फ्लो द्वारा A549 कोशिकाओं में लगाव और Internalization इन्फ्लूएंजा के एक वायरस को मापने

Immunology and Infection

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Pohl, M. O., Stertz, S. Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (105), e53372, doi:10.3791/53372 (2015).

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Abstract

Introduction

इन्फ्लूएंजा ए वायरस (IAV) के प्रवेश के लक्ष्य कोशिकाओं 1 के प्लाज्मा झिल्ली पर रिसेप्टर्स करने के लिए वायरस का बंधन के साथ शुरू होता है कि एक बहु कदम प्रक्रिया है। IAV लिए रिसेप्टर ग्लाइकोप्रोटीन और glycolipids की एक बड़ी विविधता पर मौजूद है जो सियालिक एसिड है। वायरल लिफाफे में मौजूद है जो IAV की hemagglutinin (हेक्टेयर) प्रोटीन सियालिक एसिड को बांधता है और जिससे लक्ष्य कोशिकाओं 2 के प्लाज्मा झिल्ली को वायरल कणों की कुर्की मध्यस्थता करता है। वायरस 3-6 वर्णित किया गया है क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis के माध्यम से कोशिकाओं बल्कि ऐसी macropinocytosis के रूप में वैकल्पिक प्रवेश मार्ग है, में प्रवेश करती है। हा और सियालिक एसिड के बीच बातचीत, दोनों मध्यस्थता लगाव और वायरल कणों 7 के internalization ट्रिगर के लिए पर्याप्त होना प्रतीत होता है। फिर भी, वैकल्पिक प्रवेश रिसेप्टर्स प्रस्तावित किया गया है और IAV प्रविष्टि में उनकी भूमिकाओं वर्तमान में 1,8,9 की जांच की जा रही है।

चालूrently, प्रयासों की तत्काल जरूरत उपन्यास एंटीवायरल उपचारों 10-12 विकसित करने के उद्देश्य के साथ वायरल जीवन चक्र में शामिल कर रहे हैं कि मेजबान कारकों की पहचान करने के लिए बना रहे हैं। वायरस प्रवेश जल्द से जल्द अपने बिंदु पर वायरल संक्रमण को ब्लॉक करने के क्रम में IAV विकास लक्षित करने के लिए एक अनुकूल कदम होगा। वायरस की आमतौर पर बड़ी मात्रा में भेजे गए वायरस का पता लगाने के लिए आवश्यक हैं के रूप में IAV प्रविष्टि के विभिन्न चरणों को मापने प्रयोगात्मक चुनौतीपूर्ण है। इसके अलावा, वायरस प्रविष्टि में परिवर्तन के लिए सीमा का पता लगाने के कारण वायरल प्रतिकृति की कमी के कारण केवल रैखिक है। इस उच्च संवेदनशीलता के साथ assays के लिए की जरूरत को रेखांकित करता है।

यहाँ प्रस्तुत परख सेल जुड़े वायरस की कुल राशि के संबंध में कोशिका की सतह पर संलग्न वायरस का पता लगाने के साथ ही भाँति वायरस का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। biotinylated wildtype वायरस का उपयोग फ्लो द्वारा एसटीवी-Cy3 साथ धुंधला और readout के माध्यम से सुविधाजनक माप सक्षम बनाता है। Biotinylated वायरस सेल करने के लिए ठंडे-बाउंड हैएस लगाव की अनुमति लेकिन वायरल कणों के internalization रोकने के लिए। सेल, तय permeabilized और संलग्न वायरस को मापने के लिए एसटीवी-Cy3 के साथ दाग जा सकता है। एक अवरुद्ध कदम कोशिकाओं गैर लेबल streptavidin (एसटीवी) के साथ incubated रहे हैं, जिसमें निर्धारण से पहले लागू किया जाता है, तो बाह्य, संलग्न virions से संकेत निराकृत किया जा सकता है। एक अगले चरण में, biotinylated IAV की कुर्की के बाद, तापमान 37 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरित कर दिया जाता है और वायरल कणों के internalization जगह लेने के लिए अनुमति दी है। भाँति कणों जिससे अतिरिक्त और intracellular वायरस के बीच भेदभाव की इजाजत दी एसटीवी के बंधन से सुरक्षित हैं।

प्रयोगात्मक शर्त के अनुसार, चार नमूने की आवश्यकता है: '0 मिनट': पहला नमूना, लेबल '0 मिनट', कोशिका की सतह पर ठंड बाध्य वायरस को मापने के लिए है। '0 मिनट + एसटीवी': दूसरा नमूना, '0 मिनट + एसटीवी' लेबल, प्रयोग के आधारभूत संकेत तीव्रता देता है। संलग्न वायरस बुद्धि अवरुद्ध हैज एसटीवी और एसटीवी-Cy3 के साथ संकेत के बाद धुंधला '0 मिनट' नमूने की तुलना में काफी कम किया जाना चाहिए। '30 मिनट ': तीसरे नमूना, '30 मिनट' की वजह से 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान पारी से जुड़ी है और वायरस भाँति होता है। '30 मिनट + एसटीवी ': चौथा नमूना, '30 मिनट + एसटीवी' उपायों वायरस के intracellular अंश। एसटीवी अवरुद्ध कदम 30 मिनट ऊष्मायन अवधि के बाद लागू किया जाता है। नतीजतन, कोशिका की सतह पर वायरल कणों एसटीवी-Cy3 साथ धुंधला करने के लिए केवल भाँति वायरस उपलब्ध छोड़ने एसटीवी से बंधे हुए हैं। भाँति वायरस के रिश्तेदार राशि '(नमूना '30 मिनट से वर्णित) वायरस की कुल राशि से विभाजित (नमूना '30 मिनट + एसटीवी में मापा)' भाँति वायरस के अनुपात के रूप में गणना की जा सकती है।

नियंत्रण के रूप में हम नकली संक्रमित कोशिकाओं को शामिल करने का सुझाव देते हैं। नकली संक्रमित कोशिकाओं के एसटीवी-Cy3 धुंधला निम्नलिखित संकेत पृष्ठभूमि देता हैधुंधला प्रोटोकॉल से उत्पन्न। IAV लगाव के लिए एक नियंत्रण बैक्टीरियल neuraminidase (एनए) के साथ कोशिकाओं के पूर्व उपचार है। सेलुलर ग्लाइकोप्रोटीन से सियालिक एसिड बंद एनए cleaves, जिससे कोशिका की सतह से लगाव रिसेप्टर्स को हटाने। सोडियम azide (एसए) एक शक्तिशाली चयापचय अवरोध करनेवाला है और इस तरह ब्लॉकों 13 endocytosis। सोडियम azide के साथ इलाज किया कोशिकाओं internalization के लिए बाध्यकारी वायरस के लिए सकारात्मक है लेकिन नकारात्मक होना चाहिए।

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Protocol

पहले शुरू नोट: उपयोग लामिना का प्रवाह हुड और उचित biocontainment जीवित वायरस के साथ काम कर रहे हैं। यहाँ, हम संस्कृति इन्फ्लूएंजा वायरस तनाव ए / डब्लूएसएन / 33 के लिए उपयुक्त विकास की स्थिति का वर्णन है। संक्रमण की बहुलता (MOI) और ऊष्मायन बार इस्तेमाल वायरस तनाव के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।

Biotinylated ए / डब्लूएसएन / 33 वायरस के 1. तैयारी

  1. बीज Madin-डार्बी कुत्ते Kindey (MDCK) 10% FBS और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / Strep) के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) का उपयोग कर एक T175 सेमी 2 फ्लास्क में कोशिकाओं। लगभग 70% confluency तक 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं तक पहुँच जाता है।
  2. संक्रमण से पहले, मध्यम हटाने और सेल monolayer कवर करने के लिए एक बड़ा पर्याप्त मात्रा जोड़कर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, pH7.0-7.3) के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  3. पीबीएस निकालें और 10 -4 के MOI के साथ ए / डब्लूएसएन / 33 के साथ कोशिकाओं को संक्रमित। पीबीएस में वायरस पतला 0.02 मिलीग्राम 2 मिलीग्राम +, 0.01 मिलीग्राम सीए 2 <साथ पूरक/ Sup>, 0.3% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), और 1% पेन / Strep (संक्रमण-पीबीएस)। एक T175 2 सेमी कुप्पी के लिए 4 मिलीलीटर की एक inoculum का प्रयोग करें।
  4. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे सेते हैं। फ्लास्क में 0.3% बीएसए, 20 मिमी HEPES, और 1% पेन / Strep के साथ पूरक आकांक्षा और पिपेट 10 मिलीलीटर DMEM से inoculum निकालें।
  5. तो फसल सतह पर तैरनेवाला दिखाई दे रहा है, और cytopathic प्रभाव (सीपीई) तक लगभग 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं। सीपीई टुकड़ी और 14 कोशिकाओं की मौत के बाद कोशिकाओं से गोलाई के रूप में पहचाना जा सकता है।
  6. सेल मलबे को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 450 XG पर सतह पर तैरनेवाला स्पिन। एक नए बाज़ ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण और इस कदम को एक और बार दोहराएँ। छर्रों त्यागें।
  7. Ultracentrifuge ट्यूबों और NTE बफर (10 मिमी Tris [पीएच 7.4], 100 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA) में पतला 30% सुक्रोज के 5 मिलीलीटर के साथ बुनियाद supernatants में स्थानांतरण supernatants। Ultracentrifugation पहले नलियों के संतुलन और 30 मिलीलीटर की एक अंत मात्रा तक पहुँचने के लिए पीबीएस के साथ भरें। स्पिन superna112,398 XG पर tants ultracentrifuge एक में 90 मिनट के लिए (एक SW28 रोटर के लिए 25,000 आरपीएम के लिए इसी)।
  8. ध्यान pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटाने और 250 μl पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर वायरस गोली लेना। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा resuspend गोली। ब्रैडफोर्ड परख 15 से शुद्ध वायरस के प्रोटीन सामग्री को मापने।
  9. Biotinylated ए / डब्लूएसएन / 33 उत्पन्न करने के लिए एक biotinylation किट का प्रयोग करें। निर्माता के निर्देश का पालन करें।
  10. संक्षेप में, वायरस शुद्ध करने के लिए बायोटिन की उचित मात्रा में जोड़ने और बर्फ पर 2 घंटे के लिए सेते हैं। Ultracentrifuge एक ट्यूब के लिए वायरस स्थानांतरण और 30 मिलीलीटर की एक अंत मात्रा तक पहुँचने के लिए पीबीएस के साथ ट्यूब भरने। Ultracentrifuge एक में 90 मिनट के लिए 112,389 XG पर वायरस स्पिन। Pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें और 250 μl पीबीएस जोड़ने। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में गोली लेना। अशेष यह कम से कम 24 महीने के लिए स्थिर हो जाएगा, जहां -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत Biotinylated वायरस की दुकान और।
    नोट: यह biotinylated पी के अनुमापांक निर्धारित करने के लिए उपयोगी हो सकता हैमानक पट्टिका परख द्वारा IAV की मरम्मत। हालांकि, यह बाद में प्रोटोकॉल केवल biotinylated वायरस कणों उपाय करेंगे कि ध्यान दिया जाना चाहिए। कारण अधूरा biotinylation को unbiotinylated कणों शेष पट्टिका परख द्वारा नहीं बल्कि लगाव / internalization परख में मापा संकेत करने के लिए संक्रामक अनुमापांक के लिए योगदान देगा।

2. Biotinylated वायरस के लिए आवश्यक राशि का निर्धारण करते हैं

नोट: लगाव / internalization परख प्रदर्शन किया है से पहले, यह एक नमूना की सभी कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए आवश्यक biotinylated वायरस की मात्रा निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

  1. संस्कृति और निर्माता के निर्देशों के अनुसार Trypsinize A549 कोशिकाओं। एक सेल कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गणना। FACS में पिपेट 200,000 A549 कोशिकाओं नलियों deepwell। स्पिन 450 x जी पर 3 मिनट। 200 μl पीबीएस के साथ सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें। कूल कोशिकाओं नीचे बर्फ पर 10 मिनट के लिए।
  2. Bioti का 5 गुना धारावाहिक dilutions तैयारसंक्रमण-पीबीएस में nylated वायरस शेयर।
  3. 450 x जी पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं से युक्त स्पिन ट्यूबों। 100 μl वायरस युक्त संक्रमण-पीबीएस के साथ सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें। Biotinylated वायरस के बिना नकली नियंत्रण उपयोग संक्रमण-पीबीएस के रूप में। 1 घंटे के लिए बर्फ पर ट्यूबों सेते हैं।
  4. 450 x जी पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन ट्यूबों। 200 μl पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें। यह कदम एक बार और दोहराएँ।
  5. निर्धारण के लिए, 450 x जी पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन ट्यूबों। 3.7% paraformaldehyde (पीएफए) के 100 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें। आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। फिर, 2.4 में वर्णित धोने कदम) दोहराएँ।
  6. Permeabilization के लिए, 450 x जी पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन ट्यूबों। 0.5% ट्राइटन X-100 युक्त 100 μl पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें। आरटी पर 6 मिनट के लिए सेते हैं। फिर, 2.4 में वर्णित धोने कदम) दोहराएँ।
  7. 450 x जी पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन ट्यूबों। सतह पर तैरनेवाला और resuspend तितर हटायेपीबीएस एसटीवी-Cy3 युक्त में पतला 50 μl 2% BSA में एट। (कृपया ध्यान दें, एसटीवी-Cy3 की उचित एकाग्रता प्रयोग शुरू करने से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए 1 के एक एकाग्रता के साथ शुरू:। गुना 2 dilutions अप करने के लिए 1 200 और परीक्षण:। 2,400 हमारे हाथों में, 1 की एक कमजोर पड़ने: साबित कर 1000 इष्टतम जाना चाहिए।)
  8. आरटी पर अंधेरे में 1 घंटे सेते हैं। फिर, दोहराने धोने 2.4 चरण में वर्णित है, लेकिन पीबीएस में पतला 200 μl 2% BSA में गोली resuspend।
  9. 16 प्रवाह cytometry द्वारा नमूनों का विश्लेषण करें। Cy3 पॉजिटिव आबादी पर गेट। A549 आबादी में Cy3 पॉजिटिव कोशिकाओं की अधिकतम संख्या में जिसके परिणामस्वरूप biotinylated वायरस की सबसे कम एकाग्रता चुनें।

3. Streptavidin के लिए आवश्यक राशि का निर्धारण करते हैं


नोट: कोशिकी वायरस से निकाली गई संकेत अवरुद्ध करने में दक्षता परख का पता लगाने रेंज निर्धारित करता है। इसलिए, यह जितना संभव हो उतना एसटीवी-Cy3 संकेत निराकृत करने के लिए महत्वपूर्ण है। गुएसटीवी के लिए आवश्यक राशि की जरूरत है ई (धारा 2 में निर्धारित) का इस्तेमाल किया biotinylated वायरस शेयर की मात्रा पर निर्भर करता है।

  1. कदम 2.1-2.4 का पालन करें, लेकिन धारा 2 में निर्धारित वायरस एकाग्रता का उपयोग करें।
  2. पीबीएस 2% BSA और 0.1% सोडियम azide युक्त में पतला एसटीवी से पांच गुना धारावाहिक dilutions तैयार करें।
  3. 450 x जी पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन ट्यूबों। 50 μl एसटीवी कमजोर पड़ने में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें। नकली नियंत्रण उपयोग के रूप में पीबीएस एसटीवी बिना 2% BSA और 0.1% सोडियम azide युक्त। बर्फ पर 30 मिनट के लिए ट्यूबों सेते हैं। फिर, दोहराने धोने 2.4 चरण में वर्णित है।
  4. कदम 2.5-2.9 का पालन करें। Internalization परख के लिए, (कोई एसटीवी मौजूद था जिसमें नमूना की तुलना में) Cy3-संकेत के एक मजबूत ब्लॉक में जिसके परिणामस्वरूप एसटीवी की सबसे कम एकाग्रता चुनें। इस के लिए, cy3 पॉजिटिव कोशिकाओं या Cy3 संकेत का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिशत इस्तेमाल किया जा सकता है। आदर्श रूप में, एसटीवी इलाज के नमूने की Cy3 संकेत नकली संक्रमित से संकेत के रूप में बंद होना चाहिएसंभव के रूप में कोशिकाओं।

4. लगाव / Internalization परख


नोट: परख शुरू करने से पहले सभी अभिकर्मकों तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें। प्रोटोकॉल के लिए तीन नियंत्रण परिणाम अनुभाग (नकली संक्रमित कोशिकाओं, neuraminidase पूर्व इलाज कोशिकाओं और सोडियम azide इलाज किया कोशिकाओं) में प्रस्तुत समूहों छोटे परिवर्तन के लिए आवश्यक हैं।

  1. प्रत्येक 200,000 A549 कोशिकाओं से युक्त 16 deepwell ट्यूबों तैयार। अगले 4 नलियों से मिलकर प्रयोगात्मक सेट करने के लिए, 3 नियंत्रण की स्थिति, प्रत्येक की आवश्यकता होती है 4 ट्यूब देखते हैं: नकली संक्रमित कोशिकाओं, neuraminidase (एनए) -pretreated कोशिकाओं और सोडियम azide इलाज कोशिकाओं। प्रत्येक समूह '0 मिनट', '0 मिनट + एसटीवी', '30 मिनट ', '30 मिनट + एसटीवी' के रूप में चिह्नित 4 ट्यूब के होते हैं।
  2. 450 x जी पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन ट्यूबों। 200 μl पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें।
  3. 450 x जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन ट्यूबों। सतह पर तैरनेवाला और resuspend तितर हटाये0.3% बीएसए, 20 मिमी HEPES और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (ऊष्मायन मध्यम) युक्त 200 μl DMEM में एट। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: उपयोग बैक्टीरियल neuraminidase (जैसे sialidase विब्रियो हैजा से) मिलीलीटर कोशिकाओं resuspend ऊष्मायन माध्यम में पतला / 200 म्यू के एक एकाग्रता में: neuraminidase नियंत्रण के लिए।
  4. 450 x जी पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन ट्यूबों। 200 μl पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें। 10 मिनट के लिए बर्फ पर नीचे तो, इस कदम शांत नलियों एक बार और दोहराएँ।
  5. 450 x जी पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन ट्यूबों। (संक्रमण-पीबीएस में पतला धारा 2 में निर्धारित वायरस एकाग्रता का उपयोग करें) वायरस biotinylated 100 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें। बर्फ पर 1 घंटा सेते हैं। फिर, दोहराने धोने 2.4 चरण में वर्णित है।
    नोट: उपयोग संक्रमण पीबीएस वायरस के बिना: नकली संक्रमित नियंत्रण के लिए। सोडियम azide नियंत्रण के लिए: संक्रमण-पीबीएस में पतला उपयोग वायरस 0.1% सोडियम azide के साथ पूरक।
  6. प्रोबर्फ पर संक्रमण के बाद नमूनों की cessing:
    1. अन्य नमूने तय कर रहे हैं, जब तक '0 मिनट' नमूने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 कदम और दुकान के नमूनों का पालन करें।
    2. 450 x जी पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर '0 मिनट + एसटीवी के नमूनों, स्पिन ट्यूबों के लिए। पीबीएस 2% BSA और 0.1% सोडियम azide युक्त में पतला 50 μl एसटीवी (धारा 3 में निर्धारित एकाग्रता का उपयोग करें) में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें (नमूना से निपटने जबकि internalization रोकने के लिए)। बर्फ पर 30 मिनट सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर कदम 2.4-2.5 और दुकान के नमूनों का पालन करें।
    3. 450 x जी पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर '30 मिनट 'नमूने, स्पिन ट्यूबों के लिए। 200 μl पीबीएस 2% BSA युक्त में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर कदम 2.4-2.5 और दुकान के नमूनों का पालन करें।
      नोट: सोडियम azide नियंत्रण के लिए: का प्रयोग करें पीबीएस 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट ऊष्मायन के लिए 2% BSA और 0.1% सोडियम azide के साथ पूरक।
    4. '3 के लिए0 मिनट + एसटीवी 'नमूने 450 x जी पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नलियों स्पिन। 200 μl पीबीएस 2% BSA युक्त में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट सेते हैं। फिर, 450 x जी पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन ट्यूबों। पीबीएस 2% BSA और 0.1% सोडियम azide युक्त में पतला 50 μl एसटीवी (धारा 3 में निर्धारित एकाग्रता का उपयोग करें) में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें (नमूना से निपटने जबकि internalization रोकने के लिए)। बर्फ पर 30 मिनट सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर कदम 2.4-2.5 और दुकान के नमूनों का पालन करें।
      नोट: सोडियम azide नियंत्रण के लिए: का प्रयोग करें पीबीएस 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट ऊष्मायन के लिए 2% BSA और 0.1% सोडियम azide के साथ पूरक।
  7. कदम 2.6-2.8 का पालन करें और फ्लो से नमूनों का विश्लेषण। प्रत्येक नमूने में Cy3 पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करते हैं।
  8. प्रतिशत संलग्न वायरस और भली भाँति वायरस के रिश्तेदार राशि की गणना।
    1. संलग्न वायरस की राशि की गणना करने के लिए, Cy3-स्थिति का प्रतिशत उपयोगgated कोशिकाओं या Cy3 संकेत का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता किया है। तुलना के लिए, 100% (चित्रा 4 बी) को इलाज कोशिकाओं की स्थापना की।
      नोट: संलग्न वायरस का प्रतिशत "0 मिनट" नमूना द्वारा वर्णित है।
    2. भाँति वायरस की राशि की गणना करने के लिए, "30 मिनट" नमूना (चित्रा 5 ब) के लिए "30 मिनट + एसटीवी" नमूना के अनुपात रखना।
      नोट: ऊपर उल्लेख किया है, Cy3 सकारात्मक gated कोशिकाओं या Cy3 संकेत का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिशत इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Representative Results

चार अलग-अलग प्रयोगात्मक शर्तों का वर्णन एक कार्टून चित्र 1 में दिखाया गया है एक प्रतिनिधि प्रयोग के परिणाम आंकड़े 2 में प्रस्तुत कर रहे हैं -। 5। "0 मिनट" नमूने में, biotinylated वायरस ठंड बाध्य है एसटीवी-Cy3 धुंधला द्वारा देखे जा सकते हैं जो कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए (आंकड़े 1 और 2)। ("0 मिनट + एसटीवी" नमूने में) एक अवरुद्ध कदम लागू किया जाता है, कोशिका की सतह पर वायरस नहीं रह एसटीवी-Cy3 धुंधला से पता लगाया जा सकता है। नतीजतन, "0 मिनट + एसटीवी" नमूने में संकेत तीव्रता जोरदार (आंकड़े 1 और 2) "0 मिनट" नमूना की तुलना में कम है। 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान बढ़ाने पर, संलग्न वायरस कोशिकाओं ("30 मिनट" नमूना) में लिया जाता है। भाँति वायरस & # में संकेत तीव्रता में एक कम नाटकीय बूंद में जो परिणाम लेबल हटाया एसटीवी के साथ अवरुद्ध करने के प्रति संवेदनशील नहीं है8220, कोई एसटीवी अवरुद्ध लागू किया गया था, जिसमें 30 मिनट "नमूना 30 मिनट + एसटीवी" के सापेक्ष नमूने "(आंकड़े 1 और 2)।

नियंत्रण के रूप में हम नकली संक्रमण, एनए उपचार और एसए उपचार कार्यरत हैं। 4. नकली संक्रमित कोशिकाओं के प्रयोग के लिए पृष्ठभूमि संकेत तीव्रता देने के लिए और के लिए के रूप में नकारात्मक नियंत्रण अधिनियम की धारा में वर्णित सभी प्रयोगात्मक शर्तों के लिए 3 दिखाता Cy3 पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत चित्रा वायरस लगाव (चित्रा 4)। वायरस कुर्की के लिए एक अतिरिक्त नियंत्रण bacterially व्यक्त एनए के साथ इलाज है। एनए कोशिका की सतह पर ग्लाइकोप्रोटीन से सियालिक एसिड, IAV कुर्की के लिए रिसेप्टर को निकालता है और जिससे कोशिकाओं 17 को लक्षित करने के वायरस के बंधन को कम करता है। चित्रा 4 में दिखाया गया है, एनए के साथ उपचार जोरदार अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में लगभग 90% से IAV लगाव abrogates। Internalization के बारे में, हम नियंत्रण के रूप में दक्षिण अफ्रीका का इस्तेमाल किया। एसए टीआर eatment तुरंत जिससे इस तरह के endocytosis 13 के रूप में ऊर्जा खपत प्रक्रियाओं बाधा सेलुलर एटीपी के स्तर depletes। के दौरान और वायरस कणों के संक्रमण हिचकते internalization के बाद एसए के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन। (चित्रा 5 में दिखाया गया है) भाँति वायरस के रिश्तेदार राशि अनुपचारित कोशिकाओं में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन से 45% करने के लिए लगभग 10% से उठाया गया था। हालांकि एसए उपचार के बाद, रिश्तेदार भाँति वायरस का प्रतिशत दोनों के लिए लगभग 15%, 0 के लिए incubated कोशिकाओं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट था। यह वास्तव में, एसए कोशिकाओं में वायरल कणों के प्रभावी तेज को कम कर देता है कि इंगित करता है।

चित्र 1
लगाव / internalization परख के सिद्धांत समझा चित्रा परख के 1. सिद्धांत। कार्टून।= "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
IAV लगाव और internalization के लिए चित्रा 2. प्रतिनिधि परिणाम। अनुपचारित कोशिकाओं के लिए Cy3 संकेत के संकेत तीव्रता दिखा (ए) हिस्टोग्राम। दिखाया गया है, "0 मिनट + एसटीवी", "30 मिनट" और "30 मिनट + एसटीवी" नमूना "0 मिनट 'कर रहे हैं। ए से Cy3 पॉजिटिव कोशिकाओं (बी) का प्रतिशत यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
नियंत्रण सहित लगाव और internalization के लिए 3. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा। रोंग> संकेत इलाज के बाद Cy3 पॉजिटिव A549 कोशिकाओं का प्रतिशत। दिखाया नकली संक्रमित, इलाज, एनए का इलाज और कोशिकाओं एसए-व्यवहार किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
Neuraminidase द्वारा वायरस लगाव 4. निषेध चित्रा। (ए) हिस्टोग्राम "0 मिनट" नमूनों की Cy3 संकेत तीव्रता दिखा। नकली संक्रमित और एनए इलाज कोशिकाओं (लाल और नारंगी रंग में क्रमश:): अनुपचारित (नीले रंग में) कोशिकाओं और दो नियंत्रण के नमूने प्रदर्शित कर रहे हैं। दिखाया ए से Cy3 पॉजिटिव कोशिकाओं (बी) प्रतिशत, नकली इलाज और "0 मिनट" नमूना से कोशिकाओं एनए का इलाज कर रहे हैं। अनुपचारित कोशिकाओं के लिए मूल्य 100% करने के लिए स्थापित किया गया था।कॉम / फ़ाइलें / ftp_upload / 53,372 / 53372fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा सोडियम azide (एसए) द्वारा वायरस internalization 5. निषेध। (ए) हिस्टोग्राम "30 मिनट" के Cy3 संकेत तीव्रता दिखा रहा है और "30 मिनट + एसटीवी" इलाज से नमूने (लाल और नारंगी रंग में, क्रमशः) और एसए कोशिकाओं (नीले और क्रमश: हरे रंग में) का इलाज किया। 0 और 30 मिनट के बाद इलाज और एसए इलाज कोशिकाओं से रिश्तेदार भाँति वायरस (बी) का प्रतिशत। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हमारी प्रोटोकॉल फ्लो द्वारा वायरस लगाव और internalization को मापने का एक आसान तरीका वर्णन करता है। यह वायरस की तरह कण (VLP) के उपयोग की तुलना में अधिक है जो बारीकी mimics के वायरस के संक्रमण के लेबल wildtype वायरस के उपयोग की अनुमति देता है। हमारे प्रोटोकॉल IAV की कुर्की और internalization को मापने के लिए अनुकूलित किया गया है, जबकि यह आसानी से अन्य वायरस के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। फ्लो readout के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में इसके अलावा, सह stainings आसानी से ब्याज की एक प्रोटीन की पछाड़ना या overexpression निम्नलिखित अभिव्यक्ति के स्तर का परीक्षण करने के लिए प्रोटोकॉल जैसे करने के लिए जोड़ा जा सकता है। इस प्रकार, परख व्यक्तिगत जरूरतों के आधार पर प्रोटोकॉल के संशोधन के लिए अनुमति देता है। ध्यान से, परख भी गतिज जानकारी समय के साथ वायरस internalization मापने के लिए और प्राप्त करने के लिए समय अंक की एक श्रृंखला के लिए किया जा सकता है। परख अज्ञात internalization कैनेटीक्स के साथ एक अलग वायरस के लिए अनुकूलित किया जा रहे थे तो यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है।

होवेदेखें, यह पता लगाने की खिड़की के कारण वायरल प्रतिकृति के अभाव के लगाव या internalization में मतभेद एक रैखिक पैमाने पर होने के रूप में अपेक्षाकृत छोटा है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। विश्वास बढ़ाने के लिए और हम नियंत्रण सहित सुझा शोर को कम करने के लिए (जैसे नियंत्रण से ऊपर का वर्णन) और कई दोहराता है। दिखाए गए परिणामों एक प्रतिनिधि प्रयोग को दर्शाती है, जबकि हम विभिन्न प्रयोगों भर में अच्छी संगति मनाया: उदाहरण के लिए, कुर्की के लिए, Cy3 पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत 60-80% से लेकर; भाँति वायरस के लिए हम 40-60% के बीच मूल्यों को प्राप्त किया।

परख शुरू करने से पहले, यह इस तरह के एसटीवी, एसटीवी-Cy3 और biotinylated वायरस की राशि के रूप में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों का काम कर रहे सांद्रता titrate करने के लिए महत्वपूर्ण है। अभिकर्मकों और ऊष्मायन बार की राशि का इस्तेमाल सेल लाइन और वायरस तनाव के आधार पर अलग-अलग हो सकता है कि कृपया ध्यान दें। पता लगाने की खिड़की, वायरस attachmen के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत अधिकतम करने के लिएटी 0 मिनट + एसटीवी "नमूना" में संभव के रूप में के रूप में कम और (biotinylated इस्तेमाल किया वायरस की मात्रा पर निर्भर करता है) नमूना "" 0 मिनट और "30 मिनट में संभव के रूप में उच्च किया जाना चाहिए (एसटीवी की राशि पर इस्तेमाल किया निर्भर करता है )। इसके अलावा, शोर centrifugation के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं रखकर और ठंडा पीबीएस के साथ धोने से कम किया जा सकता है।

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Acknowledgements

इस काम एसएसटी के लिए स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (31003A_135278) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। एमओपी एक्सा रिसर्च फंड से एक डॉक्टरेट अनुदान के लाभार्थी है। हम यह आंकड़ा 1 के डिजाइन के साथ मदद के लिए पेट्रीसिया Nigg धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 41966-052
FBS Life Technologies 10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163
PBS Life Technologies 14190-169  
BSA VWR Calbiochem 126579
HEPES Life Technologies 15630-100
D-Sucrose Fluka 84100
TRIS Biosolve BV 20092391
EDTA Sigma-Aldrich 3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit Fisher Scientific W9971E 
Bio Rad Protein Bio Assay Bio Rad 500-0006
deepwell tubes (1.2 ml microtubes) Milian 82 00 001
PFA  Lucerna chem  Electron microscopy sciences 15710
ultracentrifuge tubes Hemotec HmbH 253070
Triton X-100 Fluka 93420
STV-Cy3 Life Technologies 43-4315
STV Life Technologies 43-4302
sodium azide Fluka 71290
bacterial neuraminidase/sialidase Sigma-Aldrich N6514-1UN

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References

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