A Stroke Versatile modèle murin de Subcortical substance blanche pour l'étude de axonale Degeneration et blanc Matière Neurobiologie

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Nunez, S., Doroudchi, M. M., Gleichman, A. J., Ng, K. L., Llorente, I. L., Sozmen, E. G., Carmichael, S. T., Hinman, J. D. A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology. J. Vis. Exp. (109), e53404, doi:10.3791/53404 (2016).

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Abstract

Stroke affectant les comptes de la substance blanche jusqu'à 25% des présentations d'AVC cliniques, se produit en silence à des taux qui peuvent être 5-10 fois supérieure, et contribue de manière significative au développement de la démence vasculaire. Peu de modèles de focale course de matière blanche existent et ce manque de modèles appropriés a entravé la compréhension des mécanismes neurobiologiques impliqués dans la réponse des blessures et la réparation après ce type d'accident vasculaire cérébral. La principale limitation des autres modèles de course subcorticaux est qu'ils ne focalement restreignent pas l'infarctus à la matière blanche ou ont été principalement validées chez les espèces non-murins. Cela limite la capacité d'appliquer la grande variété d'outils de recherche murins pour étudier la neurobiologie du blanc coup de matière. Nous présentons ici une méthodologie pour la production fiable d'un accident vasculaire cérébral focal dans la matière blanche murin en utilisant une injection locale d'un inhibiteur de eNOS irréversible. Nous présentons également plusieurs variations sur le protocole général dont deux stéréotaxique uniquesvariations, traçage rétrograde neuronale, ainsi que l'étiquetage des tissus frais et dissection qui élargissent considérablement les applications potentielles de cette technique. Ces variations permettent de multiples approches pour analyser les effets neurobiologiques de cette forme commune et peu étudié d'accident vasculaire cérébral.

Protocol

L'utilisation d'animaux dans ce protocole a été effectué conformément aux procédures approuvées par l'Université de Californie à Los Angeles Animal Care et utilisation Comité.

Remarque: Commencez par identifier la population murine cible. Dans des études antérieures, des souris de type sauvage uniquement mâles C57 / BL6 ont été utilisés, toutefois différentes souris transgéniques ou knock-out peuvent également être utilisés. Notez que les coordonnées stéréotaxiques sont basées sur C57 / BL6 anatomie. Il est recommandé que chaque utilisateur d'abord vérifier la localisation de la course à la substance blanche.

Induction de l'AVC 1. White Matter - Medial Approche coudé

  1. Commencer par la préparation d' une pipette en verre tiré en utilisant un tube capillaire de 0,5 mm de telle sorte que le diamètre distal est compris entre 15 à 25 um 11.
  2. Préparer une aliquote stérile 10 ul de L-Nio (N (5) - HCl (1) -iminoethyl-L-ornithine) à 27,4 mg / ml (130 pM) dans stérile à 0,9% de solution saline normale.
  3. Pré-remplir la pipette en verre tiréavec un petit volume de L-Nio (2-5 ul) en fixant la pipette en verre pour tube raccordé à une ligne de vide. Poser le plat de la pipette sur la paillasse et insérez l'extrémité tiré dans la solution de L-Nio.
    1. Appliquer le vide jusqu'à au moins 2 mm de la portion de 0,5 mm de la pipette est remplie. Éteignez l'aspirateur et retirer la pipette. Placez-le de côté jusqu'à l'étape 1.12.
  4. Placer la souris dans une chambre d'induction et d' induire une anesthésie de la souris en utilisant le standard 32% d' isoflurane a coulé à travers un vaporiseur (5 L / min inhalée avec 5 L / min d' oxygène et de 0,5 L / min de N2) pendant 1 minute ou jusqu'à profondément anesthésiés. Transfert de la souris à un appareil stéréotaxique équipé d'un microscope stéréotaxique. Fournir une anesthésie de maintenance en utilisant 32% d' isoflurane coulé à travers un vaporisateur (2 L / min inhalée avec 5 L / min d' oxygène et de 0,5 L / min N2) et un cône de nez. Contrôler la profondeur de l'anesthésie avec une pincée d'orteil.
  5. Régler le bras d'injection à 36 °.
  6. Affixa tiré porte-pipette en verre à l'extrémité distale d'un système d'injection à basse pression de volume et l'attacher au bras d'injection de la configuration stéréotaxique.
  7. Manteau de les moustaches de l'animal anesthésié avec de la gelée de pétrole et lieu artificiel larme pommade sur les deux yeux. Préparer un champ opératoire stérile en plaçant un champ stérile sur la tête de l'animal avec un 5-10 cm ouverture sur la tête. Préparer une surface chirurgicale aseptique en rasant la fourrure recouvrant le crâne. Nettoyer le cuir chevelu avec une alternance de bétadine et 70% des tampons d'alcool.
  8. Faire un 1,5 cm du cuir chevelu midline incision avec des ciseaux fins stériles pour exposer la surface du crâne. Sécher le crâne avec un coton-tige stérile et en utilisant un microscope stéréotaxique à 1-3X grossissement, enlever tout le tissu du périoste recouvrant l'aide d'un outil de point de micro stérile.
  9. Marquer le bregma comme point de référence à l'aide d'un marqueur à pointe fine.
  10. Percez un craniotomie ellipitical 2 mm en utilisant une amende peu stérile de forage chirurgical stip0, en commençant à l'arrière du bregma et prolongeant en avant juste à gauche de la ligne médiane. Retirer des fragments d'os et des tissus mous recouvrant de telle sorte que le cortex cérébral peut être visualisé.
  11. Gardez le champ opératoire et la surface corticale humide en appliquant de façon intermittente gouttes de solution saline stérile.
  12. Fixer une pipette en verre tirée vers le bras d'injecteur de l'appareil stéréotaxique. Aligner l'extrémité distale de la pipette avec le bregma et remettre à zéro les coordonnées stéréotaxiques.
  13. Avancer la pipette à la première antérieur / postérieur (A / P) et médial / latéral (M / L) des coordonnées fournies dans le tableau 1.
  14. Faire avancer la pipette à la surface corticale et zéro dorsal / ventral (D / V) mesure.
  15. Passer lentement la pipette dans le cerveau jusqu'à atteindre le premier D / V de coordonnées dans le tableau 1.
  16. L'utilisation d'un système d'injection à basse pression de volume réglé à 20 psi pendant 20 impulsions msec, injecter 100 nl de L-Nio dans le cerveau et attendre 5 min pour empêcher le refluxla piste de la pipette.
    1. Utiliser un réticule étalonné dans l'oculaire du microscope stéréotactique et un grossissement de 3X.
    2. En conséquence, le déplacement d' un total de 0,100 mm 3 (0,5 mm de longueur dans une pipette de diamètre 0,5 mm, ce qui correspond à 100 nl) de la pipette de verre tiré pour chaque jeu de coordonnées. En utilisant un réticule, mesurer et normaliser puisque chaque mis en place varie en fonction de l'agrandissement et les échelles utilisées.
    3. Pour une mesure précise du volume lors de chaque injection, l'approche de la pipette coudée au microscope à partir du côté de telle sorte que le ménisque air-liquide a une vue sagittale. Le ménisque doit apparaître dans le même plan focal de la fois la paroi intérieure et extérieure de la pipette.
  17. Retirez lentement la pipette et répétez les étapes 1.13-1.16.3 à la deuxième et troisième ensemble de coordonnées fournies dans le tableau 1.
  18. Après la dernière injection, retirer la pipette et placez assez de cire d'os pour remplir le site de craniotomie. UNEpproximate les bords de la plaie du cuir chevelu et de se lier avec un adhésif cutané.
  19. Injecter 0,1 ml de 0,5% Marcaine dans les bords de la plaie à l'aide d'une aiguille 30 G stérile pour éviter pour prévenir la douleur locale associée à l'incision du cuir chevelu.
  20. Retour à l'animal de logement et de fourniture d'antibiotiques post-opératoire (0,48 mg / ml triméthoprime-sulfaméthoxazole, ou 0,5 mg / ml lévofloxacine) dans l'eau de boisson pendant 5 jours.

Induction de l'AVC 2. Blanc Matter - Postérieur Approche coudé

  1. Effectuer les étapes 01.01 à 01.12 comme dans le protocole d'approche coudée médiane, à l'exception de régler le bras d'injection de la configuration stéréotaxique à 45 degrés orientés avant en arrière.
  2. Avancer la pipette à la première A / P et M / L coordonnées fournies dans le tableau 2.
  3. étapes restantes complètes 1.14-1.20 comme dans le protocole d'approche coudée latérale.

3. Retrograde Neuronal Étiquetage

  1. Préparer un stérile 10aliquote ul de L-Nio à 54,8 mg / ml dans 0,9% de solution saline normale.
  2. Préparer une aliquote stérile de 20% Fluororuby (ou 20% de dextran amine biotinylée ou 2% Fluorogold) dans 0,9% de solution saline normale.
  3. Diluer ensemble 1: 1 à des concentrations finales de 27,4 mg / ml de L-NiO et de 10% Fluororuby.
  4. Effectuer le protocole de course comme ci-dessus dans les étapes 1.3-1.23.
  5. Visualisez le traceur fluorescent natif dans la section de tissu par fixation de perfusion, cryosectioning et microscopie comme décrit précédemment 8.

4. Traitement des tissus pour immunofluorescence

  1. A un intervalle post-AVC approprié allant de 3 heures à 14 jours après la course, euthanasier les souris par overdose isoflurane ou IACUC procédure locale approuvés.
  2. Ouvrez la cavité thoracique à l'aide de ciseaux à angle et insérer une aiguille G 23 papillon dans le ventricule gauche.
  3. Placer une petite incision dans l'oreillette droite à l'aide de ciseaux fins pour permettre une voie d'écoulement du fluide de perfusion.
  4. Perfuser transcardiaque avec 30 à 40 ml de solution saline tamponnée au phosphate froid, suivi par 30 à 40 ml de paraformaldéhyde 4% à froid à un débit de 10 ml / min à la température ambiante.
  5. Décapitez la souris et retirez le cerveau en utilisant des ciseaux stériles pour ouvrir le crâne arrière, puis retirez délicatement le crâne recouvrant avec une spatule, placez le cerveau en froid 4% PFA pendant 24 heures, puis transfert à 30% de saccharose dans du PBS pendant 48 heures .
  6. Préparer quarante sections micron flottantes en utilisant un cryostat et effectuer un traitement d'anticorps comme décrit précédemment 6-8. Dans cette étude, en utilisant les anticorps suivants: anticorps de lapin anti-neurofilament 200 (dilution 1: 500); de lapin anti-vimentine (1: 500); chèvre anti-GFAP (1: 500); lapin anti-Iba-1 (1: 1000).

5. Le traitement des tissus pour la protéine ou l'analyse de l'ARN

  1. A un intervalle post-AVC approprié allant de 3 heures à 14 jours après la course, euthanasier par overdose isoflurane ou IACUC locale procédure approuvée.
  2. Décapitez lasouris et retirer le cerveau à l'aide de ciseaux stériles pour ouvrir le crâne arrière, puis retirez délicatement le crâne sus-jacente avec une spatule.
  3. Insérer une spatule stérile de 4 mm à l'avant du cerveau pour couper le bulbe olfactif et les nerfs optiques. Soulevez doucement le cerveau de la calotte crânienne et la placer dans la dissection tampon glacée (solution saline équilibrée de 1x Hank, 25 mM HEPES-KOH, pH 7,4, glucose 35 mM, du bicarbonate de sodium à 4 mM, et 0,01 mg / ml cyclohexamide).
  4. L'utilisation d'un bloc de cerveau et de nouvelles lames de rasoir stériles, préparer 2-3 dalles mm contenant la course et la place dans le tampon de dissection froide.
  5. Sous un microscope de dissection, identifier la substance blanche sous-jacente du cortex moteur dans l'hémisphère injecté. À des intervalles plus longs post-AVC, la région peut être identifié visuellement par une nécrose focale et la myéline pâleur.
    Remarque: A des intervalles précédents post-AVC, l'injection de L-Nio mélangé avec 1 ul de 10% Fast Green peut permettre l'identification visuelle de la course (
  6. Sous la direction d'un microscope à dissection et en utilisant un nouveau scalpel, disséquer soigneusement la région de la matière blanche contenant la course, soit identifiée par l'étiquetage vert rapide ou la perte de tissu. Retirer le cortex sus-jacent et le striatum sous-jacente comme souhaité.

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Representative Results

En utilisant le modèle présenté, la substance blanche sous-jacente forelimb cortex sensorimoteur peut sûrement être ciblé. Ce modèle de course induite chimiquement produit axonale focal et la perte de myéline, astrocytosis et microgliose (Figure 1), comme cela est généralement vu dans Infarctus lacunaires humaines. En utilisant trois injections, un modèle cliniquement utile est établie avec une altération précoce sur les tâches à moteur forelimb 7 et une petite mais significative partie des expériences de tissus de l' ischémie cérébrale qui immunohistochimie, immunofluorescence, et biochimiques techniques sont réalisables et fiables au niveau quantitatif. Aux points de temps précoces (hr) après AVC induction, changements dans l' organisation moléculaire axonale peuvent être détectés (figure 2). A 7 jours, la course complète sa maturation à une zone circonscrite de la perte axonale (Figure 1a). Dans nos mains, cette méthode produit une matière blanche lésion focale approximationdiatement 800 um de diamètre horizontal et se prolongeant d'environ 1 mm le long de l'axe antéro-postérieur du corps calleux. En 7 jours, la taille totale moyenne de l' infarctus est plus ou moins 0,200 mm 3 et aura une forme elliptique. Nous avons observé environ 10% de la variabilité de la taille de la course à la fois entre les animaux et entre les sections, en fonction de l'endroit où dans l'ellipse de la section se produit. Poursuite de la croissance de la taille de l'infarctus est rarement vu au-delà de 7 jours.

L'ajout d'une injection simultanée des résultats d'amines dextran dans l' étiquetage neuronale importante dans la couche 5 et la couche 6 corps cellulaires neuronaux qui ont axones à travers la région d'accident vasculaire cérébral (Figure 3). les neurones corticaux superposée qui ne sont pas endommagés par les aspects fictifs de la procédure (passage de l'aiguille fine), subissent des lésions axonales distale et peuvent être identifiés par l'inclusion d'un traceur avec la préparation de L-Nio. Cette approche a été l'utilisation d pour démontrer les changements dynamiques dans le segment initial axone après un AVC 8.

Alors que la petite taille de la région du tissu affecté par l'AVC limite l'utilisation d'autres techniques courantes telles que 2,3,5-triphényltétrazolium chlorure (TTC) coloration, la région blanche de la course de la matière peut être identifié dans les tissus frais. L'addition d'un colorant commun tel que Fast Green produit une région identifiable du tissu qui peut être disséqué sous un microscope à dissection (figure 4). Une fois que disséqué ce tissu peut être utilisé pour l' analyse des protéines par Western blot ou une immunoprécipitation, ou pour l' isolement et l' analyse (figure 4C) ARN. Grâce à l'utilisation de diverses lignées de souris transgéniques, une variété d'approches novatrices peut être utilisée pour étudier la neurobiologie après focal coup de matière blanche , y compris des études de cartographie du destin cellulaire et microdissection laser (figure 4C).

tente "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 1
Figure 1:. Focal Stroke Blanc Matter utilisant deux médial et Postérieur Approches coudés étiquetage immunofluorescence pour neurofilaments (A, rouge) démontre le degré de perte axonale sept jours après un AVC en utilisant l'approche médiale. En utilisant l'approche coudée postérieure, le blanc lésion question de course est ciblé juste au- dessus du ventricule latéral (B, C) ​​et montre la microglie intense (B) et la réactivité des astrocytes (C). Deux astrocytes marqueurs intermédiaires de filaments, vimentine (rouge) et protéine acide fibrillaire gliale (GFAP, vert), les deux révèlent des changements dans la morphologie de la substance blanche astrocytes (fibreux) après la course (C). Les barres d'échelle = 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand version de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2:. Blanc Matter AVC Alters axonale Organisation microdomaines Dans 3 h de matière blanche course induction, organisation microdomaines axonale au niveau du noeud, marqué par bêta-IV spectrine (rouge) et au paranode, marqué par la protéine contactine associée (CASPR, vert), est perturbé (flèches, B). Controlatéral axones de la substance blanche montrent nodal régulière, paranodale, et l' organisation juxtaparanodal (A et C) , tandis que la matière blanche ipsilatéral montre un allongement nodal et paranodale qui est typique des axones avec un contact axoglial perdu (B et D). Barre d'échelle = 5 um.

Figure 3
Figure 3: Retrograde Neuronal Labeling avec la substance blanche Stroke Identifie individuelle Neurones avec des lésions axonales. Co-injection d'amine dextran fluorescent (rouge) au moment de l' accident vasculaire cérébral induction permet l' identification des neurones individuels avec axones blessés par accident vasculaire cérébral. La plupart de l'étiquetage se produit dans les axones au sein de la couche 5 et 6 neurones dans le cortex sensori primaires recouvrant la course. Image représente 7 jours après un AVC. Barre d' échelle = 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4:. Microdissection de Lésions Stroke Blanc Matière pour une utilisation dans Biochemical and transcriptionnelle Assays Co-injection de Green rapide au moment de l' accident vasculaire cérébral induction permet l' identification précoce de la région blessée à 24 h (A, panneau supérieur). Immunoblotting pour les protéines axonales spécifiques peut être effectuée pour démontrer des réductions dans la région de la course seul (A, panneau inférieur). Aux points de temps plus longues, la région du blanc course de la matière (panneau de gauche) peut être focalement disséquée sans étiquetage spécifique (B). Panneau supérieur droit montre la région de la matière blanche après le retrait de la région disséquée tandis que le panneau en bas à droite montre la région disséquée de la substance blanche contenant la course (B). PCR pour les gènes spécifiques à oligodendrocytes en utilisant l' ARN isolé à partir de régions découpées à partir de la matière blanche (C). IL = ipsilatéral; CL = controlatéral; c = contrôle; s = course.

Injection Antérieur / Postérieur Médiale / Lateral Dorsale / ventral
0,22 0,22 -2.10
2 0,70 0,15 -2.16
3 1.21 0,15 -2.18

Tableau 1: Coordonnées stéréotaxiques pour Approche coudé latéral (en mm).

Injection Antérieur / Postérieur Médiale / Lateral Dorsale / ventral
-0.75 -0.96 -2.10
2 -1.00 -0.96 -2.05
3 -1.25 -0.96 -2.00

Tableau 2: Coordonnées stéréotaxiques pour Postérieur Approche coudé (en mm).

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Discussion

Un certain nombre de modèles antérieurs de l' AVC subcortical ont été décrites , y compris les injections focales de l' endothéline-1 dans la capsule interne, la substance blanche sous - corticale et striatum dans le 6,15 rat 12-14 et de la souris. Des modèles plus récents de petits coups focaux ont utilisé l' injection de micro - emboles de cholestérol dans l'artère carotide 16 et de l' occlusion photothrombotique d'un seul artériole pénétrant 17. Chacun de ces modèles a des avantages et des inconvénients 5. Le modèle décrit ici produit une lésion qui a un certain nombre de caractéristiques qui imitent un infarctus lacunaire humain , y compris des anomalies axonales et la perte, la dégradation de la myéline, un noyau nécrotique focale et un déficit clinique qui est minime et démontre assez récupération rapide dépendant de 7 ans. Cibler la matière blanche murin permet une grande variété de manipulations génétiques qui peuvent soutenir des études mécanistiques.

La critiqueles étapes du protocole comprennent l'utilisation des coordonnées précises stéréotaxiques. Parce que la substance blanche murin est de petite taille et varie d'une souche à une révision des coordonnées stéréotaxiques peut être nécessaire en fonction de l'âge et la souche de souris utilisée. Le contrôle du volume d'injection est également important, car cela est directement corrélée à la taille de l'infarctus. Grandes injections produire de plus grandes courses qui empiètent sur le cortex sus-jacent et le striatum sous-jacente.

Injection focale de l' ET-1 en utilisant l'approche décrite ici a été rapporté , mais a été montré endothéline-1 pour avoir des effets paracrines directs sur la différenciation des oligodendrocytes et la maturation 10,18 confondant l'étude de post-AVC substance blanche biologie. En revanche, les cibles d'approche L-Nio cellules endothéliales seul, tout en produisant une lésion identique et élimine les effets paracrines de confusion sur les cellules impliquées dans la réponse des blessures. L-Nio est pas directement cytotoxique et la selected dose a été déterminée par des expériences préliminaires d'escalade de dose (données non présentées). L'approche coudée postérieure a été développé pour plus précisément axones en contre-dépouille du cortex moteur primaire produisant le déficit comportemental maximal qui peut être attribué à des lésions de la substance blanche. L'approche coudée médial également des dommages moteur axones du cortex, mais étend plus latéralement et implique axones sous-jacents cortex sensoriel primaire.

La lésion de la course se développe assez rapidement au cours des 24 premières heures. Sept jours, la taille de l'infarctus est maximale et on n'a pas observé l'évolution de la lésion significative au-delà de cette période. D'autres événements cellulaires et une dégénérescence axonale se produisent au-delà de cette première étape, mais la taille de l'infarctus, tel que mesuré par le noyau nécrotique ne changera pas de manière significative en l'absence de toute intervention.

Co-injection de traceurs neuroanatomiques au moment de l'accident vasculaire cérébral identifie les neurones qui connaissent des lésions axonales ischémique. En utilisant soit le medial ou postérieure approche coudée, les corps cellulaires neuronaux avec projections axonales endommagées restent indemnes. Cela crée un modèle utile pour étudier l'effet de l'axotomie ischémique sur les neurones du système nerveux central. Nous avons utilisé des traceurs principalement rétrogrades dont dextran amine et FluoroGold, qui montrent à la fois une excellente absorption par des axones à l'AVC endommagé. En employant la grande variété de transgéniques et des lignées de souris knock-out, les utilisateurs de ce protocole peuvent enquêter sur le rôle spécifique des gènes neuronaux impliqués dans la matière blanche AVC réponse des blessures et la réparation.

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Disclosures

Aucun

Acknowledgements

SN et CDEM ont reçu le soutien du NIH K08 NS083740 et le Département de neurologie UCLA. AJG reconnaît le soutien du Dr. Miriam and Research Foundation Sheldon G. Adelson médicale et la Fondation Larry L. Hillblom. KLN remercie le soutien du Centre de l'AVC American Heart Association 14BFSC17760005 ASA-Bugher. ILL, EGS et STC ont été pris en charge par le NIH R01 NS071481. JDH reconnaît le soutien du NIH K08 NS083740.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride Calbiochem 400600-20MG
Isoflurane Phoenix Pharmaceutical, Inc. NDC 57319-559-06
Capillary tubes World Precision Instruments 50-821-807
Picospritzer Parker Instrumentation Picospritzer II
Stereotactic setup Kent Scientific KSC51725
Pipette puller KOPF Model 720
Stereomicroscope SZ51 Olympus 88-124
Fine scissors Fine Scientific Tools 14084-08
Forceps Harvard Apparatus PY2 72-8547
Curved Forceps Harvard Apparatus PY2 72-8598
Blunt dissection tool Fine Scientific Tools 10066-15
Drill Dremel 8220-1/28
Drill bits Fine Scientific Tools 19007-05
Vetbond 3M 1469SB 
Marcaine HOSPIRA NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole STI Pharmacy NDC 54879-007-16
Fluororuby Fluorochrome Inc 30 mg
Paraformaldehyde Fisher O4042-500
Sucrose Fisher BP220-10
Cryostat Leica CM3050 S 14047033518
Glass slides Fisher 12-544-7
Fast Green  Sigma F7252-5G
Dissection microscope Nikon SMZ1500
23 G butterfly needle Fisher 14-840-35
10x Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14065056
1 M HEPES-KOH, pH 7.4 Affymetrix 16924
D-Glucose Sigma G8270
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Cyclohexamide Sigma 01810

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References

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