שבץ בחומר הלבן צדדי דגם Murine של קורטיקליים לחקר ניוון אקסונלית ולבן Matter לנוירוביולוגיה

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nunez, S., Doroudchi, M. M., Gleichman, A. J., Ng, K. L., Llorente, I. L., Sozmen, E. G., Carmichael, S. T., Hinman, J. D. A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology. J. Vis. Exp. (109), e53404, doi:10.3791/53404 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

שבץ המשפיעים חשבונות בחומר לבנים של עד 25% של מצגות שבץ קליניות, מתרחש בשקט בשיעורים שעשויות להיות 5-10 לקפל יותר, ותורם רב להתפתחות של דמנציה וסקולרית. דגמים מעטה לשבץ חומר לבן מוקדים להתקיים זה חוסר הדגמים המתאימים עכב את הבנת מנגנוני הנוירולוגית המעורבת בתגובת פציעה ותיקון לאחר סוג זה של שבץ. המגבלה העיקרית של מודלי שבץ קורטיקליים אחרים היא שהם לא focally להגביל את האוטם אל החומר הלבן או אומתו בעיקר במינים שאינם בעכברים. זה מגביל את היכולת ליישם המגוון הרחב של כלי מחקר בעכברים ללמוד לנוירוביולוגיה לשבץ חומר לבן. כאן אנו מציגים מתודולוגיה לייצור האמין של שבץ מוחה מוקדים בעניין בעכברים לבן באמצעות זריקה מקומית של מעכב eNOS בלתי הפיך. כמו כן, אנו מציגים כמה וריאציות על הפרוטוקול הכללי כולל שני stereotactic ייחודיוריאציות, מעקב עצבי מדרדר, כמו גם תיוג רקמות טרי לנתיחה המרחיב את היישומים האפשריים מאוד של טכניקה זו. וריאציות אלו מאפשרות גישות מרובות כדי לנתח את השפעות הנוירולוגית של צורה נפוצה, אלתרה זה של שבץ.

Protocol

השימוש בבעלי חיים בפרוטוקול זה בוצע בהתאם לנהלים שאושרו על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים קליפורניה בלוס אנג'לס ועדת שימוש.

הערה: התחל על ידי זיהוי אוכלוסיית murine היעד. במחקרים קודמים, wild-type זכרו רק עכברי C57 / BL6 שמשו, אולם עכברים מהונדסים או נוק אאוט שונים יכולים לשמש גם. שים לב קואורדינטות stereotactic מבוססים על האנטומיה C57 / BL6. מומלץ לכל משתמש בתחילה לאמת לוקליזציה של שבץ חומר לבן.

1. אינדוקציה שבץ החומר הלבן - גישת זוויתי המדיאלי

  1. בגין על ידי הכנת פיפטה זכוכית משך באמצעות צינור נימי 0.5 מ"מ כך בקוטר דיסטלי הוא בין 15-25 מיקרומטר 11.
  2. הכן aliquot סטרילי 10 μl של L-נ.י.ו. (N (5) - (1) -iminoethyl-L-ornithine HCl) ב 27.4 מ"ג / מ"ל ​​(130 מיקרומטר) מלח רגיל 0.9% סטרילי.
  3. מילוי מראש פיפטה זכוכית המשךעם קטן נפח של L-נ.י.ו. (2-5 μl) על ידי הדבקת פיפטה זכוכית צינורות לחבר לקו ואקום. הנח את פיפטה שטוח על גבי ספסל והכנס סוף נכנס הפתרון L-נ.י.ו..
    1. החלתי את הוואקום עד לפחות 2 מ"מ של חלק 0.5 מ"מ של פיפטה מתמלא. כבה את הוואקום למשוך את פיפטה. מניח אותו בצד עד שלב 1.12.
  4. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה ולגרום הרדמה של העכבר באמצעות isoflurane 32% תקן זרמו מאדה (5 L / min בשאיפה עם 5 חמצן L / min ו -0.5 ליטר / דקה N 2) 1 דקות או עד anesthesized עמוק. העברת העכבר מנגנון stereotactic מצויד מיקרוסקופ stereotactic. תחזוקה לספק הרדמה באמצעות 32% isoflurane זרמו מאדה (2 ליטר / דקה בשאיפה עם 5 חמצן L / min ו -0.5 ליטר / דקה N 2) וכן חרטומו. בדוק עומק ההרדמה עם קמצוץ הבוהן.
  5. התאם את הזרוע הזריק ל -36 °.
  6. אפיXA משך בעל פיפטה זכוכית אל הקצה הדיסטלי של מערכת הזרקה בלחץ נמוך נפח וצרף אותו בזרוע הזרקה של ההתקנה stereotactic.
  7. מעיל הדובדבן החיה הרדים עם וזלין משחה דמעה מלאכותית מקום מעל שתי העיניים. כן שדה כירורגי סטרילי על ידי צבת וילון סטרילי מעל הראש של החיה עם פתח 5-10 סנטימטר מעל הראש. כן משטח כירורגית aspetic ידי גילוח הפרווה המכסה את הגולגולת. נקה את הקרקפת בבטאדין לסירוגין ו מטליות אלכוהול 70%.
  8. לעשות חתך בקרקפת קו האמצע 1.5 ס"מ עם מספריים בסדר סטרילי לחשוף את פני הגולגולת. לייבש את הגולגולת עם מקלון צמר גפן סטרילי באמצעות מיקרוסקופ stereotactic בהגדלה 1-3X, להסיר את כל רקמת periosteal שמעליה באמצעות כלי הנקודות מיקרו סטרילי.
  9. סמן את גבחת כנקודת התייחסות באמצעות סמן נקודה בסדר.
  10. לקדוח craniotomy 2 מ"מ ellipitical באמצעות מקדח כירורגית Stip בסדר סטרילי0; החל בדיעבד על גבחת והארכת anteriorly רק השמאלי של קו האמצע. סר שבר עצם מכסת רקמות רכות כך בקליפת המוח ניתן דמיינה.
  11. שמור בתחום כירורגית קליפת המוח משטח לח ידי החלת טיפות לסירוגין של תמיסת מלח סטרילית.
  12. להטביע טפטפת זכוכית משך לזרוע מזרק של המנגנון stereotactic. יישר את הקצה הדיסטלי של פיפטה עם גבחת ואפס את הקואורדינטות stereotactic.
  13. לקדם את פיפטה הקדמי / האחורי (A / P) המדיאלי / לרוחב (M / L) קואורדינטות מופיע בלוח 1 הראשון.
  14. לקדם את פיפטה אל פני שטח קליפת המוח ואפס מדידת גב / גחון (D / V).
  15. לאט להעביר את פיפטה לתוך המוח עד שמגיעים D / V הראשון לתאם בטבלה 1.
  16. באמצעות מערכת הזרקה בלחץ נמוך נפח נקבע על 20 psi במשך 20 פולסים msec, להזריק 100 nl של L-נ.י.ו. לתוך המוח ולחכות 5 דקות כדי למנוע ריפלוקסאת מסלול פיפטה.
    1. השתמש reticle מכויל העינית של המיקרוסקופ stereotactic וכן הגדלה של 3X.
    2. בהתאם לכך, לעקור סך של 0.100 מ"מ 3 (0.5 אורך מ"מ טפטף בקוטר 0.5 מ"מ, מקביל ל -100 NL) מן פיפטה זכוכית משך עבור כל קבוצה של קואורדינטות. באמצעות reticule, למדוד ולתקנן שכן כל להגדיר משתנה בהתאם הגדלה וקשקשת בשימוש.
    3. למדידת נפח מדויקת במהלך כל זריקה, מתקרב פיפטה זוויתי עם מיקרוסקופ מהצד כך המניסקוס נוזל-האוויר יש נוף sagittal. המניסקוס אמור להופיע באותו מישור המוקד של שני הקיר הפנימי והחיצוני של פיפטה.
  17. לאט למשוך את פיפטה וחזר על צעדי 1.13-1.16.3 על הסט השני ושלישי של קואורדינטות מופיעות בלוח 1.
  18. לאחר הזריקה האחרונה, להסיר את פיפטה ולמקם שעוות עצם מספיק כדי למלא את אתר craniotomy. אpproximate קצות הפצע בקרקפת להיקשר עם דבק עורי.
  19. להזריק 0.1 מיליליטר של 0.5% Marcaine לשולי הפצע באמצעות מחט 30 G סטרילי כדי למנוע למנוע כאב מקומי המשויכים חתך בקרקפת.
  20. מחזירים את החיה לאנטיביוטיקה שלאחר הניתוח דיור ואספקה ​​(0.48 מ"ג / מ"ל ​​trimethoprim-sulfamethoxazole, או 0.5 מ"ג / מ"ל ​​levofloxacin) במי השתייה במשך 5 ימים.

2. אינדוקצית שבץ חומר לבן - גישת זוויתי אחורית

  1. בצע שלבים 1.1-1.12 כפי בפרוטוקול הגישה זוויתי המדיאלי, למעט להתאים את הזרוע ההזרקה של ההתקנה stereotactic ל -45 מעלות בכיוון הקדמי אל האחורי.
  2. לקדם את פיפטה A / P ו- M / L קואורדינטות תחילה סיפקה בטבלה 2.
  3. שלבים נותרים שלמים 1.14-1.20 כמו בפרוטוקול הגישה זוויתי לרוחב.

3. תיוג המדרדר עצבי

  1. כן סטרילית 10aliquot μl של L-נ.י.ו. ב 54.8 מ"ג / מ"ל ​​סליין 0.9% נורמלי.
  2. כן aliquot סטרילי של 20% Fluororuby (או 20% אמינים dextran biotinylated או 2% Fluorogold) סליין 0.9% נורמלים.
  3. לדלל יחד 1: 1 עבור ריכוזי הסופי של 27.4 מ"ג / מ"ל ​​L-נ.י.ו. ו -10% Fluororuby.
  4. בצעו את פרוטוקול שבץ כנ"ל בצעדים 1.3-1.23.
  5. דמיינו את נותב ניאון מקורי בסעיף הרקמה על ידי קיבעון זלוף, cryosectioning מיקרוסקופ כפי שתואר לעיל 8.

עיבוד רקמות 4. Immunofluorescence

  1. בהפרש שלאחר שבץ מתאים הנעים בין 3 שעות ל -14 ימים לאחר שבץ, להרדים עכברים באמצעות מנת יתר isoflurane או מקומיים IACUC אושרו הליך.
  2. פתח את חלל בית החזה באמצעות מספריים בזווית וכנס מחט פרפר 23 G לתוך החדר השמאלי.
  3. מניח חתך קטן העלייה הימנית באמצעות מספריים בסדר לאפשר מסלול יצוא של נוזל זלוף.
  4. Transcardially perfuse עם 30-40 מ"ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו קר ואחריו 30-40 מ"ל של paraformaldehyde 4% קר בשיעור של 10 מ"ל / דק 'ב RT.
  5. לערוף את העכבר להסיר את המוח באמצעות מספריים סטרילי כדי לפתוח את הגולגולת בדיעבד ולאחר מכן הסר בעדינות את הגולגולת שמעליה עם מרית, מניחים את המוח לתוך 4% קר PFA למשך 24 שעות, ולאחר מכן להעביר סוכרוז 30% ב PBS במשך 48 שעות .
  6. כן ארבעים סעיפים צפים מיקרון באמצעות cryostat ולבצע עיבוד נוגדנים כפי שתואר לעיל 6-8. במחקר זה, השתמש הנוגדנים הבאים: ארנב 200 נגד neurofilament (דילול 1: 500); ארנב-vimentin אנטי (1: 500); עז נגד GFAP (1: 500); ארנב נגד תייבא-1 (1: 1,000).

עיבוד רקמות 5. חלבון או ניתוח RNA

  1. בהפרש שלאחר שבץ מתאים הנעים בין 3 שעות ל -14 ימים לאחר שבץ, להרדים באמצעות מנת יתר isoflurane או מקומיים IACUC אושר הליך.
  2. לערוף אתעכבר ולהסיר את המוח באמצעות מספריים סטרילי כדי לפתוח את הגולגולת בדיעבד ולאחר מכן הסר בעדינות את הגולגולת שמעליה עם מרית.
  3. הכנס מרית 4 מ"מ סטרילי בקדמת המוח לנתק את הנורה חוש הריח ואת עצבי הראייה. הרם בעדינות את המוח מתוך calvarium ומניחים למאגר לנתיחה קר כקרח (תמיסת מלח מאוזן של 1x האנק, 25 מ"מ HEPES-KOH, pH 7.4, 35 גלוקוז מ"מ, 4 מ"מ סודיום ביקרבונט, ו 0.01 מ"ג / מ"ל ​​cyclohexamide).
  4. באמצעות בלוק מוח סכיני גילוח חדשים סטרילי, להכין 2-3 לוחות מ"מ המכילים שבץ ומקום למאגר לנתיחה קר.
  5. תחת מיקרוסקופ לנתח, לזהות את הקורטקס המוטורי הבסיסי חומר לבן בחצי הכדור מוזרק. במרווחים שלאחר בתנועה ארוכה באזור ניתן לזהות ויזואלית על ידי נימק מוקדים וחיוורון המיאלין.
    הערה: במרווחי מוקדם שלאחר שבץ, הזרקה של L-נ.י.ו. מעורבב עם 1 μl של 10% מהיר גרין יכול לאפשר זיהוי חזותי של שבץ (
  6. תחת הדרכתו של מיקרוסקופ לנתח באמצעות אזמל טרי, בזהירות לנתח את האזור של חומר לבן המכיל את השבץ, המזוהה באמצעות תיוג ירוק מהיר או אובדן רקמות. סר הקורטקס שמעליה בסטריאטום בסיסית כפי רצוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעזרת המודל שהוצג, קליפת הסנסורית הבסיסית forelimb חומר הלבן יכולה להיות ממוקדת באופן מהימן. מודל שבץ כימי מושרה זו מפיק אובדן axonal ו המיאלין מוקדי, astrocytosis, ו microgliosis (איור 1), כפי שנראה בדרך כלל אוטמי אַגמִימִי אדם. באמצעות שלוש זריקות, מודל שימושי קליני הוא הקים עם ליקוי מוקדם על מטלות מוטוריות forelimb 7 וחלק קטן אך משמעותי של חוויות רקמת מוח איסכמיה כי immunohistochemical, immunofluorescent, וטכניקות ביוכימיים הן ריאליות ואמינות ברמה הכמותית. בנקודות זמן מוקדם (HR) לאחר אינדוקצית שבץ, שינויים בארגון מולקולרי axonal ניתן לאתר (איור 2). ב -7 ימים, השבץ משלים ההתבגרות שלה לאזור מוגבל של אובדן axonal (איור 1 א). בידיים שלנו, שיטה זו מייצרת approxima הנגע החומר הלבן מוקדיtely 800 מיקרומטר קוטר אופקי והארכת כ 1 מ"מ לאורך ציר אחורי הקדמי של כפיס המוח. ב -7 ימים, בגודל האוטם הכולל הממוצע הוא בערך 0.200 מ"מ 3 ו תהיה צורה אליפטית. ראינו השתנות כ -10% בגודל שבץ הוא בין חיות ובין חלקים, תלוי היכן האליפסה בסעיף מתרחש. צמיחה נוספת את גודל האוטם נדיר לראות מעבר 7 ימים.

התוספת של הזרקת סימולטני של תוצאות אמינות dextran תיוג עצבי משמעותי גופי תא עצביים שכבת 5 ו שכבת 6 שיש אקסונים מקרינים דרך האזור של שבץ (איור 3). נוירונים בקליפת המוח שמעליה שאינם שנפגעו ההיבטים דמה של ההליך (מעבר מחט דקה), עוברים נזק axonal דיסטלי ויכול להיות מזוהה על ידי הכללת נותב עם הכנה L-נ.י.ו.. גישה זו הייתה בשימוש ד להפגין שינויים דינמיים במגזר הראשוני האקסון לאחר שבץ 8.

בעוד הגודל הקטן של האזור של רקמות שנפגעו השבץ מגביל את השימוש בטכניקות נפוצות אחרות כגון כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium (TTC) מכתים, באזור שבץ החומר הלבן יכול להיות מזוהה רקמה טריה. התוספת של צבע נפוץ כגון גרין המהיר מייצרת אזור מזוהה של רקמה שיכולה להיות גזור תחת מיקרוסקופ לנתח (איור 4). לאחר גזור רקמה זו יכולה לשמש לניתוח חלבונים עם כתם או immunoprecipitation המערבי, או עבור בידוד RNA וניתוח (איור 4C). באמצעות שימוש קווי עכבר שונים מהונדס, מגוון של גישות חדשניות שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את לנוירוביולוגיה לאחר שבץ החומר הלבן מוקדי כולל מחקרים מיפוי גורל התא microdissection ללכוד לייזר (איור 4C).

אוהל "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 1
איור 1:. שבץ בחומר הלבן מיקוד שימוש שניהם המדיאלי ואת האחורי גישות זוויתי תיוג Immunofluorescent עבור neurofilaments (A, אדום) מדגים את מידת אובדן axonal שבעה ימים לאחר שבץ בגישת המדיאלי. השימוש בגישת הזווית האחורית, נגע שבץ חומר הלבן ממוקד רק מעל החדר לרוחב (B, C) ​​ומראה microglial האינטנסיבי (B) תגובתיות astrocytic (C). שני astrocyte סמנים סיבי ביניים, vimentin (אדום) וחלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP, ירוק), שניהם לגלות שינויים במורפולוגיה של החומר הלבן (סיבי) האסטרוציטים לאחר שבץ (C). ברי סולם = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גדול Verשיאון של נתון זה.

איור 2
איור 2:. שבץ בחומר הלבן אלטרס אקסונלית Microdomain ארגון בתוך 3 שעות של אינדוקציה משנה שבץ לבן, ארגון microdomain אקסונלית בצומת, בסימן spectrin בטא-IV (אדום) ובבית paranode, בסימן חלבון הקשורים contactin (caspr, ירוקים), מופר (חיצים, B). אקסונים חומר לבנים נגדיים להראות קטרים ​​קבועים, paranodal, וארגון juxtaparanodal (A ו- C) ואילו החומר הלבן ipsilateral תערוכות התארכות קטרים ​​ו paranodal מאפיינת אקסונים עם קשר axoglial אבד (B ו- D). סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר.

איור 3
איור 3: המדרדר העצבי Labeling עם שבץ בחומר הלבן מזהה נוירונים בודדים עם נזק axonal. Co-הזרקת אמין dextran ניאון (אדום) בעת אינדוקציה שבץ מאפשר זיהוי של נוירונים בודדים עם אקסונים שנפגעו משבץ. רוב התיוג מתרחש אקסונים בתוך השכבה 5 ו -6 נוירונים בקורטקס הסנסורי ראשוני שמעל השבץ. תמונה מייצגת 7 ימים לאחר האירוע המוחי. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4:. Microdissection של נגעים שבץ חומר לבן לשימוש ב ביוכימיים תעתיק מבחני Co-זריקה של גרין מהיר בעת אינדוקציה שבץ מאפשר זיהוי מוקדם של האזור שנפגע 24 שע '(א', הפאנל העליון). Immunoblottiניתן לבצע ng עבור חלבונים ספציפיים אקסונלית להפגין הפחתות באזור לשבץ לבד (A, פנל תחתון). בנקודות זמן רבות יותר, באזור של שבץ חומר לבן (פנל משמאל) יכול להיות גזור focally ללא תיוג ספציפי (B). פנל עליון ימני מראה אזור של חומר לבן לאחר הסרה באזור גזור בעוד הפנל הימני התחתון מראה את האזור הגזור של חומר לבן המכיל את השבץ (B). PCR עבור גני oligodendrocyte ספציפי באמצעות RNA שבודד אזורים הגזורים מן החומר הלבן (C). IL = ipsilateral; CL = נגדי; c = שליטה; s = שבץ.

זריקה Anterior / אחורי המדיאלי / לרוחב גב / גחון
0.22 0.22 -2.10
2 0.70 0.15 -2.16
3 1.21 0.15 -2.18

טבלה 1: קואורדינטות stereotactic עבור גישה זוויתי לרוחב (במ"מ).

זריקה Anterior / אחורי המדיאלי / לרוחב גב / גחון
-0.75 -0.96 -2.10
2 -1.00 -0.96 -2.05
3 -1.25 -0.96 -2.00

טבלה 2: קואורדינטות stereotactic עבור גישה זוויתי אחורית (במ"מ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מספר הדגמים הקודמים של שבץ קורטיקליים תואר כולל זריקות מוקד של אנדותלין -1 לתוך הקפסולה הפנימית, חומר לבן קורטיקליים בסטריאטום ב 6,15 עכברוש 12-14 והעכבר. מודלים מאוחרים יותר של משייכות מוקדים קטנות נצלו הזרקת microemboli כולסטרול בעורק התרדמה 16 ו חסימת photothrombotic של עורקיק חודר יחיד 17. כל המודלים הללו יתרונות וחסרונות 5. המודל המתואר כיום מייצר נגע כי יש מספר מאפייני מחקים אוטמים אַגמִימִי אדם כוללים מומים אקסונלית ואובדן, שפלת המיאלין, גרעין נימקי מוקדים וגירעון קליני כי הוא מזערי ומדגים התאוששות מהירה למדי תלוי בגיל 7. מיקוד חומר לבן murine מאפשר מגוון רחב של מניפולציות גנטיות שיכול לתמוך מחקרים מכניסטית.

הקריטימדרגות הפרוטוקול כוללות ניצול קואורדינטות stereotactic מדויקות. בגלל חומר לבן בעכברים הוא קטן בגודלו משתנה בין זן למתח, הגרסה של קואורדינטות stereotactic עשויה להיות נחוצה בהתאם לגיל ומתח של עכבר בשימוש. שליטה על עוצמת הקול של הזרקה חשובה גם זו קשורה ישירות לגודל האוטם. זריקות גדולות יותר תפקנה משייכות גדולות יותר לפלוש אל הקורטקס שמעליה בסטריאטום בסיסית.

הזרקת מרחק של ET-1 באמצעות הגישה המתוארת כאן דווחה אבל אנדותלין -1 הוצג להיות השפעות paracrine ישירות על בידול oligodendrocyte והתבגרות 10,18 בלבול בחקר ביולוגית חומר לבן שלאחר שבץ. לעומת זאת, לתאי אנדותל מטרות גישת L-נ.י.ו. לבד תוך הפקת נגע זהה ומונעים תופעות paracrine מבלבלות על התאים מעורבים בתגובת פציעה. L-נ.י.ו. אינו ציטוטוקסיות ישירות לבין תמיכה בבחירהמנת טד נקבעה על ידי ניסויי גברת מינון ראשוניים (מידע לא מוצג). הגישה זוויתי האחורית פותחה אקסונים לערער ליתר דיוק מן האזור המוטורי עיקרי בייצור הגירעון התנהגותי המקסימאלי שניתן לייחס לפגיעה בחומר לבנה. הגישה זוויתי המדיאלי גם נזקים אקסונים הקורטקס המוטורי אך מרחיב יותר רוחבית כוללת אקסונים שבבסיס בקליפה המוטורית העיקרי.

נגע השבץ מרחיב למדי במהירות מעל 24 השעות הראשונות. על ידי שבעה ימים, את גודל האוטם הוא מקסימלית ואנחנו לא נצפינו צמיחת נגע משמעותית מעבר זמן. אירועים הסלולר נוספים וניוון אקסונלית יתרחשו מעבר לשלב הראשוני הזה, אבל את הגודל האוטם כפי שהיא נמדדת על ידי הליבה נמקי לא ישתנה באופן משמעותי בהעדר כל התערבות.

שיתוף הזרקת קליעים נותבים neuroanatomical בעת שבץ מזהה נוירונים חווה פציעה axonal איסכמי. שימוש באחת התרופהial או גישת זווית אחורית, גופי התא העצביים עם תחזיות axonal פגומות להישאר ללא פגע. זה יוצר מודל שימושי כדי לחקור את ההשפעה של axotomy איסכמי על נוירונים במערכת עצבים מרכזיים. יש לנו מנוצלים קליעים נותבים מדרדרים בעיקר כולל אמין dextran ו fluorogold, אשר הוא להראות ספיגה מצוינת על ידי אקסונים פגועי שבץ. על ידי העסקת המגוון הרחב של מהונדס עקום החוצה קווי עכבר, משתמשים של פרוטוקול זה יכול לחקור את התפקיד הספציפי של גנים עצביים המעורבים בתגובת פציעת חומר לבנה שבץ ותיקון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אף לא אחד

Acknowledgements

SN ו MDD קיבל תמיכה מ- NIH K08 NS083740 ומחלקת UCLA לנוירולוגיה. AJG מודה תמיכה על ידי ד"ר מרים ושלדון אדלסון למחקר רפואי וקרן לארי L. Hillblom. Kln בתודה מודה תמיכה ממרכז שבץ איגוד הלב האמריקני 14BFSC17760005 אס"א-Bugher. חולה, EGS ו STC נתמכו על ידי NIH R01 NS071481. JDH מודה תמיכה מ- NIH K08 NS083740.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride Calbiochem 400600-20MG
Isoflurane Phoenix Pharmaceutical, Inc. NDC 57319-559-06
Capillary tubes World Precision Instruments 50-821-807
Picospritzer Parker Instrumentation Picospritzer II
Stereotactic setup Kent Scientific KSC51725
Pipette puller KOPF Model 720
Stereomicroscope SZ51 Olympus 88-124
Fine scissors Fine Scientific Tools 14084-08
Forceps Harvard Apparatus PY2 72-8547
Curved Forceps Harvard Apparatus PY2 72-8598
Blunt dissection tool Fine Scientific Tools 10066-15
Drill Dremel 8220-1/28
Drill bits Fine Scientific Tools 19007-05
Vetbond 3M 1469SB 
Marcaine HOSPIRA NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole STI Pharmacy NDC 54879-007-16
Fluororuby Fluorochrome Inc 30 mg
Paraformaldehyde Fisher O4042-500
Sucrose Fisher BP220-10
Cryostat Leica CM3050 S 14047033518
Glass slides Fisher 12-544-7
Fast Green  Sigma F7252-5G
Dissection microscope Nikon SMZ1500
23 G butterfly needle Fisher 14-840-35
10x Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14065056
1 M HEPES-KOH, pH 7.4 Affymetrix 16924
D-Glucose Sigma G8270
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Cyclohexamide Sigma 01810

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129, 28-292 (2014).
  2. Saini, M., et al. Silent stroke: not listened to rather than silent. Stroke. 43, 3102-3104 (2012).
  3. Koton, S., et al. Burden and outcome of prevalent ischemic brain disease in a national acute stroke registry. Stroke. 44, 3293-3297 (2013).
  4. Jiwa, N. S., Garrard, P., Hainsworth, A. H. Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment: a systematic review. J Neurochem. 115, 814-828 (2010).
  5. Sozmen, E. G., Hinman, J. D., Carmichael, S. T. Models that matter: white matter stroke models. Neurotherapeutics. 9, 349-358 (2012).
  6. Sozmen, E. G., Kolekar, A., Havton, L. A., Carmichael, S. T. A white matter stroke model in the mouse: axonal damage, progenitor responses and MRI correlates. J Neurosci Methods. 180, 261-272 (2009).
  7. Rosenzweig, S., Carmichael, S. T. Age-dependent exacerbation of white matter stroke outcomes: a role for oxidative damage and inflammatory mediators. Stroke. 44, 2579-2586 (2013).
  8. Hinman, J. D., Rasband, M. N., Carmichael, S. T. Remodeling of the axon initial segment after focal cortical and white matter stroke. Stroke. 44, 182-189 (2013).
  9. McCall, T. B., Feelisch, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Identification of N-iminoethyl-L-ornithine as an irreversible inhibitor of nitric oxide synthase in phagocytic cells. Brit j pharmacol. 102, 234-238 (1991).
  10. Gadea, A., Aguirre, A., Haydar, T. F., Gallo, V. Endothelin-1 regulates oligodendrocyte development. J Neurosci. 29, 10047-10062 (2009).
  11. Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. CSH prot. (2006).
  12. Hughes, P. M., et al. Focal lesions in the rat central nervous system induced by endothelin-1. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62, 1276-1286 (2003).
  13. Whitehead, S. N., Hachinski, V. C., Cechetto, D. F. Interaction between a rat model of cerebral ischemia and beta-amyloid toxicity: inflammatory responses. Stroke. 36, 107-112 (2005).
  14. Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat. Behav Brain Res. 169, 206-211 (2006).
  15. Horie, N., et al. Mouse model of focal cerebral ischemia using endothelin-1. J Neurosci Methods. 173, 286-290 (2008).
  16. Wang, M., et al. Cognitive deficits and delayed neuronal loss in a mouse model of multiple microinfarcts. Neuroscience. 32, 17948-17960 (2012).
  17. Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nat Neurosci. 16, 55-63 (2013).
  18. Jung, K. J., et al. The role of endothelin receptor A during myelination of developing oligodendrocytes. J Korean Med Sci. 26, 92-99 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics