Un système organotypiques à haut débit pour la caractérisation de la sensibilité des médicaments cellules du myélome multiple primaire

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Silva, A., Jacobson, T., Meads, M., Distler, A., Shain, K. An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells. J. Vis. Exp. (101), e53070, doi:10.3791/53070 (2015).

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Abstract

Dans ce travail, nous décrivons une nouvelle approche qui combine ex vivo tests de sensibilité aux médicaments et l'analyse d'image numérique pour estimer la chimiosensibilité et l'hétérogénéité de myélome multiple (MM) de cellules provenant de patients. Cette approche consiste à ensemencer les cellules MM primaires fraîchement extraites d'aspirats de moelle osseuse dans des chambres microfluidiques mises en œuvre dans des plaques à puits multiples, chacun consistant en une reconstruction du microenvironnement de la moelle osseuse, y compris la matrice extracellulaire (collagène ou de la membrane basale matrice) et le stroma (patient des cellules dérivées de souches mésenchymateuses ou des cellules endotheliales) d'origine humaine (HUVEC). Les chambres sont drogués avec différents agents et concentrations, et sont imagés séquentiellement pendant 96 heures grâce à la microscopie à champ clair, dans un microscope motorisé équipé d'un appareil photo numérique. Logiciel d'analyse d'image numérique détecte cellules vivantes et mortes de présence ou absence de mouvement de la membrane, et génère des courbes d'évolution de la viabilité en fonction of concentration de drogue et le temps d'exposition. On utilise un modèle de calcul pour déterminer les paramètres de la chimiosensibilité de la population ayant une tumeur de chaque médicament, ainsi que le nombre de sous-populations présentes en tant que mesure de l'hétérogénéité de la tumeur. Ces modèles adaptés au patient peuvent alors être utilisées pour simuler des régimes thérapeutiques et estimer la réponse clinique.

Introduction

Le but de cette méthode est de caractériser la sensibilité aux médicaments du myélome multiple (MM) des cellules primaires pour un panneau d'agents ex vivo, aussi près que possible des conditions physiologiques, et avec suffisamment de précision que ces résultats peuvent être utilisés pour identifier des sous-chimiorésistance populations au sein de la charge tumorale et, finalement, à paramétrer des modèles de calcul visant à estimer la réponse clinique.

Les modèles informatiques sont des outils puissants pour analyser les systèmes complexes, tels que le cancer interactions hôte-thérapie. Cependant, les modèles sont seulement aussi bon que les données utilisées pour les paramétrer. Malheureusement, la plupart des données disponibles dans la littérature ne peuvent pas être utilisés dans sa forme actuelle pour paramétrer ces modèles, car ils sont souvent obtenus dans des conditions expérimentales mutuellement exclusifs. Ainsi, de nouvelles expériences sont souvent nécessaires dans le but d'obtenir l'ensemble des paramètres expérimentaux nécessaires. La plupart des essais de viabilité, cependant, sont destructrices et enous limités à un petit nombre de points dans le temps, souvent un seul. Cette handicape grandement l'utilisation de tests de chimiosensibilité de paramétrer des modèles de calcul, puisque de telles expériences ne parviennent pas à fournir des informations sur la dynamique temporelle du système. Cela est particulièrement vrai avec les cellules cancéreuses primaires, qui sont souvent limitées à quelques millions par échantillon, et ont une courte durée de vie après la biopsie, limitant ainsi le nombre de conditions expérimentales disponibles. En outre, la plupart des essais de viabilité nécessitent la séparation du cancer des cellules non cancéreuses (stroma) au moment de la quantification, qui ajoute un surcroît de travail pour le protocole, perturbe en outre les cellules, et limite le nombre d'expériences qui peuvent être effectuées .

Il ya 40 ans, le saumon et ses collaborateurs 1 proposé leur fameux test in vitro de la formation de colonies pour l'évaluation de la chimiosensibilité des cellules tumorales. Malheureusement, ce test a trouvé un succès mitigé en raison du petit nombre de mye multiplesLoma (MM) des échantillons de patients qui étaient capables de former des colonies dans des conditions de contrôle: Il a été estimé que seulement un petit sous-groupe de 0,001% à 0,1% des cellules MM ont été capables de replication, étant désignées comme des cellules souches de myélome multiple 2. Cela a limité de manière significative le taux de succès de l'essai et le nombre de médicaments qui pourraient être testés en même temps, même dans les modèles plus récents 3. Cette question est beaucoup plus important maintenant, quand des agents MM (standard ou expérimentales) sont plus nombreux que il ya quatre décennies.

Une limitation majeure de ces premiers essais est leur production dichotomique: soit un patient est «sensible» ou «résistant» à un médicament particulier. Aucune information n'a été fournie concernant le degré de sensibilité et de l'hétérogénéité de la population de la tumeur. Ainsi, les patients avec de petites sous-populations de cellules résistantes à croissance rapide seraient classées comme «sensibles» à la thérapie, mais retombait peu, et donc pas benEFIT du traitement. Compte tenu de l'importance de la durée de la réponse de la survie globale (OS) des patients atteints de cancer de 4,5, il est clair comment ces tests ne sont pas en mesure d'estimer correctement OS cohérente.

Afin de contourner ces limitations, et d'être en mesure de générer des modèles de calcul spécifiques à un patient qui permettraient d'estimer la réponse clinique personnalisé à un panel de médicaments, nous avons développé une méthode pour la sensibilité au médicament de contrôle non destructif de myélome multiple (MM) lignées cellulaires et les cellules MM primaires dans une ex vivo reconstruction du microenvironnement de la moelle osseuse, y compris le stroma et la matrice extracellulaire 6. Cet essai, cependant, avait la limitation de compter sur une diapositive microfluidique commerciale particulière, dont les dimensions et le coût limité le nombre d'expériences ou de médicaments qui pourraient être réalisées à la fois dans un équipement donné.

Le système décrit ici étend cette analyse originale dans une haute-throughput organotypique plate-forme de dose-réponse, pour le criblage in vitro de médicaments, sur la base d'un algorithme numérique d'analyse d'image de manière non destructive quantifier la viabilité cellulaire. Chaque puits dans 384 ou 1 536 puits des plaques est une reconstruction 3D du microenvironnement de la moelle osseuse, y compris des cellules primaires de MM, une matrice extracellulaire, et le stroma et les facteurs de croissance dérivés de patients. Microscopie directe et une analyse d'image numérique sont utilisés pour détecter des événements de mort cellulaire dans différentes concentrations de médicament, qui sont utilisés pour générer des surfaces de dose-réponse. D'après les données in vitro, un modèle mathématique identifie la taille et la chimiosensibilité des sous-populations à l'intérieur de la charge tumorale du patient, et peut être utilisé pour simuler la manière dont la tumeur répondrait à la drogue (s) dans des conditions physiologiques dans un régime clinique 6 ( Figure 1).

Les principales innovations de cette plate-forme sont: (a) petit nombre de cellules cancéreuses nécessaires (1,000-10,000 par médicament concentration); (B) l'évaluation de l'efficacité des médicaments dans des conditions physiologiques (matrice extracellulaire, stroma, des facteurs de croissance provenant de patients); (C) Aucune toxicité de la viabilité des marqueurs 7 puisque seule l'imagerie du champ lumineux est utilisé, donc pas nécessaire de transfecter des cellules avec une fluorescence 8 ou 9 bioluminescence; (D) l'imagerie en continu fournit l'effet du médicament en fonction de la concentration et du temps d'exposition (pharmacodynamie); et (e) l'intégration entre les modèles in vitro et l'évolution de calcul pour estimer le résultat clinique 6 (Silva et al., en préparation).

Le facteur clé qui permet à l'algorithme d'analyse d'image numérique de discerner le cancer à partir de cellules stromales est leur affinité différente pour le fond du puits: les cellules MM ne se conforment pas, et restent en suspension dans la matrice, tandis que les cellules stromales adhèrent au fond de la bien et puis étirer.

Cette séparation se produit même si MM et le stroma unere ensemencées en même temps, et se produit au cours de la / O N processus d'incubation. L'ensemencement de filature dans la centrifugeuse suivante de la plaque accélère encore ce processus. En conséquence, les cellules MM apparaissent dans l'image que les disques ronds lumineux entouré par un anneau sombre, tandis que le stroma maintient un profil bas et une teinte plus foncée (Figure 2). Ainsi, le dosage dans sa forme actuelle est le mieux adapté pour les cellules cancéreuses non-adhérentes, bien que des ajustements dans l'algorithme pourrait être fait pour le cancer et le stroma séparé reposant sur d'autres caractéristiques morphologiques, comme la taille et la forme. Dans ce protocole, nous décrivons deux types de matrice extracellulaire (collagène et de sous-sol matrice de membrane) ainsi que les deux types de co-cultures, avec (cellules souches mésenchymateuses de moelle extraite d'os) BMSC et HUVEC, qui représente les créneaux interstitiels et périvasculaires de la moelle osseuse respectivement.

Utiliser une plaque de 384 puits, 5 concentrations par la drogue et deux répétitions, nous avons été en mesure de test jusqu'à 31 médicaments différents avec l'échantillon d'un seul patient. En 1536 plaques ainsi ce nombre est 127. Figure 3 représente la disposition actuellement utilisée pour l'ensemencement manuel cellulaire, tandis que la figure 1 supplémentaire représente la distribution optimale aide d'une pipette robotisée. Dans la conception de la figure 3, chaque plaque de 384 puits peut transporter 3 échantillons de patients avec 7 différents médicaments, soit un échantillon de patient testés avec 21 médicaments. Chaque médicament est représenté par 5 concentrations, et chaque état est ensemencée en double. 4 puits de contrôle (pas de médicament ajouté) sont ensemencées pour chaque ensemble de 7 médicaments (par exemple, les puits 36-39, 126-129 et 200-203). Pour garantir l'efficacité des médicaments utilisés, une lignée cellulaire de myélome humain (par exemple, H929 ou MM1.S) est également tête de série, et droguée en double à la plus forte concentration de chacun des médicaments utilisés (puits 76-89). Le contrôle de la lignée cellulaire positif assure que les médicaments utilisés ont une puissance suffisante, puisque leurs courbes de réponse de dose sont comparables acexpériences Ross. Deux puits sont ensemencés avec une lignée cellulaire de myélome que le contrôle des conditions environnementales, en d'autres termes, pour détecter d'éventuels problèmes dans la paillasse incubateur lors de l'imagerie (puits 75 et 90). Le dénombrement des puits suit un motif en zigzag afin de réduire la distance parcourue par la platine motorisée du microscope, ce qui réduit le temps d'acquisition et de réduire l'usure de l'équipement.

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Protocol

L'utilisation de cellules humaines dérivées de biopsies, comme décrit ci-dessous a été approuvé par l'Institutional Review Board de Moffitt et effectuée en vertu de l'essai clinique de MCC # 14745 menée à l'H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute.

1. Tri des cellules de la moelle osseuse MM aspirats

  1. Récupérer des aspirats de moelle osseuse (20 ml) provenant de patients à l'héparine de sodium seringue.
  2. Isoler les cellules mononucléaires par centrifugation moelle dilué (1: 1 avec du PBS stérile) sur un gradient aqueux milieu de centrifugation stérile à 400 xg pendant 30 min à température ambiante.
  3. Recueillir l'interface, qui contient les cellules mononucléaires. Laver les cellules avec du PBS froid et compter en utilisant un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé, en utilisant du bleu trypan pour la détermination de la viabilité.
  4. Préparer une préparation de cellules diaporama sur couche mince de 10 et tache avec Wright-Giemsa pour évaluer plasma pourcentage de cellules 11.
  5. Calculerla quantité de billes de CD138 à utiliser en fonction du nombre de cellules et le pourcentage de cellules de plasma. Si l'échantillon de départ est inférieure à 20% des cellules plasmatiques, puis remettre en suspension les cellules en utilisant 90 ul de tampon de séparation et 10 ul de billes CD138 par 5 x 10 6 cellules. Si l'échantillon de départ est supérieure à 20% des cellules plasmatiques, remises en suspension en utilisant 80 ul de tampon de séparation et 20 ul de billes CD138 par 1 x 10 7 cellules.
  6. Incuber les cellules avec des perles à 4 ° C pendant 15 min.
  7. Cellules passe à travers un tamis de 35 um ajoutées séparation d'effectuer une pré-humidifié (LS) colonnes placés dans le séparateur de champ magnétique (voir la liste des matériaux).
  8. Retirer la colonne de l'aimant. Recueillir les cellules CD138 sélectionnées par lavage de la colonne avec 3 fois 1 ml d'un tampon de séparation.
  9. Évaluer l'enrichissement CD138 avec une autre préparation de cellules en couche mince teinté glisser 10.
  10. Filtre plasma obtenu à partir d'une biopsie de moelle osseuse à partir de chaque patient avec un filtre à seringue de 0,22 um. Utilisez plasma fraisdu même patient que les cellules CD138 +.
  11. Préparer médias pour l'expérience en la complétant RPMI-1640 avec 10% de sérum inactivé à la chaleur de veau fœtal, 10% de plasma du patient et 1% de pénicilline-streptomycine.
  12. Recueillir l'écoulement de la sélection (CD138-) et suivez la méthode d'adhérence classique 12 pour sélectionner les cellules mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSC). Étant donné que ce procédé nécessite semaines avant BMSC sont prêts à être utilisés, il est nécessaire d'avoir BMSC prêt de patients précédents ou de donneurs sains.

2. Les cellules de semis dans des plaques (en utilisant un multi-canal Pipettor Manuel)

  1. Utilisez une plaque multi-puits (384 ou 1536) avec des murs noirs et un fond plat transparent, de préférence une optimisée pour des applications optiques et de la culture cellulaire.
  2. Co-culture avec des cellules BMSC mm de collagène de type I ou l'autre ou d'une matrice de membrane basale, cependant, nécessitent HUVEC matrice de membrane basale.
  3. Garder les densités finales de chaque type de cellule dansla plage suivante: 3 x 10 5 cellules / ml pour les lignées de cellules MM, 2 x 10 5 cellules / ml pour les cellules HUVEC ou des BMSC et 2 x 10 6 cellules / ml pour les cellules MM patient dérivée.
    Note: Ces densités sont le résultat de l'optimisation expérimentale pour permettre une qualité d'image la plus élevée possible et le plus long temps de formation d'image tout en maintenant possible pertinence biologique dans les dosages. Les lignées de cellules MM sont ensemencées à faible densité que les cellules MM primaires en raison de leur taux de replication plus rapide et plus grande taille.
  4. Co-culture de cellules MM avec des BMSC primaires:
    1. Préparer des aliquotes de 100 pi de médias pré-mixte constitué de 20 pi de 10x MEM, 20 pi de H2O désionisée, 10 pi de solution de bicarbonate de sodium à 7,5%, et de 50 pi de 1x RPMI 1640 et conserver à 4 ° C.
    2. Au moment de l'ensemencement des plaques avec des cellules MM, mélanger des aliquotes de milieu de pré-mélangé avec 150 ul de 3,1 mg / ml de collagène bovin de type I à un volume final de 250 ul.
    3. Re-suspmettre fin à 50 pi de cellules dans du milieu RPMI 1640 à six fois la densité finale souhaitée.
    4. Mélanger la suspension de cellules avec du collagène mélange pour créer un volume final de 300 ul en utilisant une pipette P200.
    5. Avec une pipette manuelle ou répéteur, déposer une baisse de 8 pi de cellules finale / matrice mélange au centre de chaque puits dans des plaques de 384 puits, ou 2 pi dans chaque puits de 1 536 plaques à puits (voir l'étape 2.6 pour un exemple de disposition spatiale des puits).
    6. Plaque centrifuger 2 min à 500 g de concentrer toutes les cellules à le même plan focal lors de l'imagerie.
    7. Laisser la plaque dans un incubateur (5% de CO2, 37 ° C) pendant 1 heure, par polymérisation en gel.
    8. Ajouter 80 ul de milieu de croissance supplémenté (RPMI-1640, 10% de FBS, 10% HI patient dérivé de plasma, 1% P / S) dans chaque puits des plaques à 384 puits, ou 8 ul dans des plaques à 1536 puits.
    9. Laisser plaque O / N dans un incubateur (5% de CO2, 37 ° C) pour l'adhésion de stroma vers le bas de la plaque.
  5. Co-culture de cellules primaires avec des cellules HUVEC MM:
    1. Transfert matrice de membrane basale à partir de -80 ° C à un seau avec de la glace à fondre.
    2. Count et remettre en suspension les cellules primaires et des cellules HUVEC dans un milieu RPMI-1640 à quatre fois la densité finale, chacune dans un tube séparé.
    3. Mélanger les cellules du patient et les volumes HUVEC à une proportion 1: 1.
    4. Une fois la matrice de la membrane basale est décongelé, mais pas encore polymérisé, mélanger 1: 1 avec un mélange de cellules de l'étape précédente.
    5. gouttelettes de semences avec un volume adéquat de la cellule-matrice mélange au centre de chaque puits (8 pi pour les plaques 384 puits et 2 pl pour des plaques 1536 puits, voir l'étape 2.6 pour un exemple de disposition spatiale des puits).
    6. plaque de centrifuger à 500 g pendant 10 min.
    7. Placer la plaque dans un incubateur (5% de CO2, 37 ° C) pendant 1 heure pour la polymérisation de la matrice.
    8. Ajouter un média de croissance (RPMI-1640 complété avec 10% de FBS, 10% de plasma du patient et 1% P / S) à chaque puits (80 ul pour les plaques à 384 puits, 8 pl de 1,5Plaques 36 puits).
    9. Laisser plaque O / N dans un incubateur (5% de CO2, 37 ° C) pour l'adhésion de cellules HUVEC vers le bas de la plaque.
  6. Ensemencer une plaque de 384 puits. La figure 3 montre une distribution spatiale typique de l'ensemencement.
    1. A partir du B2 ainsi, ensemencer autant de colonnes que des médicaments pour être testés. Dans l'exemple de la figure 3, utiliser sept médicaments.
    2. Répétez l'ensemencement autant de fois que les concentrations à utiliser. Dans l'exemple de la figure 3, utiliser cinq concentrations.
    3. Seed quatre autres puits pour des conditions de contrôle.
    4. Répétez les étapes 2.6.1 et 2.6.2 pour la deuxième réplique.
    5. Répétez les étapes 2.6.1 à 2.6.4 pour chaque échantillon de patient à tester dans la plaque.
    6. Graine d'une lignée cellulaire MM dans deux lignes de puits, chacun ayant le plus grand nombre de puits en tant que médicaments à tester (en double). Chacun de ces puits seront traités avec la plus forte concentration de chaque médicament afin d'assurer que le stock avait utilisé poten adéquatecy (voir la figure 3 par exemple).
    7. Seed deux puits avec une lignée de cellules MM pour servir de contrôle des conditions expérimentales, telles que le bon fonctionnement du haut incubateur de banc, les milieux de croissance, etc.

3. ensemencer des cellules en plaques (L'utilisation d'un robot Pipettor)

Note: Cette série d'étapes graines une plaque 384 puits à l'aide d'une pipette robotisée. La conception de la plaque est représenté dans la figure supplémentaire 1, où les cellules de MM primaires sont testés sur un panel de 31 médicaments différents à cinq concentrations différentes en deux répétitions, ainsi que le contrôle négatif. Une lignée cellulaire est également ensemencé comme témoin positif pour l'évaluation de l'efficacité des médicaments et testé contre les 31 médicaments à la concentration maximale, en deux répétitions. Les fichiers fournis sont pour une marque et modèle particulier (voir le tableau des matériaux), mais l'algorithme peuvent être adaptées à toutes les pipettes robotiques.

  1. Co-culture de cellules de MM primaires avec BMSCs:
    1. Préparer un tube de 15 ml constitué de 240 ul de 10 x MEM, 240 ul de H2O désionisée, 120 ul de solution de bicarbonate de sodium à 7,5%, 600 ul de 1 x RPMI 1640 et 1,8 ml de 3,1 mg / ml bovine du collagène de type I. étiquetage Tube "pré-mélange pour CD138 +". Placez-les sur la glace jusqu'à utilisation.
    2. Préparer un tube de 1,5 ml constitué de 50 ul de 10 x MEM, 50 ul de H2O désionisée, 25 ul de solution de bicarbonate de sodium à 7,5%, 125 ul de 1 x RPMI 1640 et 375 ul de 3,1 mg / ml bovine du collagène de type I. Étiquette Tube "pré-mélange de la lignée cellulaire". Placez-les sur la glace jusqu'à utilisation.
    3. Re-suspendre 300 pi de cellules CD138 + dans du RPMI 1640 à six fois la densité finale souhaitée. Re-suspendre 300 pi de cellules dans du milieu RPMI 1640 BMSC à six fois la densité finale souhaitée. Mélanger les deux volumes ensemble dans un tube de 1,5 ml et appellation "CD138 +". Placez dans un incubateur jusqu'à utilisation.
    4. Re-suspendre 60 pi delignée cellulaire dans un milieu RPMI 1640 à six fois la densité finale souhaitée. Re-suspendre 60 pi de cellules BMSC dans RPMI 1640 à six fois la densité finale souhaitée. Mélanger les deux volumes ensemble dans un tube de 1,5 ml et appellation "lignée cellulaire". Placez dans un incubateur jusqu'à utilisation.
    5. En utilisant le logiciel fourni avec le dispositif robotique de pipetage, charger le premier fichier de script, "cell_seedingPt47.PGM". Placez une zone de 200 ul de la pointe de pipette, d'une plaque de microtitrage, et une plaque 384 puits stérile dans les stations A, B et E, respectivement, du robot.
    6. Mélanger le contenu de tubes "pré-mélange pour CD138 +" et "CD138 +". Transférer 1,5 ml de son contenu dans le puits n ° 1 de la microplaque. Placer le tube avec le volume restant sur la glace. Démarrez le programme. Le robot va ensemencer les 176 premiers puits (11 les plus à gauche colonnes) de la plaque de 384 puits, puis pause. Transférer le reste du tube sur la glace pour le puits n ° 2 de la microplaque. Reprendre le programme. Lerobot ensemencer les 144 puits restants de la plaque 384 puits et la pause.
    7. Mélanger le contenu de tubes "pré-mélange pour la lignée cellulaire" et "lignée cellulaire" et transférer le contenu dans le puits n ° 3 de la microplaque. Reprendre programme. Le robot va ensemencer les 64 puits restants de la plaque 384 puits.
    8. Placez la plaque de 384 puits dans la centrifugeuse pendant 10 min à 500 g et 4 ° C. Plaque de transfert de l'incubateur (5% de CO2, 37 ° C) pendant 1 heure pour la polymérisation du collagène.
    9. Chargez le deuxième fichier de script, "media_layer.PGM". Passer zone de pointe de la pipette 120 ul, un réservoir de réactif avec 31 ml de RPMI-1640 supplémenté avec 10% de FBS, 10% de plasma du patient et 1% P / S, et la plaque 384 puits avec des cellules dans les stations A, B et E, respectivement. Exécutez le programme. Le robot va transférer 81 pi de milieu à chaque puits. Une fois terminé, transférer plaque 384 puits dans l'incubateur et de permettre stroma à adhérer au substrat O / N.
  2. 4. Préparation des drogues et droguer des plaques (Utilisation d'un multi-canal Pipettor Manuel)

    1. Préparer un modèle semblable à la figure 3, afin de faciliter le processus d'ajout médicament puits et de réduire les chances de confusion.
    2. Préparez, dans une plaque de 96 puits, une dilution en série de chacun des médicaments à tester dans la plaque, par exemple, pour les cinq concentrations en utilisant une dilution de 3 fois:
      1. Ajouter 120 ul de médicament à 10x la concentration souhaitée dans la concentration la plus élevée ainsi. Par exemple, utiliser 500 uM melphalan si la plus forte concentration des cellules seront exposés dans la plaque sera de 50 uM.
      2. Ajouter 80 ul de milieu de culture (RPMI complété avec 10% de FBS, 10% de plasma dérivé du patient et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S)) pour les quatre puits suivants.
      3. Transfert 40 pi de la première et à la deuxième et mélanger, pour un volume total de 120 pi au 1/3 de la concentration du médicament du premier puits, ou 167 uM.
      4. Répétez l'étape 4.2.3 pour les puits restants (par exemple, transférer 40 ul du deuxième au troisième, mélanger, puis transférer 40 ul du troisième au quatrième, etc.).
    3. Transfert 8 pi de chaque médicament contenant bien aux puits correspondant de la plaque de cellule. Chaque médicament contenant puits doit avoir un volume suffisant pour 10 puits de la plaque cellulaire. Dans l'exemple de la figure 3, chaque concentration de médicament est ajouté à 6 puits différents, à l'exception de la concentration la plus élevée, qui est ajouté à 8 puits.
    4. Ajouter 8 ul de milieu de culture (RPMI complété avec 10% de FBS, 10% de plasma dérivé du patient et 1% P / S) pour les puits de contrôle.
    5. La place des cellules dans un microscope dès que prêt et tourner sur la paillasse d'incubation.

    5. Préparation des drogues et droguer des plaques (L'utilisation d'un robot Pipettor)

    1. Télécharger des fichiers de script pour pipette robotisé de http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS files.zip
    2. Chargez le script "media_layer_DRUGPLATE.PGM» dans l'interface utilisateur de robotique de pipetage. Placez une zone de la pointe de pipette 120 pi, le réservoir avec 21 ml de RPMI-1640 complété avec 10% de FBS, 10% de plasma du patient et 1% P / S et une plaque 384 puits vide dans les stations A, B et E, respectivement. Exécutez le programme, la robotique de pipetage va ajouter 30 ul des médias à tous les puits de la plaque de 384 puits.
    3. En suivant le modèle de la figure 2 supplémentaire ajouter 200 ul de médicament à 20x la concentration maximale dans chaque puits d'une plaque de microtitrage. Cette configuration peut accueillir jusqu'à 31 médicaments. Pour le contrôle du puits (CTRL), ajouter du milieu RPMI-1640 complété avec 10% de FBS, 10% de plasma du patient et 1% P / S.
    4. Placez une zone de la pointe de pipette 120 pi, plaque de microtitrage avec des médicaments à une concentration 20X, et 384 puits avec les médias (de l'étape 5.1) dans les stations A, B et C, respectivement. Chargez le programme "drug_plate.PGM". La robotique de pipetage va créer une dilution en sériede 1: 3, à la suite de la distribution spatiale supplémentaire dans la figure 1.
    5. Placez une zone de la pointe de pipette 120 pi, la plaque 384 puits avec une dilution de la drogue (de l'étape 5.3) et la plaque 384 puits avec des cellules (de l'étape 3.1.9) dans les stations A, B et C, respectivement. Charger et démarrer le programme "drug_add.PGM". La robotique de pipetage va transférer 8 pi de médicaments de chaque puits dans la plaque de la drogue à son homologue dans la plaque de cellule. Une fois terminé, transférer plaque de cellule à l'incubateur du microscope numérique dès que possible.

    6. imagerie des cellules en plaque

    Remarque: La procédure ci-dessous applique au microscope Evos Auto FL, mais peut facilement être adapté à d'autres microscopes de platine motorisée avec paillasse incubation ou de pépinières microscopes-intégré.

    1. Nettoyez l'intérieur de l'incubateur haut de banc avec un mélange éthanol-lingette humide et retirer délicatement le couvercle de la plaque tout en plaçant le couvercle de la incubator.
    2. Suivez les étapes de logiciels pour ajouter des balises. Ce terme est utilisé pour désigner les points de repère pour les régions d'intérêt, à imager successivement pendant l'expérience (voir mode d'emploi des logiciels pour plus de détails).
    3. Utilisez un objectif de grossissement 5X ou 10X. Assurez-vous que l'accent est semblable à la figure 2: les cellules MM apparaissent comme des disques lumineux entouré par un anneau sombre et BMSCs ou HUVECs sont à peine visibles. Certaines cellules de MM primaires sont très petits et donc un réglage fin peut être nécessaire pour trouver la mise au point optimale.
    4. Réglez l'intervalle d'acquisition entre les 10-30 min et pour une durée d'au moins 96 h. Alors que de plus longs intervalles entre les acquisitions sont acceptables, des intervalles de 45 min ou plus peuvent réduire de manière significative la précision de mesure de la viabilité.
    5. Configurez le logiciel de sorte que les images de chaque puits sont stockées dans des fichiers séparés nommés Beacon-1, Beacon-2, etc. Si la robotique de pipetage a été utilisé, définir les balises dans l'ordre décrit dansFigure 3 supplémentaire.
    6. Assurez-vous qu'il ya assez d'eau dans l'humidificateur de l'incubateur et du gaz, de sorte que les cellules seront dans des conditions optimales.
    7. À la fin de l'expérience, copiez les dossiers contenant les images à l'ordinateur qui va exécuter l'analyse.

    7. Quantification de la sensibilité des médicaments

    Nota: Les instructions suivantes guident l'utilisation de l'analyse d'image en utilisant une grappe d'ordinateurs, depuis l'analyse d'une plaque multi-puits dans un ordinateur personnel est extrêmement chronophage.

    1. Télécharger le logiciel ImageJ sur le site de NIH: http://imagej.nih.gov/ij/
    2. Télécharger scénario et plugins à http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
    3. Suivez les instructions dans http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf pour exécuter le logiciel d'analyse d'image numérique. Le résultat devrait être une feuille de calcul nommée results.csv contenant les mesures de viabilité à intervalles réguliers pour each puits dans la plaque pour la durée de l'expérience (par exemple, 96 heures).
    4. Si vous utilisez un multi-canal pipette manuelle, effectuez les étapes suivantes.
      1. Télécharger le fichier http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt et le modifier pour correspondre à la présentation de la plaque définie à l'étape 3.1 (par exemple, la figure 3).
      2. Téléchargez le logiciel http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar et exécutez-le en utilisant les fichiers créés dans les étapes 5.3 et 5.4 comme paramètre d'entrée. Le résultat sera un nom de dossier rapport contenant plusieurs feuilles de calcul, regroupant chacun les résultats pour un médicament particulier.
      3. Copier et coller le contenu dans tableur http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
        Remarque: Le résultat doit être graphiques tels que celui représenté sur la figure 4, représentant la chimiosensibilité de l'échantillon à différents médicaments en fonction de la concentration du médicament et la durée d'exposition.
      4. </ Ol>
      5. Si vous utilisez un dispositif robotique de pipetage, effectuez les étapes suivantes.
        1. Télécharger des fichiers de modèles de fichiers de script de téléchargement pour pipette robotisé de http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic Template Files.zip et extraire les fichiers dans un répertoire.
        2. Modifiez le fichier DrugList.csv selon la liste des médicaments et de la concentration de la drogue le plus élevé dans la plaque avec des cellules. Suivez l'agencement de la figure 2 supplémentaire.
        3. Exécutez le programme BuildExperimentalDesign.java passant en paramètre le dossier contenant les fichiers extraits à l'étape 7.5.1 et les fichiers results.csv de l'étape 7.3. Le résultat devrait être de deux dossiers nommer MM1_S et PtSample. Le premier contient une description des puits (médicaments et concentrations) pour le contrôle positif de lignée cellulaire. La seconde contient la même information, mais en ce qui concerne la partie de la plaque ensemencée avec des cellules de patients.
        4. Copiez le fichier results.csv dans chacun des répertoires créés lors de l'étape 7.5.3. Téléchargerle logiciel http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar et exécutez-le en utilisant les fichiers créés dans les étapes 7.5.3 pour les deux dossiers. Le résultat sera un nom de dossier Rapport dans chacun des dossiers créés dans 7.5.3. Le dossier Rapport contient plusieurs feuilles de calcul, regroupant chacun les résultats pour un médicament particulier.
        5. Exécutez le programme BuildGraphPadFile.java et passer comme paramètre le dossier contenant les fichiers extraits à l'étape 7.5.1 et les fichiers results.csv de l'étape 7.3. Le résultat sera un fichier GraphPad contenant les courbes dose-réponse pour chacune des 31 médicaments, et normalisée par le contrôle. Chaque carte contiendra 5 concentrations de médicament pour les cellules de MM primaires et une concentration pour le contrôle de la lignée cellulaire positive.

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Representative Results

Le flux de l'expérience est brièvement décrit à la figure 1 Si toutes les étapes sont terminées avec succès, les images obtenues par le microscope devraient être équivalentes à la figure 2:. Vivent les cellules MM doivent être clairement visibles comme des disques lumineux et BMSCs ou HUVECs devraient être à peine visible et bien réparties dans le fond. Comme on le voit sur ​​la figure 2A, les cellules MM varient en taille d'un patient à l'autre, mais en général, ils sont plus petits que les lignées cellulaires. Comme ils ne se répliquent pas pratiquement ex vivo au cours de l'intervalle de l'expérience (96 heures), ils peuvent être ensemencées à des concentrations plus élevées (1-3 millions de cellules / ml). Stroma devrait être à peine détectable, comme BMSC adhérer au fond du puits et extensible, présentant un profil bas. La lignée cellulaire de myélome humain H929 est significativement plus grande que les cellules MM provenant de patients (figure 2B), et reproduit dans les 24 heures. Pour éviter l'encombrement de l'image, les lignées cellulaires MM sont voirded une faible densité, 0,3 million / ml. Figures 2C et 2D représentent des cellules provenant de patients MM et des lignées cellulaires de myélome humaines H929, respectivement, co-cultivées avec des cellules HUVEC. HUVEC adhère d'abord au fond du puits et ensuite commencer à communiquer avec l'autre et forment des réseaux, qui deviennent plus tard lumens plus épais et plus avec.

Figure 4 illustre ce qui est à prévoir à partir des vidéos transformés générés par l'algorithme d'analyse d'image, montrant détecté des cellules de MM vivants pseudo-colorés en vert (figure 4A) sans ou avec très peu de signal vert dans BMSCs et HUVECs à la fin de l'expérience à la concentration de médicament la plus élevée, lorsque toutes les cellules MM sont morts (figure 4B). Le logiciel doit agréger les résultats de différents puits et de construire un tableau représentant la perte progressive de la viabilité avec le temps d'exposition à des concentrations de médicaments différents (figure 4C). La courbe de dose-réponse de lalignée cellulaire de contrôle (par exemple, H929 ou MM1.S) doit être le même que pour les expériences précédentes; écarts importants pourraient indiquer des problèmes avec la solution stock de médicament utilisé dans l'expérience.

Il est important de bien respecter tous les puits ensemencées avant de commencer le processus d'imagerie, comme des artefacts peuvent induire en erreur le logiciel d'analyse d'images et de conduire à des résultats erronés. Par exemple, la figure 5A montre le résultat d'une densité excessive de BMSC dans le puits ou trop de temps écoulé entre le traitement à la trypsine et l'ensemencement, ce qui conduit à ces cellules formant des touffes. La figure 5B montre «colonies» de cellules MM. Si les lignées de cellules sont ensemencées à des densités élevées, ils forment des colonies comme ils se répliquent, ce qui réduit la précision de l'algorithme d'analyse d'image numérique car il devient de plus en plus difficile de discerner une cellule de l'autre. La figure 5C est un exemple de la vis à vis, où trop peu de cellules ont été ensemencées MM. Tson produit souvent lorsque le nombre de cellules MM obtenus à partir de la ponction de moelle osseuse est inférieure à 500 000, et le "volume mort" à gauche dans le tube avant de re-suspension devient comparable au volume du support requis pour remettre en suspension les cellules MM à des densités élevées . Pour résoudre ce problème, de déterminer le volume mort pour le tube utilisé et l'inclure dans les calculs de dilution. Figure 5D est un exemple de plan focal biaisée. Notez comment MM cellules en haut à gauche sont lumineuses et ceux en bas à droite sont sombres. Ceci est causé par h plaque inégalement placé ou un objectif mal placés. Cela entraînera cellules MM dans différentes sections de l'image devant être comptées différemment. Les barres d'échelle (de bas à droite de chaque image) représentent 500 um.

Figure 1
Figure 1. Protocole description globale. (A) Au cours d'une marro osseusew biopsie un tube supplémentaire de ponction est obtenue pour le protocole. (B) un myélome multiple (MM), les cellules sont magnétiquement séparés des autres cellules dans l'aspirat. (c) trois tubes contenant les cellules MM (MM), des cellules non-MM, et le plasma, respectivement, sont obtenues à partir du procédé de séparation. (D) dérivées de moelle osseuse cellules souches mésenchymateuses (BMSC) depuis les aspirats précédentes sont co-cultivées avec des cellules MM fraîchement obtenus, et remises en suspension dans une matrice extracellulaire (collagène ou de la membrane basale matrice). (E) La plaque est centrifugée à faire en sorte que le plus grand nombre possible MM sont dans le même plan focal et le BMSC sont prêts à adhérer au fond du puits. La plaque est placée dans l'incubateur jusqu'à ce que la matrice polymérise. (F) dans chaque puits est rempli d'un mélange de milieux de culture et plasma dérivé du patient. La plaque est placée dans un incubateur O / N. (G) Les médicaments sont ajoutés à chaque puits et la plaque est placée dans un microscopeéquipé d'un appareil photo numérique, platine motorisée et paillasse incubateur et imagé à intervalles réguliers pour une période de 96 h. (H) Les fichiers d'image pour chaque puits sont analysés en utilisant un algorithme qui segments vivent les cellules MM basé sur le mouvement de la membrane (cellules vivantes sont pseudo colorés en vert) et crée une feuille de calcul avec les changements de la cellularité pour chaque puits pour chaque point de temps. La barre d'échelle (en bas à droite) représente 500 um. (I) les groupes Un programme de logiciel que le puits par des médicaments et des concentrations et crée une feuille de calcul avec des courbes de réponse à la dose normalisée afin que les mesures initiales sont 100%. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Pré-drogue apparition attendue de puits. (A) les cellules MM co-cultivées avec stroma. (B) La lignée cellulaire de myélome humain H929 co-cultivées avec stroma. (C) du patient dérivées des cellules MM en co-culture avec des cellules HUVEC. (D) Human myélome lignée cellulaire H929 en co-culture avec des cellules HUVEC. Les barres d'échelle (de bas à droite de chaque figure) représentent 500 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Répartition spatiale de puits Recommandé dans une plaque de 384 puits. Chaque plaque 384 peut transporter 3 échantillons de patients avec 7 différents médicaments, soit un échantillon de patient testés avec 21 médicaments. Wells en vert clair, bleu clair et beige, contiennent des cellules MM à partir de trois patients différents. Rx1, Rx2, etc., représentent différents médicaments, chacun à cinq con différentecentrations et en double exemplaire. Quatre puits sont utilisés comme témoins pour chaque patient pour le patient (36 à 39 1, 126-129 pour le patient 2 et de 200 à 203 pour le patient 3). Wells en orange contiennent des lignées cellulaires à plus forte concentration de drogue de chaque médicament, en double exemplaire. Wells en jaune sont des contrôles de lignées cellulaires (pas de drogue). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Exemple d'analyse d'images numériques et graphiques de réponse à la dose. (A) dans les cellules MM co-culture avec des BMSC, incorporé dans le collagène I, est exposé à une concentration de 50 nM carfilzomib. L'analyse d'image algorithme détecte les cellules vivantes et les pseudo-colore en vert. (B) Les images sont acquises à des intervalles réguliers pendant toute la durée de l'expérience. Dans ce concentrations dsur la drogue, presque toutes les cellules sont morts à la fin de 96 h. (C) Le graphique montre l'évolution du nombre de cellules viables pendant cinq concentrations différentes de carfilzomib le long d'un intervalle de 96 h, normalisée pour le temps = 0 h à 100%. La lignée cellulaire de myélome humain MM1.S été utilisé comme témoin pour l'efficacité du médicament. Les barres d'échelle (en bas à droite de A et B) représentent 500 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Les erreurs courantes tandis que l'ensemencement ou l'imagerie plaque. (A) les cellules du stroma "Tangled". (B) «colonies» de cellules MM. (C) Trop peu de cellules de MM. (D) Skewed plan focal. Les barres d'échelle (de bas à droite de chaque image) représentent 500 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 1 sup
Figure 1. supplémentaire de distribution spatiale optimale des puits dans la plaque 384 puits à l'aide d'une pipette robotisée. Dans cette configuration 31 médicaments différents peut être testée à 5 concentrations différentes et 2 répétitions (vert). En outre, les contrôles positifs avec une lignée de cellules peuvent être utilisés pour assurer la puissance du médicament (rose). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 Sup
Figure 2. supplémentaire de distribution spatiale des drogue »de plaque de maître". La robotique de pipetage va utiliser cette plaque où chaque puits contient l'un des 31 médicaments à une concentration de 20x, pour créer la plaque médicament de dilution. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 Sup
Figure 3. supplémentaire Numérotation des puits pour être utilisé lors de la préparation d'une plaque avec une pipette robotisée. Le logiciel décrit dans le protocole nécessite cette numérotation des puits afin de cartographier adéquatement les puits aux médicaments et les concentrations. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

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Supplemental Figure 4. Comparaison entre lame microfluidique (Khin et al., 2014) et le protocole actuel. Réponse dose de H929 lignée cellulaire de myélome multiple mesurée pendant 24 heures dans le système précédent (bortézomib en haut à gauche, le melphalan milieu à gauche) et dans le système actuel ( top bortézomib droite et melphalan milieu à droite). Pour fins de comparaison, DL50 à 24 h pour les deux plates-formes a été de 3,9 nM et 4,1 nM pour le bortézomib, et de 6,4 uM et 14,65 pM pour melphalan. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

En résumé, ceci est une méthode de débit puissant et haute de quantifier chimiosensibilité des cellules de MM primaires et ex vivo pharmacodynamique de médicaments dans une reconstitution de la moelle osseuse. Les étapes critiques au sein de ce protocole sont le bon ensemencement des puits et en se concentrant adéquate (voir Figure 2 pour les résultats escomptés): veiller à ce que les cellules de MM et stromales sont uniformément réparties, que les cellules stromales sont adhérentes au fond du puits, que tous MM les cellules sont dans le même plan focal, et que les cellules MM ont l'aspect d'un disque lumineux entouré d'un anneau sombre.

En cas de semis inadéquate (voir figure 5), ne pas poursuivre l'expérience, mais plutôt semer une deuxième plaque. Si le problème détecté était MM basse ou haute ou la densité de cellules du stroma, vérifier la concentration cellulaire dans le tube avant de semer et remettre en suspension à intervalles réguliers pendant le processus d'ensemencement pour assurer une distribution homogène de cellulesdans les médias. L'utilisation d'une pipette multi-canaux avec fonction répétiteur ou un distributeur robotique peut réduire considérablement ce problème. La proportion de cellule / matrice sur un support (01:10) utilisés dans cette analyse cherche à maximiser le nombre de puits qui peuvent être ensemencées et donc des conditions étudiées. Cependant, l'étude des facteurs solubles produits ou consommés par les cellules cancéreuses ou stroma, il est recommandé que la proportion de cellules / matrice de support soit de 1: 1.

Tel qu'il est actuellement mis en oeuvre, ce système ne permet de quantifier les cellules non adhérentes. Afin de quantifier les changements dans la cellularité de stroma le logiciel devra être modifié et ajusté aux caractéristiques morphologiques du stroma. Ce serait une caractéristique utile pour étudier l'effet de cellules cancéreuses ou de drogues dans le compartiment stroma. Le système ici décrit est également incapable de quantifier cellularité des cellules cancéreuses adhérentes, surtout si elles sont combinées avec stroma adhérente. La solution serait de modifications dans l'imag numériquee algorithme analyse pour séparer le stroma de cancer sur la base de caractéristiques morphologiques, ou d'effectuer une pré-incuber la population soit avec un colorant fluorescent qui peut être utilisé pour identifier les cellules de chaque population.

L'importance de ce protocole par rapport aux approches précédentes est la capacité d'évaluer la réponse aux médicaments des cellules cancéreuses primaires dans une ex vivo reconstruction du microenvironnement de la moelle osseuse d'une manière non destructive, de sorte que des mesures successives peuvent être effectuées, fournissant ainsi beaucoup plus détaillée les informations de la pharmacodynamique, plutôt que des points de temps fixes. Une des limitations de notre essai avant 6 est le gradient linéaire généré par diffusion de la drogue, ce qui ne évaluation de la sensibilité aux médicaments a permis à l'intérieur d'une fenêtre linéaire de concentrations. Le dosage actuelle évaluation de la viabilité permet travers toute gamme de concentrations de médicament, puisque chaque puits est une entité distincte. Les deux dosages, cependant, génèrent (résultats équivalents

Parmi les multiples applications futures de cette approche, notre groupe se concentre en utilisant des modèles mathématiques pour extrapoler les informations de pharmacodynamie fournies par ces essais dans la réponse clinique. Pour atteindre cet objectif, nous proposons de répondre aux points de données obtenues (figure 4C) pour chaque médicament à un système d'équations différentielles, décrivant la dynamique de la mort cellulaire induite par le médicament. Ensuite, en appliquant à ces modèles mathématiques les propriétés pharmacocinétiques connues de chaque médicament dans un traitement clinique, il serait possible d'estimer la réponse réelle du patient 6. En automatisant l'ensemencement et droguer en utilisant un système robotique, il serait possible de tester non seulement la norme de médicaments de soins, mais aussi plus d'une centaine de médicaments expérimentaux par échantillon (en une plaque de 1536). Cela ouvrirait la possibilité pour in silico des essais cliniques, où des centaines de médicaments expérimentaux pourraient être testés danscohortes d'échantillons de patients, créant ainsi des courbes de survie pour 13 des essais cliniques virtuelles.

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Acknowledgments

Cette recherche a été financée par l'État de Bankhead-Coley Science Team Grant de la Floride (2BT03), les National Institutes of / Institut national du cancer de la Santé (1R21CA164322-01) et Science Team Grant Moffitt Cancer Center. Ce travail a été financé en partie par le Fonds pour la recherche translationnelle de base au H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, un Comprehensive Cancer Center NCI désigné (P30-CA076292). L'accès aux cellules primaires a été rendue possible grâce au Protocole de Total Care Cancer au Moffitt Cancer Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EVOS FL AUTO AMG AMAFD1000 + AMC1000 Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind CORNING CLS3683 SIGMA Corning CellBIND 384 well plates
384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind CORNING CLS3832 ALDRICH Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus  GE Healthcare GE17-1440-02 SIGMA For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads Miltenyi  130-051-301 Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns Miltenyi   130-042-401 Column for separation of cells.
MidiMACS Separator Miltenyi  130-042-302 Magnet for separation column.
Matrigel Sigma-Aldrich E6909 SIGMA ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex Life Technologies A1413201 LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC Life Technologies C-003-25P-B Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media GIBCO 11875-093 RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated GIBCO 10082-147 Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1 mg/ml Bovine collagen type I Advanced Biomatrix 5005-B Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS BIOTEK PRC3841 Robotic pipettor system

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