Ein organ High Throughput-System zur Charakterisierung von Arzneimittelempfindlichkeit von Primary Multiple Myelomzellen

Medicine

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Silva, A., Jacobson, T., Meads, M., Distler, A., Shain, K. An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells. J. Vis. Exp. (101), e53070, doi:10.3791/53070 (2015).

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Abstract

In dieser Arbeit beschreiben wir einen neuen Ansatz, der ex vivo Arzneimittelempfindlichkeit Assays und digitale Bildanalyse kombiniert, um Chemosensitivität und Heterogenität der Patienten stamm multiplem Myelom (MM) Zellen zu schätzen. Dieser Ansatz besteht darin, Impfen primären Myelomzellen frisch aus Knochenmarkabsaugungen in mikrofluidische Kammern in Multi-Well-Platten durchgeführt, die jeweils aus einer Rekonstruktion der Knochenmarkmikroumgebung, einschließlich der extrazellulären Matrix (Kollagen oder Basalmembran-Matrix) und Stroma (extrahierten patienten Mesenchymale Stammzellen) oder vom Menschen stammenden Endothelzellen (HUVECs). Die Kammern werden mit verschiedenen Mitteln und Konzentrationen betäubt und sequentiell für 96 h durch Hellfeldmikroskopie visualisiert, in einem motorisierten Mikroskop mit einer Digitalkamera ausgestattet. Digitale Bildanalyse-Software erkennt lebenden und toten Zellen von Vorhandensein oder Fehlen der Membranbewegung und erzeugt Kurven der Veränderung der Lebensfähigkeit als Funktion of Wirkstoffkonzentration und Belichtungszeit. Wir benutzen ein Computermodell, um die Parameter der Chemosensitivität des Tumors Bevölkerung zu jedem Medikament, als auch die Anzahl der als Maß für die Tumorheterogenität vorliegenden Teilpopulationen zu bestimmen. Diese Patienten zugeschnittene Modelle können dann verwendet werden, um Therapieschemata zu simulieren und zu schätzen, das klinische Ansprechen werden.

Introduction

Das Ziel dieser Methode ist es, die Arzneimittelempfindlichkeit von multiplem Myelom (MM) zu charakterisieren primären Zellen zu einer Gruppe von Mitteln ex vivo, so nahe wie möglich zu physiologischen Bedingungen, und mit ausreichender Präzision, die diese Ergebnisse verwendet werden, um zu identifizieren chemoresistant sub- werden Populationen innerhalb des Tumorlast und letztlich um Rechenmodelle entwickelt, um das klinische Ansprechen schätzen parametrieren.

Rechenmodelle sind leistungsfähige Werkzeuge, um komplexe Systeme, wie Krebs-host-Therapie Wechselwirkungen zu analysieren. Jedoch sind Modelle nur so gut wie die Daten verwendet, um sie zu parametrieren. Leider können die meisten Daten in der Literatur noch nicht in seiner gegenwärtigen Form verwendet werden, um diese Modelle zu parametrisieren, da sie oft in gegenseitig exklusiven experimentellen Bedingungen erhalten werden. Somit werden neue Versuche oft mit dem Ziel, den Erhalt der benötigten Menge von Versuchsparametern erforderlich. Die meisten Lebensfähigkeitstests sind jedoch destruktiv und thuns auf eine kleine Anzahl von Zeitpunkten, die oft nur eine beschränkt. Diese stark behindert die Verwendung von Chemosensitivitätstests Rechenmodelle zu parametrieren, da solche Versuche fehlschlagen, um Informationen über die zeitliche Dynamik des Systems sorgen. Dies gilt vor allem mit primären Krebszellen, die oft auf wenige Millionen pro Probe begrenzt sind, und haben eine kurze Lebensdauer nach Biopsie, wodurch die Anzahl der Versuchsbedingungen verfügbar einschränkend. Zudem sind die meisten Lebensfähigkeitstests erfordern die Trennung der Krebs aus der Nicht-Krebs (Stroma) -Zellen bei der Quantifizierung, die zusätzliche Arbeit zum Protokoll hinzugefügt, weiterhin beeinflusst die Zellen und begrenzt die Anzahl der Experimente, die durchgeführt werden können .

Vor 40 Jahren, Lachs und Mitarbeiter 1 vorgeschlagenen ihren berühmten In-vitro-Koloniebildungstest für die Bewertung der Chemosensitivität von Tumorzellen. Leider ist dieser Assay gefunden gemischtem Erfolg aufgrund der geringen Anzahl der Mehrfach myeLoma (MM) Patientenproben, die zur Bildung von Kolonien unter Kontrollbedingungen waren: Es wurde geschätzt, dass nur eine kleine Untergruppe von 0,001% bis 0,1% MM-Zellen zur Replikation fähig sind, wobei das multiple Myelom-Stammzellen 2 bezeichnet. Diese deutlich eingeschränkt die Erfolgsrate des Assays und der Anzahl von Arzneimitteln, die gleichzeitig getestet werden konnten, auch in der neueren Modellen 3. Dieses Problem ist jetzt viel wichtiger, wenn MM Mittel (Standard oder experimentell) sind zahlreicher als vor vier Jahrzehnten.

Eine große Einschränkung dieser frühen Assays ist ihre dichotomisiert Ausgang entweder ein Patient "empfindlich" oder "resistent" auf ein bestimmtes Medikament. Es werden keine Informationen über den Grad der Empfindlichkeit und Heterogenität des Tumors Bevölkerung zur Verfügung gestellt. So würden Patienten mit kleinen Subpopulationen von schnell wachsenden resistenten Zellen als "sensibel" eingestuft werden, die Therapie, aber in Kürze zurückfallen und damit nicht beneFit von Behandlung. Angesichts der Bedeutung der Dauer der Reaktion im Gesamtüberleben (OS) von Krebspatienten 4,5, ist es klar, wie diese Tests waren nicht in der Lage, richtig zu schätzen OS konsequent.

Um diese Einschränkungen zu umgehen, und um patientenspezifische Rechenmodelle die personalisiert klinische Antwort auf eine Gruppe von Medikamenten abschätzen würde erzeugen zu können, haben wir ein Verfahren zur zerstörungsfreien Prüfung Arzneimittelempfindlichkeit von multiplem Myelom (MM) Zelllinien entwickelt und primären MM-Zellen in einem ex vivo Rekonstruktion des Knochenmark-Mikroumgebung, einschließlich der extrazellulären Matrix und Stroma 6. Dieser Test hatte jedoch die Begrenzung sich auf eine bestimmte kommerzielle mikrofluidischen Rutsche, deren Abmessungen und Kosten begrenzt die Anzahl von Experimenten oder Medikamente, die auf einmal in einem bestimmten Teil der Ausrüstung ausgeführt werden können.

Das hier beschriebene System erweitert diese ursprüngliche Test in einen Hoch-throughput organotypischen Dosis-Antwort-Plattform, für die in vitro-Screening von Drogen, bezogen auf ein digitales Bildanalysealgorithmus zerstörungs Quantifizierung der Lebensfähigkeit der Zellen. Jede Vertiefung 384 oder 1536-Well-Platten ist eine 3D-Rekonstruktion des Knochenmark-Mikroumgebung, einschließlich primären Myelomzellen, extrazelluläre Matrix, und vom Patienten stammende Stromazellen und Wachstumsfaktoren. Live-Mikroskopie und digitale Bildanalyse verwendet werden, um Zelltod Ereignisse in verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen, die verwendet werden, um die Dosis-Wirkungsflächen erzeugen detektieren. Aus der in-vitro-Daten, identifiziert ein mathematisches Modell der Größe und Chemosensitivität von Subpopulationen innerhalb der Tumorbelastung des Patienten, und kann verwendet werden, um zu simulieren, wie der Tumor würde zum Wirkstoff (e) unter physiologischen Bedingungen in einer klinischen Therapie 6 reagieren (BE Abbildung 1).

Die wichtigsten Neuerungen dieser Plattform sind: (a) kleine Anzahl von Krebszellen notwendig (1.000-10.000 pro Medikament concentration); (B) Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten in physiologischen Bedingungen (extrazelluläre Matrix, Stroma, Patienten stammende Wachstumsfaktoren); (C) keine Toxizität von Lebensfähigkeit Markierungen 7, da nur Hellfeldabbildung verwendet wird, also keine Notwendigkeit, Zellen mit Fluoreszenz 8 oder 9 Biolumineszenz transfizieren; (D) kontinuierliche Bildgebung bietet Arzneimittelwirkung in Abhängigkeit von Konzentration und Einwirkzeit (Pharmakodynamik); und (e) die Integration von in vitro und Rechen evolutionäre Modelle, um das klinische Ergebnis 6 (Silva et al., in Vorbereitung) zu schätzen.

Der Schlüsselfaktor, der die digitale Bildanalyse-Algorithmus, um Krebs von Stromazellen zu erkennen erlaubt, ist ihre unterschiedliche Affinität zu dem Boden der Vertiefung: MM Zellen nicht haften und verbleiben in Suspension in der Matrix, während die Stromazellen an der Unterseite der haften gut und dann dehnen.

Diese Trennung geschieht, obwohl MM und Stroma einWieder gleichzeitig ausgesät und während der O / N Verfahren Inkubation auftritt. Der Stillstand kommen, in der Zentrifuge folgenden Aussaat der Platte weiter beschleunigt diesen Prozess. Als Folge erscheinen MM-Zellen in dem Bild als helle runde Scheiben von einem dunklen Ring umgeben, während das Stroma ein niedriges Profil und einem dunkleren Farbton (Abbildung 2) unterhält. Daher ist der Assay in seiner gegenwärtigen Form am besten geeignet für nicht-adhärente Krebszellen, wobei Anpassungen in der Algorithmus könnte getrennte Krebs und Stroma durchgeführt werden, die auf anderen morphologischen Eigenschaften, wie Größe und Form. In diesem Protokoll beschreiben wir zwei Typen von extrazellulären Matrix (Kollagen und Basalmembran-Matrix) sowie zwei Arten von Co-Kulturen mit (Knochenmark abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen) BMSC und HUVECs, die die interstitielle und perivaskuläre Nischen des Knochenmarks verbunden.

Mit Hilfe eines 384-Well-Platte, 5 Konzentrationen pro Wirkstoff und zwei Wiederholungen, konnten wir test bis zu 31 verschiedene Medikamente mit der Probe eines einzelnen Patienten. In 1.536-Well-Platten ist diese Zahl 127. Figur 3 zeigt die Anordnung zur Zeit für die manuelle Zellbesiedelung verwendet, während Supplemental 1 stellt die optimale Verteilung mit einem Pipettierroboter. In der Gestaltung von Figur 3 kann jeder 384-Well-Platte 3 Patientenproben mit 7 verschiedenen Medikamenten oder einer Patientenprobe mit 21 getesteten Medikamente tragen. Jedes Medikament wird durch 5-Konzentrationen dargestellt, und jeder Zustand ist in Duplikate ausgesät. 4 Kontroll-Wells (kein Medikament hinzugefügt) werden für jeden Satz von 7 Medikamente (zB Bohrlöcher 36-39, 126-129 und 200-203) ausgesät. Um die Wirksamkeit der verwendeten Medikamente zu gewährleisten, ist auch eine menschliche Myelom-Zelllinie (zB H929 oder MM1.S) ausgesät und in Duplikaten bei der höchsten Konzentration von jedem der verwendeten (Brunnen 76-89) Drogen betäubt. Die positive Zelllinie Kontrolle sichergestellt, dass die verwendeten Medikamente eine ausreichende Wirksamkeit, da die Dosis-Wirkungs-Kurven sind vergleichbar across Experimente. Zwei Vertiefungen werden mit einer Myelomzelllinie, das als Kontrolle für die Umgebungsbedingungen ausgesät, in anderen Worten, um mögliche Probleme bei der Tischplatte Inkubator während der Bilderzeugung zu detektieren (Vertiefungen 75 und 90). Die Aufzählung der Vertiefungen folgt einem Zickzack-Muster, um den Abstand von der motorisierten Objekttisch des Mikroskops, die Erfassungszeit reduziert und reduziert den Verschleiß der Ausrüstung bedeckt reduzieren.

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Protocol

Die Verwendung von menschlichen Zellen aus Biopsien, wie unten beschrieben wurde von Moffitt der Institutional Review Board genehmigt und im Rahmen der klinischen Studie MCC # 14745 am H. Lee Moffitt Cancer Center und Research Institute durchgeführt abgeleitet.

1. Sortierung der MM Zellen aus Knochenmarkaspirate

  1. Sammeln Knochenmarkabsaugungen (20 ml) von Patienten in Natriumheparin Spritze.
  2. Mononukleäre Zellen durch Zentrifugieren verdünnter Mark (1: 1 mit sterilem PBS) über einen sterilen wässrigen Medium Zentrifugation Gradienten bei 400 xg für 30 min bei Raumtemperatur.
  3. Sammeln Sie die Schnittstelle, die die mononuklearen Zellen enthält. Waschen Sie die Zellen mit kaltem PBS und zählt mit einer Zählkammer oder automatische Zellzähler, unter Verwendung von Trypanblau zur Bestimmung der Lebensfähigkeit.
  4. Bereiten Sie eine Dünnschichtzelle Vorbereitung Schlitten 10 und Fleck mit Wright-Giemsa-Färbung an Plasmazellanteil 11 zu bewerten.
  5. Berechnendie Menge an CD138 Beads enthalten, um verwendet werden, um die Anzahl der Zellen und Plasmazellanteil. Wenn Ausgangsprobe weniger als 20% Plasmazellen, dann erneut zu suspendieren Zellen unter Verwendung von 90 ul der Trennpuffer und 10 ul CD138 Kügelchen pro 5 x 10 6 Zellen. Wenn Ausgangsprobe um mehr als 20% Plasmazellen, suspendiert unter Verwendung von 80 ul der Trennpuffer und 20 ul CD138 Kügelchen pro 1 x 10 7 Zellen.
  6. Zellen, die mit Perlen Inkubieren bei 4 ° C für 15 min.
  7. Pass-Zellen durch ein 35 um Sieb gegeben, um vorbenetzt Trennung (LS) Spalten in der magnetischen Feldtrennzeichen gesetzt (siehe Liste der Materialien).
  8. Entfernen Sie Spalte von Magneten. Sammeln CD138-ausgewählten Zellen durch die Säule 3-mal mit 1 ml Trennpuffer.
  9. Beurteilen CD138 Anreicherung mit anderen gefärbten Dünnschichtzelle Vorbereitung schieben 10.
  10. Filter Plasma von Knochenmark-Biopsie von jedem Patienten mit einer 0,22 um Spritzenfilter erhalten. Verwenden Frischplasmavon dem gleichen Patienten wie die CD138 + Zellen.
  11. Vorzubereiten Medien für Experiment durch Hinzu RPMI-1640 mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 10% Patientenplasma und 1% Penicillin-Streptomycin.
  12. Sammeln Sie die Durchfluss der Auswahl (CD138-) und folgen dem klassischen Klebeverfahren 12 bis zum Knochenmark mesenchymale Zellen (BMSCs) zu wählen. Da dieser Prozess erfordert Wochen vor BMSCs bereit sind, verwendet werden, ist es notwendig BMSCs bereit von früheren Patienten oder gesunden Spendern zu haben.

2. Seeding Zellen in Platten (unter Verwendung eines manuellen Mehrkanal-Pipetten)

  1. Verwenden Sie eine Multiwellplatte (384 oder 1536), mit schwarzen Wänden und einer transparenten flachen Boden, die für optische Anwendungen und Zellkultur bevorzugt eine optimiert.
  2. Co-Kultur BMSCs mit MM-Zellen entweder in Kollagen Typ I oder Basalmembranmatrix jedoch HUVECs erfordern Basalmembranmatrix.
  3. Halten Sie die endgültigen Dichten von jedem Zelltyp indie folgenden Bereich: 3 x 10 5 Zellen / ml für MM-Zelllinien, 2 x 10 5 Zellen / ml für HUVECs oder BMSCs und 2 x 10 6 Zellen / ml für Patienten stammende Myelomzellen.
    Anmerkung: Diese Dichten sind das Ergebnis experimentelle Optimierung für die höchstmögliche Bildqualität und eine möglichst lange Aufnahmezeit erlauben unter Erhalt der biologischen Relevanz in den Assays. MM Zelllinien werden bei niedrigeren Dichten als primären MM-Zellen aufgrund ihrer schneller Replikationsrate und größere Größe ausgesät.
  4. Co-Kultur von primären MM-Zellen mit BMSCs:
    1. Vorzubereiten 100 ul Aliquots von vorgemischten Medien, bestehend aus 20 ul 10x MEM, 20 & mgr; l deionisiertes H 2 O, 10 & mgr; l von 7,5% iger Natriumbicarbonatlösung und 50 ul 1x RPMI 1.640 und bei 4 ° C.
    2. Zum Zeitpunkt der Aussaat der Platten mit MM-Zellen zu mischen Aliquots von vorgemischten Medien mit 150 ul 3,1 mg / ml bovinem Kollagen Typ I zu einem Endvolumen von 250 ul.
    3. Re-suspEnde 50 & mgr; l Zellen in RPMI 1640 mit dem Sechsfachen der endgültigen gewünschten Dichte.
    4. Mischen, um Zellsuspension mit Kollagenmischung, um ein Endvolumen von 300 ul unter Verwendung eines P200-Pipette zu schaffen.
    5. Mit einem manuellen oder Repeater-Pipette, Hinterlegung einer 8 ul Tropfen endgültige Zell / Matrix-Mix in der Mitte jeder Vertiefung in 384-Well-Platten, oder 2 & mgr; l in jede Vertiefung der 1536-Well-Platten (siehe Schritt 2.6 ein Beispiel für räumliche Anordnung von Brunnen).
    6. Zentrifuge Platte für 2 Minuten bei 500 · g, um alle Zellen auf den gleichen Brennebene während der Bildgebung zu konzentrieren.
    7. Verlassen Platte in einem Inkubator (5% CO 2, 37 ° C) für 1 h zum Gelpolymerisation.
    8. Werden 80 & mgr; l supplementiertes Wachstumsmedium (RPMI-1640, 10% FBS HALLO, 10% Patienten stammenden Plasma, 1% P / S) zu jeder Vertiefung in Platten mit 384 Vertiefungen oder 8 ul in 1.536-Well-Platten.
    9. Verlassen Platte O / N im Inkubator (5% CO 2, 37 ° C) für die Haftung des Stroma zu der Unterseite der Platte.
  5. Co-Cu-lture von primären MM-Zellen mit HUVECs:
    1. Übertragungs Basalmembranmatrix von -80 ° C auf einen Eimer mit Eis auftauen.
    2. Zu zählen und zu resuspendieren primären Zellen und HUVECs in RPMI-1640-Medium bei 4-fachen der Enddichte, die jeweils in einem separaten Röhrchen.
    3. Mischungs Patienten Zellen und HUVECs Volumina bei einer 1: 1-Verhältnis.
    4. Sobald Basalmembranmatrix wird aufgetaut, aber noch nicht polymerisiert ist, mischen 1: 1 mit der Zellmischung aus dem vorherigen Schritt.
    5. Samentröpfchen mit ausreichenden Volumen von Zell-Matrix-Mischung in der Mitte jeder Vertiefung (8 & mgr; l für 384-Well-Platten und 2 ul für 1.536-Well-Platten, siehe Schritt 2.6 Ein Beispiel für die räumliche Anordnung der Vertiefungen).
    6. Zentrifugenplatte bei 500 × g für 10 min.
    7. Plazierungsplatte im Inkubator (5% CO 2, 37 ° C) für 1 h zur Matrix Polymerisation.
    8. Hinzuzufügen Wachstumsmedien (RPMI-1640, ergänzt mit 10% FBS, 10% Patientenplasma und 1% P / S) in jede Vertiefung (80 & mgr; l für 384-Well-Platten, 8 & mgr; l für 1,536-Well-Platten).
    9. Verlassen Platte O / N im Inkubator (5% CO 2, 37 ° C) für die Haftung von HUVECs mit dem Boden der Platte.
  6. Seed eine 384-Well-Platte, Fig. 3 zeigt eine typische räumliche Verteilung der Aussaat.
    1. Ab und B2, Samen so viele Spalten wie zu testenden Arzneimittel. Im Beispiel der Figur 3 verwenden sieben Drogen.
    2. Wiederholen Impfen so oft Konzentrationen verwendet werden. Im Beispiel der Figur 3 verwenden fünf Konzentrationen.
    3. Seed vier weitere Brunnen für Steuerbedingungen.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 2.6.1 und 2.6.2 für die zweite Replikation.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 2.6.1 bis 2.6.4 für jede Patientenprobe in der Platte getestet werden.
    6. Seed einen MM-Zelllinie in zwei Linien von Vertiefungen mit je so viele Brunnen wie Drogen, um (in zweifacher Ausfertigung) getestet werden. Jede dieser Bohrungen werden mit der höchsten Wirkstoffkonzentration, behandelt werden, um sicherzustellen, dass das benutzt wurde, hatte eine ausreichende potency (siehe Figur 3 zum Beispiel).
    7. Seed zwei Brunnen mit einem MM-Zelllinie, um die Kontrolle über den Versuchsbedingungen, wie zum Beispiel ordnungsgemäße Funktionieren des Tischbrutschrank, Nährmedien, usw. dienen.

3. Seeding Zellen in Platten (Mit einem Pipettierroboter)

Hinweis: Diese Reihe von Schritten Samen eine 384-Well-Platte mit einem Pipettierroboter. Das Design der Platte wird in Supplemental Abbildung 1, in dem primären MM-Zellen gegen eine Auswahl von 31 verschiedenen Drogen bei fünf verschiedenen Konzentrationen in zwei Wiederholungen getestet sowie Negativkontrolle dargestellt. Eine Zelllinie wird auch als positive Kontrolle für die Beurteilung der Medikamentenwirksamkeit ausgesät und gegen alle 31 Arzneimittel bei der höchsten getesteten Konzentration in zwei Wiederholungen. Die zur Verfügung gestellten Dateien für eine bestimmte Marke und Modell (siehe Materialien Tabelle), aber der Algorithmus kann auf alle Roboter Pipetten angepasst werden.

  1. Co-Kultur von primären MM Zells mit BMSCs:
    1. Vorbereitung einer 15-ml-Röhrchen mit 240 & mgr; l 10x MEM, 240 & mgr; l deionisiertes H 2 O, 120 & mgr; l von 7,5% iger Natriumhydrogencarbonatlösung, 600 ul 1x RPMI 1.640 und 1,8 ml von 3,1 mg / ml bovinem Kollagen Typ I Etiketten Rohr als "Pre-Mix für CD138 +". Auf Eis bis zum Gebrauch.
    2. Vorbereitung einer 1,5-ml-Röhrchen, die aus 50 ul 10x MEM, 50 & mgr; l deionisiertem H 2 O, 25 & mgr; l von 7,5% iger Natriumhydrogencarbonatlösung, 125 ul 1x RPMI 1,640 und 375 & mgr; l von 3,1 mg / ml bovinem Kollagen Typ I Etiketten Rohr als "Pre-Mix für Zelllinie". Auf Eis bis zum Gebrauch.
    3. Resuspendieren 300 ul CD138 + Zellen in RPMI 1640 mit dem Sechsfachen der endgültigen gewünschten Dichte. Resuspendieren 300 ul BMSC-Zellen in RPMI 1640 mit dem Sechsfachen der endgültigen gewünschten Dichte. Mischen Sie beide Bände zusammen in einem 1,5-ml-Tube und Label "CD138 +". Zeigen im Inkubator bis zum Gebrauch.
    4. Re-suspend 60 ulZelllinie in RPMI 1640 mit dem Sechsfachen der endgültigen gewünschten Dichte. Resuspendieren 60 ul von BMSC-Zellen in RPMI 1640 mit dem Sechsfachen der endgültigen gewünschten Dichte. Mischen Sie beide Bände zusammen in einem 1,5-ml-Tube und Bezeichnung "Zelllinie". Zeigen im Inkubator bis zum Gebrauch.
    5. Unter Verwendung des mit dem Pipettierroboter mitgelieferte Software, laden Sie das erste Skript-Datei ", cell_seedingPt47.PGM". Legen Sie eine 200 ul Pipettenspitze Box, eine Mikrotiterplatte, und eines sterilen 384-Well-Platte in den Stationen A, B und E jeweils des Roboters.
    6. Mischen Sie den Inhalt der Röhrchen "Pre-Mix für CD138 +" und "CD138 +". Übertragen Sie 1,5 ml des Inhalts zum Brunnen # 1 der Mikrotiterplatte. Das Röhrchen mit Restvolumen auf Eis. Starten Sie das Programm. Der Roboter wird die ersten 176 Bohrlöcher (11 am weitesten links Spalten) der 384-Well-Platte säen und dann anzuhalten. Übertragen Sie die restlichen der Röhre auf Eis gut # 2 von Mikrotiterplatten. Wiederaufnahme des Programms. DieRoboter die verbleibenden 144 Wells der 384-Well-Platte und Pause Samen.
    7. Mischen Sie den Inhalt der Röhrchen "Pre-Mix für die Zelllinie" und "Zelllinie" und Inhalt in gut # 3 von Mikrotiterplatten. Lebenslauf-Programm. Der Roboter wird die restlichen 64 Wells der 384-Well-Platte Samen.
    8. Platzieren 384-Well-Platte in Zentrifuge für 10 min bei 500 × g und 4 ° C. Transferplatte zur Umsetzung 1 Stunde für Kollagen Polymerisation Inkubator (5% CO 2, 37 ° C).
    9. Laden Sie das zweite Skript-Datei ", media_layer.PGM". Auch 120 & mgr; l-Pipettenspitze Feld ein Reagenzglas mit 31 ml RPMI-1640 mit 10% FBS, 10% Patientenplasma und 1% P / S, ergänzt, und der 384-Well-Platte mit Zellen in den Stationen A, B und E, jeweils. Führen Sie das Programm. Der Roboter 81 ul Medium in jede Vertiefung zu übertragen. Sobald Sie fertig sind, übertragen 384-Well-Platte zu Inkubator und lassen Stroma, um sich an das Substrat O / N.
  2. 4. Drug Vorbereitung und unter Drogen von Platten (unter Verwendung eines manuellen Mehrkanal-Pipetten)

    1. Bereiten Sie eine Vorlage ähnlich, um den Prozess des Hinzufügens Medikament in die Vertiefungen zu erleichtern und die Chance der Verwirrung reduzieren Abbildung 3.
    2. Herzustellen, in einer 96-Well-Platte, eine serielle Verdünnung jeder der Wirkstoffe in der Platte getestet werden, beispielsweise für fünf Konzentrationen unter Verwendung eines 3-fachen Verdünnung:
      1. Fügen Sie 120 ul von Drogen bei 10x die gewünschte Konzentration in der höchsten Konzentration gut. Verwenden Sie beispielsweise 500 & mgr; M Melphalan, wenn die höchste Konzentration die Zellen in der Platte ausgesetzt sein werden 50 & mgr; M.
      2. Werden 80 & mgr; l Wachstumsmedium (RPMI, supplementiert mit 10% FBS, 10% Patienten stammenden Plasma und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S)), um die vier aufeinander folgenden Vertiefungen.
      3. Transfer von 40 ul aus dem ersten in das zweite und zu mischen, um ein Gesamtvolumen von 120 ul bei 1/3 der Arzneimittelkonzentration der ersten Wanne ist, oder 167 uM.
      4. Wiederholen Sie Schritt 4.2.3 an die verbleibenden Vertiefungen (zB Transfer 40 ul vom zweiten in den dritten, zu mischen, dann Transfer 40 ul vom dritten in den vierten, etc.).
    3. Übertragen 8 ul von jedem Arzneimittel mit gut zu den entsprechenden Schacht in der Zellenplatte. Jedes Arzneimittel, das auch haben sollte genug Volumen für 10 Brunnen in der Zellenplatte. Im Beispiel der Figur 3 wird jeder Arzneimittelkonzentration zu 6 verschiedenen Vertiefungen mit Ausnahme der höchsten Konzentration, die 8 Vertiefungen gegeben zugegeben.
    4. Sie 8 ul Wachstumsmedium (RPMI, supplementiert mit 10% FBS, 10% Patienten stamm Plasma und 1% P / S) zu den Kontrollvertiefungen.
    5. Ortszellen im Mikroskop, sobald fertig und schalten Sie den Tisch Inkubation.

    5. Drug Vorbereitung und unter Drogen von Platten (Mit einem Pipettierroboter)

    1. Laden Sie Script-Dateien für Pipettierroboter aus http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS files.zip
    2. Laden Sie das Skript "media_layer_DRUGPLATE.PGM" im Pipettierroboter Benutzeroberfläche. Legen Sie eine 120 ul Pipettenspitze Feld Behälter mit 21 ml RPMI-1640 mit 10% FBS, 10% Patientenplasma und 1% P / S und eine leere 384-Well-Platte in den Stationen A, B und E, bzw. ergänzt. Führen Sie das Programm, das Pipettierroboter werden 30 ul Medium in alle Vertiefungen in der 384-Well-Platte hinzuzufügen.
    3. Im Anschluss an die Vorlage von Supplemental 2 fügen 200 ul Arzneimittel bei 20x maximale Konzentration in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte. Dieses Setup bietet Platz für bis zu 31 Medikamente. Zu der Kontrollvertiefung (CTRL), fügen RPMI-1640 mit 10% FBS, 10% Patientenplasma und 1% P / S ergänzt.
    4. Legen Sie eine 120 ul Pipettenspitze Feld Mikrotiterplatte mit Drogen zu 20X Konzentration und 384-Well mit Medien (aus Schritt 5.1) in den Stationen A, B und C sind. Laden Sie das Programm "drug_plate.PGM". Der Pipettierroboter eine Verdünnungsreihe erstellenvon 1: 3, nach der räumlichen Verteilung in Supplemental 1.
    5. Legen Sie eine 120 ul Pipettenspitze Box, die 384-Well-Platte mit Arzneimittelverdünnung (aus Schritt 5.3) und der 384-Well-Platte mit Zellen (aus Schritt 3.1.9) in den Stationen A, B und C sind. Laden und ausführen Programm "drug_add.PGM". Der Pipettierroboter wird 8 ul der Drogen aus jeder Vertiefung in der Arzneimittelplatte zu seinem Gegenstück in der Zellenplatte zu übertragen. Sobald Sie fertig sind, übertragen Zellplatte in den Inkubator des digitalen Mikroskops so bald wie möglich.

    6. Imaging von Zellen in Platten

    Hinweis: Das folgende Verfahren gilt für die Evos Auto FL Mikroskop, kann aber leicht an andere Motortisch Mikroskope mit Tisch Inkubation oder Inkubator-Embedded-Mikroskope angepasst werden.

    1. Reinigen Sie das Innere des Tischbrutschrank mit einem Ethanol-Feuchttuch und entfernen Sie vorsichtig den Deckel der Platte beim Aufsetzen der Deckel des incubator.
    2. Befolgen Sie die Schritte, um die Software-Beacons hinzufügen. Dies ist der Begriff verwendet, um Landmarken für die Regionen von Interesse beziehen, nacheinander während des Experiments (siehe Software-Handbuch für Details) abgebildet werden.
    3. Verwenden Sie ein 5-fach oder 10-facher Vergrößerung Ziel. Stellen Sie sicher, dass der Fokus ähnlich 2: MM-Zellen als helle Scheiben von einem dunklen Ring und BMSCs oder HUVECs sind kaum sichtbar, umgeben angezeigt. Einige primären MM-Zellen sind sehr klein und damit eine Feinabstimmung erforderlich sein, um den optimalen Fokus zu finden.
    4. Stellen Sie den Erfassungsintervall zwischen 10-30 min und für die Dauer von mindestens 96 Stunden. Während längere Intervalle zwischen den Übernahmen akzeptabel sind, können Intervalle von 45 Minuten oder mehr deutlich reduzieren die Genauigkeit der Messung der Rentabilität.
    5. Konfigurieren Sie die Software so, dass die Bilder jeder Vertiefung werden in separaten Dateien namens Beacon-1, Beacon-2, usw. Wenn die Pipettierroboter verwendet wurde gespeichert sind, legen Sie die Baken in der in dargestellten ReihenfolgeSupplemental 3.
    6. Stellen Sie sicher, dass es genug Wasser im Inkubator Luftbefeuchter und Gas, so dass Zellen werden unter optimalen Bedingungen sein.
    7. Nach Beendigung des Versuchs, kopieren Sie die Ordner mit den Bildern auf den Computer, der die Analyse ausgeführt wird.

    7. Quantifizierung der Arzneimittelempfindlichkeit

    Anmerkung: Die folgenden Anweisungen führen die Verwendung der Bildanalyse mit einem Computer-Cluster, da die Analyse einer Multi-Well-Platte in einen Personalcomputer ist äußerst zeitaufwendig.

    1. Laden Sie ImageJ Software von NIH Website: http://imagej.nih.gov/ij/
    2. Laden Sie Skript und Plugins auf http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
    3. Befolgen Sie die Anweisungen in http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf auf digitale Bildanalyse-Software laufen. Das Ergebnis sollte eine Tabelle mit dem Namen Results.csv, die die Lebensfähigkeit Messungen in regelmäßigen Abständen für eac seinh auch in der Platte für die Dauer des Experiments (dh 96 Stunden).
    4. Bei Verwendung einer manuellen Mehrkanalpipette, die folgenden Schritte aus.
      1. Laden Sie die Datei http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt und ändern Sie es, um das Layout der Platte in Schritt 3.1 festgelegt entsprechen (zB 3).
      2. Laden Sie die Software http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar und führen Sie es mit den Dateien in den Schritten 5.3 und 5.4 als Eingabeparameter erstellt. Das Ergebnis wird eine Ordnernamen Bericht enthält mehrere Tabellen, jede Gruppierung der Ergebnisse für ein bestimmtes Medikament.
      3. Kopieren und Einfügen von Inhalten in Tabellenvorlage http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
        Anmerkung: Das Ergebnis sollte Diagramme wie die in 4 dargestellt, die die Chemosensitivität der Probe auf verschiedene Arzneimittel als eine Funktion der Arzneimittel-Konzentration und Einwirkzeit können.
      4. </ Ol>
      5. Wenn Sie einen Pipettierroboter, führen Sie folgende Schritte.
        1. Laden Sie Vorlagendateien von Download-Script-Dateien für Pipettierroboter aus http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic Template Files.zip und extrahieren Dateien in einem Verzeichnis.
        2. Ändern Sie die Datei DrugList.csv gemäß der Liste der Medikamente und höchste Wirkstoffkonzentration in der Platte mit Zellen. Folgen Sie dem Layout Supplemental 2.
        3. Führen Sie das Programm BuildExperimentalDesign.java vorbei als Parameter den Ordner mit den in Schritt 7.5.1 extrahierten Dateien und die Dateien Results.csv aus Schritt 7.3. Das Ergebnis sollte zwei Ordner benennen MM1_S und PtSample. Die erste enthält eine Beschreibung der Vertiefungen (Arzneimittel und Konzentrationen) für die Zelllinie positive Kontrolle. Der zweite enthält die gleichen Informationen, jedoch in Bezug auf die Teil der Platte mit der Patientenzellen geimpft.
        4. Kopieren Sie die Datei Results.csv in jedem der Verzeichnisse im Schritt 7.5.3 erstellt. Downloaddie Software http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar und führen Sie es mit den Dateien in Schritten 7.5.3 für beide Ordner erstellt. Das Ergebnis wird eine Ordnernamen Bericht in jedem der Ordner in 7.5.3 erstellt werden. Der Ordner Bericht mehrere Tabellen, die jeweils die Ergebnisse für ein bestimmtes Medikament Gruppierung.
        5. Führen Sie das Programm BuildGraphPadFile.java und übergeben Sie als Parameter den Ordner mit den Dateien, die in Schritt 7.5.1 extrahiert und die Dateien Results.csv aus Schritt 7.3. Das Ergebnis wird eine GraphPad Datei mit den Dosisantwortkurven für jedes der 31 Drogen und normiert durch die Kontrolle. Jedes Diagramm wird 5 Wirkstoffkonzentrationen für die primären MM-Zellen und eine Konzentration für die positive Zelllinie Kontrolle enthalten.

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Representative Results

Die Strömung des Experiments wird kurz in 1 beschriebenen Wenn alle Schritte erfolgreich abgeschlossen wurde, die durch das Mikroskop erhaltenen Bilder sind gleichwertige sein. Abbildung 2: Live MM-Zellen sollten klar als helle Platten und BMSCs oder HUVECs sollte kaum sichtbar sein, gesehen werden und auch im Hintergrund verteilt. Wie in 2A zu sehen ist, reichen MM-Zellen in der Größe von einem Patienten zum anderen, aber im allgemeinen kleiner als Zelllinien sind. Da sie praktisch nicht während des Intervalls des Experiments replizieren ex vivo (96 h), können sie in höheren Konzentrationen (1-3 Millionen Zellen / ml) angeimpft werden. Stroma sollte kaum nachweisbar, da BMSC zu dem Boden des Bohrlochs und Dehnungs haften, ein niedriges Profil. Der menschliche Myelomzellinie H929 ist deutlich größer als Patienten stamm MM-Zellen (2B) und repliziert innerhalb von 24 Std. Um Gedränge des Bildes zu vermeiden, sind MM-Zelllinien zu sehended eine niedrigere Dichten, 0.300.000 / ml. 2C und 2D stellen Patienten stammende Myelomzellen und menschlichen Myelomzelllinien H929 bzw. co-kultiviert mit HUVECs. HUVECs Erste, der den Boden des gut haften und dann beginnen, sich gegenseitig und bilden Netzwerke, die später dicker und mit Lumen zu kontaktieren.

Figur 4 veranschaulicht, was aus den verarbeiteten Videos durch die Bildanalyse-Algorithmus erzeugt zu erwarten, zeigt detektiert Live MM Zellen in grün (4A) pseudo-farbig mit keinen oder sehr wenig grünes Signal in BMSCs und HUVECs am Ende des Experiments in der höchsten Wirkstoffkonzentration, wenn alle MM-Zellen sind tot (4B). Die Software sollte die Resultate aus verschiedenen Brunnen aggregieren und bauen ein Schaubild, die allmähliche Verlust der Lebensfähigkeit mit Expositionszeit bei unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen (4C). Die Kurve der Dosis-Antwort derKontrollzelllinie (zB H929 oder MM1.S) sollten die gleiche wie bei früheren Experimenten; signifikante Abweichungen könnte Probleme mit der Stammlösung des Arzneimittels in dem Experiment benutzt wird.

Es ist wichtig, genau zu beobachten alle Brunnen vor dem Start der bildgebenden Verfahren ausgesät, als Artefakte kann die Bildanalyse-Software irregeführt und führen zu falschen Ergebnissen. Zum Beispiel zeigt 5A das Ergebnis einer übermäßigen Dichte BMSCs im Brunnen oder zu viel Zeit zwischen Trypsinierung und Aussaat verstrichen, was zu dieser Zellen bilden Klumpen. 5B zeigt "Kolonien" von MM-Zellen. Wenn Zelllinien werden in hoher Dichte ausgesät, werden sie Kolonien bilden, wie sie replizieren und dies reduziert die Genauigkeit der digitalen Bildanalyse-Algorithmus, wie es immer schwieriger wird, eine Zelle von der anderen zu unterscheiden. 5C ist ein Beispiel für die entgegengesetzte, in dem zuwenig MM-Zellen wurden ausgesät. Tseine oft auftritt, wenn die Anzahl von MM-Zellen aus dem Knochenmark-Aspirat erhalten wird unter 500.000, und das "Totvolumen" in der Röhre nach links, bevor Resuspension wird vergleichbar mit dem Volumen der Medien erforderlich ist, um erneut zu suspendieren MM-Zellen in hohen Dichten . Um dieses Problem zu lösen, zu bestimmen, das Totvolumen für das Rohr verwendet wird und es in der Verdünnungs Berechnungen. 5D ist ein Beispiel der schiefen Fokalebene. Beachten Sie, wie MM-Zellen oben links sind hell und die, die in der unteren rechten Ecke sind dunkel. Dies wird durch Uhr ungleichmäßig platziert Platte oder falsch platziert Ziel verursacht. Dies führt dazu, Myelomzellen in verschiedenen Abschnitten des Bildes unterschiedlich gezählt werden. Maßstabsbalken (rechts unten auf jedem Bild) stellen 500 um.

Abbildung 1
Abbildung 1. Protocol allgemeine Beschreibung. (A) Während eines Knochen marrow Biopsie ein zusätzliches Rohr absaugen wird für das Protokoll erhalten. (B) Ein multiples Myelom (MM) Zellen magnetisch von den anderen Zellen in dem Aspirat getrennt. (C) Drei Rohre, enthaltend MM-Zellen (MM), nicht-MM-Zellen und Plasma ausmachen, sind aus dem Trennverfahren, erhalten. (D) Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen (BMSCs) aus früheren Aspiraten co-kultiviert mit frisch erhaltenen Myelomzellen und der extrazellulären Matrix (Kollagen oder Basalmembranmatrix) resuspendiert. (E) Die Platte wird zentrifugiert, dass so viele wie möglich zu gewährleisten MM sind in der gleichen Brennebene und der BMSC sind bereit, um den Boden des gut haften. Die Platte wird in Brutschrank gestellt, bis Matrix polymerisiert. (F) Die Vertiefungen werden mit einer Mischung aus Kulturmedien und vom Patienten stammende Plasma gefüllt. Die Platte wird in einen Inkubator O / N gegeben. (G) Die Arzneimittel werden zu jeder Vertiefung gegeben und die Platte wird in einem Mikroskop platziertmit einer digitalen Kamera, Motortisch und Tischbrutschrank ausgestattet, und in regelmäßigen Abständen über einen Zeitraum von 96 Stunden abgebildet. (H) Die Bilddateien für jede Vertiefung werden analysiert unter Verwendung eines Algorithmus, der Bereich hinter MM Zellen auf Membranbewegung (lebende Zellen werden in pseudo grün gefärbt) und erstellt eine Tabelle mit den Veränderungen in der Zellularität für jede Vertiefung für jeden Zeitpunkt. Maßstabsleiste (unten rechts) stellt 500 um. (I) Ein Software-Programm-Gruppen die Brunnen durch Medikamente und Konzentrationen und erstellt eine Tabelle mit Kurven der Dosis-Wirkungs-normalisiert, so dass erste Maßnahmen zu 100%. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Pre-Medikament erwarten Erscheinungsbild der Brunnen. (A) MM-Zellen co-kultiviert mit Stroma. (B) Der menschliche Myelom-Zelllinie H929 co-kultiviert mit Stroma. (C) vom Patienten stammende Myelomzellen in Co-Kultur mit HUVECs. (D) humanen Myelomzelllinie H929 in Co-Kultur mit HUVECs. Maßstabsbalken (unten rechts auf jeder Abbildung) stellen 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Empfohlene räumliche Verteilung von Vertiefungen in einer 384-Well-Platte. Jeder 384-well Platte 3 Patientenproben mit 7 verschiedenen Drogen oder einer Patientenprobe mit 21 Drogen getestet tragen. Wells in hellgrün, hellblau und tan, enthalten MM-Zellen von drei verschiedenen Patienten. RX1, RX2, usw., repräsentieren verschiedene Medikamente, die jeweils an fünf verschiedenen conzent und in zweifacher Ausfertigung. Vier Vertiefungen werden als Kontrollen für jeden Patienten (36-39 für Patient 1, 126-129 für Patienten 2 und 200-203 für die Patienten 3). Wells in orange enthalten Zelllinien mit dem höchsten Wirkstoffkonzentration jeder Droge, in zweifacher Ausfertigung. Wells in Gelb sind Zelllinie Kontrollen (kein Arzneimittel). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Beispiel digitale Bildanalyse und Dosis-Antwort-Diagramme. (A) M-Zellen in Co-Kultur mit BMSCs in Kollagen I eingebettet sind, auf eine Konzentration von 50 nM carfilzomib belichtet. Die Bildanalyse-Algorithmus erkennt lebenden Zellen und Pseudo-Farben sie in grün. (B) Die Bilder werden in regelmäßigen Intervallen während der Dauer des Experiments erfasst. In diesem concentratiauf der Arzneimittel fast alle Zellen am Ende des 96 Stunden tot. (C) Die Tabelle zeigt die Veränderung der Anzahl der lebensfähigen Zellen für fünf verschiedene Konzentrationen carfilzomib entlang einem Intervall von 96 Stunden, zum Zeitpunkt normiert = 0 h 100%. Der menschliche Myelom-Zelllinie MM1.S wurde als Kontrolle für die Wirksamkeit von Medikamenten eingesetzt. Maßstabsbalken (unten rechts von A und B) stellen 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Abbildung 5: Häufige Fehler während der Aussaat oder Speicherfolie. (A) Stroma-Zellen "wirren". (B) "Kolonien" von MM-Zellen. (C) Zu wenige MM-Zellen. (D) Skewed Brennebene. Maßstabsbalken (rechts unten auf jedem Bild) stellen 500 & mgr;. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 1 sup
Zusätzliche Abbildung 1. optimale räumliche Verteilung der Vertiefungen in 384-Well-Platte unter Verwendung eines Pipettierroboter. In dieser Konfiguration 31 verschiedene Medikamente können bei 5 verschiedenen Konzentrationen und 2 Wiederholungen (grün) getestet werden. Darüber hinaus können positive Kontrollen mit einer Zelllinie verwendet werden, um Drogen Potenz (pink) zu gewährleisten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2 Sup
Supplemental Abbildung 2. Räumliche Verteilung Droge "Masterplatte". Der Pipettierroboter diese Platte, wo jeder enthält auch eine der 31 Medikamente mit 20-facher Konzentration zu verwenden, um das Medikament zu Verdünnungsplatte erstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3 Sup
Supplemental Abbildung 3. Die Nummerierung der Brunnen bei der Vorbereitung einer Platte mit einem Pipettierroboter zu nutzen. Die im Protokoll beschriebene Software benötigt diese Nummerierung der Brunnen, um angemessen Karte der Vertiefungen auf die Medikamente und Konzentrationen. Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Figur.

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Supplemental Abbildung 4. Vergleich mikrofluidischen Schieber (Khin et al., 2014) und aktuelle Protokoll. Dosiswirkung von H929 multiplem Myelom-Zelllinie für 24 Stunden in dem bisherigen System (oben links Bortezomib, Melphalan Mitte links) und in Stromsystem gemessen ( oben rechts Bortezomib und Mitte rechts Melphalan). Zu Vergleichszwecken wurden LD50 bei 24 Stunden für beide Plattformen betrug 3,9 nM und 4,1 nM für Bortezomib und 6,4 um und 14,65 & mgr; M für Melphalan. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Zusammenfassend, es ist eine leistungsfähige und hohem Durchsatz Methode Chemosensitivität von primären Myelomzellen und ex vivo Pharmakodynamik von Medikamenten in einer Rekonstruktion des Knochenmarks zu quantifizieren. Die kritischen Schritte in diesem Protokoll sind die richtige Aussaat der Brunnen und eine angemessene Fokussierung (siehe Abbildung 2 für erwartete Ergebnisse): sicherzustellen, dass MM und Stromazellen gleichmäßig verteilt sind, bestehen darin, dass Stromazellen Anhänger der Boden des Bohrlochs, dass alle MM Zellen sind in der gleichen Brennebene, und das MM-Zellen den Aspekt einer hellen Platte durch einen dunklen Ring umgeben ist.

Bei unsachgemäßer Aussaat (siehe Abbildung 5), nicht mit dem Versuch fort, aber eine zweite Platte und nicht Saatgut. Wenn das Problem erkannt war niedrig oder hoch MM oder Stroma Zelldichte, überprüfen Sie die Zellkonzentration in der Röhre vor der Aussaat und resuspendieren in regelmäßigen Abständen während der Aussaat Prozess, um eine homogene Verteilung der Zellen zu gewährleistenin Medien. Die Verwendung einer Mehrkanalpipette mit Repeaterfunktion oder Kanalautomat kann dieses Problem deutlich reduziert. Der Anteil der Zelle / Matrix-Medien (1:10) in diesem Assay verwendete gesucht, um die Anzahl von Vertiefungen, ausgesät werden konnte und somit untersuchten Bedingungen maximieren. Jedoch lösliche Faktoren produziert oder Krebszellen oder Stromazellen verbraucht studieren, ist es empfehlenswert, dass ein Anteil von Zell / Matrix-Medien 1: 1 sein.

Wie sie derzeit durchgeführt, quantifiziert dieses System nur die nicht-adhärenten Zellen. Um Veränderungen in der Zellstruktur Stroma quantifizieren würde die Software müssen geändert und an die morphologischen Eigenschaften des Stroma eingestellt werden. Dies wäre eine nützliche Eigenschaft, die Wirkung von Krebszellen oder Drogen im Stroma Fach studieren. Das hier beschriebene System ist auch nicht in der Lage Zellularität von adhärenten Krebszellen zu quantifizieren, insbesondere wenn sie mit adhärenten Stromazellen kombiniert werden. Die Lösung würde Änderungen in der digitalen imag seine Analysealgorithmus, um den Tumor von Stroma getrennt Basis morphologischer Merkmale oder vor Inkubieren entweder Population mit einem fluoreszierenden Farbstoff, der verwendet werden könnte, um Zellen aus entweder Population zu identifizieren.

Die Bedeutung dieses Protokoll im Vergleich zu früheren Ansätzen ist die Fähigkeit zu bewerten Arzneimittelreaktion von primären Krebszellen in einer ex vivo-Rekonstruktion von Knochenmark-Mikroumgebung in einer zerstörungsfreien Art und Weise, so daß aufeinanderfolgende Messungen durchgeführt werden, wodurch sehr viel detaillierter Bereitstellen Daten von der Pharmakodynamik, anstatt zu festen Zeitpunkten. Einer der Grenzen unserer früheren Assay 6 war die linearen Gradienten von Arzneimitteldiffusion, die nur erlaubt Beurteilung Arzneimittelempfindlichkeit innerhalb eines linearen Fenster der Konzentrationen erzeugt. Der aktuelle Test ermöglicht Bewertung der Lebensfähigkeit über jede Reihe von Arzneimittelkonzentrationen, da jede Vertiefung ist eine separate Einheit. Beide Assays erzeugen jedoch gleichwertige Ergebnisse (

Unter den mehreren zukünftigen Anwendungen dieser Ansatz wird in unserer Gruppe mit Hilfe mathematischer Modelle, um die pharmakodynamische Daten, die diese Tests in der klinischen Reaktion vorgesehen extrapolieren konzentriert. Um dieses Ziel zu schlagen wir vor, die Datenpunkte erhalten (4C) für jedes Medikament auf ein System von Differentialgleichungen zu passen, zur Beschreibung der Dynamik der Arzneimittel-induzierten Zelltod zu erreichen. Dann wird durch Anlegen dieser mathematischen Modelle die bekannten pharmakokinetischen Eigenschaften jedes Wirkstoffs in einer klinischen Therapie wäre es möglich, die tatsächliche Reaktion des Patienten 6 zu schätzen. Durch die Automatisierung von Aussaat und unter Drogen mit einem Robot-System, wäre es möglich, nicht nur Standard der Behandlung Medikamente zu testen, sondern auch mehr als hundert experimentelle Drogen pro Probe (in einem 1536-Well-Platte). Dies würde die Möglichkeit für die in silico klinischen Studien, in denen Hunderte von experimentellen Medikamenten könnte getestet werden geöffnetKohorten von Patientenproben, wodurch Überlebenskurven für virtuelle klinischen Studien 13.

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Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch den Staat Florida zu Bankhead-Coley Teams Wissenschaft Grant (2BT03), den National Institutes of Health / National Cancer Institute (1R21CA164322-01) und Moffitt Cancer Center-Team Wissenschaft Grants finanziert. Diese Arbeit wurde teilweise bereits von der Translational Research Core Facility am H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, einem NCI Bezeichnung Comprehensive Cancer Center (P30-CA076292) unterstützt. Zugang zu Primärzellen möglich durch die Gesamt Cancer Care Protokoll am Moffitt Cancer Center gemacht wurde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EVOS FL AUTO AMG AMAFD1000 + AMC1000 Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind CORNING CLS3683 SIGMA Corning CellBIND 384 well plates
384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind CORNING CLS3832 ALDRICH Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus  GE Healthcare GE17-1440-02 SIGMA For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads Miltenyi  130-051-301 Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns Miltenyi   130-042-401 Column for separation of cells.
MidiMACS Separator Miltenyi  130-042-302 Magnet for separation column.
Matrigel Sigma-Aldrich E6909 SIGMA ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex Life Technologies A1413201 LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC Life Technologies C-003-25P-B Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media GIBCO 11875-093 RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated GIBCO 10082-147 Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1 mg/ml Bovine collagen type I Advanced Biomatrix 5005-B Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS BIOTEK PRC3841 Robotic pipettor system

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