Ensayos pronta entrada virales para la identificación y evaluación de compuestos antivirales

Immunology and Infection

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Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J. Vis. Exp. (104), e53124, doi:10.3791/53124 (2015).

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Abstract

Protocol

Nota: Asegúrese de que todos los procedimientos relacionados con el cultivo de células y de infección por el virus se llevan a cabo en las campanas de bioseguridad certificados que sean apropiados para el nivel de bioseguridad de las muestras que se manejan. Para el propósito de describir los protocolos, la luciferasa Gaussia HCV reportero de etiquetado se usa como un modelo de virus 32. En el contexto de los resultados representativos, el ácido compuestos chebulágico (CHLA) y punicalagina (PUG) se utilizan como antivirales candidatos que se dirigen las interacciones glicoproteína viral con glicosaminoglicanos superficie celular durante la entrada viral temprana pasos 31. La heparina, que se sabe que interfiere con la entrada de muchos virus 30,31,33,34, se utiliza como un tratamiento control positivo en tal contexto. Para base de fondo en las técnicas de virología, la propagación de virus, determinación del título de virus, y la expresión de la dosis infecciosa en unidades formadoras de placa (PFU), se centran unidades formadoras (FFU), o multiplicidad de infección (MOI), el lector es repreferido para hacer referencia 35. Para ejemplos anteriores y condiciones optimizadas utilizados para los virus que se muestran en los resultados representativos, se remite al lector a las referencias 30-32,36-39, así como detalles enumerados en la Tabla 1, la Figura 1A, y la Figura 2A.

1. Cultivo Celular, Preparación Compuesto y citotoxicidad Compuesto

  1. Crece la línea celular respectiva para el sistema de infección por el virus para ser analizados (Tabla 1). Para VHC, crecer las células Huh-7.5 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 200 U / ml de penicilina G, 200 mg / ml de estreptomicina, y 0,5 mg / ml de anfotericina B.
  2. Preparar los compuestos de ensayo y controles utilizando sus respectivos disolventes: por ejemplo, disolver CHLA y PUG en sulfóxido de dimetilo (DMSO); preparar heparina en agua bidestilada estéril. Para todas las diluciones posteriores, utilizar medios de cultivo.
    Nota: La última concentración de DMSO en los tratamientos compuesto de ensayo es menos de 1% en los experimentos; 1% de DMSO se incluye como un tratamiento de control negativo en los ensayos para la comparación.
  3. Determinar la citotoxicidad de los compuestos de ensayo (por ejemplo, chla y PUG) sobre las células para la infección viral mediante el uso de una viabilidad celular determinar reactivo tal como XTT (2,3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -5-fenilamino) carbonil] -2H-tetrazolio hidróxido):
    1. Para VHC, sembrar células Huh-7.5 en una placa de 96 pocillos (1 × 10 4 células por pocillo) y se incuba a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% O / N para obtener una monocapa.
    2. Aplicar el control de DMSO (1%) o concentraciones crecientes del compuestos de ensayo y CHLA PUG (Ex. 0, 10, 50, 100, y 500 mM) a los pocillos de cultivo por triplicado.
    3. Incubar a 37 ° C durante 72 hr, luego descarta el medio en la placa y lavar las células con 200 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces.
    4. Añadir 100 l de assaying solución del kit de ensayo in vitro de la toxicología en basado en XTT a cada pocillo e incubar las placas a 37 ° C durante otras 3 horas para permitir la producción de formazan XTT.
    5. Determinar la absorbancia con un lector de microplacas a una longitud de onda de ensayo de 492 nm y una longitud de onda de referencia de 690 nm.
    6. Calcular el porcentaje de células supervivientes usando la siguiente fórmula: Viabilidad celular (%) = A / Como × 100%, donde "A" y "Como 'se refieren a la absorbancia de los compuestos de ensayo y el control de disolvente (ex 1% de DMSO. ) tratamientos, respectivamente. Determinar la concentración de 50% de citotoxicidad celular (CC 50) de los compuestos de ensayo a partir de un software de análisis tales como GraphPad Prism de acuerdo con el protocolo del fabricante.

2. Lectura de la infección viral

Nota: La lectura de la infección viral depende del sistema utilizado y virus puede implicar métodos tales como ensayos de placas o measuring señales indicadoras de virus reportero-etiquetado. El método para detectar la infección por VHC reportero basado en la actividad de informador de luciferasa se describe a continuación.

  1. Reunir los sobrenadantes de los pozos infectados y aclarar a 17.000 xg en una microcentrífuga durante 5 min a 4 ° C.
  2. Mezclar 20 l de sobrenadante de ensayo a 50 l de sustrato de luciferasa del kit de ensayo de luciferasa Gaussia y medir directamente con un luminómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  3. Expresar la infectividad del VHC como log 10 de unidades relativas de luz (RLU) para la determinación de la inhibición viral (%) y calcular la concentración 50% eficaz (CE 50) de los compuestos de ensayo contra la infección por el VHC usando algoritmos de software GraphPad Prism de acuerdo con el protocolo del fabricante.

3. Inactivación Viral Ensayo

Nota: Los ejemplos de período de incubación y la dosis viral de diversos virus unare enumerados en la Figura 1A. Las concentraciones más altas del virus también pueden ser probados por el aumento de la MOI / PFU.

  1. Semilla de células en una placa de 96 pocillos de 7,5 Huh-(1 × 10 4 células por pocillo) y se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 5% de O / N para obtener una monocapa.
  2. Incubar los compuestos de ensayo o controles (concentraciones finales son: CHLA = 50 M; PUG = 50 M; heparina = 1,000 g / ml; DMSO = 1%) con las partículas de VHC a 37 ° C (Figura 1A, 'a largo plazo' ) en una proporción de 1: 1. Por ejemplo, para un inóculo de virus de 100 l que contiene 1 x 10 4 FFU, añadir 100 l de una dilución de trabajo 100 mM CHLA; esto produce el tratamiento CHLA a una concentración final de 50 mM.
  3. Diluir la mezcla de virus-fármaco para (ineficaz) de concentración "sub-terapéutica" de los compuestos de ensayo. Por ejemplo, la concentración ineficaz de CHLA y PUG contra el VHC está en 1 M 31; Por Consiguienteesto requiere una dilución de 50 veces de la mezcla de virus-fármaco que se puede lograr con 9,8 ml de medio basal (medio de cultivo celular con 2% de FBS).
    Nota: La dilución a la concentración sub-terapéutica impide la interacción significativa entre los compuestos de ensayo y la superficie de la célula huésped y permite el examen del efecto del tratamiento en los viriones libres de células. Tenga en cuenta que esta dilución depende de la respuesta a la dosis antiviral de los compuestos de ensayo frente a la infección viral en particular, y se determina antes de realizar este ensayo en particular 31.
  4. Para la comparación, mezclar el virus con los compuestos de ensayo y de inmediato diluir (sin período de incubación) a la concentración sub-terapéutica antes de la infección (Figura 1A, 'corto plazo').
  5. Añadir 100 l de la mezcla de HCV-fármaco diluida sobre el 7,5-Eh monocapa celular (la cantidad de virus se encuentra ahora en 1 x 10 2 FFU; MOI final = 0,01) e incubar durante 3 horas a 37 ° C para permitir viraladsorción.
  6. Tras la infección, eliminar el inóculo diluido y lavar suavemente los pocillos con 200 l de PBS dos veces.
    Nota: Realizar los lavados con cuidado para evitar el levantamiento de las células.
  7. Aplicar 100 l de medio basal a cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 72 hr.
  8. Analizar la infección resultante sometiendo a ensayo el sobrenadante para la actividad de luciferasa como se describe en '2. Lectura de la infección viral '.

4. Ensayo Adjunto Viral

Nota: Los ejemplos de período de incubación y la dosis viral para varios virus se enumeran en la Figura 2A, el "Anexo". Las concentraciones más altas del virus también pueden ser probados por el aumento de la MOI / PFU.

  1. Semilla de células en una placa de 96 pocillos de 7,5 Huh-(1 × 10 4 células por pocillo) y se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 5% de O / N para obtener una monocapa.
  2. Pre-enfriar las monocapas de células en placas a 4 ° C for 1 hr.
  3. Co-tratamiento de las células con inóculo HCV (MOI = 0,01) y compuestos o controles de ensayo (concentraciones finales son: CHLA = 50 M; PUG = 50 M; heparina = 1,000 g / ml; DMSO = 1%) a 4 ° C durante 3 hr. Por ejemplo, para un inóculo de virus de 90 l que contiene 1 x 10 2 FFU, añadir 10 l de una dilución de trabajo 500 mM CHLA; esto produce el tratamiento CHLA a una concentración final de 50 mM y una infección por el VHC a MOI = 0,01 en la monocapa de células.
    Nota: Es importante llevar a cabo el experimento a 4 ° C, ya que permite la unión del virus, pero se opone a la entrada que se produce de manera más eficiente a 37 ° C. Realizar la adición de compuestos de virus y de prueba en el hielo y la incubación subsiguiente en un refrigerador 4 ° C para asegurar que la temperatura se mantiene a 4 ° C.
  4. Eliminar el sobrenadante y lavar suavemente la monocapa de células con 200 l de helado de PBS dos veces.
    Nota: Realizar los lavados con cuidado para evitar el levantamiento de las células <./ li>
  5. Aplicar 100 l de medio basal a cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 72 hr.
  6. Analizar la infección resultante sometiendo a ensayo el sobrenadante para la actividad de luciferasa como se describe en '2. Lectura de la infección viral '.

5. Viral Entry / ensayo de fusión

Nota: Ejemplo de períodos de incubación y dosis viral para varios virus se enumeran en "Entrada / Fusión 'Figura 2A. Las concentraciones más altas del virus también pueden ser probados por el aumento de la MOI / PFU.

  1. Semilla de células en una placa de 96 pocillos de 7,5 Huh-(1 × 10 4 células por pocillo) y se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 5% de O / N para obtener una monocapa.
  2. Pre-enfriar las monocapas de células en placas a 4 ° C durante 1 hora.
  3. Infectar las células con HCV (MOI = 0,01) a 4 ° C durante 3 hr. Por ejemplo, utilice un inóculo de virus 100 l que contiene 1 x 10 2 FFU.
    Nota: Realice el adición del inóculo viral en hielo y la incubación subsiguiente en un refrigerador 4 ° C para mantener la temperatura a 4 ° C, la cual permite la entrada de unión pero no viral.
  4. Eliminar el sobrenadante y lavar suavemente las monocapas de células con 200 l de helado de PBS dos veces.
    Nota: Realizar los lavados con cuidado para evitar el levantamiento de las células.
  5. Tratar los pocillos con los compuestos de ensayo o controles (concentraciones finales son: CHLA = 50 M; PUG = 50 M; heparina = 1,000 g / ml; DMSO = 1%) y se incuba a 37 ° C durante 3 hr. Por ejemplo, añadir 10 l de una dilución de trabajo 500 M CHLA a 90 l de los medios de comunicación, mezclar y tratar los pozos; esto produce el tratamiento CHLA a una concentración final de 50 mM.
    Nota: El cambio de 4 ° C a 37 ° C ahora facilita el evento de entrada / fusión viral y por lo tanto permite la evaluación del efecto de los compuestos de ensayo 'en este paso particular.
  6. Aspirar el sobrenadante que contiene el fármaco y quitar no internalizadovirus extracelulares ya sea por lavado con 200 l de tampón citrato (citrato de sodio 50 mM, cloruro de potasio mM 4, pH 3,0) o PBS. Aplicar 100 l de medio basal antes de la incubación a 37 ° C durante 72 hr.
  7. Analizar la infección resultante sometiendo a ensayo el sobrenadante para la actividad de luciferasa como se describe en '2. Lectura de la infección viral '.

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Representative Results

En la Figura 1, se realizó el "ensayo de inactivación viral 'para examinar si dos compuestos naturales CHLA específica y PUG podrían inactivar los virus con envoltura diferentes en el estado libre de células y prevenir la infección subsiguiente. La respuesta a la dosis antiviral y la citotoxicidad de estos compuestos se han determinado antes de realizar el estudio mecanicista 31. Los virus fueron pre-tratados con los compuestos de ensayo y después las mezclas de virus a los fármacos se diluyeron a concentraciones sub-terapéuticas antes de la inoculación sobre la respectiva monocapa de células para cada sistema de virus. Como se muestra en la Figura 1, tanto CHLA y PUG aparecieron para interactuar con los viriones libres de células, dando lugar a efectos irreversibles que protegían la monocapa de células de la infección subsiguiente. Los dos compuestos de ensayo alcanzan alrededor de 100% de inhibición contra HCMV, VHC y DENV-2, mientras que un 60 - 80% de bloque se observó contra MV y RSV. Estos resultados Suggest que CHLA y PUG tienen impacto directo sobre estas partículas virales libres al inactivar ellos y neutralizando su infectividad.

En la Figura 2, el apego y ensayos de entrada / fusión se llevaron a cabo para explorar el efecto de CHLA y PUG en contra de estos principios de los acontecimientos relacionados con la entrada-virales de HCMV, VHC, DENV-2, MV, y RSV. Tanto CHLA y PUG impidieron efectivamente la unión de los virus investigados en la célula huésped respectiva, como se muestra por la inhibición de la infección viral resultante (Figura 2, el "Anexo ': barras de color gris claro). El efecto inhibidor sobre la fijación del virus por ambos compuestos era similar contra HCMV (Figura 2B), HCV (Figura 2C), DENV-2 (Figura 2D), y RSV (Figura 2F), que van desde 90 hasta 100%. Por otro lado, PUG parecía ser más eficaz que CHLA contra MV de unión (Figura 2E), con la tasa de inhibición de la two compuestos que varían entre 50 - 80%. La heparina tratamiento de control, que es conocido para bloquear la entrada de muchos virus, también inhibió la unión de HCMV, DENV-2, RSV, ad MV, pero fue menos eficaz contra el VHC. La subsiguiente 'ensayo de entrada / fusión viral' examinó si CHLA y PUG mantuvieron su actividad durante la fase de entrada de virus / fusión (Figura 2, 'Entrada / Fusión': barras de color gris oscuro). Una vez más, tanto CHLA y PUG se observaron perjudicar efectivamente el paso de entrada / fusión viral de los virus examinados (Figura 2 B - F), produciendo un 50 - efecto protector del 90% en la respectiva monocapa celular. La heparina también inhibe potentemente la entrada / fusión de DENV-2 y las infecciones por VRS, pero fue menos eficaz contra HCMV, VHC y MV (<40% de inhibición en promedio).

<td> HEL
Virus Tipo de la célula
HCMV
VHC Huh-7.5
DENV-2 Vero
MV CHO-SLAM
RSV HEp-2

Tabla 1:. Tipo de célula huésped para la infección viral El tipo celular utilizado para cada sistema de la infección viral se describe en los resultados representativos se indica. Los detalles adicionales con respecto a las células se pueden encontrar en la referencia 31.

Figura 1
Figura 1. Inactivación de infecciones virales por el CHLA compuestos de ensayo y PUG Diferentes virus se trataron con los compuestos de ensayo durante un período largo. (Se incubaron durante 1.5 - 3 horas antes de la titulación; barras de color gris claro) o corto período de tiempo (inmediatamente diluido; gris oscuro bares) a 37 ° C antes de una dilución a concentraciones sub-terapéuticación y posterior análisis de la infección en las respectivas células de acogida. (A) Esquema del experimento (que se muestra a la izquierda) con la concentración de virus final (PFU / pocillo o MOI), período de incubación del virus con la droga a largo plazo (i), y el tiempo de incubación posterior (ii) indicado para cada virus en el cuadro a la derecha. Los análisis para (B) HCMV, (C) del VHC, (D) DENV-2, (E) MV, y (F) de RSV se indican en cada panel adicional. Los resultados se representan frente al tratamiento de control negativo DMSO para la infección por virus y los datos mostrados son las medias ± error estándar de la media (SEM) de tres experimentos independientes. Esta cifra se ha modificado de la referencia 31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Evaluación de las actividades antivirales de la CHLA compuestos de ensayo y PUG contra la fijación del virus y la entrada / fusión. (A) El procedimiento experimental, la concentración de virus (PFU / pocillo o MOI), y el tiempo de adición y el tratamiento con los compuestos de prueba (i, ii, iii) se presentan para cada virus en los esquemas y las tablas asociadas. En el análisis de la fijación del virus (barras de color gris claro), las monocapas de diferentes tipos de células fueron pre-refrigerados a 4 ° C durante 1 hr, a continuación, co-tratado con los respectivos virus y compuestos de ensayo a 4 ° C (1,5 - 3 h; i) antes de lavar los inóculos y los compuestos de ensayo para su posterior incubación (37 ° C; ii) y el examen de la infección por virus. En la entrada del virus / análisis de fusión (barras gris oscuro), monocapas de células sembradas se pre-refrigerada a 4 ° C durante 1 hora y después se estimularon con los virus respectivos a 4 ° C durante 1,5 - 3 h (i). Las células fueron entonceslavada y tratada con los compuestos de ensayo durante un periodo de incubación adicional (ii) durante el cual la temperatura se cambió a 37 ° C para facilitar el evento de entrada / fusión viral. Al final de la incubación, los virus extracelulares fueron retirados por cualquiera de tampón citrato (pH 3,0) o lavados con PBS y las células se incubaron adicionalmente (iii) para el análisis de la infección por virus. Resultados para (B) HCMV, (C) del VHC, (D) DENV-2, (E) MV, y (F) de RSV se indican en cada panel adicional. Los datos se representan frente al tratamiento de control negativo de la infección por el virus de DMSO y se presentan como medias ± SEM de tres experimentos independientes. Esta cifra se ha modificado de la referencia 31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM GIBCO 11995-040
FBS GIBCO 26140-079
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
Amphotericin B GIBCO 15290-018
DMSO Sigma D5879
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
PBS pH 7.4  GIBCO 10010023
Microplate reader Thermo Scientific 89087-320
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002420
BioLux Gaussia luciferase assay kit New England Biolabs E3300L   
Luminometer Promega GloMax-20/20
Sodium citrate, dihydrate Sigma 71402
Potassium chloride Sigma P5405

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