra (D). Este diseño permite un fácil posicionamiento de la muestra (E) por encima del cuerno (F).

Figura 6
Figura 6. Efectos de diferentes niveles de amplitud en la lisis por ultrasonidos de células U937 utilizando los contadores de TC 20 y Z2. Las células se sonicaron con el Dismembrator 40 kHz celular en 33% de la amplitud (100-110 W / cm 2) o 50% de la amplitud (125-130 W / cm 2), utilizando tres pulsos de 1 seg de ultrasonido, con 1 seg espaciamiento entre cada de estos pulsos. (A) Una captura de pantalla desde el software contador Z2 demuestra el efecto de la sonicación en células U937. (B) Los datos del contador TC 20 fueron compilados en un gráfico para demostrar la reproducibilidad de los resultadoss. Estos datos incluyen los recuentos de células totales y en vivo, así como el azul de tripano evaluó la viabilidad celular. Bares reflejan el error estándar de la media (SEM) para 4 poblaciones de células independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7. Efectos de metil- β-ciclodextrina en la potenciación de la sensibilidad ultrasónica de U937 y células THP1. (A) células U937 se trataron con concentraciones variables de MeβCD durante 30 min antes de ser sonicado con 40 kHz ultrasonido (105 W / cm 2 ) utilizando tres pulsos de 1 seg 1 seg espaciados aparte. Las poblaciones de células se agruparon en ≥12 my ≥17 micras. (B) células U937 o THP1 fueron tratados de nuevo con diferentes concentraciones de MeβCD durante 30 min antes de ser sonicado con el sistema de 40 kHz usando 1-3 pulsos de ultrasonido 1 seg 1 seg espaciadas aparte. La viabilidad celular y la actividad mitocondrial fueron evaluados con el kit de XTT. 100 l de células se sembraron por pocillo en una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos. La placa se incubó durante 24 h antes de la adición de solución de XTT. Las células se incubaron entonces durante 2 horas más antes de que se lea la longitud de onda. Bares reflejan SEM para 4 poblaciones de células independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Para lograr resultados óptimos, especial cuidado se debe tomar para colocar cuidadosamente la muestra y limpiar la unión convertidor bocina. La colocación de la muestra en el cuerno es importante para la obtención de la destrucción celular consistente, como el cambio de la distancia desde el cuerno alterará los focos acústico, y por lo tanto alterar la energía de la muestra se expone a. La energía acústica dentro del cuerno taza se puede mapear usando el metro cavitación para encontrar la posición de máxima cavitación. Además, el medidor de cavitación, junto con el osciloscopio son vitales para la determinación de la intensidad del sonido de las células están siendo expuestos a, así como la homogeneidad de la forma de onda. Por lo tanto, estos instrumentos deben ser utilizados para detectar problemas con el sistema, y ​​ayudar a determinar lo que la solución de problemas puede ser necesaria para corregir la inestabilidad del sistema.

Como se mencionó anteriormente, el sistema de baja frecuencia puede actuar para desgasificar más el agua durante todo el experimento si se ejecuta paravarios minutos antes de muestrear sonicación. Este plazo inicial debe realizarse para obtener un medio de ultrasonidos relativamente desgasificado y resultados así consistentes durante los experimentos. Además, las células no se deben sonicaron en o cerca de la amplitud máxima en la evaluación de la eficacia de sonosensitizers, como la verdadera medida de la sensibilización sería difícil de evaluar. El uso de 33% de la amplitud en el sistema kHz 40 es un lugar ideal, ya que produce daño notable, pero ofrece sonosensitizers amplio espacio para demostrar su eficacia, como se ha demostrado con MeβCD contra U937 y células THP1 (Figura 7). Estos datos también confirman que MeβCD sensibiliza múltiples líneas de leucemia a ultrasonido de baja frecuencia de una manera dependiente de la dosis.

Ha habido una serie de experimentos realizados con mayor frecuencia en el intervalo de 0,75 MHz a 8 MHz mostrando evidencia de burbujas de cavitación intramembrane siendo generado a través de sonicación 17-19. Sin embargo, Questions aún permanecen en lo que respecta a el mecanismo exacto de inducida por ultrasonidos lisis celular 18. Hemos demostrado un vínculo entre el citoesqueleto de fluidización y aumento de la sensibilidad sonic utilizando ultrasonido de baja frecuencia 15, un fenómeno demostrado por otros laboratorios 20, 21. Además, hemos encontrado que los agentes de microfilamentos de alteración tales como citocalasina B potencian la sensibilidad de ultrasonidos en la leucemia múltiple líneas, pero no hHSCs o leucocitos 22, lo que sugiere que la inhibición de la polimerización de actina pueden ser un mecanismo sonosensitizing de particular interés. También hemos observado que la vincristina, un agente de microtúbulos disruptores que inhibe la polimerización de tubulina 23, 24, aumenta notablemente la sensibilidad de ultrasonidos de diferentes tipos de leucemia in vitro incluyendo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, y leucemia linfoide aguda. Por el contrario, los agentes del citoesqueleto-dirigida que estabilizan los componentes del citoesqueleto (una paclitaxeld jasplaquinolida) parece hacer que las células resistentes al tratamiento con ultrasonidos, se refleja en menores tasas de lisis celular 22. Tomados en conjunto, estos datos apoyan la hipótesis de que la fluidización de los componentes del citoesqueleto de las células neoplásicas es de hecho un factor importante en el aumento de la eficacia de SDT 25. El presente estudio también demuestra que el agotamiento de colesterol puede ser otro método por el cual para potenciar aún más la sensibilidad de ultrasonidos de células neoplásicas, como las células U937 tratadas con MeβCD están marcadamente sensibilizados a 40 kHz ultrasonido.

Mientras que nuestros protocolos de sonicación han demostrado notable actividad antineoplásica in vitro, la metodología actual se limita a trabajar en modelos de cultivo y pequeños vertebrados que son capaces de encajar en los viales utilizados para ultrasonidos. Hemos demostrado que el pez cebra puede ser sonicado de forma segura utilizando pulsos de ultrasonido de baja frecuencia (20 kHz), y que su tolerancia a los agentes quimioterapéuticos es cuantitativamente comparable adosis toleradas por los modelos murinos, lo que sugiere 26 que el pez cebra portador de un tumor pueden ser utilizados en investigaciones preliminares para evaluar la actividad antineoplásica in vivo de estos protocolos. Sin embargo, la administración de agentes quimioterapéuticos antes de la sonicación de modelos de mamíferos ha sido reportado en el rango de 1 MHz, y tales protocolos probable puede ser ampliado para incorporar ultrasonido de baja frecuencia, así como el colesterol de ozono y agentes del citoesqueleto-dirigida.

Aplicaciones clínicas potenciales de esta forma de SDT pueden implicar sonicación de sangre extracorpóreo en el que agentes antineoplásicos se administran por vía intravenosa (iv) antes de la sangre que son removidos por sonicación 25. Este método elimina posibles barreras de sonido planteados por la anatomía humana, y puede ser una manera eficaz para dañar blastos leucémicos, así como metástasis de tumores sólidos. También es posible que el colesterol de ozono y agentes del citoesqueleto dirigida podríausarse en protocolos HIFU que ya están siendo examinadas en la clínica en un intento de mejorar la eficacia de esta modalidad de tratamiento.

Los métodos descritos en el presente estudio son capaces de evaluar el valor de sonosensitizers potenciales, y el perfeccionamiento del sistema puede mejorar esta utilidad. Sin embargo, hay muchas variables a tener en cuenta cuando se utiliza este tipo de legados ultrasónicas, incluyendo la calidad de suministro de energía, focos acústica, y la variación individual entre los convertidores. Por lo tanto, la investigación futura se centrará en la visualización de las ondas sonoras y la comprensión de su influencia en los resultados. SDT ha demostrado mejorar la lisis celular in vitro y puede llegar a ser clínicamente viable si hay más datos in vivo en modelos de mamíferos se adquieren. Los experimentos que examinan otras características potencialmente explotables de células malignas, así como diversas modalidades combinadas que participan múltiples agentes y ecografía continúan en nuestro laboratorio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes  Life Technologies 12440079
Amphotericin B Solution  Sigma-Aldrich A2942 
Penicillin/Streptomycin 100x Solution  Life Technologies 10378-016
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12105
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn Branson Ultrasonics 101-063-726 sonication device
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000 ml Beaker Heater Brisk Heat SDCJF1A-GBH1000-1 heater used for temperature control
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software Beckman-Coulter 6605700
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0102
Gentamicin 50 mg/ml Sigma-Aldrich G1397 
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
Falcon 50 ml & 25 ml Vented Culture Flasks Fisher Scientific 353082
Lonza L-Glutamine 200 mM 0.85% NaCl Lonza 17-605C 
Seal-Rite 1.5 ml Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Vials and caps Beckman-Coulter  A35473
AccuJet Pro Auto Pipet  BrandTech Scientific 26330
USA Scientific 10 ml Disposable Serological Pipets USA Scientific 1071-0810
Tip One 100 μl and 1,000 μl Filter Tips USA Scientific 1120-1840, 1126-7810
100 μl Micropipette  Wheaton 851164
1,000 μl Micropipette Wheaton 851168
BioRad Dual Chamber Counting Slides Bio-Rad 145-0015
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator Forma Scientific 3131
Tektronix  DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope Tektronix DPO2002B used to measure the ultrasonic waveform
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter PPB Megasonics PB-500  used to assess the sound intensity in W/cm2
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone Teledyne TC4013-1  connects to the oscilloscope 
Wheaton 250 ml Flasks Sigma-Aldrich Z364827
20 ml Glass Scintillation Vials  Sigma-Aldrich Z190527
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution  Beckman-Coulter N/A diluent for Z2 counter
Chloroform 99% Sigma-Aldrich C2432
Ethanol 200 Proof Anhydrous  Sigma-Aldrich 459836
Mineral Oil N/A
XTT Cell Proliferation Assay Kit ATCC 30-1011K
96-Well Microplate Reader Cole-Palmer  EW-13055-54
U937 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC CRL­1593.2
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC TIB-202

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trendowski, M. The promise of sonodynamic therapy. Cancer Metastasis Rev. 33, (1), 143-160 (2014).
  2. Semins, M. J., Trock, B. J., Matlaga, B. R. The effect of shock wave rate on the outcome of shock wave lithotripsy: A meta-analysis. J Urol. 179, (1), 194-197 (2008).
  3. Pace, K. T., Ghiculete, D., Harju, M., Honey, R. J. Shock Wave Lithotripsy at 60 or 120 shocks per minute: A randomized, double-blind trial. J Urol. 174, (2), 595-599 (2005).
  4. McClain, P. D., Lange, J. N., Assimos, D. G. Optimizing shock wave lithotripsy: a comprehensive review. Rev Urol. 15, (2), 49-60 (2013).
  5. Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nat Rev Drug Discov. 4, (3), 255-260 (2005).
  6. Cordeiro, E. R., Cathelineau, X., Thüroff, S., Marberger, M., Crouzet, S., de la Rosette, J. J. High-intensity focused ultrasound (HIFU) for definitive treatment of prostate cancer. BJU Int. 110, (9), 1228-1242 (2012).
  7. Li, P. Z., et al. High-intensity focused ultrasound treatment for patients with unresectable pancreatic cancer. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 11, (6), 655-660 (2012).
  8. Xiaoping, L., Leizhen, Z. Advances of high intensity focused ultrasound (HIFU) for pancreatic cancer. Int J Hyperthermia. 29, (7), 678-682 (2013).
  9. Lukka, H., et al. High-intensity focused ultrasound for prostate cancer: a systematic review. Clin Oncol (R Coll Radiol). 23, (2), 117-127 (2011).
  10. So, A. I. HIFU ablation is not a proven standard treatment for localized prostate cancer). Can Urol Assoc J. 5, (6), 424-426 (2011).
  11. Crouzet, S., et al. Whole-gland ablation of localized prostate cancer with high-intensity focused ultrasound: oncologic outcomes and morbidity in 1002 patients. Eur Urol. 65, (5), 907-914 (2014).
  12. Tezel, A., Mitragotri, S. Interactions of inertial cavitation bubbles with stratum corneum lipid bilayers during low-frequency sonophoresis. Biophys J. 85, 3502-3512 (2003).
  13. Tang, H., Wang, C. C., Blankschtein, D., Langer, R. An investigation of the role of cavitation in low-frequency ultrasound-mediated transdermal drug transport. Pharm Res. 19, (8), 1160-1169 (2002).
  14. Ueda, H., Mutoh, M., Seki, T., Kobayashi, D., Morimoto, Y. Acoustic cavitation as an enhancing mechanism of low-frequency sonophoresis for transdermal drug delivery. Biol Pharm Bull. 32, (5), 916-920 (2009).
  15. Trendowski, M., Yu, G., Wong, Y., Aquafondata, C., Christen, T., Fondy, T. P. The real deal: Using cytochalasin B in sonodynamic therapy to preferentially damage leukemia cells. Anticancer Res. 34, (5), 2195-2202 (2014).
  16. Sonifier Cell Disrupter Model SLPeEDP. Branson Ultrasonics Corporation. Available from: http://www.emersonindustrial.com/en-US/documentcenter/BransonUltrasonics/Sonifier_Brochure.pdf (2010).
  17. Lagneaux, L., et al. Ultrasonic low-energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells. Exp Hematol. 30, (11), 1293-1301 (2002).
  18. Krasovitskia, B., Frenkelb, V., Shohama, S., Kimmel, K. Intramembrane cavitation as a unifying mechanism for ultrasound-induced bioeffects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, (8), 3258-3263 (2011).
  19. Sundaram, J., Mellein, B. R., Mitragotri, S. An experimental and theoretical analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes. Biophys J. 84, (5), 3087-3101 (2003).
  20. Mizrahi, N., et al. Low intensity ultrasound perturbs cytoskeleton dynamics. Soft Matter. 8, (8), 2438-2443 (2012).
  21. Chen, X., Leow, R. S., Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Single-site sonoporation disrupts actin cytoskeleton organization. J R Soc Interface. 11, (95), 20140071 (2014).
  22. Trendowski, M., et al. Preferential enlargement of leukemia cells using cytoskeletal-directed agents and cell cycle growth control parameters to induce sensitivity to low frequency ultrasound. Cancer Lett. In press, (2015).
  23. Dumontet, C., Sikic, B. I. Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents: Microtubule dynamics, drug transport, and cell death. J Clin Oncol. 17, (3), 1061-1070 (1999).
  24. Verrills, N. M., Kavallaris, M. Improving the targeting of tubulin-binding agents: lessons from drug resistance studies. Curr Pharm Des. 11, (13), 1719-1733 (2005).
  25. Trendowski, M. The inherent metastasis of leukaemia and its exploitation by sonodynamic therapy. Crit Rev Oncol Hematol. In press, (2014).
  26. Trendowski, M., Wong, V., Wellington, K., Hatfield, S., Fondy, T. P. Tolerated doses in zebrafish of cytochalasins and jasplakinolide for comparison with tolerated doses in mice in the evaluation of pre-clinical activity of microfilament-directed agents in tumor model systems in vivo. In Vivo. 28, (6), 1021-1031 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics