Generatie en kwantitatieve analyse van Pulsed Low Frequency Ultrasound om de Sonic Gevoeligheid van Onbehandelde Bepaal en behandeld neoplastische cellen

1Department of Biology, Syracuse University
Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trendowski, M., Christen, T. D., Zoino, J. N., Acquafondata, C., Fondy, T. P. Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells. J. Vis. Exp. (101), e53060, doi:10.3791/53060 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Ultrasound verwijst naar elke oscillerende geluidsdrukgolf met een frequentie hoger dan de bovengrens van het menselijk oor capaciteit (~ 20 kHz) 1. Laagfrequente ultrageluid in de 20-60 kHz is gebruikt in het laboratorium voor de opwekking van emulsies, voorbereiding celmonsters voor nucleïnezuurextractie voor weefselontwrichting, en voor verschillende andere tests. Het nut van laagfrequente ultrageluid is ook uitgebreid om de industriële omgeving voor het lassen, het reinigen diverse materialen, en materialen verwerken. In de handel verkrijgbare echografie generatoren komen frequenties variërend 18-60 kHz, en full-scale wattages van 100-1200 W.

Hoewel ultrasound lang gebruikt in de klinische setting voor diagnostische beeldvorming, is toegepast als therapeutische modaliteit onlangs. Echografie ≥1 MHz in staat is veilig verstoren urinewegen (nierstenen) en gal calculi (stenen in the galblaas of de lever) bij patiënten met symptomen 2,3 verminderen. Deze benadering bekend als extracorporale schokgolf lithotripsie (ESWL) wordt nu algemeen toegepast in de kliniek (meer dan een miljoen patiënten per jaar behandeld met ESWL in de Verenigde Staten alleen 4), en biedt een modaliteit waarmee op niet-invasieve breken met calculi minimale bijkomende schade door het gebruik van uitwendig aangelegde, geconcentreerd, hoge intensiteit akoestische pulsen 2-4.

Door de unieke directe afschuifkrachten, alsmede cavitatiebellen gegenereerd door een hoge intensiteit ultrageluid, zijn deze methodieken in kankertherapie onderzocht voor de behandeling van castratieresistente prostaatcarcinoom en pancreas adenocarcinoom in een benadering bekend als high intensity focused ultrasound (HIFU ) 5-8. Op een wijze vergelijkbaar met ESWL, HIFU gebruikt meerdere ultrageluidbundels en richt ze op een geselecteerde concentratiegebied aan temperaturen van 60 ° C of hig genererenhaar door het gebruik van akoestische energie, coagulatieve necrose induceren in het doelweefsel 5. Hoewel andere modaliteiten thermische ablatie momenteel bestaan ​​(radiofrequente ablatie en microgolf ablatie), HIFU biedt een duidelijk voordeel ten opzichte van deze methoden, dat is de enige niet-invasieve hyperthermisch modaliteit 5. HIFU heeft bereikt gemengde resultaten in de kliniek en is momenteel alleen beschikbaar in klinische studies 8-11. Niettemin hebben het beperkte succes dat heeft bereikt, en de veelbelovende in vivo data verkregen van preklinische zoogdieren modellen van het potentieel van ultrageluid in de behandeling van kanker aangetoond.

In een poging om HIFU verbeteren hebben onderzoekers geprobeerd om ultrageluid te combineren met geschikte antineoplastische middelen een vorm van sonochemotherapy genereren. Sonodynamic therapie (SDT) is een veelbelovende nieuwe behandeling modaliteit heeft aangetoond indrukwekkende antineoplastische activiteit in zowel in vitro en 1. Het is aangetoond dat ultrageluid voorkeur schade kwaadaardige cellen op basis van het verschil grootte tussen dergelijke cellen en die van normale histologie 1,5. SDT bevat gespecialiseerde agenten bekend als sonosensitizers om de omvang van de preferentiële schade die wordt uitgeoefend door ultrageluid tegen neoplastische cellen te verhogen. Terwijl therapeutische toepassingen van SDT eerder zijn onderzocht, ultrasone systemen maken gebruik doorgaans hogere frequentie ultrageluid (≥1 MHz), en de gevolgen van lage kHz ultrasone trillingen is nog niet volledig onderzocht. Lagere frequenties van ultrageluid worden vaak bedreven in het produceren inertiale cavitatie, een verschijnsel dat resulteert in de vernietiging van de cellen door de snelle instorten microbellen induceren fysicochemische schade 14/12. Dit verschil in de vorming van inertiale cavitatie tussen MHz en lage kHz ultrasound is toegeschreven aan het feit dat lagere golffrequenties mogelijk microbelletjesis meer tijd om te groeien door verholpen diffusie in de uitbreiding halve cyclus, dus het produceren van meer gewelddadige instortingen tijdens de volgende compressie halve cyclus 12.

We hebben eerder aangetoond dat U937 humane monocytische leukemie cellen zijn gevoelig voor lage frequenties ultrageluid (23,5 kHz) en dat deze gevoeligheid sterk kan worden verhoogd door toepassing van taxanen die het cytoskelet 15 verstoren. Verder hebben we aangetoond dat cellen worden beschadigd bij voorkeur op basis van grootte, met grotere cellen vertonen hogere ultrasone gevoeligheid. Daarnaast normale humane hematopoïetische stamcellen (hHSCs) en leukocyten bij vergelijkbare celgrootte zijn veel beter bestand tegen sonicatie dan hun tegenhangers neoplastische 15, voorlopig suggereert dat lage frequentie ultrageluid kan worden gebruikt om bij voorkeur beschadigen kwaadaardige cellen in de aanwezigheid van normaal weefsel.

Om verder te onderzoeken van de unieke propschappen laagfrequent ultrageluid voor potentiële therapeutische toepassing hebben we het schoonmaken en stabilisatie procedures ontwikkeld om de effectiviteit en de betrouwbaarheid van één van de huidige sonicatie leiden en zo de Branson Model SLPe 150 W, 40 kHz Cell Disrupter, uitgerust met een 20 mm hoorn aangebracht in een 7,62 cm cup. Verder zijn we in staat om nauwkeurige sample cavitatie energieën en samenhangende golfvormen en amplitude binnen het 40 kHz met een cavitatie meter en oscilloscoop hydrofoon was bepaald. Door raffinage en systematiseren onze protocollen, zijn we in staat om de consistentie te vestigen in onze experimentele sonicaties, waardoor we kwantitatief vergelijken de sonische gevoeligheden van neoplastische en normale cellen van verschillende histogenetic geslachten geweest. Ons protocol voor de 40 kHz-systeem wordt gepresenteerd in uitgebreide detail om voor geïnteresseerde laboratoria in staat zijn van het uitvoeren van vergelijkbare experimenten, en onze bevindingen van de antineoplastische effecten uitgelokt door te evaluerenlage frequentie echografie. Verder wordt ingegaan op de dosisafhankelijke effecten van methyl-β-cyclodextrine (MeβCD Figuur 1), een cholesterol-afbrekende middel, op een verbeterde ultrasone gevoeligheid van U937 en THP1 humane monocytische leukemiecellen.

Protocol

1. Reinigen Cell Sonifier System

  1. Reinig de unie tussen de hoorn en converter met chloroform en een uitstrijkje van katoen. Breng een lichte olie of minerale olie aan op de schroefdraad van de hoorn en de converter om opbouw van metalen spaanders, roest, of oxidatie verder te verwijderen.
  2. Gebruik chloroform om de olie en andere verontreinigingen uit de vereniging na het afvegen van de draden met olie.

2. weer in elkaar zetten van de Cel Sonifier en het opzetten van het systeem

  1. Bevestig de hoorn op de converter. Om goed koppel het systeem verwijdert de verzamelde converter en hoorn uit de beker samenstel door aan de hoorn uit de bodem van de beker (Figuur 2A). Plaats een slot sleutel in één van de drie kleine gaten bij de bovenkant van de converter (Figuur 2B). Vervolgens plaatst u een momentsleutel uitgerust met de voet een ½ inch kraai op het langwerpige deel van de hoorn (Figuur 2B). Draai in standaard klok mee, totdat het draaimoment meterstanden 54,23 N. m (figuur 2C), het koppel door de fabrikant aanbevolen 16. Monteer de aangescherpte converter en hoorn terug in de beker, en monteer de hoorn en converter om een ​​ring stand in een rechtopstaande positie. Bevestig de omvormer op de voeding voordat u het systeem voor de experimentele pulse dosering.
  2. Stel het systeem voor de pulse doseren met behulp van 1 sec van sonicatie met 1 seconde tussen de pulsen. Verschillende dosering modellen kunnen worden gebruikt voor andere experimentele omstandigheden. Vele variabelen, zoals water volume en hoorn diameter zou mogelijk wijzigingen in deze dosering. De hiervoor genoemde celmonster types, volume en concentratie empirische gegevens en observatie heeft geleid tot het formuleren van dit doseringsschema.
  3. Stel het systeem om de gewenste amplitude. In dit protocol gebruikt 33% en 50% amplitude om volledige celvernietiging, die het effect aantonen van sonosensit, te voorkomenizers moeilijk of onmogelijk te meten.
    LET OP: In deze studie wordt de amplitudes worden vergeleken.

3. Het beoordelen System Intensity en functie

  1. Houd de cavitatie meter van 1,5 cm, de hoogte van het monster sonicatie. Let op de metingen te beoordelen of het systeem draait op een verwachte intensiteit. Met behulp van het huidige systeem en waterstanden, verwachten tussen 100-110 W / cm 2 voor 33% amplitude en 115-125 W / cm 2 voor 50% amplitude. Let op de cavitatie meterstanden van de meter display dat cavitatie energie vertegenwoordigt in W / cm 2 direct. Neem deze metingen aan het oppervlak van het water en zodat er geen luchtbellen aan de voorzijde van de meter probe.
    OPMERKING: Het is belangrijk op te merken dat deze procedures worden gedaan zonder de dop voor de toegang boven de hoorn. Zij behoeven niet te worden herhaald na elke sonicatie. Integendeel, ze moeten alleen worden uitgevoerd na het reinigen, monteren, en het opzetten van het systeem. Plaats de hydrofoon in een monsterflesje met 12,5 ml water om de hydrofoonsensor volledig onderdompelen. Hang de hydrofoon met behulp van de ring staan.
  2. Bevestig de hydrofoon met de ingang van de oscilloscoop om pulsgolf beoordelen. Onderzoek de oscilloscoop voor een duidelijke sinus, zoals afwijkende golven van de frequentie van het systeem kan veranderen van de specificaties van de fabrikant. Zowel de cavitatie meter en oscilloscoop geven leesfrequentie, maar alleen de oscilloscoop afwijkende golven die wijzen op een defecte systeem of onjuiste samenstel tonen.

4. Voorbereiding van de Cellen en Medium

  1. Bereid het medium met 240 ml Iscove's gemodificeerd Dubecco's medium (IMDM) en 50 ml foetaal runderserum. Niet ontdooien foetaal runderserum in een warmwaterbad, zoals snelle stijging van de temperatuur kan leiden tot een compromis in het serum stabiliteit. Combineer 240 gl gentamicine 50 mg / ml en 5 ml penicilline/ Streptomycine 100x in een standaard kweekkolf, en aan het medium. Bewaar het medium bij 4 ° C.
  2. Zaad U937 cellen op ~ 4 x 10 4 cellen / ml in een 25 cm2 kolf het bereide medium. Beoordelen cellen voor de concentratie en de levensvatbaarheid gebruik van een TC20 celgetalmeter en trypaanblauw uitsluiting door het plaatsen van 15-20 ul van cellen en 15-20 pi trypan blauw in een micro-centrifugebuis en het mengen van de inhoud. Pipette15-20 ul van dit mengsel in een TC20 sampling glijbaan, en initiëren tellingen door het plaatsen van de dia in de TC20 cel teller.
  3. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2, en controleer op levensvatbaarheid van de cellen met behulp van trypan blauw uitsluiting en de TC20 cel teller. Wanneer de cellen bij een geschikte concentratie en / of zijn behandeld met sonosensitizers gedurende een geschikte tijd, overdracht 3 ml cellen uit de kolf naar een 20 ml glazen scintillatieflesje. In dit protocol, groei U937 cellen gedurende 48 uur en daarna behandel met 0,5, 1,of 5 mM MeβCD gedurende 30 minuten voldoende afbrekende de cholesterol van de cellen voorafgaand aan sonicatie.

5. Cell Sonicatie

  1. Degas gedeïoniseerd, gedestilleerd water met behulp van een vacuüm en Buchner kolf. Breng het water aan de beker hoorn en vult tot een niveau van 15 mm boven de bovenzijde van de hoorn. De sonicatie werkwijze veroorzaakt verdere ontgassing van het water gedurende enkele minuten, en kan leiden tot inconsistenties in de loop van het experiment als het systeem niet wordt uitgevoerd voorafgaand aan sonicatie proeven. Daarom lopen het systeem voor de ~ 7 min voorafgaand aan sonicatie proeven.
  2. Bevestig de scintillatieflesje met daarin de cellen aan de vasthoudinrichting. Maak dan de vasthoudinrichting aan de bovenkant van de beker hoorn en ingesteld op een hoogte van 15 mm vanaf de bovenkant van de hoorn (aan het wateroppervlak met het schuifmechanisme).
  3. De cellen worden typisch gesonificeerd met behulp van drie 1 sec pulsen van ultrageluid met 1 sec tussenruimte tussen elk van deze pulsen. Hiervoorprotocol, ultrasone trillingen cellen bij 33% en 50% amplitude met de bovenvermelde pulse dosering.

6. Beoordeling van Cellen voor Schade Post-ultrasoonapparaat

  1. Beoordelen van de geschorste cellen voor schade en levensvatbaarheid met trypanblauw en de TC20 cel teller. Daarnaast analyseert het monster met behulp van een Z2 teller. Voor Z2 teller analyse, pipet 100 ul celsuspensie in 20 ml isotone zoutoplossing (200: 1 verhouding). Voorafgaand aan analyse, spoelen de opening van de Z2 deeltjesanalysator ten minste tweemaal met een isotone zoutoplossing. Plaats de Z2 monster in de teller houder, en het platform om het diafragma te verhogen voor het begin telt.
  2. Verwerven van de gegevens van de TC20 en Z2-teller met behulp van software van de fabrikant. Analyseer deze gegevens voor beschadiging van cellen, de levensvatbaarheid, en de oprichting van cellulaire puin van sonicatie.

7. XTT Assay aan levensvatbaarheid van de cellen bepalen en mitochondriale activiteit van de behandelde U937 en THP1 Cellen

  1. Prior de XTT testen groeien U937 en THP1 cellen onder dezelfde omstandigheden. Voorbehandelen cellen met dezelfde concentratie reeks MeβCD gedurende 30 minuten voorafgaand aan sonicatie. Gebruik dezelfde ultrasone parameters als hiervoor, behalve dat de cellen nu gesonificeerd met behulp van diverse 1-3 een seconde pulsen op afstand één seconde uit elkaar om verschillende schade XTT kit evaluatiesysteem opzetten.
    Opmerking: Veel van deze stappen worden direct uit de XTT-kit manual genomen en worden alleen herhaald voor het gemak van geïnteresseerde laboratoria.
  2. Verzamel cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 10 min. Resuspendeer celpellet in het groeimedium eerder beschreven. Resuspendeer cellen op ~ 1 x 10 5 cellen / ml. Zaad U937 cellen bij 100 gl per putje in een platte-bodem 96-putjes microtiterplaat in drievoud, en herhaal voor THP1 cellen met een afzonderlijke 96-wells plaat. Omvat 3 controleputjes met 100 ul compleet groeimedium alleen als blanco absorptiemetingen. Vervolgens incubeer de geënte platen voor 24 uur.
  3. Ontdooi twee aliquots van de XTT-reagens en de activering reagens bij 37 ° C vóór gebruik. Swirl porties zachtjes tot heldere oplossingen worden verkregen. Voeg 0,1 ml van de activatie reagens 5,0 ml van de XTT-reagens, die voldoende geactiveerde XTT oplossing voor een 96-well microtiter plate assay vormt. Doe hetzelfde voor de andere plaat.
  4. Voeg 50 ul van de geactiveerde XTT-oplossing in elk putje. Zet de plaat om de celkweek CO 2 incubator gedurende 2 uur. Schud de plaat voorzichtig na de incubatietijd in de positieve putten gelijkmatig te verdelen de oranje kleur. Meet de absorptie van de test wells met de cellen en de blanco achtergrond controleputjes bij een golflengte van 450-500 nm met behulp van een microtiter plaatlezer.
  5. Ofwel nul de microtiter plaatlezer met de blanco controle wells of aftrekken de gemiddelde waarde van de specifieke resultaten. Meet de absorptie van alle wells assay weer een wavelength tussen 630-690 nm en aftrekken van de waarden van 450-500 nm verkregen waarden. Opmerking: Deze tweede absorptie bepaling helpt niet-specifieke lezingen uit de test resultaten te elimineren. De XTT assay werd vier maal herhaald voor beide cellijnen.

Representative Results

Stabiliteit van het systeem is van groot belang bij het verkrijgen van reproduceerbare en betrouwbare resultaten. De juiste torsie specificatie van 54,23 N. M bereikte goede koppeling van de transducer en sonotrode 2, met de consistentie van de golfvorm door middel van een oscilloscoop en hydrofoon (figuur 3A) wordt beoordeeld. Figuur 3B toont metingen in het monsterbuisje en Figuur 3C beoordeelt stabiliteit binnen de beker hoorn. Zoals verwacht, werd de amplitude enigszins verminderd als gevolg van wat energie wordt geabsorbeerd door de glazen. Echter, de golfvorm niet verstoord of vervormd in ofwel B paneel of C, die nodig zijn voor betrouwbare levering van sonische energie op het monster. Een golfvorm die niet worden weergegeven als een duidelijke enkelvoud sinus duidt op een defecte transducer of oneigenlijk setup. Dit wordt uitgedrukt in Figuur 3D waarbij meerdere afwijkende golven toont een duidelijke afwezigheid van een sinus, en een frequentie lezen geent verwacht met een goed functionerend systeem. De cavitatie meter gebruikt om de cavitatie-energie (figuur 4) te meten vonden de geluidsintensiteit tot 100-110 W / cm2 bij 33% amplitude, en 125-130 W / cm2 bij 50% amplitude.

Zodra het 40 kHz-systeem op geschikte wijze geijkt en werd geassembleerd in zijn geheel (figuur 5), werd als betrouwbaar celvernietiging gemakkelijk bereikt, zoals bepaald door zowel de TC20 en Z2 tellers (figuur 6). Zoals verwacht, was uitgebreider celbeschadiging waargenomen in celpopulaties gesonificeerd bij 50%, in plaats van op 33% amplitude. Niettemin, 33% amplitude is bruikbaar als een startpunt om potentiële sonische effect van toegediende middelen te detecteren, aangezien het produceert zichtbare schade, maar laat ruimte voor meer schade wordt gedetecteerd wanneer middelen worden toegepast op de versterking van ultrasone gevoelige karakter ervan. Dit wordt aangetoond in figuur 7A, waarbij hetdosisafhankelijke effecten van MeβCD voor potentiëren de ultrasone gevoeligheid van U937 cellen worden gepresenteerd. Hoewel niet gesonificeerd MeβCD-behandelde cellen waren zeer vergelijkbaar in levensvatbaarheid niet gesonificeerd, onbehandelde cellen, de levensvatbaarheid sterk gedaald na drie pulsen van 1 seconde 40 kHz ultrasoon toegepast. Bovendien wordt de afname in levensvatbaarheid na sonicatie dosisafhankelijk te zijn, zoals 5 mM MeβCD produceerde de grootste daling in aantal cellen, gevolgd door 1 mM, en 0,5 mM MeβCD.

Soortgelijke effecten op cellevensvatbaarheid en mitochondriale activiteit werden waargenomen bij zowel U937 en THP1 cellen die werden behandeld met variërende concentraties MeβCD vóór sonicatie, zoals gemeten met de XTT-kit (Figuur 7B). Hoewel THP1 cellen blijken iets sonic resistenter dan U937 cellen is, worden zowel menselijke leukemie leidingen beschadigd op een dosisafhankelijke wijze. Hogere concentraties van MeβCD en meer pulsen van ultrageluid produced de laagste reductie van XTT tot een oplosbaar, felgekleurde oranje derivaat zowel U937 en THP1 cellen, overeenkomend levensvatbaarheid van de cellen en mitochondriale activiteit verlagen.

Figuur 1
Figuur 1. Moleculaire structuur van methyl- β-cyclodextrine. (A) volledige constructie van methyl-β-cyclodextrine (MeβCD). (B) MeβCD is een polymeer van zeven herhalingseenheden met een R groep hetzij H of CH3. Moleculaire Formule: C 56 H 98 O 35. Moleculair gewicht = 1.331,36.

Figuur 2
Figuur 2. Goed koppelmanchet de 40 kHz ultrasoundsysteem. (A) De claxon converter verwijderd uit de beker PRIof koppelmanchet. (B) Plaats de sleuf sleutel en momentsleutel op hun respectievelijke posities. (C) Breng 54,23 N. M van het koppel in een richting van de klok voordat opnieuw bevestigen van de hoorn en converter om de beker.

Figuur 3
Figuur 3. Gebruik van een oscilloscoop voor de golfvorm van het ultrasone systeem karakteriseren. (A) Een oscilloscoop met hydrofoon kan worden gebruikt om de amplitude en golfvorm consistentie evalueren. (B) een opname die met de kop boven de hoorn op 1,5 cm en gesteld op 33% amplitude. (C) De golfvorm hier afgebeeld is uit te lezen verworven wanneer de hydrofoon wordt geplaatst binnen de 20 ml glazen scintillatieflesje. Het flesje wordt gepositioneerd op 1,5 cm boven de hoorn en opnieuw vastgesteld op 33% amplitude. (D) Een oscilloscoop screenshot ofa-systeem met afwijkende frequenties zoals zou worden verwacht met een defecte systeem of onjuiste koppeling van de hoorn converter unie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Toepassing van een cavitatie meter om de geluidsintensiteit van het ultrasone systeem te karakteriseren. De cavitatie meter gezien hier wordt gebruikt om cavitatie te energie representeren in W / cm 2. Dit is een zeer belangrijk instrument om consistentie van energie ten opzichte van het monster.

Figuur 5
Figuur 5. Belangrijke onderdelen van de 40 kHz echo-systeem. De ultrasone systeem is compleet met kop hoorn getoond ( (B), de module (C) en monster positioneringsmechanisme (D). Dit ontwerp zorgt voor een gemakkelijke plaatsing van het monster (E) boven de hoorn (F).

Figuur 6
Figuur 6. Effect van verschillende amplitude van de ultrasone lysis van U937-cellen met de TC20 en Z2 tellers. Cellen werden gesoniceerd met 40 kHz cel dismembrator bij 33% amplitude (100-110 W / cm 2) of 50% amplitude (125-130 W / cm 2) met behulp van drie 1 sec pulsen van ultrageluid met 1 sec afstand tussen elke van deze pulsen. (A) Een screenshot van de teller Z2 software toont het effect van sonicatie op U937 cellen. (B) De gegevens van de TC20 teller werden in een grafiek opgesteld om de reproduceerbaarheid van de resultaten te tonens. Deze gegevens omvatten het totale en levende celtellingen, alsmede de trypan blue cellevensvatbaarheid geëvalueerd. Bars weerspiegelen de standaardafwijking van het gemiddelde (SEM) voor 4 onafhankelijke celpopulaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7
Figuur 7. Effect van methyl- β-cyclodextrine op potentiërende de ultrasone gevoeligheid van U937 en THP1 cellen. (A) U937-cellen werden behandeld met variërende concentraties van MeβCD gedurende 30 min voorafgaand aan wordt gesonificeerd bij 40 kHz ultrasound (105 W / cm 2 ) met behulp van drie 1 sec pulsen afstand 1 sec elkaar. Celpopulaties werden gegroepeerd in ≥12 um en ≥17 um. (B) U937 of THP1 cellen werden opnieuw behandeld met variërende concentrantsoen MeβCD gedurende 30 minuten alvorens te worden gesoniceerd met 40 kHz systeem met 1-3 pulsen van 1 seconde ultrasone afstand 1 sec elkaar. Levensvatbaarheid van de cellen en mitochondriale activiteit werden gemeten met de XTT-kit. 100 gl cellen per well in een platte-bodem 96-putjes microtiterplaat. De plaat werd gedurende 24 uur voorafgaande aan de toevoeging van XTT-oplossing. Cellen werden daarna gedurende nog eens 2 uur voor de golflengte werd gelezen. Bars weerspiegelen SEM voor 4 onafhankelijke celpopulaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Om optimale resultaten te bereiken, moet bijzondere zorg worden genomen om zorgvuldig te positioneren het monster en het reinigen van de converter-hoorn unie. De plaatsing van het monster in de hoorn is belangrijk voor het verkrijgen van consistente celdestructie, het veranderen van de afstand tussen de hoorn de akoestische foci wijzigen en derhalve de energie het monster bloot te wijzigen. De akoestische energie in de beker hoorn kan worden toegewezen met de cavitatie meter om de positie van maximale cavitatie vinden. Bovendien, de cavitatie meter, samen met de oscilloscoop zijn essentieel voor het bepalen van de geluidsintensiteit de cellen worden blootgesteld, en de homogeniteit van de golfvorm. Daarom dienen deze instrumenten worden gebruikt om problemen te ontdekken met het systeem, en te bepalen welke problemen kunnen nodig zijn om systeeminstabiliteit corrigeren.

Zoals eerder vermeld, kan de laagfrequente systeem gedurende het experiment als niet gedraaid treden verder ontgast waterenkele minuten voorafgaand aan sonicatie proeven. Deze eerste run moet worden uitgevoerd om een ​​relatief ontgast sonicatie medium en dus consistente resultaten tijdens de experimenten opleveren. Bovendien moeten de cellen niet gesoniceerd op of nabij het maximum amplitude bij de beoordeling van de werkzaamheid van sonosensitizers, als ware omvang van sensibilisatie moeilijk te beoordelen zijn. Met 33% amplitude over het 40 kHz-systeem een ideale instelling waarbij produceert aanzienlijke schade, maar biedt sonosensitizers voldoende ruimte om de werkzaamheid aan te tonen, zoals aangetoond met MeβCD tegen U937 en THP1 cellen (figuur 7). Deze gegevens bevestigen ook dat MeβCD sensibiliseert meerdere leukemie lijnen laagfrequente ultrageluid op een dosisafhankelijke wijze.

Er zijn een aantal experimenten uitgevoerd met een hogere frequentie in het bereik van 0,75 MHz tot 8 MHz die tekenen van intramembrane cavitatiebubbels door middel van sonicatie 17-19 gegenereerd zijn. Echter, VRAGEnS nog met betrekking tot het exacte mechanisme van door ultrageluid geïnduceerde cellyse 18 blijven. We hebben een verband aangetoond tussen fluïdiseren het cytoskelet en verhoogde gevoeligheid sonic middels laagfrequente ultrageluid 15, een verschijnsel blijkt uit andere laboratoria 20, 21. Verder hebben we vastgesteld dat de gloeidraad verstoren middelen zoals cytochalasine B potentiëren ultrasone gevoeligheid in meerdere leukemie lijnen, maar niet hHSCs of leukocyten 22, hetgeen suggereert dat remming van actine polymerisatie kan een sonosensitizing mechanisme van bijzonder belang. We hebben ook waargenomen dat vincristine, een microtubule-verstorende middel dat tubulinepolymerisatie 23, 24 remt, aanzienlijk verhoogt de ultrasone gevoeligheid van verschillende types leukemie in vitro waaronder acute myeloïde leukemie, chronische myeloïde leukemie en acute lymfatische leukemie. Daarentegen-cytoskelet gerichte middelen die cytoskelet componenten stabiliseren (paclitaxel eend jasplakinolide) lijken cellen resistent tegen sonicatie, weerspiegeld door de lagere tarieven van cellysis 22 te maken. Tezamen ondersteunen deze gegevens de hypothese dat het cytoskelet componenten van neoplastische cellen fluïdiserende inderdaad een belangrijke factor bij het ​​vergroten van de effectiviteit van SDT 25. De onderhavige studie toont ook aan dat cholesterol depletie andere methode om verder te versterken de ultrasone gevoeligheid van neoplastische cellen, MeβCD behandelde U937 cellen aanzienlijk gevoelig zijn voor 40 kHz ultrageluid kan zijn.

Terwijl onze sonicatie protocollen aanzienlijke antineoplastische activiteit in vitro hebben aangetoond, is de huidige methode voor werk dat in cultuur kleine vertebrate modellen die kunnen passen in de flesjes voor ultrasoonapparaat zijn. We hebben aangetoond dat zebravis veilig worden gesonificeerd met behulp van gepulseerde lage ultrasone trillingen (20 kHz) en dat de tolerantie voor chemotherapeutische middelen kwantitatief vergelijkbaardoses getolereerd door knaagdiermodellen 26, wat suggereert dat tumordragende zebravis worden gebruikt vooronderzoek de in vivo antineoplastische activiteit van deze protocols evalueren. Niettemin toedienen chemotherapeutische middelen voorafgaand aan sonicatie van Zoogdiermodellen gerapporteerd in de 1 MHz, en dergelijke protocollen kan waarschijnlijk worden uitgebreid tot lage frequenties ultrageluid, en cholesterol kunnen aantasten en cytoskelet gerichte middelen bevatten.

Potentiële klinische toepassingen van deze vorm van SDT kunnen extracorporele bloed sonicatie waarin taxanen intraveneus toegediend (iv) voorafgaand aan het bloed worden verwijderd ultrasoonapparaat 25 omvatten. Deze methode verwijdert mogelijke geluidsschermen's van menselijke anatomie, en kunnen een effectieve manier om leukemische ontploffing, alsook metastasen beschadigen van vaste tumoren. Het is ook mogelijk dat cholesterol-aantasten en cytoskelet gerichte middelen kunnenworden gebruikt HIFU protocollen die reeds in de kliniek onderzocht in een poging om de werkzaamheid van deze behandelingsmodaliteit te verbeteren.

De in deze studie beschreven methoden zijn in staat van de beoordeling van de waarde van de potentiële sonosensitizers, en verder het systeem verfijning kan dit hulpprogramma verbeteren. Er zijn echter vele variabelen te overwegen bij het gebruik van dergelijke ultrasone inrichtingen, inclusief voeding kwaliteit, akoestische foci en variaties tussen converters. Daarom zal toekomstig onderzoek zich richten op het visualiseren van de geluidsgolven en het begrijpen van hun invloed op de resultaten. SDT heeft aangetoond dat cellysis in vitro te versterken en kan blijken klinisch haalbaar als meer in vivo data in zoogdierlijke modellen verkregen worden. Experimenten om andere potentieel bruikbare kenmerken van kwaadaardige cellen, en verschillende gecombineerde modaliteiten waarbij meerdere agentia en ultrageluid verder in ons laboratorium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes  Life Technologies 12440079
Amphotericin B Solution  Sigma-Aldrich A2942 
Penicillin/Streptomycin 100x Solution  Life Technologies 10378-016
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12105
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn Branson Ultrasonics 101-063-726 sonication device
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000 ml Beaker Heater Brisk Heat SDCJF1A-GBH1000-1 heater used for temperature control
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software Beckman-Coulter 6605700
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0102
Gentamicin 50 mg/ml Sigma-Aldrich G1397 
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
Falcon 50 ml & 25 ml Vented Culture Flasks Fisher Scientific 353082
Lonza L-Glutamine 200 mM 0.85% NaCl Lonza 17-605C 
Seal-Rite 1.5 ml Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Vials and caps Beckman-Coulter  A35473
AccuJet Pro Auto Pipet  BrandTech Scientific 26330
USA Scientific 10 ml Disposable Serological Pipets USA Scientific 1071-0810
Tip One 100 μl and 1,000 μl Filter Tips USA Scientific 1120-1840, 1126-7810
100 μl Micropipette  Wheaton 851164
1,000 μl Micropipette Wheaton 851168
BioRad Dual Chamber Counting Slides Bio-Rad 145-0015
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator Forma Scientific 3131
Tektronix  DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope Tektronix DPO2002B used to measure the ultrasonic waveform
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter PPB Megasonics PB-500  used to assess the sound intensity in W/cm2
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone Teledyne TC4013-1  connects to the oscilloscope 
Wheaton 250 ml Flasks Sigma-Aldrich Z364827
20 ml Glass Scintillation Vials  Sigma-Aldrich Z190527
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution  Beckman-Coulter N/A diluent for Z2 counter
Chloroform 99% Sigma-Aldrich C2432
Ethanol 200 Proof Anhydrous  Sigma-Aldrich 459836
Mineral Oil N/A
XTT Cell Proliferation Assay Kit ATCC 30-1011K
96-Well Microplate Reader Cole-Palmer  EW-13055-54
U937 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC CRL­1593.2
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC TIB-202

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trendowski, M. The promise of sonodynamic therapy. Cancer Metastasis Rev. 33, (1), 143-160 (2014).
  2. Semins, M. J., Trock, B. J., Matlaga, B. R. The effect of shock wave rate on the outcome of shock wave lithotripsy: A meta-analysis. J Urol. 179, (1), 194-197 (2008).
  3. Pace, K. T., Ghiculete, D., Harju, M., Honey, R. J. Shock Wave Lithotripsy at 60 or 120 shocks per minute: A randomized, double-blind trial. J Urol. 174, (2), 595-599 (2005).
  4. McClain, P. D., Lange, J. N., Assimos, D. G. Optimizing shock wave lithotripsy: a comprehensive review. Rev Urol. 15, (2), 49-60 (2013).
  5. Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nat Rev Drug Discov. 4, (3), 255-260 (2005).
  6. Cordeiro, E. R., Cathelineau, X., Thüroff, S., Marberger, M., Crouzet, S., de la Rosette, J. J. High-intensity focused ultrasound (HIFU) for definitive treatment of prostate cancer. BJU Int. 110, (9), 1228-1242 (2012).
  7. Li, P. Z., et al. High-intensity focused ultrasound treatment for patients with unresectable pancreatic cancer. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 11, (6), 655-660 (2012).
  8. Xiaoping, L., Leizhen, Z. Advances of high intensity focused ultrasound (HIFU) for pancreatic cancer. Int J Hyperthermia. 29, (7), 678-682 (2013).
  9. Lukka, H., et al. High-intensity focused ultrasound for prostate cancer: a systematic review. Clin Oncol (R Coll Radiol). 23, (2), 117-127 (2011).
  10. So, A. I. HIFU ablation is not a proven standard treatment for localized prostate cancer). Can Urol Assoc J. 5, (6), 424-426 (2011).
  11. Crouzet, S., et al. Whole-gland ablation of localized prostate cancer with high-intensity focused ultrasound: oncologic outcomes and morbidity in 1002 patients. Eur Urol. 65, (5), 907-914 (2014).
  12. Tezel, A., Mitragotri, S. Interactions of inertial cavitation bubbles with stratum corneum lipid bilayers during low-frequency sonophoresis. Biophys J. 85, 3502-3512 (2003).
  13. Tang, H., Wang, C. C., Blankschtein, D., Langer, R. An investigation of the role of cavitation in low-frequency ultrasound-mediated transdermal drug transport. Pharm Res. 19, (8), 1160-1169 (2002).
  14. Ueda, H., Mutoh, M., Seki, T., Kobayashi, D., Morimoto, Y. Acoustic cavitation as an enhancing mechanism of low-frequency sonophoresis for transdermal drug delivery. Biol Pharm Bull. 32, (5), 916-920 (2009).
  15. Trendowski, M., Yu, G., Wong, Y., Aquafondata, C., Christen, T., Fondy, T. P. The real deal: Using cytochalasin B in sonodynamic therapy to preferentially damage leukemia cells. Anticancer Res. 34, (5), 2195-2202 (2014).
  16. Sonifier Cell Disrupter Model SLPeEDP. Branson Ultrasonics Corporation. Available from: http://www.emersonindustrial.com/en-US/documentcenter/BransonUltrasonics/Sonifier_Brochure.pdf (2010).
  17. Lagneaux, L., et al. Ultrasonic low-energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells. Exp Hematol. 30, (11), 1293-1301 (2002).
  18. Krasovitskia, B., Frenkelb, V., Shohama, S., Kimmel, K. Intramembrane cavitation as a unifying mechanism for ultrasound-induced bioeffects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, (8), 3258-3263 (2011).
  19. Sundaram, J., Mellein, B. R., Mitragotri, S. An experimental and theoretical analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes. Biophys J. 84, (5), 3087-3101 (2003).
  20. Mizrahi, N., et al. Low intensity ultrasound perturbs cytoskeleton dynamics. Soft Matter. 8, (8), 2438-2443 (2012).
  21. Chen, X., Leow, R. S., Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Single-site sonoporation disrupts actin cytoskeleton organization. J R Soc Interface. 11, (95), 20140071 (2014).
  22. Trendowski, M., et al. Preferential enlargement of leukemia cells using cytoskeletal-directed agents and cell cycle growth control parameters to induce sensitivity to low frequency ultrasound. Cancer Lett. In press, (2015).
  23. Dumontet, C., Sikic, B. I. Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents: Microtubule dynamics, drug transport, and cell death. J Clin Oncol. 17, (3), 1061-1070 (1999).
  24. Verrills, N. M., Kavallaris, M. Improving the targeting of tubulin-binding agents: lessons from drug resistance studies. Curr Pharm Des. 11, (13), 1719-1733 (2005).
  25. Trendowski, M. The inherent metastasis of leukaemia and its exploitation by sonodynamic therapy. Crit Rev Oncol Hematol. In press, (2014).
  26. Trendowski, M., Wong, V., Wellington, K., Hatfield, S., Fondy, T. P. Tolerated doses in zebrafish of cytochalasins and jasplakinolide for comparison with tolerated doses in mice in the evaluation of pre-clinical activity of microfilament-directed agents in tumor model systems in vivo. In Vivo. 28, (6), 1021-1031 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics