En organotypiske høy gjennomstrømning System for Karakterisering av Drug Sensitivity of Primary myelomatose Cells

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Silva, A., Jacobson, T., Meads, M., Distler, A., Shain, K. An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells. J. Vis. Exp. (101), e53070, doi:10.3791/53070 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I dette arbeidet beskriver vi en ny fremgangsmåte som kombinerer ex vivo medikamentsensitivitet analyser og digital bildeanalyse for å estimere kjemosensitivitet og heterogenitet av pasientavledet multippel myelom (MM) celler. Denne tilnærmingen består i seeding primære MM celler ferskt hentet fra benmarg aspirates inn microfluidic kamre implementert i multi-brønners plater, som hver består av en rekonstruksjon av mikromiljøet i benmargen, inkludert ekstracellulære matrise (kollagen eller basalmembran matrix) og stroma (pasient- avledede stamceller) eller menneskeavledet endotelceller (HUVECs). Kamrene er dopet med forskjellige stoffer og konsentrasjoner, og avbildes sekvensielt for 96 timer gjennom lyse felt mikroskopi, i en motorisert mikroskop utstyrt med et digitalt kamera. Digital Image Analysis programvare oppdager levende og døde celler fra nærvær eller fravær av membran bevegelse, og generer kurver av endring i levedyktighet som funksjon of medikament-konsentrasjon og eksponeringstid. Vi bruker en datamodell for å bestemme parametrene av kjemosensitivitet av tumoren befolkningen til hvert medikament, så vel som antall sub-populasjoner er til stede som et mål på tumor heterogenitet. Disse pasienttilpassede modeller kan da brukes til å simulere terapeutiske regimer og beregne klinisk respons.

Introduction

Målet med denne fremgangsmåte er å karakterisere medikamentsensitivitet av multippel myelom (MM) primære celler til et panel av midler ex vivo, så nær som mulig til fysiologiske betingelser, og med tilstrekkelig nøyaktighet at disse resultatene kan brukes for å identifisere kjemoresistent sub- populasjoner innenfor tumorbyrde og til slutt å parameter beregningsmodeller utviklet for å estimere klinisk respons.

Beregningsmodeller er kraftige verktøy for å analysere komplekse systemer, som kreft-host-terapi interaksjoner. Men modellene er bare så god som dataene brukes til å parameterisere dem. Dessverre kan de fleste data som er tilgjengelige i litteraturen ikke brukes i sin nåværende form å parameter slike modeller, da de ofte er innhentet i gjensidig utelukkende eksperimentelle forhold. Således blir nye eksperimenter ofte nødvendig med sikte på å skaffe et sett av eksperimentelle parametre som trengs. De fleste levedyktighet analyser, men er destruktiv og thvi er begrenset til et lite antall av tidspunkter, ofte bare en. Dette handicap sterkt bruken av kjemosensitivitet analyser å parameter beregningsmodeller, siden slike eksperimenter unnlater å gi informasjon om de time dynamikken i systemet. Dette gjelder spesielt med primære kreftceller, som ofte er begrenset til noen få millioner per prøve, og har en kort levetid etter biopsi, og dermed begrense antallet tilgjengelige eksperimentelle betingelser. I tillegg har de fleste levedyktighet analyser krever separasjon av cancer fra den ikke-kreft (stroma) celler på tidspunktet for kvantifisering, som legger ekstra arbeid for å protokollen, ytterligere perturbs cellene, og begrenser antall forsøk som kan utføres .

40 år siden, laks og samarbeidspartnere en foreslått sin berømte in vitro kolonidannelse analyse for vurdering av kjemosensitivitet av tumorceller. Dessverre er denne analyse funnet blandet suksess på grunn av det lille antallet av multippel Myeloma (MM) pasientprøver som var istand til å danne kolonier under kontroll betingelser: Det ble anslått at bare en liten undergruppe av 0,001% til 0,1% av MM-celler var i stand til replikasjon, som er betegnet som multippelt myelom stamceller 2. Dette betydelig redusert suksessrate på analysen og antallet medikamenter som kan testes på en gang, selv i nyere modeller 3. Dette problemet er mye viktigere nå når MM agenter (standard eller eksperimentelle) er flere enn fire tiår siden.

En vesentlig begrensning av disse tidlige analysene er deres dikotomert utgang: enten en pasient er "følsom" eller "resistent" til et bestemt medikament. Ingen informasjon er gitt om graden av sensitivitet og heterogenitet av svulsten befolkningen. Dermed vil pasienter med små sub-populasjoner av raskt voksende resistente celler bli klassifisert som "sensitive" til terapi, men ville tilbakefall kort tid, og dermed ikke benEFIT fra behandling. Gitt viktigheten av responsvarighet i total overlevelse (OS) på kreftpasienter 4,5, er det klart hvordan disse analysene var ikke i stand til å beregne riktig OS konsekvent.

For å omgå disse begrensninger og for å være i stand til å generere pasientspesifikke beregningsmodeller som vil anslå tilpasset klinisk respons til et panel av medikamenter, har vi utviklet en metode for ikke-destruktiv testing medikamentsensitivitet av multippel myelom (MM) cellelinjer og primær MM celler i en ex vivo rekonstruksjon av mikromiljøet i benmargen, inkludert ekstracellulære matrise og stroma 6. Dette assay hadde imidlertid den begrensning av å stole på en bestemt kommersiell mikrofluid slide, hvis dimensjoner og kostnad begrenset antall eksperimenter eller medikamenter som kan bli utført samtidig i en gitt stykke av utstyr.

Den her beskrevne system utvider denne opprinnelige analysen inn i en høy-throughput organotypiske dose-respons-plattform, for in vitro screening av legemidler, basert på en digital bildeanalyse algoritmen til ikke-destruktiv kvantifisering av cellelevedyktighet. Hver brønn i 384 eller 1536-brønners plater er en 3D-rekonstruksjon av mikromiljøet i benmargen, inkludert primær MM celler, ekstracellulære matrise og pasient-avledet stromaceller og vekstfaktorer. Levende mikroskopi og digital bildeanalyse blir anvendt for å detektere celledød hendelser i forskjellige medikamentkonsentrasjoner, som blir brukt for å generere doseresponsoverflater. Fra in vitro-data, identifiserer en matematisk modell av størrelsen og kjemosensitivitet av sub-populasjoner i pasientens tumorbelastning, og kan brukes til å simulere hvor tumoren ville svare på stoffet (e) i fysiologiske betingelser i en klinisk regime 6 ( Figur 1).

De viktigste nyvinningene i denne plattformen er: (a) lite antall kreftceller som kreves (1.000-10.000 per narkotika concentrasjon); (B) evaluering av legemidlets effekt i fysiologiske betingelser (ekstracellulær matriks, stroma, pasient-avledet vekstfaktorer); (C) Ingen toksisitet fra levedyktighet markører 7 ettersom bare lysfelt-avbildning blir brukt, og dermed ikke noe behov for å transfektere celler med fluorescens 8 eller 9 Bioluminescens; (D) kontinuerlig avbildning gir legemiddeleffekt som en funksjon av konsentrasjon og eksponeringstid (farmakodynamikken); og (e) integrasjonen mellom in vitro og beregnings evolusjonære modeller for å beregne klinisk resultat 6 (Silva et al., under forberedelse).

Den viktigste faktor som gjør det mulig for digital bildeanalyse algoritme for å skjelne kreft fra stromale celler er deres ulike affinitet til bunnen av brønnen: mm celler ikke kleber, og forbli i suspensjon i matrisen, mens stromale celler holder seg til bunnen av godt og deretter strekke.

Denne separasjon skjer selv om MM og stroma enre sådd på samme tid, og skjer i løpet av O / N prosess med inkubasjon. Den spinne ned i sentrifugen etter såing av platen ytterligere akselererer denne prosessen. Som en konsekvens, mm celler vises i bildet som runde lyse skiver som er omgitt av en mørk ring, mens stroma opprettholder en lav profil og en mørkere nyanse (figur 2). Således er analysen i sin nåværende form er best egnet for ikke-adherente cancerceller, selv om justeringer i algoritmen kunne gjøres til separate kreft og stroma basert på andre morfologiske egenskaper, slik som størrelse og form. I denne protokollen beskriver vi to typer ekstracellulære matrise (kollagen og basalmembran matrix) samt to typer co-kulturer, med (benmargs avledet mesenchymale stamceller) BMSC og HUVECS, som representerer interstitiell og perivaskulære nisjer av benmargen hhv.

Ved hjelp av en 384-brønners plate, fem konsentrasjoner per narkotika og to paralleller, kunne vi test opp til 31 forskjellige stoffer med prøven av en enkelt pasient. I 1536-brønners plater dette tallet er 127. Figur 3 viser utformingen for tiden brukes for manuell celle såing, mens Opplysning Figur 1 representerer den optimale fordeling ved hjelp av en robot-pipette. I utformingen på figur 3, kan hver 384-brønners plate bærer tre pasientprøver med 7 forskjellige legemidler, eller en pasientprøve som ble testet med 21 stoff. Hvert legemiddel er representert ved 5 konsentrasjoner, og hver tilstand blir sådd i duplikater. Fire kontrollbrønner (ingen medikament tilsatt) blir utsådd for hvert sett av syv legemidler (f.eks, brønner 36-39, 126-129 og 200-203). For å sikre styrken av de stoffer som brukes, er en human myelom cellelinje (for eksempel H929 eller MM1.S) også seeded, og dopet i duplikater ved den høyeste konsentrasjon av hver av de stoffer som brukes (brønnene 76-89). Den positive cellelinje kontroll sikrer at legemidler som brukes har tilstrekkelig styrke, siden deres doseresponskurver er sammenlign across eksperimenter. To brønner er podet med en myelom cellelinje som kontroll for de miljøforhold, med andre ord, for å oppdage mulige problemer i benketoppen inkubatoren under avbildning (brønner 75 og 90). Oppregningen av brønnene følger et sikksakkmønster for å redusere den avstand som dekkes av den motoriserte trinn av mikroskop, noe som reduserer innhentingstiden og reduserer slitasje på utstyret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bruken av menneskelige celler avledet fra biopsier som beskrevet nedenfor ble godkjent av Moffitt sin Institutional Review Board og utført under klinisk utprøving MCC # 14745 utført ved H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute.

1. Sortering av MM Celler fra Bone Marrow aspirerer

  1. Samle benmarg aspirater (20 ml) fra pasienter i natriumheparin sprøyte.
  2. Isoler mononukleære celler ved sentrifugering fortynnet marg (1: 1 med steril PBS) over en steril vandig medium gradient sentrifugering ved 400 xg i 30 min ved omgivelsestemperatur.
  3. Samle grensesnittet, som inneholder de mononukleære celler. Vask cellene med kald PBS og tell ved hjelp av et hemocytometer eller automatisk celleteller, ved hjelp av trypanblått for bestemmelse av levedyktighet.
  4. Forbered et tynt lag celle forberedelse lysbilde 10 og flekken med Wright-Giemsa beis for å vurdere plasma celle prosent 11.
  5. Beregnmengden av CD138 perler som skal brukes basert på antallet av celler og plasmaceller i prosent. Hvis utgangs prøve er mindre enn 20% plasmaceller, deretter re-suspendere cellene ved anvendelse av 90 ul av separasjonsbuffer og 10 ul av CD138 perler per 5 x 10 6 celler. Hvis utgangs prøve er mer enn 20% plasmaceller, resuspendert ved hjelp av 80 ul av separasjonsbuffer og 20 ul CD138 perler per 1 x 10 7 celler.
  6. Inkuber cellene med kuler ved 4 ° C i 15 min.
  7. Passerer cellene gjennom et 35 um sil tilsatt til pre-fuktede separasjon (LS) søyler plassert i magnetfeltet separator (se liste over materialer).
  8. Fjern kolonne fra magnet. Samle CD138-valgte celler ved vasking av kolonnen tre ganger med 1 ml separasjon buffer.
  9. Vurdere CD138 berikelse med en annen farget tynt lag cellepreparat skyv 10.
  10. Filter plasma erholdt fra benmargsbiopsi fra hver pasient med en 0,22 um sprøytefilter. Bruk fersk plasmafra den samme pasient som CD138 + celler.
  11. Klargjør media for forsøket ved å supplere RPMI-1640 med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum, 10% pasientens plasma og 1% penicillin-streptomycin.
  12. Samle gjennomstrømning av utvalget (CD138-) og følger den klassiske vedheft metoden 12 for å velge for benmargs mesenchymalceller (BMSCs). Siden denne prosessen krever uker før BMSCs er klar til å brukes, er det nødvendig å ha BMSCs klart fra tidligere pasienter eller friske donorer.

2. Seeding Celler i plater (med en manuell flerkanals Pipettor)

  1. Bruk en multi-brønn-plate (384 eller 1536) med sorte vegger og en flat gjennomsiktig bunn, fortrinnsvis en optimalisert for optiske anvendelser og cellekultur.
  2. Ko-kultur med BMSCs mm celler enten i kollagen type I eller basalmembran matrise, men HUVECs krever basalmembran matrise.
  3. Hold de endelige tettheter av hver celletype ifølgende område: 3 x 10 5 celler / ml for MM cellelinjer, 2 x 10 5 celler / ml for HUVECs eller BMSCs, og 2 x 10 6 celler / ml for pasient avledet MM celler.
    Merk: Disse tetthetene er et resultat av eksperimentell optimalisering for å tillate størst mulig bildekvalitet og lengst mulig avbildning tid under opprettholdelse av biologisk relevans i assayene. MM cellelinjer blir utsådd ved lavere tettheter enn primær mm celler på grunn av deres hurtigere replikasjon hastighet og større størrelse.
  4. Co-kulturen i primær MM celler med BMSCs:
    1. Forbered 100 ul porsjoner av pre-blandede media som består av 20 ul 10 x MEM, 20 ul avionisert H2O, 10 pl av 7,5% natrium-bikarbonat-oppløsning, og 50 ul av 1 x RPMI 1640 og oppbevares ved 4 ° C.
    2. På tidspunktet for utsåing av platene med MM-celler, blande aliquoter av forblandet media med 150 ul av 3,1 mg / ml bovint kollagen type I til et sluttvolum på 250 ul.
    3. Re-suspslutt 50 ul av celler i RPMI 1640 med seks ganger den endelige ønskede densitet.
    4. Bland til cellesuspensjonen med kollagen blanding for å skape et endelig volum på 300 pl ved anvendelse av en pipette P200.
    5. Ved hjelp av en manuell eller repeater pipette, avsette en 8 pl dråpe av endelige celle / matriks blanding i midten av hver brønn i 384-brønns plater, eller 2 ul i hver brønn av 1536-brønners plater (se trinn 2.6 for et eksempel på romlig arrangement av brønner).
    6. Sentrifuger plate i 2 minutter ved 500 x g for å konsentrere alle celler i samme fokalplan under avbildning.
    7. La plate i en inkubator (5% CO2, 37 ° C) i 1 time, for gel-polymerisasjon.
    8. Legg 80 ul vekstmedium supplert (RPMI-1640, 10% FBS, 10% HI pasient-avledet plasma, 1% P / S) til hver brønn i 384-brønns plater, eller 8 ul i 1536-brønners plater.
    9. La plate O / N i inkubator (5% CO2, 37 ° C) for feste av stroma til bunnen av platen.
  5. Co-cuLTURE av primære MM celler med HUVECs:
    1. Overføring basalmembran matriks fra -80 ° C til en bøtte med is for å tine.
    2. Telle og re-suspen primære celler og HUVECs i RPMI-1640 media på 4 ganger det siste tetthet, hver i et eget rør.
    3. Bland pasientens celler og HUVECs volumer ved et 1: 1 forhold.
    4. Når basalmembran matrisen er tint, men likevel ikke polymerisert, blande 1: 1 med celleblandingen fra foregående trinn.
    5. Seed dråper med tilstrekkelig volum av celle-matriks blanding i midten av hver brønn (8 ul i 384-brønns plater og 2 ul i 1536-brønners plater, se trinn 2.6 for et eksempel på en romlig arrangement av brønner).
    6. Sentrifuger plate ved 500 xg i 10 min.
    7. Sett platen i inkubator (5% CO2, 37 ° C) i 1 time for matrise polymerisasjon.
    8. Legg vekstmedier (RPMI-1640 supplert med 10% FBS, 10% pasientens plasma og 1% P / S) til hver brønn (80 ul i 384-brønns plater, 8 ul i 1,536-brønners plater).
    9. La plate O / N i inkubator (5% CO2, 37 ° C) for feste av HUVECs til bunnen av platen.
  6. Pode en 384-brønners plate. Figur 3 viser en typisk romlig fordeling av poding.
    1. Fra og med godt B2, frø så mange kolonner som legemidler som skal testes. I eksempelet i figur 3, bruker syv medikamenter.
    2. Gjenta seeding så mange ganger som konsentrasjoner som skal brukes. I eksempelet i figur 3, brukes fem konsentrasjoner.
    3. Seed fire brønner for kontroll forhold.
    4. Gjenta trinn 2.6.1 og 2.6.2 for andre replikere.
    5. Gjenta trinn 2.6.1 til 2.6.4 for hver pasientprøve som skal testes i platen.
    6. Seed en MM-cellelinje i to linjer av brønner, hver med like mange brønner som legemidler som skal testes (i duplikat). Hver av disse brønnene vil bli behandlet med den høyeste konsentrasjon av hvert legemiddel for å sikre at lager brukt hadde tilstrekkelig PotenCY (se figur 3 for eksempel).
    7. Seed to brønner med en MM-cellelinje for å tjene som kontroll av eksperimentelle betingelser, slik som funksjon av benken toppen inkubator, vekstmedier, etc.

3. Seeding Celler i Plates (Ved hjelp av en robot Pipettor)

Merk: Denne serien av trinn frø en 384-brønners plate ved hjelp av en robot pipettor. Utformingen av platen er vist i Supplemental figur 1, hvor primær mm celler testet mot et panel av 31 forskjellige medikamenter ved fem forskjellige konsentrasjoner i to paralleller, i tillegg til negativ kontroll. En cellelinje er også podes som positiv kontroll for evaluering av legemidlets effekt og testet mot alle 31 stoffene ved den høyeste konsentrasjon, i to paralleller. Filene gitt er for et bestemt merke og modell (se Materialer tabell), men algoritmen kan tilpasses eventuelle robot pipetter.

  1. Co-kulturen i primær MM celles med BMSCs:
    1. Forbered et 15 ml rør som består av 240 pl av 10 x MEM, 240 ul avionisert H 2 O, 120 mL av 7,5% natriumbikarbonat-løsning, 600 ul av 1 x RPMI 1640 og 1,8 ml av 3,1 mg / ml bovint kollagen type I. Merk tube som "pre-mix for CD138 +". Plasser på is inntil bruk.
    2. Tilbered en 1,5 ml rør som består av 50 ul av 10 x MEM, 50 mL deionisert H2O, 25 pl av 7,5% natriumbikarbonat-løsning, 125 ul av 1 x RPMI 1640 og 375 ul av 3,1 mg / ml bovint kollagen type I. etikett tube som "pre-mix for Cell Line". Plasser på is inntil bruk.
    3. Re-suspendere 300 ul CD138 + celler i RPMI 1640 til seks ganger det siste ønsket tetthet. Re-suspendere 300 ul BMSC celler i RPMI 1640 til seks ganger det siste ønsket tetthet. Bland begge volumer sammen i en 1,5 ml tube og etiketten "CD138 +". Plasser i inkubator før bruk.
    4. Re-suspendere 60 mLcellelinje i RPMI 1640 med seks ganger den endelige ønskede densitet. Re-suspendere 60 mL av BMSC celler i RPMI 1640 til seks ganger det siste ønsket tetthet. Bland begge volumer sammen i en 1,5 ml tube og etiketten "Cell Line". Plasser i inkubator før bruk.
    5. Ved hjelp av programvaren som følger med robot pipettor, legger den første skriptfilen, "cell_seedingPt47.PGM". Plasser en 200 ul pipette boks, en mikrotiterplate, og en steril 384-brønners plate i stasjonene A, B og E, respektivt, av roboten.
    6. Bland innholdet i rør "pre-mix for CD138 +" og "CD138 +". Overfør 1,5 ml av innholdet til brønnen 1 av mikrotiterplaten. Plasser røret med resterende volum på is. Starte programmet. Roboten vil seede de første 176 brønner (11 kolonnene lengst til venstre) av 384-brønners plate og deretter pause. Overfør den resterende av røret på is til brønn 2 av mikrotiterplate. Gjenoppta programmet. DenRoboten vil seede de resterende 144 brønner på 384-brønners plate og pause.
    7. Bland innholdet i rør "pre-mix for Cell Line" og "Cell Line" og overføre innholdet til brønn # 3 av mikrotiterplate. Gjenoppta programmet. Roboten vil seede de resterende 64 brønner på 384-brønners plate.
    8. Plasser 384-brønners plate i sentrifuge i 10 minutter ved 500 xg og 4 ° C. Overføringsplate for å inkubator (5% CO2, 37 ° C) i 1 time for kollagen polymerisasjon.
    9. Legg den andre skriptfilen, "media_layer.PGM". Plasser 120 mL pipettespissen boks, en reagent reservoar med 31 ml RPMI-1640 supplert med 10% FBS, 10% pasientens plasma og 1% P / S, og den 384-brønns plate med celler i stasjonene A, B og E, hhv. Kjør programmet. Roboten vil overføre 81 ul av mediet i hver brønn. Når du er ferdig, overfører 384-brønners plate til inkubator og la stroma å følge underlaget O / N.
  2. 4. Drug Utarbeidelse og medisinere av plater (Ved hjelp av en manuell flerkanals Pipettor)

    1. Utarbeide en mal som ligner på figur 3 for å lette prosessen med å legge stoffet til brønner og redusere sjansen for misforståelser.
    2. Tilberede, i en 96-brønners plate, en seriefortynning av hver av de legemidler som skal testes i platen, for eksempel i fem konsentrasjoner ved hjelp av en tre-ganger fortynning:
      1. Legg 120 mL av medikament ved 10 x den ønskede konsentrasjon i den høyeste konsentrasjon brønnen. For eksempel bruke 500 mikrometer melfalan hvis den høyeste konsentrasjonen cellene vil bli utsatt i platen vil være 50 mikrometer.
      2. Legg 80 ul vekstmedium (RPMI supplert med 10% FBS, 10% pasient-avledet plasma og 1% penicillin / streptomycin (P / S)) til de fire etterfølgende brønner.
      3. Overfør 40 pl fra den første brønnen til den andre og blandes, til et totalt volum på 120 ul ved 1/3 av den første brønnen er legemiddelkonsentrasjon, eller ett67 mikrometer.
      4. Gjenta trinn 4.2.3 til de resterende brønnene (f.eks overføre 40 ul fra andre til tredje, mikse, deretter overføre 40 ul fra tredje til fjerde, etc.).
    3. Overfør 8 ul fra hvert medikament inneholdende godt til den tilsvarende brønn i celleplaten. Hver medikamentinneholdende brønn bør ha tilstrekkelig volum til 10 brønner i celleplaten. I eksempelet i figur 3, er hver medikamentkonsentrasjon tilsatt til 6 forskjellige brønner, bortsett fra den høyeste konsentrasjon, som er lagt til 8 brønner.
    4. Tilsett 8 ul vekstmedium (RPMI supplert med 10% FBS, 10% pasient-avledet plasma og 1% P / S) til kontrollbrønnene.
    5. Plasser cellene i mikroskop så snart klar og slå på benken toppen inkubasjon.

    5. Drug Utarbeidelse og medisinere av plater (Ved hjelp av en robot Pipettor)

    1. Last ned skriptfiler for robot pipettor fra http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS files.zip
    2. Laste script "media_layer_DRUGPLATE.PGM" i robot pipettor brukergrensesnitt. Plasser en 120 ul pipette boksen reservoar med 21 ml RPMI-1640 supplert med 10% FBS, 10% pasientens plasma og 1% P / S og et tomt 384-brønners plate i stasjonene A, B og E, respektivt. Kjør programmet, vil robot pipettor legge 30 mL av media til alle brønnene i 384-brønns plate.
    3. Etter mal fra Opplysning figur 2 Tilsett 200 ul av medikament ved 20x maksimale konsentrasjon til hver brønn av en mikrotiterplate. Dette oppsettet har plass til opptil 31 medikamenter. Til kontrollbrønnen (CTRL), tilsett RPMI-1640 supplert med 10% FBS, 10% pasient plasma og 1% P / S.
    4. Plasser en 120 mL pipette boksen, mikrotiterplate med narkotika på 20X konsentrasjon, og 384-godt med media (fra trinn 5.1) i stasjonene A, B og C, henholdsvis. Laste programmet "drug_plate.PGM". Robot pipettor vil skape en seriell fortynningpå 1: 3 etter den romlige fordeling i Supplemental figur 1.
    5. Plasser en 120 ul pipette boks i 384-brønns plate med medikament-fortynning (fra trinn 5.3) og 384-brønners plate med celler (fra trinn 3.1.9) i stasjonene A, B og C, henholdsvis. Lasten og kjøre programmet "drug_add.PGM". Robot pipetten vil overføre 8 mL av medikament fra hver brønn i stoffet platen til dets motpart i celleplaten. Når ferdig, overføre celleplaten til inkubatoren av den digitale mikroskop så snart som mulig.

    6. Imaging Celler i Plate

    Merk: Fremgangsmåten nedenfor gjelder for Evos Auto FL mikroskop, men kan lett tilpasses andre motoriserte scene mikroskoper med benk toppen inkubasjon eller inkubator-embedded mikroskoper.

    1. Rengjør innsiden av benken toppen kuvøse med en etanol-våtserviett og fjern forsiktig lokket av platen mens du setter lokket på incubator.
    2. Følg programvare trinnene for å legge beacons. Dette er betegnelsen som brukes for å referere til landemerker for regioner av interesse, for å bli fotografert suksessivt under forsøket (se programvare bruksanvisning for detaljer).
    3. Bruk en 5X eller 10X forstørrelse objektiv. Sørg for at fokus er lik Figur 2: MM celler vises som lyse disker omgitt av en mørk ring og BMSCs eller HUVECs er knapt synlig. Noen primære MM celler er svært liten, og dermed en finjustering kan være nødvendig for å finne den optimale fokus.
    4. Juster kjøpet intervallet mellom 10-30 min og for varighet på minst 96 timer. Selv om lengre intervaller mellom kjøp er akseptable, kan intervaller på 45 minutter eller mer i betydelig grad redusere presisjonen av målingen av levedyktighet.
    5. Konfigurere programvaren slik at bildene av hver brønn lagres i egne filer med navn Beacon-1, Beacon-2, etc. Hvis robot pipettor ble brukt, satt fyrtårnene i den rekkefølgen avbildet iOpplysning Figur 3.
    6. Sørg for at det er nok vann i kuvøsen luftfukter og gass, slik at cellene vil være i optimale forhold.
    7. Ved gjennomføring av forsøket, kopierer mappene som inneholder bildene til datamaskinen som skal kjøre analysen.

    7. Kvantifisering av Drug Sensitivity

    Merk: De følgende instruksjonene styre bruken av bildeanalyse ved hjelp av en datamaskin klynge, siden analysen av en multi-brønn plate i en personlig datamaskin er svært tidkrevende.

    1. Last ned ImageJ programvare fra NIH hjemmeside: http://imagej.nih.gov/ij/
    2. Last ned script og plugins på http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
    3. Følg instruksjonene i http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf å kjøre digital bildeanalyse programvare. Resultatet skal være et regneark som heter Results.csv inneholder levedyktighet målinger med jevne mellomrom for each brønn i platen for varigheten av forsøket (dvs. 96 timer).
    4. Hvis du bruker en manuell flerkanals pipette, utføre følgende trinn.
      1. Last ned filen http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt og endre den til å matche oppsettet av platen definert i trinn 3.1 (for eksempel figur 3).
      2. Last ned programvaren http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar og kjøre det ved hjelp av filer som er opprettet i trinn 5.3 og 5.4 som input parameter. Resultatet vil være et mappenavn Rapporter som inneholder flere regneark, hver gruppering resultatene for et bestemt legemiddel.
      3. Kopiere og lime inn innholdet i regnearkmalen http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
        Merk: Resultatet bør være grafer som den vist i figur 4, som representerer kjemosensitivitet av prøven til forskjellige medikamenter som en funksjon av medikamentkonsentrasjon og eksponeringstid.
      4. </ Ol>
      5. Hvis du bruker en robot pipettor, utføre følgende trinn.
        1. Last ned malfiler fra nedlasting skriptfiler for robot pipettor fra http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic Mal Files.zip og pakke ut filer i en katalog.
        2. Endre filen DrugList.csv henhold til listen over legemidler og høyest legemiddelkonsentrasjon i platen med celler. Følg oppsettet av Opplysning figur 2.
        3. Kjør programmet BuildExperimentalDesign.java passerer som parameter mappen som inneholder filene ut i trinn 7.5.1 og filene Results.csv fra trinn 7.3. Resultatet skal være to mapper nevne MM1_S og PtSample. Det første inneholder en beskrivelse av brønnene (narkotika og konsentrasjoner) for cellelinjen positiv kontroll. Den andre inneholder samme informasjon, men med hensyn til en del av platen podet med pasientens celler.
        4. Kopiere filen Results.csv i hver av kataloger opprettet i trinn 7.5.3. Last nedprogramvaren http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar og kjøre det ved hjelp av filer som er opprettet i trinn 7.5.3 for begge mapper. Resultatet vil være et mappenavn Rapporter i hver av mappene opprettet i 7.5.3. Rapporten mappen inneholder flere regneark, hver gruppering resultatene for et bestemt legemiddel.
        5. Kjør programmet BuildGraphPadFile.java og passere som parameter mappen som inneholder filene ut i trinn 7.5.1 og filene Results.csv fra trinn 7.3. Resultatet vil bli en GraphPad fil som inneholder doseresponskurver for hver av de 31 stoffer, og normalisert ved kontrollen. Hvert diagram vil inneholde fem legemiddelkonsentrasjon for primær MM celler og en konsentrasjon for den positive cellelinje kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Strømmen av forsøket er kort beskrevet i figur 1. Dersom alle trinnene er fullført, bildene innhentet av mikroskopet bør være tilsvarende til fig. 2: lever mm celler bør være tydelig ses som lyse disker og BMSCs eller HUVECs bør være knapt synlig og godt fordelt i bakgrunnen. Som vist i figur 2A, mm celler varierer i størrelse fra en pasient til den andre, men generelt er de mindre enn cellelinjer. Siden de praktisk talt ikke replikere ex vivo under intervallet av eksperimentet (96 timer), kan de bli sådd ut ved høyere konsentrasjoner (1-3 millioner celler / ml). Stroma bør være knapt synlig, som BMSC holder seg til bunnen av brønnen og strekk, presentere en lav profil. Den humane myelomcellelinje H929 er vesentlig større enn pasient-avledet mm celler (figur 2B), og replikerer i løpet av 24 timer. For å forhindre trengsel av bildet, er MM cellelinjer seded en lavere tettheter, 0.300.000 / ml. Figur 2C og 2D representerer pasient-avledet mm celler og humane myelomcellelinjer H929, henholdsvis ko-dyrket med HUVECS. HUVECS først holder seg til bunnen av brønnen, og deretter begynne å kontakte hverandre og danner nettverk, som senere blir tykkere og med lumen.

Figur 4 er et eksempel på hva som kan forventes fra de behandlede video generert av bildeanalyse-algoritmen, som viser påvises levende mm celler pseudo-farget med grønt (figur 4A) med ingen eller svært lite grønt signal i BMSCs og HUVECs ved slutten av forsøket i den høyeste legemiddelkonsentrasjon, når alle mm celler er døde (figur 4B). Programvaren skal aggregere resultatene fra ulike brønner og bygge et diagram som viser gradvis tap av levedyktighet med eksponeringstiden ved ulike legemiddelkonsentrasjoner (Figur 4C). Kurven for doseresponsen vedkontrollcellelinje (for eksempel H929 eller MM1.S) bør være den samme som for tidligere eksperimenter; betydelige avvik kan indikere problemer med stamløsning av stoffet som brukes i forsøket.

Det er viktig å nøye observere alle brønnene seeded før du starter bildeprosessen, som artefakter kan villede bildeanalyse programvare og føre til falske resultater. For eksempel viser figur 5A resultatet av en overdreven tetthet av BMSCs i brønnen eller for mye tid som er gått mellom trypsinering og poding, som fører til disse cellene danner klumper. Figur 5B viser "kolonier" av MM-celler. Hvis cellelinjer blir utsådd ved høye tettheter, vil de danne kolonier som de replikere og dette reduserer nøyaktigheten av den digitale bildeanalyse algoritmen som det blir stadig vanskeligere å skjelne én celle fra en annen. Figur 5C er et eksempel på det motsatte, der også få mm celler ble sådd. Tsin oppstår ofte når antallet mm celler oppnådd fra benmargs er under 500 000, og "dødvolum" venstre i røret før re-suspensjon blir sammenlignes med volumet av mediet er nødvendig for å resuspendere mm celler i høye tettheter . For å løse dette problemet ved å bestemme dødvolum for røret som brukes og inkludere den i fortynningen beregningene. Figur 5D er et eksempel på skrå fokalplanet. Legg merke til hvordan MM celler på øverst til venstre er lyse og de i nederste høyre er mørk. Dette er forårsaket av am ujevnt plassert plate eller feilaktig plassert objektiv. Dette vil føre til MM celler i ulike deler av bildet som skal telles annerledes. Skala barer (nederst til høyre på hvert bilde) representerer 500 mikrometer.

Figur 1
Figur 1. Protokoll samlet beskrivelse. (A) Under et bein Marrow biopsi en ekstra rør av aspirate oppnås for protokollen. (B) myelomatose (MM) celler er magnetisk skilt fra andre celler i aspirer. (C) tre rør, som inneholder MM-celler (MM), ikke-MM-celler og plasma, respektivt, blir oppnådd fra separasjonsprosessen. (D) på benmarg avledet mesenchymale stamceller (BMSCs) fra tidligere aspirates er co-kultivert med fersk innhentet MM celler, og re-suspendert i ekstracellulære matrise (kollagen eller basalmembran matrix). (E) Platen blir spunnet ned for å sikre at så mange som mulig MM er i samme fokalplan og BMSC er klar til å forholde seg til bunnen av brønnen. Platen plasseres i inkubatoren inntil matrisen polymeriserer. (F) Hver brønn er fylt med en blanding av kulturmedier og pasient-avledet plasma. Platen er plassert i en inkubator O / N. (G) Medikamenter blir tilsatt til hver brønn og platen blir plassert i et mikroskoputstyrt med et digitalt kamera, motorisert scene og topplaten inkubator, og avbildes med jevne mellomrom i en periode på 96 timer. (H) bildefiler for hver brønn ble analysert ved hjelp av en algoritme som deler bor mm celler basert på membranbevegelse (levende celler blir pseudo farget med grønt) og skaper et regneark med endringer i celledannelse for hver brønn for hvert tidspunkt. Scale bar (nederst til høyre) representerer 500 mikrometer. (I) et program grupper brønnene ved narkotika og konsentrasjoner og skaper et regneark med kurver av doserespons normalisert slik at de første tiltakene er 100%. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Pre-medikament forventet utseende av brønner. (A) MM celler co-dyrket med stroma. (B) Den humane myelomcellelinje H929 ko-dyrket med stroma. (C) Pasient-avledet MM celler i co-kultur med HUVECS. (D) human myelom cellelinje H929 i ko-kultur med HUVECS. Skala barer (nederst til høyre på hver figur) representerer 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Anbefalt romlige fordelingen av brønner i en 384-brønners plate. Hver 384-brønners plate kan bære tre pasientprøver med 7 forskjellige medikamenter, eller en pasientprøve testet med 21 narkotika. Brønner i lys grønn, lys blå og tan, inneholde MM celler fra tre forskjellige pasienter. RX1, Rx2, etc., representerer ulike rusmidler, hver på fem forskjellige contrasjoner og i to eksemplarer. Fire brønner blir anvendt som kontroller for hver pasient (36-39 for pasient 1, 126-129 for pasient 2 og 200-203 for pasient 3). Brønner i orange inneholder cellelinjer ved høyeste legemiddelkonsentrasjon av hvert medikament, i duplikat. Brønner i gult er cellelinje kontroller (ingen narkotika). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Eksempel på digital bildeanalyse og doserespons diagrammer. (A) MM celler i ko-kultur med BMSCs, innleiret i kollagen I, utsatt for en konsentrasjon på 50 nM carfilzomib. Bildeanalyse algoritmen oppdager levende celler og pseudo-farger dem i grønt. (B) blir ervervet ved regelmessige intervaller i løpet av forsøket. I denne concentratipå fra stoffet, er nesten alle celler er døde ved slutten av 96 timer. (C) Figuren viser endringer i antall levedyktige celler for fem forskjellige konsentrasjoner av carfilzomib langs et intervall på 96 timer, normalisert for tid = 0 timer som 100%. Den humane myelomcellelinje MM1.S ble anvendt som kontroll for legemidlets effekt. Skala barer (nederst til høyre på A og B) representerer 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Vanlige feil mens seeding eller bilde plate. (A) stromaceller "flokete". (B) "Colonies" av MM celler. (C) For få mm celler. (D) Skjev fokusplan. Skala barer (nederst til høyre på hvert bilde) representerer 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1 sup
Opplysning Figur 1. Optimal romlige fordelingen av brønner i 384-brønns plate ved hjelp av en robot pipettor. I denne konfigurasjonen 31 forskjellige legemidler kan testes på 5 forskjellige konsentrasjoner og to gjentak (grønn). I tillegg kan positive kontroller med en cellelinje brukes for å sikre stoffet potens (rosa). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 Sup
Opplysning Figur 2. Romlig fordeling av narkotika "master plate". Robot pipettor vil bruke denne platen der hver inneholder vel en av de 31 stoffene på 20x konsentrasjon, for å skape legemiddelfortynning plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 Sup
Opplysning Figur 3. Nummerering av brønner som skal brukes når du forbereder en plate med en robot pipettor. Programvaren som beskrives i protokollen krever denne nummereringen av brønnene for å tilstrekkelig kartlegge brønnene til narkotika og konsentrasjoner. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

/ftp_upload/53070/53070fig4sup.jpg "/>
Opplysning Figur 4. Sammenligning mellom microfluidic sklie (Khin et al., 2014) og nåværende protokollen. Dose respons H929 multippelt myelom cellelinjen målt i 24 timer i den gamle ordningen (øverst til venstre bortezomib, midtre venstre melfalan) og i dagens system ( øverst til høyre bortezomib og midtre høyre melfalan). For sammenligningens skyld, LD50 ved 24-timers for begge plattformene var 3,9 nM og 4,1 nM for bortezomib, og 6,4 mikrometer og 14.65 mikrometer for melfalan. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oppsummert er dette en kraftig og høy gjennomstrømning metode for å kvantifisere kjemosensitivitet av primære MM celler og ex vivo farmakodynamikk av narkotika i en rekonstruksjon av benmargen. De kritiske trinnene i denne protokollen er den riktige såing av brønnene og tilstrekkelig fokusering (se figur 2 for forventede resultater): sørge for at MM og stromale celler er jevnt fordelt, at stromale celler er adherent til bunnen av brønnen, som alle MM celler er i samme fokalplan, og at MM celler har aspektet av en lys skive omgitt av en mørk ring.

I tilfelle av feil seeding (se figur 5), ikke fortsette med forsøket, men heller frø en ny plate. Hvis problemet oppdaget var lav eller høy MM eller stroma celletettheten, kontrollerer cellekonsentrasjonen i røret før såing og resuspender med jevne mellomrom i løpet av seeding prosessen for å sikre en homogen fordeling av cellenei media. Bruken av en flerkanals pipette med repeater funksjon eller robot dispenser i betydelig grad kan redusere dette problemet. Andelen av celle / matriks til media (01:10) som brukes i denne analysen søkt å maksimere antallet brønner som kan være podet og dermed forholdene studert. Imidlertid, for å studere løselige faktorer produsert eller konsumert av kreftceller eller stroma, anbefales det at en andel av celle / matriks i media være 1: 1.

Som for tiden implementert, kvantifiserer dette systemet bare de ikke-adherente celler. For å kvantifisere endringer i celletall stroma programvaren måtte endres og tilpasses de morfologiske egenskapene til stroma. Dette ville være en nyttig funksjon for å studere effekten av kreftceller eller legemidler i stroma rommet. Det her beskrevne system er også i stand til å kvantifisere cellularitet av adherente kreftceller, spesielt hvis de kombineres med vedhengende stroma. Løsningen vil være endringer i den digitale image analyse algoritme for å skille fra stroma kreft basert på morfologiske egenskaper, eller for å pre-inkubere hver populasjon med et fluorescerende fargestoff som kan brukes til å identifisere celler fra enten populasjon.

Betydningen av denne protokollen sammenlignet med tidligere metoder er evnen til å vurdere medikamentrespons av primære kreftceller i en ex vivo rekonstruksjon av mikromiljøet i benmargen i en ikke-destruktiv måte, slik at sekvensielle målinger kan gjøres, og dermed gi mye mer detaljert informasjonen om farmakodynamikk, heller enn på faste tidspunkter. En av begrensningene i vår tidligere assay 6 var lineær gradient dannet ved diffusjon stoff, som bare tillot evaluering av medikamentsensitivitet innen et lineært vindu av konsentrasjoner. Den nåværende analysen tillater vurdering av levedyktighet over noen spekter av legemiddelkonsentrasjon, siden hver brønn er en separat enhet. Begge analysene har imidlertid generere tilsvarende resultater (

Blant de mange fremtidige anvendelser av denne tilnærmingen, er vår gruppe fokusert på å bruke matematiske modeller for å ekstrapolere farmakodynamikk informasjon fra disse analysene til klinisk respons. For å oppnå dette målet vi foreslå å passe datapunktene oppnådd (Figur 4C) for hvert legemiddel som et system av differensialligninger, som beskriver dynamikken i narkotika-indusert celledød. Deretter, ved å påføre på disse matematiske modellene de kjente farmakokinetiske egenskaper av hvert medikament i en klinisk diett, ville det være mulig å estimere den virkelige respons av pasienten 6. Ved å automatisere såing og kjemiske preparater ved hjelp av et robotsystem, ville det være mulig å teste ikke bare standard medikamenter, men også over hundre eksperimentelt stoff per prøve (på en 1536-brønners plate). Dette vil åpne muligheten for i silico kliniske studier, der hundrevis av eksperimentelle medikamenter kan bli testet ikohorter av pasienter prøver, og dermed skape overlevelseskurver for virtuelle kliniske studier 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denne forskningen ble finansiert av staten Floridas Bankhead-Coley teamet Science Grant (2BT03), National Institutes of Health / National Cancer Institute (1R21CA164322-01) og Moffitt kreftsenter Team Science Grant. Dette arbeidet har vært støttet blant annet av translasjonell forskning kjernefasiliteten på H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, en NCI utpekt Comprehensive Cancer Center (P30-CA076292). Tilgang til primære celler ble gjort mulig gjennom Total Cancer Care Protocol ved Moffitt Cancer Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EVOS FL AUTO AMG AMAFD1000 + AMC1000 Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind CORNING CLS3683 SIGMA Corning CellBIND 384 well plates
384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind CORNING CLS3832 ALDRICH Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus  GE Healthcare GE17-1440-02 SIGMA For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads Miltenyi  130-051-301 Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns Miltenyi   130-042-401 Column for separation of cells.
MidiMACS Separator Miltenyi  130-042-302 Magnet for separation column.
Matrigel Sigma-Aldrich E6909 SIGMA ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex Life Technologies A1413201 LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC Life Technologies C-003-25P-B Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media GIBCO 11875-093 RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated GIBCO 10082-147 Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1 mg/ml Bovine collagen type I Advanced Biomatrix 5005-B Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS BIOTEK PRC3841 Robotic pipettor system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salmon, S. E., et al. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs. N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).
  2. Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
  3. Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
  4. Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials. J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).
  5. Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. The role of complete response in multiple myeloma. Blood. 114, 3139-3146 (2009).
  6. Khin, Z. P., et al. A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma. Cancer Res. 74, 56-67 (2014).
  7. Misund, K., et al. A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells. J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).
  8. Ramasamy, K., et al. Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells. Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).
  9. McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nat Med. 16, 483-489 (2010).
  10. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  11. Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry. Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).
  12. Najar, M., et al. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6. Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).
  13. Scott, J. Phase i trialist. Lancet Oncol. 13, 236 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics