कोशिकी एसिड के उत्पादन के मापन और विश्लेषण ग्लाइकोलाइटिक दर निर्धारित करने के लिए

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Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J. Vis. Exp. (106), e53464, doi:10.3791/53464 (2015).

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Abstract

Introduction

इस विधि के समग्र लक्ष्य को सटीकता से बाह्य प्रवाह विश्लेषण का उपयोग कोशिकाओं की ग्लाइकोलाइटिक दर को मापने के लिए है। बाह्य अम्लीकरण का उपयोग कर ग्लाइकोलाइटिक दर के मात्रात्मक माप कई प्रयोगों के वांछित समापन बिंदु है। हालांकि, बाह्य अम्लीकरण की कुल दर दो घटकों का योग है: श्वसन अम्लीकरण, सीओ (2 3 सीओ तो HCO 3 को विघटित एच हाइड्रेट्स जो - + एच +) 2 के रूप में, और ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण, फार्म में + एच + - लैक्टेट की।

कुल बाह्य अम्लीकरण के लिए सीओ 2 के योगदान को हाल ही में जब तक यहां इस्तेमाल किया माप मंच, XF24 विश्लेषक 7 में नगण्य माना गया है। हालांकि, यह 2 बाह्य अम्लीकरण 4-5 करने के लिए एक बड़ा योगदान हो सकता है कि सह कई अन्य प्रणालियों में स्पष्ट है। एकाधिक कागजात इस चोर को स्वीकार करते हैंयोगदान है, लेकिन एसिड 3,8,9 व्युत्पन्न सीओ 2 के प्रत्यक्ष quantitation के प्रयास नहीं करते। हमने हाल ही में कहा कि सीओ 2 उत्पादन इस प्रणाली 6 में बाह्य अम्लीकरण का एक महत्वपूर्ण स्रोत है मात्रात्मक प्रदर्शन किया। ग्लूकोज अपचय से सीओ 2 उत्पन्न कि कई चयापचय मार्ग देखते हैं, हालांकि इसके अलावा, उन साइट्रिक एसिड चक्र में मैट्रिक्स डीहाइड्रोजनेज द्वारा बाहर किए गए भारी योगदान कर रहे हैं और सभी अन्य स्रोतों प्रयोगात्मक त्रुटि 6 के भीतर हैं कि सीओ 2 की मात्रा में उत्पन्न।

सीओ 2 उत्पादन के लिए संशोधन के बिना, बाह्य अम्लीकरण इसलिए ग्लाइकोलाइटिक दर की एक अस्पष्ट संकेत है और मात्रात्मक इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। हमारे पिछले प्रकाशन श्वसन सीओ 2 भी आम तौर पर मुख्य रूप से ग्लाइकोलाइसिस 6 का उपयोग करने के लिए माना कोशिकाओं में, कुल अम्लीकरण संकेत के थोक शामिल कई उदाहरण हैं जहां पर प्रकाश डाला गया। इसके अतिरिक्त,कुल अम्लीकरण के लिए श्वसन सीओ 2 योगदान एक प्रयोग के अलग-अलग हिस्सों के दौरान ग्लाइकोलाइटिक दर की सही तुलना सीओ 2 के लिए सुधार की आवश्यकता है कि प्रदर्शन, सामान्य चयापचय की रूपरेखा प्रयोगों के दौरान व्यापक रूप से भिन्न होता है।

बाह्य अम्लीकरण की दर का उपयोग कोशिकाओं की ग्लाइकोलाइटिक दर को मापने के लिए, यह उत्पन्न कुल एच + में परिवर्तन करने के लिए पीएच परिवर्तन परिवर्तित करने के लिए, और साइट्रिक एसिड चक्र के संचालन के दौरान जारी सीओ 2 की वजह से बाह्य अम्लीकरण घटाना करने के लिए आवश्यक है। यहाँ, हम (ओ 2 एकाग्रता में बाह्य परिवर्तन से) और सीओ 2 उत्पादन (पीएच में बाह्य परिवर्तन और calibrated परख माध्यम की बफरिंग सत्ता से) बाह्य प्रोटॉन उत्पादन की दर को मापने के लिए एक सरल विधि का वर्णन है, और ग्लाइकोलाइटिक दर की गणना करने के लिए प्रदर्शन इन माप का उपयोग।

इस विधि ताकत लैक्टेट उत्पादन द्वारा परिभाषित के रूप में ठीक से ग्लाइकोलाइटिक दर की गणना करने के लिए इसे का उपयोग करके बाह्य अम्लीकरण माप की उपयोगिता ens। श्वसन सीओ 2 (या लैक्टेट के प्रत्यक्ष माप) के लिए सुधार के बिना, यह निर्धारित करने के लिए असंभव है और यदि कुल अम्लीकरण दर लैक्टेट उत्पादन का एक सीधा माप के रूप में कुल बाह्य अम्लीकरण का उपयोग करने वाले प्रयोगों की व्याख्या confounding, ग्लाइकोलाइटिक दर को दर्शाता है किस हद तक।

गणना

सीओ 2 और लैक्टेट प्रयोगात्मक त्रुटि के भीतर कर रहे हैं, myoblast कोशिकाओं 6 के साथ प्रयोगों के आधार पर बाह्य एसिड का उत्पादन करने के लिए केवल दो योगदानकर्ताओं। इसलिए, कुल बाह्य अम्लीकरण (पीपीआर, प्रोटॉन उत्पादन की दर) की दर के रूप में परिभाषित किया जा सकता है:

पीपीआर मुन्ना = पीपीआर resp + पीपीआर glyc 1 समीकरण

। _content "> जहां मुन्ना = कुल; resp = श्वसन; glyc = ग्लाइकोलाइटिक ग्लाइकोलाइटिक पीपीआर इस प्रकार है:

पीपीआर glyc = पीपीआर मुन्ना - पीपीआर resp 2 समीकरण

यहां,

पीपीआर मुन्ना = ECAR मुन्ना / बी पी 3 समीकरण

जहां ECAR = बाह्य अम्लीकरण दर (मील प्रति घंटे / मिनट), और बीपी = बफरिंग शक्ति (मील प्रति घंटे / pmol एच + 7 μl में) है, जबकि

पीपीआर resp = (10 पीएच-PK 1 / (1 ​​+ 10 पीएच-PK 1)) (अधिकतम एच + / ओ 2) (ओसीआर मुन्ना - ओसीआर सड़ांध / MYX) समीकरण 4

जहां कश्मीर 1 = 2 सीओ हाइड्रेशन और HCO से 3 हदबंदी के संयुक्त संतुलन निरंतर - + एच +; अधिकतम एच + / ओ 2 = वेंई सह ऐसे ग्लूकोज 6 की पूरी ऑक्सीकरण के रूप में एक विशेष चयापचय परिवर्तन के लिए 2 व्युत्पन्न अम्लीकरण; ओसीआर = ऑक्सीजन की खपत की दर (pmol 2 हे / मिनट), और ओसीआर सड़ांध / MYX = गैर माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर।

4 समीकरण (माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन जहर rotenone और myxothiazol के लिए प्रतिरोधी है कि ओसीआर के रूप में परिभाषित) और अधिकतम एच के लिए खातों + प्रत्येक सब्सट्रेट (अधिकतम एच + / ओ 2 के लिए भस्म हे 2 प्रति उत्पन्न किसी भी गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर घटाकर माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर आइसोलेट्स ) (6) को देखने के लिए, साथ ही प्रयोगात्मक तापमान और पीएच (10 पीएच-PK 1 / (1 ​​+ 10 पीएच-PK 1 में एच + को जन्म देने के सीओ 2 के अनुपात में)। ग्लूकोज का पूरा ऑक्सीकरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल आक्सीजन खपत की दर (ओसीआर) सीओ 2 उत्पादन की दर को बिल्कुल बराबर है। बाह्य प्रवाह माप की सीमित परख मात्रा में सीओ 2 का उत्पादनश्वसन द्वारा घ परख माध्यम में फंस बनी हुई है। + एच + - फंस सीओ 2 में से अधिकांश तो HCO 3 को विघटित होकर जो एच 2 3 सीओ, को हाइड्रेटेड है। एक छोटा सा अंश भंग रहता है, लेकिन हाइड्रेटेड नहीं, और HCO 3 करने के लिए सीओ 2 हाइड्रेशन और हदबंदी के संयुक्त संतुलन निरंतर द्वारा thermodynamically निर्देशित के रूप में एक और छोटा सा अंश, हाइड्रेटेड लेकिन अलग नहीं है - + एच + प्रयोगात्मक तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) और पीएच पर (~ 7.4)।

इस प्रकार, पीपीआर मुन्ना है से पीपीआर resp घटाकर पीपीआर जी की गणना के लिए पूरा समीकरण:

पीपीआर glyc = ECAR मुन्ना / बीपी - (10 पीएच-PK 1 / (1 ​​+ 10 पीएच-PK 1)) (अधिकतम एच + / ओ 2) (ओसीआर मुन्ना - ओसीआर सड़ांध / MYX) 5 समीकरण

मैंn इस तरह से, श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस, साथ ही उनके संबद्ध एटीपी उत्पादन दर की दरों, मात्रात्मक सीधा माप (ऑक्सीजन की खपत, बाह्य अम्लीकरण, प्रतिरोधक क्षमता) और अन्य आवश्यक मूल्यों का आयात या गणना (एच + / ओ 2 से निर्धारित किया जा सकता , पी / हे, और संतुलन निरंतर कश्मीर 1) 6। यहाँ वर्णित प्रयोग कुंजी XF24 10,11 के रूप में बाह्य प्रवाह विश्लेषक इस तरह के प्रयोग करने के लिए मानक तकनीक पर फैलता है; अन्य बाह्य प्रवाह माप प्रारूपों (जैसे, एक्सएफ 96, या xfp) के लिए, नीचे सभी संस्करणों को उचित रूप से बढ़ाया जाना चाहिए।

परख माध्यम की बफरिंग बिजली नपे-तुले पीएच जांच का उपयोग कर सकते हैं या तो सीधे बाह्य प्रवाह मंच में या अलग से एक मानक वक्र के निर्माण से मापा जा सकता है। इधर, बाह्य प्रवाह परख माध्यम से बफरिंग को मापने के लिए तीन विकल्प सभी injecti का उपयोग सहित, दिया जाता हैसेल मुक्त नमूना कुओं, या सेल युक्त कुओं (खंड 1) में या एक बाहरी पीएच माप (खंड 2) का उपयोग करके केवल पिछले इंजेक्शन बंदरगाह का उपयोग कर के साथ बाह्य प्रवाह विश्लेषक के बंदरगाहों पर। उदाहरण डेटा की पूर्ण गणना के लिए संलग्न स्प्रेडशीट देखें।

बाह्य प्रवाह साधन का पीएच का पता लगाने की क्षमता का उपयोग कर बफरिंग शक्ति को मापने के लिए, यह संकेत भिन्नता को कम करने के लिए सेल मुक्त कुओं का उपयोग करने के लिए सबसे सुरक्षित है। हालांकि, त्रुटि के भीतर, कोई अंतर सांख्यिकीय सेल मुक्त और सेल युक्त इस माप जब प्रदर्शन कुओं (डेटा दिखाया गया है) के बीच मौजूद है। नोट: 1.7 कदम में वर्णित भिन्नता noisier संकेत के नुकसान के साथ कहा, यौगिकों से या कोशिकाओं की उपस्थिति द्वारा प्रदत्त बफरिंग के लिए किसी भी संभावित परिवर्तनों के लिए लेखांकन का लाभ दिया जाता है। जैसा कि ऊपर कहा, हालांकि, कोई महत्वपूर्ण मतभेद तालिका 1 में दिखाया सेल मुक्त डिजाइन के बीच गणना की बफरिंग सत्ता में पाए गए औरयहाँ वर्णित प्रयोगात्मक शर्तों के तहत तालिका 2 में बाद प्रयोग डिजाइन।

इसके अतिरिक्त, छोटे ΔpH पर्वतमाला (<0.4 इकाइयों; प्रयोगात्मक सबसे अच्छा 0.2 इकाइयों के लिए प्रतिबंधित) से अधिक है, रैखिक ढलान Δ मील प्रति घंटे / pmol एच साजिश रचने के द्वारा प्राप्त + पर्याप्त रूप से ΔpH और [एच +] के बीच लघुगणक संबंध अनुमान लगाती है। इस मानक वक्र के ढलान इसलिए 7 μl में पीएच / nmol एच + में परीक्षण के अंतर्गत परख माध्यम की बफरिंग शक्ति का प्रतिनिधित्व करता है, या मील प्रति घंटे / pmol एच + 7 μl में। हम मध्यम बफरिंग शक्ति बढ़ रही है या माप के समय के दौरान एक 0.2 पीएच इकाई परिवर्तन से अधिक है कि नमूने के लिए सेल घनत्व को कम करने की सिफारिश। माप समय भी कम किया जा सकता है, लेकिन यह स्थिर राज्य अम्लीकरण दर कम है और दर गणना में त्रुटि पेश हो सकता है।

Protocol

1. एक बाह्य प्रवाह साधन में बफरिंग शक्ति को मापने: दो रूपों

नोट: गणना और यहाँ वर्णित विधि एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग कर विकसित किया गया। अन्य उपकरणों के लिए, माप मात्रा उचित रूप से बढ़ाया जाना चाहिए।

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार (सामग्री और उपकरण देखें) एचसीएल ध्यान केंद्रित करने का उपयोग कर पानी में 0.1 एम मानक एचसीएल तैयार करें।
    नोट: सभी चार इंजेक्शन बंदरगाहों में उपयोग के लिए एचसीएल इंजेक्शन तैयार करने के लिए एक उदाहरण गणना तालिका 1 में दिखाया गया है:

तालिका एक
टेबल अच्छी तरह से एक बाह्य प्रवाह परख में 1. लगातार एचसीएल इंजेक्शन।

  1. मध्यम में एचसीएल मानक के dilutions तैयार कर्र जा रहा है तकनीकी प्रतिकृति की संख्या के लिए 1 टेबल के रूप में assayed होएक थाली में बाहर आइईडी, प्लस एक pipetting त्रुटि के लिए अनुमति देने के लिए, जैसे, बंदरगाह के चार तकनीकी प्रतिकृति के एक इंजेक्शन के लिए, (48.9 μl एक्स 5) परख माध्यम में (1.1 μl एक्स 5) 0.1 एम एचसीएल के एक शेयर तैयार करते हैं।
  2. माप जांच कारतूस के प्रत्येक पोर्ट ए में 50 μl बांटो। शेष बंदरगाहों बी, सी, और डी के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ
  3. चार बंदरगाह परिवर्धन के प्रत्येक के लिए [2 मिनट के मिश्रण, 1 मिनट रुको, और 5 मिनट माप] के दो चक्रों के बाद एक मानक अंशांकन चक्र के साथ एक बाह्य प्रवाह परख 10, भागो (चित्र 2 देखें)।
    1. सॉफ्टवेयर के निर्देशों के अनुसार साधन सॉफ्टवेयर में ऊपर प्रयोग कार्यक्रम। मशीन में तैयार कारतूस लोड और सॉफ्टवेयर के निर्देशों के अनुसार अंशांकन प्रदर्शन करते हैं।
    2. इस कार्यक्रम के द्वारा जब संकेत दिया है, calibrant युक्त प्लेट हटा दें और अच्छी तरह से साधन में से प्रत्येक में परख मध्यम युक्त थाली डालें; कार्यक्रम जारी है।
  4. यू पहले से स्थिर अवस्था में प्राप्त 8-10 डेटा अंक (आम तौर पर पिछले 8-10 अंक) की औसत गाते हैं और प्रत्येक बंदरगाह इसके बाद, मानक एसिड में से प्रत्येक के इंजेक्शन की वजह से पीएच (ΔpH) में (संचयी) अंतर की गणना।
  5. Nmol एच के खिलाफ ΔpH प्लॉट + माप जांच से फंस 7 μl मात्रा में होता है। रैखिक ढलान मील प्रति घंटे / pmol एच + में बफरिंग शक्ति (बीपी) है।
  6. वैकल्पिक रूप से कदम 1.2-1.3 करने के लिए, 2 टेबल में के रूप में बंदरगाह डी में एक एचसीएल इंजेक्शन द्वारा पीछा बंदरगाहों ए, बी, और सी एक प्रयोग के संचालन के लिए उपयोग किया जाता है, जिसमें एक परख निम्नलिखित ΔpH माप, बाहर ले जाने, चार तकनीकी प्रतिकृति हैं बाह्य प्रवाह परख थाली की (चार पृष्ठभूमि तापमान सुधार कुओं को छोड़कर) 20 प्रयोगात्मक कुओं में एक 5 सूत्री मानक वक्र के प्रत्येक बिंदु उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

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अच्छी तरह से एक बाह्य प्रवाह परख में टेबल 2. एकल एचसीएल इंजेक्शन।

2. एक बाहरी पीएच मीटर का उपयोग बफरिंग शक्ति को मापने

नोट: एक बाहरी पीएच जांच का उपयोग एक माध्यम की बफरिंग शक्ति को मापने के 37 डिग्री सेल्सियस पर जांच जांचना और प्रयोग के दौरान सभी अभिकर्मकों के लिए इस तापमान बनाए रखने के लिए।

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एचसीएल ध्यान केंद्रित करने का उपयोग कर पानी में 0.1 एम मानक एचसीएल तैयार करें।
  2. गर्म पीएच जांच, पीएच मानकों, जिसका बफरिंग बिजली मापा जा रहा है परख मध्यम, और एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस से 0.1 एम एचसीएल।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 37 डिग्री सेल्सियस पर पीएच जांच जांचना। एक गर्मी की थाली या नहाने के पानी का उपयोग करके परख भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सभी अभिकर्मकों बनाए रखें।
  4. अशेष एक छोटे से बीकर या शंक्वाकार ट्यूब में परख के माध्यम के 10 मिलीलीटर। लगातार एक डूबे पीएच जांच का उपयोग पीएच की निगरानी करें।
  5. के रूप में करने के लिए 0.1 एम एचसीएल जोड़ें10-20 μl aliquots में मध्यम कहते हैं।
    1. एक हलचल पट्टी का उपयोग करके या स्वयं एक एसिड इसके बाद कंटेनर घूमता द्वारा मिश्रण सुनिश्चित करें।
    2. पीएच माप को स्थिर करने के लिए कुछ ही सेकंड, तो प्रत्येक अतिरिक्त के बाद पीएच रिकॉर्ड की अनुमति दें।
    3. 3 टेबल में प्रदर्शन किया, परिवर्धन के लिए पर्याप्त संख्या में सटीक ढलान गणना सुनिश्चित करने के लिए और प्रयोग के दौरान उम्मीद पीएच रेंज को कवर करने के लिए बनाते हैं।

टेबल तीन
तालिका 3. एक पीएच मीटर का उपयोग बफरिंग शक्ति को मापने। डेटा 0.1 एम एचसीएल के छह से 20 μl परिवर्धन के साथ एक ठेठ प्रयोग प्रतिनिधित्व करते हैं।

  1. Nmol एच + खिलाफ साजिश ΔpH बफरिंग शक्ति (चित्रा 1) का प्रतिनिधित्व करता है कि एक रेखीय ढाल दे रही है, 7 μl प्रति जोड़ा।


चित्रा 1. बफरिंग शक्ति का निर्धारण। एचसीएल मानक वक्र 3 टेबल के रूप में 1 टेबल, 2 टेबल या (यहाँ) के रूप में मापा जाता है। रेखीय वक्र फिट की ढलान बफरिंग शक्ति (पीएच / nmol एच + 7 μl में) देता है। प्रत्येक बिंदु n के ± SEM = 9 तकनीकी प्रतिकृति मतलब प्रतिनिधित्व करता है।

  1. बफरिंग बिजली विधि 1 या 2 से ऊपर के माध्यम से जाना जाता है, एक बार सत्ता बफरिंग द्वारा ECAR विभाजित करके पीपीआर (pmol एच + / मिनट / ग्राम प्रोटीन) को ECAR संकेत (मील प्रति घंटे / मिनट) में परिवर्तित (बीपी) (मील प्रति घंटे / pmol एच +) और एक अच्छी तरह का प्रोटीन सामग्री के लिए स्केलिंग:
    पीपीआर मुन्ना (pmol एच + / मिनट / ग्राम प्रोटीन) = ECAR (मील प्रति घंटे / मिनट) / बीपी (मील प्रति घंटे / pmol एच + 7 μl में) अच्छी तरह से (माइक्रोग्राम) / प्रति प्रोटीन समीकरण 6
  2. वैकल्पिक रूप से, विधि में एक ही प्रयोगों का उपयोगएस 1 या 2 स्वचालित रूप से डेटा संग्रह के दौरान पीपीआर गणना करने के लिए साधन सॉफ्टवेयर द्वारा इस्तेमाल के लिए प्रतिरोधक क्षमता (बीसी) मूल्य की गणना करने के लिए।
    नोट: साधन उपयोगकर्ता पुस्तिका 12 (पेज 107) की गणना और ई.पू. के रूप में वर्णन किया गया है, जहां प्रतिरोधक क्षमता, उपयोग करने के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करता है
    ईसा पूर्व (मोल / एल) = मोल्स एच + / (ΔpH एक्स बफर मात्रा (एल)) समीकरण 7
    नोट: समीकरण 7 के रूप में परिभाषित प्रतिरोधक क्षमता ऊपर वर्णित साधन या बाहरी पीएच जांच assays में गणना की जा सकती है। बफरिंग शक्ति और प्रतिरोधक क्षमता के बीच रूपांतरण आसानी से (संलग्न स्प्रेडशीट देखें) किया जाता है:
    बीसी = 1 एक्स 10 -9 / बी पी ((मील प्रति घंटे / pmol एच + 7 μl में) / 7 μl) समीकरण 8
    नोट: परख प्रदर्शन करने के लिए पूर्व में जाना जाता है, तो प्रतिरोधक क्षमता प्रयोगात्मक सेटअप के दौरान साधन सॉफ्टवेयर में सीधे प्रवेश किया जा सकता है।
  3. पिछले प्रकाशन 6 में वर्णित है, इस प्रक्रिया और सबसे पारंपरिक बफर सिस्टम के लिए ऊपर प्रयोग गणना लागू करें।
    नोट: तालिका 4 सूचियों बफरिंग शक्ति और कई पारंपरिक मीडिया की प्रतिरोधक क्षमता।

तालिका 4
तालिका 4. बफरिंग शक्ति और चयनित मीडिया की प्रतिरोधक क्षमता।

3. C2C12 Myoblast कोशिकाओं का उपयोग एक बाह्य प्रवाह परख प्रदर्शन

नोट: कदम 3.4.3 में, सीओ 2 में कोई मनाया मतभेद अपनी उपस्थिति HCO 3 करने के लिए सीओ 2 का पूरा रूपांतरण के लिए आवश्यक नहीं है, सुझाव है कि C2C12 संस्कृति में कार्बोनिक एनहाइड्रेस की उपस्थिति पर एसिड का उत्पादन निर्भर व्युत्पन्न थे - + एच +। हालांकि, अनुभव से अलग प्रायोगिक प्रणाली में इस परीक्षण ओम से पहले की सिफारिश की हैitting कार्बोनिक एनहाइड्रेस।

  1. संस्कृति माउस C2C12 11.1 मिमी ग्लूकोज, 2 मिमी glutamine, 10% v / वी भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 100 यू के साथ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 95% हवा / 5% सीओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 13 myoblasts / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन।
  2. 24 घंटा से पहले परख करने के लिए, 20,000 कोशिकाओं में एक ही संस्कृति के माध्यम से 100 μl में थाली / बीज कोशिकाओं / अच्छी तरह से करने में कोई अतिरिक्त कोटिंग के साथ एक 24 अच्छी तरह से पॉलीस्टीरिन बाह्य प्रवाह परख प्लेट (सामग्री और तरीके देखें)।
  3. , FCCP oligomycin पतला, और क्रेब्स घंटी फास्फेट HEPES (KRPH) परख मध्यम (2 मिमी HEPES, 136 मिमी NaCl, 2 मिमी नः 2 4 पीओ, 3.7 मिमी KCl, 1 में rotenone प्लस myxothiazol, और 10x अंतिम एकाग्रता के लिए एचसीएल (वैकल्पिक) मिमी 2 MgCl, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिमी CaCl 2, 0.1% w / वी फैटी एसिड मुक्त गोजातीय सीरम albumin, पीएच 7.4)।
  4. सेल तैयारी
    1. 30 मिनट से पहले परख करने के लिए, जीई aspirating द्वारा पक्षपाती कोशिकाओं तीन बार धोनेntly अच्छी तरह से मध्यम हटाने और फिर धीरे से 500 μl KRPH जोड़ने।
    2. हवा के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर तीसरे धोने के कदम के बाद कोशिकाओं को सेते नहीं है (5% इस बिकारबोनिट मुक्त माध्यम के पीएच बदल जाएगा जो सीओ 2, के तहत)।
    3. परख शुरू में, कोई अतिरिक्त सब्सट्रेट के साथ, 500 यू / एमएल कार्बोनिक एनहाइड्रेस और या तो ग्लूकोज (10 मिमी) या केवल मध्यम युक्त 500 μl ताजा KRPH साथ कुओं में KRPH जगह।
  5. सेंसर कारतूस लोड हो रहा है
    1. पोर्ट एक: 2 माइक्रोग्राम / एमएल oligomycin, पोर्ट बी: 0.5 माइक्रोन FCCP, पोर्ट सी (परख में अंतिम सांद्रता में अच्छी तरह से दिया) के रूप में एक बाह्य प्रवाह सेंसर कारतूस के कारतूस बंदरगाहों में 3.3 कदम में तैयार प्रत्येक 10x परिसर के pipet 50 μl aliquots : 1 माइक्रोन rotenone, 1 माइक्रोन myxothiazol, पोर्ट डी: एचसीएल (ऊपर और 2 टेबल में वर्णित के रूप में एक में परख एसिड अंशांकन प्रदर्शन कर तो)।
      नोट: पूरा सांस की श्रृंखला निषेध करने के उद्देश्य से यहां वर्णित के लिए, 1 माइक्रोन मेरीxothiazol 1 माइक्रोन antimycin ए के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है
  6. बाह्य प्रवाह परख:
    1. 10 में वर्णित के रूप में श्वसन नियंत्रण का निर्धारण करने के लिए एक मानक बाह्य प्रवाह परख प्रदर्शन।

नोट: प्रयोग के प्रत्येक खंड के लिए, मिश्रण का निर्धारण प्रतीक्षा करें, और माप बार खंड प्रति चक्र के रूप में अच्छी तरह से नंबर, वांछित।

नोट: 5 तालिका में डेटा तीन परख चक्र बफरिंग की जांच के लिए एचसीएल (के विभिन्न मात्रा के पोर्ट डी अलावा के बाद होने वाली के साथ, 2 मिनट के मिश्रण, 1 मिनट रुको, और प्रत्येक खंड के लिए 5 मिनट के उपाय के दो परख चक्र पर एकत्र किए गए थे तालिका 2 में के रूप में शक्ति)।

तालिका 5
सारणी 5. कोशिकी प्रवाह परख विन्यास।

4. Measuriएनजी अंत बिंदु लैक्टेट एकाग्रता

नोट: की कमी (2 मिनट से अधिक) प्रारंभिक वेग को मापने के द्वारा एक पारंपरिक 96 अच्छी तरह से थाली में सीधे निर्धारित किया जा सकता एक बाह्य प्रवाह प्रयोग के अंत में कुछ अलग प्रणाली, अंत बिंदु लैक्टेट एकाग्रता में यहाँ वर्णित अप्रत्यक्ष परख मान्य करने के लिए NAD + → एनएडीएच हमारे पूर्व प्रकाशन 6 में विस्तार से वर्णित लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज, द्वारा उत्प्रेरित। प्रतिनिधि परिणाम में प्रस्तुत आंकड़ों के लिए, ग्लूकोज युक्त परख कुओं में अंत बिंदु लैक्टेट एकाग्रता ~ 40 माइक्रोन था।

  1. 2x hydrazine मध्यम तैयार: 1 एम Tris, 20 मिमी EDTA, 400 मिमी hydrazine, पीएच 9.8 से 22 डिग्री सेल्सियस)। इसके तत्काल बाद परख शुरू होने से पहले, 40 यू / एमएल के लिए 4 मिमी और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) को NAD + जोड़ें। अंतिम परख मध्यम रचना (1x): 500 मिमी Tris, 10 मिमी EDTA, 200 मिमी hydrazine, 2 मिमी NAD +, 20 यू / एमएल LDH।
  2. इसके तत्काल बाद बाह्य प्रवाह परख के बाद, 100 को हटानेएक अपारदर्शी (काला) की एक अच्छी तरह से करने के लिए बाह्य प्रवाह परख प्लेट और हस्तांतरण के प्रत्येक अच्छी तरह से परख मध्यम 96 अच्छी तरह से थाली के μl।
  3. अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के लिए, 100 μl 2x hydrazine माध्यम जोड़ें।
  4. इसके तत्काल बाद एक microplate रीडर में प्लेट लोड और 340 एनएम उत्तेजना / 460 एनएम उत्सर्जन पर NADH प्रतिदीप्ति की निगरानी शुरू करते हैं।
  5. लगभग 2 मिनट के लिए प्रारंभिक वेग रिकॉर्ड।
  6. 0 से 50 माइक्रोन के लिए जोड़ा लैक्टेट सांद्रता के लिए लैक्टेट एकाग्रता के खिलाफ प्रारंभिक वेग की साजिश रचने के लिए एक मानक वक्र के निर्माण के लिए एक समान प्रयोग चलाएँ।
  7. प्रत्येक प्रयोगात्मक अच्छी तरह से मानक वक्र का उपयोग करने में लैक्टेट एकाग्रता की गणना।

5. प्रोटीन सामग्री को मापने

  1. परख थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से शेष परख के माध्यम से निकालें।
  2. नीचे अच्छी तरह से सतह से कोशिकाओं की dislodging कम करने के लिए सावधान किया जा रहा, बीएसए मुक्त KRPH μl कुओं 250 के साथ तीन बार धोएं।
  3. 25 μl RIPA सेल जोड़ेंमध्यम (150 मिमी NaCl, 50 मिमी Tris, 1 मिमी EGTA, 1 मिमी EDTA, 1% v / वी ट्राइटन X-100, 0.5% w / वी सोडियम deoxycholate, 0.1% v / वी एसडीएस, 22 डिग्री सेल्सियस पर 7.4 पीएच) परख थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए।
  4. 30 मिनट के लिए बर्फ पर थाली सेते हैं।
  5. 5 मिनट के लिए 1,200 rpm पर एक थाली प्रकार के बरतन पर थाली आंदोलन।
  6. Lysis बफर रचना माप पद्धति के साथ संगत है सुनिश्चित करना है कि बीसीए परख द्वारा जैसे मानक तरीकों, द्वारा प्रोटीन एकाग्रता उपाय। चित्रा 2 में प्रयोग में प्रोटीन सामग्री ~ 4 माइक्रोग्राम / अच्छी तरह से किया गया था।

Representative Results

चित्रा 2 एक ठेठ प्रयोग के लिए कच्चे डेटा से पता चलता है। ओसीआर और पीएच (ऊर्ध्वाधर सलाखों छायांकित) दोनों के बिंदु से बिंदु रिकॉर्डिंग से पिछले 10 माप अंक की गणना के लिए इस्तेमाल किया गया। प्रारंभिक चिंताओं प्रत्येक परख चक्र के औसत मूल्य (मध्य बिंदु माप), वहन नहीं कर रहे थे बंदरगाह अलावा और स्थिर अवस्था अम्लीकरण दर के बीच एक मामूली अंतराल होना को दिखाई दिया, खासकर के रूप में एक सटीक गणना के लिए दर का पर्याप्त समाधान उपलब्ध नहीं होता है कि इस गणना त्रुटि के लिए काफी योगदान करने के लिए प्रकट नहीं होता है (जैसा कि दिखाया गया है)। सही प्रतिरोधक क्षमता प्रयोगात्मक सेटअप के दौरान दर्ज किया जाता है, तो वैकल्पिक रूप से, पीपीआर साधन सॉफ्टवेयर में या डेटा उत्पादन सेटिंग्स में से एक के रूप में उपलब्ध पीसी-संगत प्रारूप में पीपीआर उत्पादन प्रदर्शित करके साधन डेटा संग्रह readout से सीधे पढ़ा जा सकता है।

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चित्रा 2 हे और एच + का 2. प्रतिनिधि बाह्य प्रवाह निशान। ओसीआर और पीएच परख शुरू में 10 मिमी ग्लूकोज युक्त, 5 तालिका में उदाहरण के प्रयोग के लिए बताते हैं। पोर्ट डी (इन औसतन निशान में दिखाया गया है) बफरिंग शक्ति की जांच के लिए अलग-अलग एचसीएल सांद्रता था। पिछले प्रकाशन 6 से डेटा। प्रत्येक बिंदु n = 8 जैविक प्रतिकृति का ± SEM के मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रतिनिधि परिणामों के डेटा विश्लेषण

स्प्रेडशीट 6 तालिका में दिखाया गया है और एक अनुलग्नक के रूप में प्रदान का उपयोग करना, व्यक्तिगत कुओं से डेटा मूल्यों पीले हेडर के साथ दिखाया कॉलम में दर्ज किया जा सकता है। सभी छह स्तंभों के लिए सही इन प्रविष्टियों से गणना कर रहे हैं। 6 तालिका में उदाहरण पीपीआर resp और के साथ या जोड़ा ग्लूकोज बिना मूल की स्थिति, oligomycin की पूर्व बंदरगाह के लिए एक अतिरिक्त के लिए अलग-अलग कुओं से ECAR और ओसीआर डेटा का उपयोग कर पीपीआर glyc की गणना से पता चलता है। प्रत्येक जैविक तैयारी पर तकनीकी प्रतिकृति आम तौर पर पिछले चार स्तंभों में उत्पादनों के एकल मूल्यों देने के लिए औसत रहे हैं, तो अलग अलग जैविक तैयारी से डेटा त्रुटि बी.पी. में सांख्यिकी और इन चार मूल्यों का उचित प्रचार-प्रसार के साथ औसत रहे हैं।

टेबल 6
6 तालिका श्वसन और ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण की गणना। पीले रंग में अध्यक्षता कॉलम मूल्यों गणना से दर्ज किए जाने की संकेत मिलता है (उदाहरण के लिए, बीपी, मैक्स एच + / ओ 2), या डेटा संग्रह से (जैसे, ECAR मुन्ना, ओसीआर)। पुनश्च: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें |। कृपया यहाँ क्लिक करें एक एक्सेल स्प्रेडशीट के रूप में इस तालिका डाउनलोड करने के लिए ।

सुधार के बाद पीपीआर के लिए ग्लाइकोलाइसिस और श्वसन का योगदान

चित्रा 3 FCCP अलावा (पोर्ट बी) निम्नलिखित मूल निवासी ग्लाइकोलाइटिक और श्वसन अम्लीकरण की दरों, इसके अलावा (पोर्ट ए) oligomycin निम्न दरों, और दरों के लिए 6 तालिका में के रूप में गणना के आंकड़ों की चित्रमय उत्पादन से पता चलता है। इन आंकड़ों से स्पष्ट रूप से सब्सट्रेट के विकल्प के साथ श्वसन और ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण परिवर्तन का अनुपात (कोई भी साथ नियंत्रण (सीटीएल बनाम ग्लूकोज) जोड़ा) प्रदर्शन कैसे और माइटोकॉन्ड्रियल स्थिति (देशी समारोह बनाम औषधीय बदल समारोह) के साथ।

"> चित्र तीन
ग्लाइकोलाइटिक और श्वसन स्रोतों से चित्रा 3. प्रोटोन उत्पादन दर (पीपीआर)। श्वसन से पीपीआर (खुले भाग) और कहा कि ग्लूकोज (तीन बाईं सलाखों) के साथ या जोड़ा ग्लूकोज (तीन सही सलाखों) के बिना 5 समीकरण उपयोग कर की गणना C2C12 कोशिकाओं के ग्लाइकोलाइसिस (भरा भाग)। 6 से डेटा। सभी डेटा n के ± SEM = 8 जैविक प्रतिकृति मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं।

Discussion

कोशिकी अम्लीकरण सेलुलर चयापचय दर का आसानी से मापा संकेत है। (लैक्टेट उत्पादन द्वारा परिभाषित के रूप में) इसे ठीक तरह से परख माध्यम की बफरिंग शक्ति का पता करने के लिए महत्वपूर्ण है सेलुलर ग्लायकोलायसिस की दर निर्धारित करने के लिए, और उत्पादन की दर प्रोटॉन के लिए ऑक्सीजन की खपत और अम्लीकरण के बाह्य प्रवाह माप बदलने के लिए। इस गणना के प्रदर्शन करके, साइट्रिक एसिड चक्र में जारी सीओ 2 से उत्पन्न अम्लीकरण लैक्टेट उत्पादन का परिणाम है कि अम्लीकरण छोड़ने घटाया जा सकता है।

इस सुधार के लिए बफरिंग शक्ति को मापने के लिए यहां दिए गए कई अलग अलग तरीकों से अलग फायदे और नुकसान ले। एक पीएच जांच का उपयोग बाहरी माप बेहद सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, लेकिन परख थाली, परख के दौरान यौगिकों के अलावा, या टी की उपस्थिति के भीतर निहित fluorophores द्वारा शुरू की पीएच का पता लगाने में छोटे मतभेदों प्रतिबिंबित नहीं कर सकतेवह कोशिकाओं को खुद। में प्लेट पीएच माप इन मुद्दों का समाधान, लेकिन यह भी प्रयोगात्मक शोर की डिग्री बदलती परिचय।

ECAR करने के लिए सीओ 2 सुधार पहली बार ग्लाइकोलाइटिक दर की स्पष्ट और मात्रात्मक गणना के लिए अनुमति देता है, और एक प्रयोग के दौरान कुल ECAR को श्वसन और ग्लाइकोलाइटिक योगदान में भिन्नता का पता चलता है। 5 समीकरण और ओसीआर, ECAR के माप का उपयोग करना, और बिजली की बफरिंग, ग्लाइकोलाइटिक दर प्रदान की साधारण स्प्रेडशीट (तालिका 6) का उपयोग कर की गणना की जा सकती है। 6 यदि चाहें तो इस दर के बाद तदर्थ लैक्टेट माप द्वारा सत्यापित किया जा सकता है। पेन्टोज़ फॉस्फेट मार्ग अत्यधिक सक्रिय है जहां कोशिकाओं में, इस तरह 6-aminonicotinamide रूप मार्ग अवरोधकों का उपयोग ग्लाइकोलाइटिक दर को अलग-थलग करने के लिए उपयोगी हो सकता है। दोनों सीओ 2 के योगदान की गणना - कुल से और लैक्टेट व्युत्पन्न एच + अतिरिक्त सेलुलर अम्लीकरण दर और आक्सीजन consumpt मापाआयन दर चयापचय गतिविधि के बारे में शक्तिशाली और मात्रात्मक बयान देने के लिए बाह्य प्रवाह डेटा का उपयोग कर के लिए एक अमूल्य उपकरण है।

बफरिंग शक्ति को मापने के लिए, और जांच और इच्छित डेटा के तहत कोशिकाओं के लिए बाह्य प्रवाह प्रयोग के अनुकूलन के लिए विभिन्न संशोधनों सहित यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं, का उपयोग करना, बरकरार कोशिकाओं में ग्लायकोलायसिस की दर प्रयोगात्मक स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के तहत मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इस विधि को एक polystyrene सतह (का पालन किया जा सकता है कि या कोशिकाओं या अंगों) पर पक्षपाती संस्कृति में विकसित कर सकते हैं कि कोशिकाओं तक सीमित है। संवर्धित कोशिकाओं समरूप और मिला हुआ है जब उपयोगी डेटा अभी भी इन शर्तों में से एक सीमा से अधिक प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि यह सबसे अधिक विश्वसनीय है। गणना कश्मीर कोशिकाओं रहे हैं तो अलग substrates और आंशिक ऑक्सीकरण 6 के लिए अधिक से भरा ऑक्सीकरण के लिए 0.65-1.0 अधिकतम एच + / ओ 2 पर्वतमाला, कोशिकाओं के चयापचय के कुछ ज्ञान की आवश्यकता होती हैNown ग्लूकोज oxidize के लिए, 1.0 का एक मूल्य माना जा सकता है।

प्रणालियों में इस्तेमाल किया जब सभी चयापचय लक्षण वर्णन के लिए प्रासंगिक है, इस विधि विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जिसमें सांस की और ग्लाइकोलाइटिक चयापचय के बीच एक पारी सेलुलर एटीपी आपूर्ति स्टेम कोशिकाओं और ट्यूमर व्युत्पन्न कैंसर कोशिकाओं के लक्षण वर्णन सहित एक महत्वपूर्ण फेनोटाइप है बनाए रखने के लिए। इन और अन्य संदर्भों में चयापचय नियंत्रण परिवर्तन को समझना इन प्रकार की कोशिकाओं की प्रयोगात्मक डिजाइन और विश्लेषण में मिलावट और सटीकता का एक बड़ा डिग्री की अनुमति देगा।

Disclosures

डॉ सोणा मुखर्जी वह कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित है कि वाणी है। डॉ मार्टिन ब्रांड इस लेख में इस्तेमाल उपकरणों और अभिकर्मकों पैदा करता है जो कुंजी बायोसाइंसेज, के लिए परामर्श दिया है। इस लेख के लिए ओपन एक्सेस फीस कुंजी बायोसाइंसेज द्वारा भुगतान किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pherastar FS BMG n/a microplate reader
Seahorse XF-24 Seahorse Bioscience n/a extracellular flux instrument
Seahorse XF assay plate Seahorse Bioscience V7-PS consumable
XF Calibrant Seahorse Bioscience 100840-000 solution
HCl standard Sigma 38280 chemical
oligomycin Sigma O4876 chemical
FCCP Sigma C2920 chemical
Rotenone Sigma R8875 chemical
Myxothiazol Sigma T5580 chemical
DMEM Corning 10-013-CV medium component
FBS Corning 35-010-CV medium component
penicillin/streptomycin Corning 30-002-CI medium component
carbonic anhydrase Sigma C2624 chemical
96-well assay plate Corning CLS3991 consumable
NAD+ Sigma N7004 chemical
LDH Sigma L1254 chemical

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References

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