Akış Sitometrisi ile A549 Hücreleri Eklenti ve içselleştirilmesi Gribi bir virüs Ölçme

1Institute of Medical Virology, University of Zurich
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pohl, M. O., Stertz, S. Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (105), e53372, doi:10.3791/53372 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Influenza A virüsü (IAV) giriş hedef hücrelere 1 plazma membranında reseptörlere virüs bağlayıcı ile başlayan bir çok-aşamalı süreçtir. IAV reseptörü glikoproteinlerin ve glikolipitlerin çok çeşitli üzerinde mevcut olan sialik asit. Viral zarf içinde mevcut olan IAV bir hemaglütinin (HA) proteini sialik aside bağlanır ve böylece hedef hücrelerin 2 plazma zarına viral partiküllerin bağlanmasına aracılık eder. Virüs 3-6 tarif edilmiştir klatrin dolayımlı endositoz yoluyla hücrelerin değil, aynı zamanda, makropinositozlar gibi alternatif giriş yolları, girer. HA ve sialik asit arasındaki etkileşim, her iki aracı bağlanma ve viral parçacıkların 7 içselleşmesini tetiklenmesi için yeterli olduğu görülmektedir. Bununla birlikte, alternatif giriş reseptörleri öne sürülmüştür ve IAV girişi rolleri şu anda 1,8,9 araştırılmaktadır.

Sokak köpeğirently çabalar acil olarak ihtiyaç duyulan yeni antiviral tedaviler 10-12 geliştirilmesi amacıyla, virüsün yaşam döngüsünde yer alan ana bilgisayar faktörlerini tanımlamak için yapılır. Virüs girdi onun erken noktada viral enfeksiyon engellemek için IAV büyümeyi hedeflemek için olumlu bir adım olacaktır. Virüsün genellikle büyük miktarlarda gelen virüs tespit etmek gerekli olarak IAV girişi farklı aşamalarını Ölçme deneysel zordur. Buna ek olarak, virüs girişi değişiklikleri için algılama aralığı nedeniyle viral replikasyon eksikliği sadece doğrusal olduğunu. Bu yüksek hassasiyet ile tahliller ihtiyacını vurgulamaktadır.

Burada takdim deney hücreye birleşik virüs toplam miktarına bağlı olarak, hücre yüzeyinde bağlanmış virüsünün taranmasında olarak içsel virüs tespit edilmesine olanak sağlar. Biyotinlenmiş yabanıl tür virüsün kullanımı flow sitometri STV-Cy3'e ile boyama ve okuma yoluyla uygun ölçüm sağlar. Biyotinile virüs hücreye soğuk sınırdırs eki izin ancak viral parçacıkların içselleştirilmesi önlemek için. Hücreler, sabit permeabilize ve ekli virüs ölçmek için STV-Cy3 ile boyanmış olabilir. Bir bloke etme adımı olmayan hücreler etiketli streptavidin (STV) ile inkübe edildiği tespitten önce uygulanırsa, hücre dışı, bağlı virionlar sinyal iptal edilebilir. Bir sonraki adımda, biyotinlenmiş IAV bağlanmasını takiben, sıcaklık 37 ° C'ye kaydırılır ve viral parçacıkların içselleştirme gerçekleşmesi sağlanır. Içselleştirilmiş parçacıklar, böylece ekstra ve hücre içi virüsler arasında ayrımcılık sağlayan STV bağlanması korunur.

Deneysel koşul başına, dört numune gereklidir: '0 dk': İlk örnek, etiketlenmiş '0 dakika' hücre yüzeyinde soğuk bağlı virüs ölçmektir. '0 dk + STV': İkinci örnek, '0 dk + STV' etiketli, deney temel sinyal yoğunluğu verir. Ekli virüs zekâ engellendih STV ve STV-Cy3 ile sinyal aşağıdaki boyama '0 dak' örnek kıyasla çok daha düşük olmalıdır. '30 Dakika ': üçüncü numune, '30 dakika' nedeniyle, 30 dakika boyunca 37 ° C'ye kadar bir sıcaklık geçişi eklenmiş ve virüs içselleştirilir içerir. '30 Dakika + STV ': Dördüncü örnek, '30 dakika + STV' önlemler virüslerin hücre içi fraksiyon. STV bloke etme adımı 30 dakika inkübasyon süresi sonrasında uygulanır. Bunun bir sonucu olarak, hücre yüzeyinde viral partiküller STV- Cy3 ile lekeleme için tek içsel virüsleri uygun ayrılan STV bağlıdırlar. Içsel virüs nispi miktarı '(örnek '30 dakika tarafından anlatıldığı gibi) bir virüs toplam miktarına bölünmesiyle elde edilen (örnek '30 dakika + stv olarak ölçülür)' içsel virüs oranı olarak hesaplanabilir.

Kontroller olarak, sözde-enfekte edilmiş hücreler dahil etmektedir. Mock-enfekte olmuş hücrelerde STV-Cy3 boyaması aşağıdaki sinyal arka plan verirboyama protokolünden elde edilir. IAV bağlanması için bir kontrol bakteriyel nöraminidaz (NA) içeren hücrelerin önceden bir tedavi yöntemidir. Hücresel glikoproteinlerin gelen sialik asit kapalı NA böler, böylece hücre yüzeyinden eki reseptörleri çıkarılması. Sodyum azid (SA) etkili bir metabolizma inhibitörüdür ve böylece blok 13, endositoz. Sodyum azid ile muamele hücreler internalizasyonundan bağlanma virüsü için pozitif ancak negatif olmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Önce başlangıç ​​Not: Kullanım laminer akış kaput ve uygun biyolojik tecrit canlı virüs ile çalışırken. Burada, kültür, influenza virüs suşu A / WSN / 33 uygun büyüme koşulları açıklar. Enfeksiyon (MOI) ve inkübasyon süreleri, kullanılan virüs suşu bağlı olarak değişebilir.

Biyotinilat A / WSN / 33 Virüs 1. Hazırlık

  1. Tohum Madin-Darby köpek kindey (MDCK),% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin (pen / strep) ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) kullanılarak T175 cm 2 şişe içine hücreleri. Yaklaşık% 70 konflüansa kadar 37 ° C 'de kültür hücreleri ulaşılır.
  2. Enfeksiyon öncesinde, orta çıkarın ve hücre tekli tabakası kapak için yeterince büyük bir hacim ilave edilerek, fosfat tamponlu salin (PBS, pH7.0-7.3) hücreleri yıkayın.
  3. PBS çıkarın ve 10 -4 bir İçişleri Bakanlığı ile A / WSN / 33 ile hücreleri enfekte. PBS virüs seyreltin 0.02 mg Mg 2+, 0.01 mg Ca 2 + <ile desteklenmiş/ sup>,% 0.3 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve% 1 Pen / Strep (enfeksiyon PBS). Bir T175 cm2 şişe için 4 ml bir inokulum kullanın.
  4. Hücreler, 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Şişe içine% 0.3 BSA, 20 mM HEPES,% 1 Pen / Strep ile takviye edilmiş aspirasyon ve pipet 10 ml DMEM ile inokulum çıkarın.
  5. Daha sonra, hasat süpernatan görülebilir ve sitopatik etki (CPE) kadar yaklaşık 3 gün boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri. CPE dekolmanı ve hücrelerin 14 ölümü ardından hücrelerin yuvarlama olarak kabul edilebilir.
  6. Hücre debrisini uzaklaştırmak için 5 dakika süreyle 450 x g'de süpernatan dönerler. Yeni şahin tüp içine süpernatant aktarın ve bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Pelet atın.
  7. Ultrasantrifüj tüpleri ve NTE tampon maddesi (10 mM Tris [pH 7.4], 100 mM NaCI, 1 mM EDTA) içinde seyreltildi,% 30 sukroz, 5 ml örtü süpernatantlarma Aktarım süpernatanlar. Ultrasantrifügasyon önce tüpleri Denge ve 30 ml'lik bir son hacmi ulaşmak için PBS ile doldurun. Spin Superna112.398 x g'de tants bir ultrasantrifüjdeki 90 dakika boyunca (bir SVV28 rotor 25.000 rpm'de karşılık gelir).
  8. Dikkatle pipetleme tarafından süpernatant kaldırmak ve 250 ul PBS içinde 4 ° C'de gece boyunca virüs pelet ıslatın. Yukarı ve aşağı pipetleme süspanse edin pelet. Bradford tahlili 15 ile arıtılmış, virüs protein içeriğini ölçmek.
  9. Biyotinlenmiş A / WSN / 33 oluşturmak için bir biyotinilasyon kiti kullanın. Üreticinin talimatları uygulayın.
  10. Kısaca, saflaştırılmış virüs biyotin uygun miktarda ve buz üzerinde 2 saat boyunca inkübe edilir. Ultrasantrifüj işlemi tüp virüs aktarın ve 30 ml'lik bir son hacme ulaşmak için PBS ile tüp doldurun. Bir ultrasantrifüjdeki 90 dakika 112.389 xg'de virüsü Spin. Pipetleme süpernatant kaldırmak ve 250 ul PBS ekleyin. 4 ° C'de gece boyunca pelet bekletin. Kısım en az 24 ay süreyle stabil olacak -80 ° C'de saklandı Biyotinile edilmiş virüs depolamak ve.
    NOT: biyotinlenmiş p titresi belirlemek için yararlı olabilirStandart plak yöntemi ile IAV onarımı. Bununla birlikte, daha sonraki protokolü sadece biyotinlenmiş virüs partikülleri ölçecek dikkat edilmelidir. Nedeniyle eksik biyotinilasyon için biyotinile edilmemiş parçacıklar Kalan plak deneyi ile değil, ek / içselleştirme tahlilinde ölçülen sinyalin bulaşıcı titresi katkıda bulunacaktır.

2. Biyotinile Virüs Gerekli miktarı belirleyin

Not: bağlanma / içselleştirme deney gerçekleştirilmeden önce, bir numunenin tüm hücreleri enfekte etmek için gerekli olan biyotinlenmiş virüs miktarını belirlemek için önemlidir.

  1. Kültür ve üreticinin talimatlarına göre trypsinize A549 hücreleri. Hücre bölme kullanarak hücreleri sayın. FACS içine Pipet 200.000 A549 hücreleri tüpler derin bölmeli. Spin 450 x g'de 3 dakika. 200 ul PBS ile süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Serin hücreleri, buz üzerinde 10 dakika karıştırıldı.
  2. Bioti 5-kat seri dilüsyonları hazırlayınEnfeksiyon-PBS içinde nylated virüs stoku.
  3. 450 x g'de 3 dakika boyunca 4 ° C 'de hücreleri içeren Spin tüpler. 100 ul virüs içeren enfeksiyon PBS ile süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Biyotinlenmiş virüs olmadan sahte kontrolü kullanımı enfeksiyon PBS gibi. 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin.
  4. 450 x g'de 3 dakika boyunca 4 ° C 'de Spin tüpler. 200 ul PBS içinde supernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
  5. Tespit için 450 x g'de 3 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj tüpleri. % 3.7 paraformaldehid (PFA) 100 ul süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, 2.4 açıklanan yıkama adımı) tekrarlayın.
  6. Geçirgenliği için, 450 x g'de 3 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj tüpleri. % 0.5 Triton X-100 ihtiva eden 100 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve süpernatan pelet çıkarın. Oda sıcaklığında 6 dakika süreyle inkübe edilir. Ardından, 2.4 açıklanan yıkama adımı) tekrarlayın.
  7. 450 x g'de 3 dakika boyunca 4 ° C 'de Spin tüpler. Supernatant ve tekrar süspansiyon pell kaldırPBS STV- Cy3 ihtiva eden seyreltilmiş 50 ul% 2 BSA et. (Lütfen dikkat, STV-Cy3 uygun konsantrasyonu deney başlamadan önce belirlenmelidir 1 konsantrasyonunda ile başlayın. Kat 2 dilüsyonları kadar 1 200 ve test. 2400 Bizim ellerde, 1 bir seyreltme: kanıtladı 1000 optimal olduğu).
  8. Oda sıcaklığında, karanlıkta 1 saat inkübe edin. Daha sonra, tekrar yıkama aşaması 2.4'te açıklandığı gibi, ama PBS içinde seyreltilmiş 200 ul% 2 BSA pelletini.
  9. 16 flow sitometri örnekleri analiz edin. Cy3-pozitif nüfus Kapısı. A549 popülasyonda Cy3-pozitif hücrelerin maksimum sayıda yol biyotinlenmiş virüsün düşük konsantrasyonu yapın.

3. Streptavidin Gerekli miktarı belirleyin


Not: Hücre dışı virüs gelen sinyalin bloke verimi deneyinin bir algılama aralığı belirler. Bu nedenle, mümkün olduğunca STV- Cy3 sinyali ortadan kaldırmak için önemlidir. ThSTV gerekli miktarda gerekli e (bölüm 2 belirlenen) kullanılan biyotinlenmiş virüs stokunun miktarına bağlıdır.

  1. Adımları 2,1-2,4 izleyin ancak 2. bölümünde belirlenen virüs konsantrasyonu kullanın.
  2. PBS,% 2 BSA ve% 0.1 sodyum azit içeren içerisinde seyreltilmiş STV beş kat seri dilüsyonları hazırlayın.
  3. 450 x g'de 3 dakika boyunca 4 ° C 'de Spin tüpler. 50 ul STV seyreltme süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Sahte kontrolü kullanımı gibi PBS STV olmadan% 2 BSA ve% 0,1 sodyum azit içeren. Buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin. Ardından, tekrar yıkama adımı 2.4 tarif.
  4. Adımlar 2.5-2.9 izleyin. Içselleştirme tahlil için, (herhangi bir STV da bulunduğu numune ile karşılaştırıldığında), Cy3-sinyali güçlü bir blok elde STV en düşük konsantrasyonunu belirleyin. Bunun için, CY3-pozitif hücreleri veya Cy3 sinyali ortalama floresan yoğunluğu yüzdesi kullanılabilir. İdeal olarak, STV ile tedavi numunelerin Cy3 sinyali mock-enfekte gelen sinyale kadar yakın olmalıdırmümkün olduğu hücreler.

4. Eklenti / İçselleştirme Deneyi


NOT: Deneye başlamadan önce tüm reaktifler hazırlamak için emin olun. Protokole üç kontrol sonuç bölümünde (sahte enfekte edilmiş hücreler, nöraminidaz ön-muamele edilmiş hücreler ve sodyum azit ile muamele edilmiş hücreler) yer alan grupların küçük değişiklikler için gereklidir.

  1. Her 200.000 A549 hücreleri içeren 16 derin kuyu tüpleri hazırlayın. Sonraki 4 tüpten oluşan deney seti, 3 kontrol koşulları gerektiren her 4 tüp vardır: sözde-enfekte edilmiş hücreler, nöraminidaz (NA) -pretreated hücreleri ve sodyum azit ile tedavi edilen hücreler. Her grup '0 dk', '0 dakika + STV', '30 dakika ''30 dakika + STV' olarak etiketlenmiş 4 borulardan oluşmaktadır.
  2. 450 x g'de 3 dakika boyunca 4 ° C 'de Spin tüpler. 200 ul PBS içinde supernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın.
  3. 450 x g'de 4 ° C'de Spin tüpler. Supernatant ve tekrar süspansiyon pell kaldır% 0.3 BSA, 20 mM HEPES ve% 1 penisilin-streptomisin (kuluçka ortamı) ihtiva eden 200 ul DMEM içinde ve çal. 37 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir.
    NOT: bakteriyel nöraminidaz (örneğin siyalidaz Vibrio kolera itibaren) mi hücrelerin yeniden askıya almak için inkübasyon ortamı içinde seyreltilmiş / 200 mU bir konsantrasyonda: nöraminidaz kontrolü için.
  4. 450 x g'de 3 dakika boyunca 4 ° C 'de Spin tüpler. 200 ul PBS içinde supernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. 10 dakika buz üzerinde aşağı, sonra bu adımı serin tüpleri bir kez daha tekrarlayın.
  5. 450 x g'de 3 dakika boyunca 4 ° C 'de Spin tüpler. (Enfeksiyon PBS içinde seyreltilmiş 2. bölümünde belirlenen virüs konsantrasyonunu kullanın) virüsü biyotinile 100 ul süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Buz üzerinde 1 saat inkübe edin. Ardından, tekrar yıkama adımı 2.4 tarif.
    NOT: enfeksiyon PBS virüsü olmadan: mock-enfekte kontrolü için. Sodyum azid kontrolü için: enfeksiyon PBS içinde seyreltilmiş Kullanım virüsü% 0,1 sodyum azid ile desteklenmiş.
  6. ProfesyonelBuz üzerinde enfeksiyon sonrası numune cessing:
    1. Diğer numuneler sabit kadar '0 dak' numuneler için, 4 ° C'de adım 2.5 ve mağaza örnekleri izleyin.
    2. 450 x g'de 3 dakika boyunca 4 ° C 'de' 0 dakika + stv 'örnekleri, santrifüj tüpleri için. PBS% 2 BSA ve% 0,1 sodyum azit içeren seyreltilmiş 50 ul STV (bölüm 3'te belirlenen konsantrasyon kullanın) supernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın (numuneyi işlerken içselleştirilmesi önlemek için). Buz üzerinde 30 dakika kuluçkalayın. 4 ° C'de adım 2,4-2,5 ve mağaza örnekleri izleyin.
    3. 450 x g'de 3 dakika boyunca 4 ° C 'de '30 dakika' örnekleri, santrifüj tüpleri için. 200 ul PBS% 2 BSA içeren süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. 37 ° C'de 30 dakika kuluçkalayın. 4 ° C'de adım 2,4-2,5 ve mağaza örnekleri izleyin.
      Not: Sodyum azid kontrolü için: kullanımlar PBS, 37 ° C'de 30 dakika inkübasyon için 2% BSA ve% 0.1 sodyum azid ile takviye edilmiştir.
    4. '3 için0 dakika + stv 'numuneleri 450 x g'de 3 dakika boyunca 4 ° C'de tüpler dönerler. 200 ul PBS% 2 BSA içeren süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. 37 ° C'de 30 dakika kuluçkalayın. Daha sonra, 450 x g'de 3 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj tüpleri. PBS% 2 BSA ve% 0,1 sodyum azit içeren seyreltilmiş 50 ul STV (bölüm 3'te belirlenen konsantrasyon kullanın) supernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın (numuneyi işlerken içselleştirilmesi önlemek için). Buz üzerinde 30 dakika kuluçkalayın. 4 ° C'de adım 2,4-2,5 ve mağaza örnekleri izleyin.
      Not: Sodyum azid kontrolü için: kullanımlar PBS, 37 ° C'de 30 dakika inkübasyon için 2% BSA ve% 0.1 sodyum azid ile takviye edilmiştir.
  7. Adımları 2,6-2,8 izleyin ve flow sitometri örnekleri analiz. Her bir numunedeki Cy3-pozitif hücrelerin yüzdesi belirlenir.
  8. Yüzde ekli virüs ve içselleştirilmiş virüs nispi miktarını hesaplayın.
    1. Ekli virüs miktarını hesaplamak için, Cy3 positi yüzdesini kullanıngeçirilen hücreler ya da Cy3 sinyali ortalama floresan yoğunluğu ettik. Karşılaştırma için, 100% (Şekil 4B) muamele edilmemiş hücreler ayarlayın.
      Not: bağlı virüs yüzdesi "0 min" numune tarafından tarif edilmektedir.
    2. Içselleştirilmiş virüs miktarını hesaplamak için, "30 dakika" örnek (Şekil 5B) ile "30 dakika + STV" örnek oranı alır.
      Not: Yukarıda sözü edildiği gibi, Cy3 pozitif kapılanmış hücrelerin veya Cy3 sinyali ortalama floresan yoğunluğu yüzdesi kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dört farklı deneysel koşullar açıklayan bir çizgi, Şekil 1 'de gösterilen bir temsili örneğin sonuçları Şekil 2'de gösterildiği gibi, -. 5. "0 dak" örnek olarak, biyotinile virüsü soğuk bağlanır STV- Cy3 boyama ile görselleştirilebilir hedef hücrelere (Şekil 1 ve 2). ("0 dakika + STV" örnek olarak) bir bloke etme adımı uygulandığında, hücre yüzeyinde virüs artık STV- Cy3 boyama ile saptanabilir. Bunun bir sonucu olarak, "0 dakika + STV" numunede sinyal yoğunluğu güçlü (Şekil 1 ve 2) "0 dak" örnek ile karşılaştırıldığında azalır. 37 ° C sıcaklığın arttırılmasıyla üzerine bağlanmış virüs hücreleri ("30 dak" örnek) içine alınır. İçselleşmiş virüs ve # sinyal yoğunluğunda daha az dramatik bir düşüş ile sonuçlanır işaretlenmemiş STV blokajdan karşı hassas değildir8220, hiçbir STV bloke tatbik edildiği 30 dakika "örnek 30 dakika + STV" göre örnekler "(Şekil 1 ve 2).

Kontroller olarak, sahte enfeksiyon, UA tedavi ve SA ıslahı. 4. Sahte enfeksiyonlu hücreler deney için zemin sinyali yoğunluk vermek için ve negatif kontrol olarak görev bölümde açıklanan tüm deneysel şartlarda 3 görüntüler Cy3-pozitif hücrelerin yüzdelerini Şekil Virüs eki (Şekil 4). Virüs bağlanması için bir ek kontrol bakteriyel olarak salgılanan NA tedavisidir. NA, hücre yüzeyi üzerinde glikoproteinlerin sialik asit, IAV bağlanması için reseptörü ortadan kaldırır ve böylece hücreler 17 hedef virüs bağlanmasını azaltır. Şekil 4'te gösterildiği gibi, NA ile tretman, tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla yaklaşık% 90 oranında IAV eki ortadan kaldırır. Içselleştirilmesi ile ilgili olarak, biz kontrol olarak SA kullanılır. SA tr eatment derhal böylece bu endositoz 13 enerji tüketen süreçleri inhibe hücresel ATP seviyelerinin neden olmaktadır. Sırasında ve virüs parçacıkları enfekte inhibe içselleştirme sonra SA ile hücrelerin inkübasyonu. (Şekil 5'de gösterilen) içsel virüs nispi miktarı, işlenmemiş hücrelerde 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilerek 45 yaklaşık% 10 ile% yükseltildi. Ancak SA işlendikten sonra göreli içsel virüs yüzdesi hem de% 15 civarında, 0 İnkubasyona tâbi tutulan hücreler, 37 ° C'de 30 dakika idi. Bu gerçekten, SA hücrelerine viral partiküllerin etkin alımını azaltır gösterir.

figür 1
Eki / içselleştirilmesi tahlil ilkesini açıklayan Şekil testinin 1. İlke. Karikatür.= "_ blank"> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
IAV eki ve içselleştirilmesi için Şekil 2. Temsilcisi sonucu. Tedavi edilmeyen hücreler için Cy3 sinyalin şiddetini gösteren (A) Histogram. Gösterildiği, "0 dk + STV", "30 dakika" ve "30 dakika + STV" örnek "0 dak" dir. A. Cy3-pozitif hücrelerin (B) Yüzde bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Kontrolleri dahil olmak üzere eki ve içselleştirilmesi için 3. Temsilcisi sonucu Şekil. Rong> belirtilen tedavisini takiben Cy3-pozitif A549 hücrelerinin yüzdesi. Vardır Gösterildi mock-enfekte tedavi edilmezse, NA-tedavi ve hücreleri SA-tedavi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Nöraminidazına virüs eki 4. inhibisyonu Şekil. (A) Histogram "0 dak" örneklerin Cy3 sinyal yoğunluğu gösteren. Mock-enfekte ve NA ile tedavi hücreleri (kırmızı ve turuncu sırasıyla): Tedavi edilmemiş (mavi) hücreleri ve iki kontrol numuneleri Görüntülenen vardır. Gösterilen A. Cy3-pozitif hücrelerin (B) oranı, sahte muamele edilmemiş ve "0 dak" örnek hücreleri NA-muamele edilmektedir. Tedavi edilmeyen hücreler için değer% 100'e ayarlandı.com / files / ftp_upload / 53372 / 53372fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil sodyumazid (SA) virüs içselleştirme 5. engellenmesi. (A) Histogram "30 dakika" nin Cy3 sinyal yoğunluğu gösteren ve "30 dakika + STV" Tedavi edilmeyen örnekler (kırmızı ve turuncu sırasıyla) ve SA- hücreler (mavi ve sırasıyla yeşil) tedavi. 0 ve 30 dakika sonra tedavi edilmezse ve SA-tedavili hücrelerde göreli içselleştirilmiş virüsün (B) Yüzde. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bizim protokol akış sitometri virüs eki ve içselleştirilmesi ölçmek için kolay bir yol açıklar. Bu, virüs benzeri partiküller (VLP'ler) kullanımı ile karşılaştırıldığında bu daha yakından taklit virüsü enfeksiyonlarının etiketli yabanıl tür virüsün kullanılmasını mümkün kılar. Protokol IAV bağlanmasını ve içselleşmesini ölçmek için optimize edilmiş olsa da kolayca diğer virüsler için adapte edilebilir. Akış sitometri okuma için kullanılan ek olarak, ko-renklendirmeler havaalanı bir proteinin demonte ya da aşırı dışavurumu, aşağıdaki sentezleme seviyelerini ölçmek için bir protokol, örneğin ilave edilebilir. Bu durumda, deney bireysel ihtiyaçlara bağlı olarak, iletişim kuralı modifikasyonları sağlar. Not, tahlil de kinetik bilgiler zamanla virüs içselleştirilmesi ölçmek ve elde etmek için zaman noktalarında bir dizi yapılabilir. Deney bilinmiyor içselleştirme kinetikleri farklı bir virüs için adapte edilmesi halinde bu durum özellikle önemli olabilir.

However, bu algılama pencere viral replikasyon olmaması eki ya da interne farklılıklar doğrusal bir ölçek üzerinde ortaya gibi nispeten küçük olduğuna dikkat edilmelidir. Güvenini artırmak için ve biz kontrolleri dahil olmak üzere tavsiye gürültüyü azaltmak için (örneğin kontroller yukarıda tarif) ve çeşitli çoğaltır. Gösterilen sonuçlar, temsili bir deney tasvir ederken, farklı deneyde iyi bir uyum görülmüştür: örneğin, bağlanma için, Cy3-pozitif hücrelerin yüzdesi% 60-80 arasında değişmektedir; içselleştirilmiş virüs biz% 40-60 arasında değişen değerler elde edilmiştir.

Deney başlamadan önce, bu tür STV, STV- Cy3 ve biyotinile edilmiş virüs miktarı olarak kullanılan reaktiflerin çalışma konsantrasyonlarda titre etmek önemlidir. Reaktifler ve kuluçka süreleri miktarı, kullanılan bir hücre hattı ve virüs suşuna bağlı olarak değişebilir lütfen unutmayın. Saptama penceresi virüs attachmen pozitif hücrelerin yüzdesi en üst düzeye çıkarmakt, 0 dakika + STV "örnek" mümkün olduğu kadar düşük ve (biyotinlenmiş kullanılan virüs miktarına bağlı olarak) örnek "" 0 dakika karıştırıldı ve "30 dakika içinde mümkün olduğu kadar yüksek olmalıdır (STV miktarına bağlı olarak kullanılan ). Buna ek olarak, ses santrifüj sırasında 4 ° C 'de hücreler tutarak ve buz gibi soğuk PBS ile yıkanarak azaltılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Bu çalışma SST İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_135278) bir hibe ile desteklenmiştir. MOP AXA Araştırma Fonu doktora hibe faydalanıcısı olduğu. Biz Şekil 1 tasarımı ile yardım için Patricia Nigg teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 41966-052
FBS Life Technologies 10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163
PBS Life Technologies 14190-169  
BSA VWR Calbiochem 126579
HEPES Life Technologies 15630-100
D-Sucrose Fluka 84100
TRIS Biosolve BV 20092391
EDTA Sigma-Aldrich 3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit Fisher Scientific W9971E 
Bio Rad Protein Bio Assay Bio Rad 500-0006
deepwell tubes (1.2 ml microtubes) Milian 82 00 001
PFA  Lucerna chem  Electron microscopy sciences 15710
ultracentrifuge tubes Hemotec HmbH 253070
Triton X-100 Fluka 93420
STV-Cy3 Life Technologies 43-4315
STV Life Technologies 43-4302
sodium azide Fluka 71290
bacterial neuraminidase/sialidase Sigma-Aldrich N6514-1UN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
  2. Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  3. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
  4. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
  5. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
  6. Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
  7. Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
  8. Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
  9. Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
  10. Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
  11. Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
  12. Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
  13. Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
  14. Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  16. Macey, M. G. Flow Cytometry Principles and Applications. Macey, M. G. Humana Press. (2007).
  17. Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics