Måling og analyse av Ekstracellulær Acid Produksjon fastslår glykolyttiske Rate

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J. Vis. Exp. (106), e53464, doi:10.3791/53464 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Det overordnede målet med denne metoden er å måle glycolytic frekvensen av cellene ved hjelp av ekstracellulært flux analyse. Kvantitativ måling av glycolytic hastighet ved hjelp av ekstracellulære forsuring er det ønskede sluttpunktet for mange eksperimenter. Imidlertid er den totale hastigheten til ekstracellulær surgjøring summen av to komponenter: respiratorisk surgjøring i form av CO 2 (som hydrater til H 2 CO 3 deretter spaltes til HCO 3 - + H +), og glykolytisk surgjøring i form av laktat - + H +.

Bidragene fra CO 2 til total ekstracellulære forsuring har inntil nylig vært ansett ubetydelig i målingen plattformen som brukes her, XF24 analysator 7. Men det er klart i flere andre systemer som CO 2 kan være en viktig bidragsyter til ekstracellulære forsuring 4-5. Flere papirer erkjenne dette conbidrag, men ikke forsøk direkte kvantifisering av CO 2-avledede syre 3,8,9. Vi har nylig demonstrert kvantitativt at CO 2 produksjon er en betydelig kilde til ekstracellulært forsuring i dette systemet 6. Videre, selv om det er flere metabolske baner som genererer CO 2 fra glukose katabolisme, de som er utført av matrise dehydrogenaser i sitronsyresyklusen er den overveldende bidragsytere og alle andre kilder genererer mengder CO 2 som er innenfor eksperimentell feil 6.

Uten korreksjon for CO 2 produksjon, er ekstracellulær surgjøring derfor et tvetydig indikator for glykolytisk hastighet og kan ikke brukes kvantitativt. Vår forrige publisering fremhever flere tilfeller der luft CO 2 omfatter mesteparten av den totale forsuring signal, selv i celler generelt antas å primært bruke glykolyse 6. I tillegg,respiratorisk CO to bidrag til total surgjøring varierer mye i løpet av vanlige metabolske profilering eksperimenter som viser at riktig sammenligning av de glykolytiske frekvensen under forskjellige deler av et eksperiment som krever korreksjon for CO 2.

For å måle den glykolytiske frekvensen av celler ved hjelp av frekvensen av ekstracellulær surgjøring, er det nødvendig å omdanne pH-endringer til endringer i total H + generert, og å subtrahere det ekstracellulære surgjøring forårsaket av CO 2 frigjøres under drift av sitronsyresyklusen. Her beskriver vi en grei metode for måling av ekstracellulær proton produksjonshastighet (fra ekstracellulære forandringer i pH-verdien og den kalibrerte bufring kraften i analysemedium) og CO 2 produksjon (fra ekstracellulære endringer i O 2 konsentrasjon), og viser hvordan man skal beregne glykolytisk hastighet ved hjelp av disse målingene.

Denne metoden styrke ENS nytten av ekstracellulære forsuring måling ved å bruke det til riktig beregne glycolytic sats som definert av laktat produksjon. Uten korreksjon for luft CO 2 (eller direkte måling av laktat), er det umulig å fastslå om og i hvilken grad den totale forsuring raten reflekterer glycolytic rate, konfunderende tolkningen av eksperimenter som bruker total ekstracellulære forsuring som en direkte måling av laktatproduksjon.

BEREGNINGER

CO 2 og laktat er innenfor eksperimentell feil, de eneste to bidragsytere til ekstracellulære syreproduksjon, basert på eksperimenter med myoblast celler 6. Derfor kan hastigheten av total ekstracellulær surgjøring (PPR, proton produksjonshastigheten) kan defineres som:

PPR tot = PPR resp + PPR glyc ligning 1

. _content "> hvor tot = totalt; resp = åndedretts; glyc = glycolytic glycolytic PPR er dermed:

PPR glyc = PPR tot - PPR resp Equation 2

Her,

PPR tot = ECAR tot / BP Equation 3

hvor ECAR = ekstracellulære forsuring hastighet (km / h / min), og BP = buffering effekt (mph / pmol H + i 7 mL), mens

PPR resp = (10 pH-pK 1 / (1 ​​+ 10 pH-pK 1)) (maks H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / MYX) Ligning 4

der K 1 = kombinert likevektskonstanten av CO 2 hydrering og dissosiasjon til HCO 3 - + H +; max H + / O 2 = the CO to avledede surgjøring for en bestemt metabolsk transformasjon, for eksempel fullstendig oksydasjon av glukose til 6; OCR = oksygenforbruk rate (pmol O 2 / min), og OCR rot / MYX = non-mitokondrie OCR.

Ligning 4 isolerer mitokondrie OCR ved å trekke enhver ikke-mitokondrie OCR (definert som OCR som er motstandsdyktig mot mitokondrie åndedretts gifter rotenon og myxothiazol) og står for den maksimale H + generert per O 2 forbrukes for hvert substrat (maks H + / O 2 ) (se 6), såvel som andelen av CO 2 gir opphav til H + ved den eksperimentelle temperatur og pH (10 pH-pK 1 / (1 ​​+ 10 pH-pK 1). For fullstendig oksydasjon av glukose, mitokondriell Oxygen Forbruk Rate (OCR) er nøyaktig lik frekvensen av CO 2 produksjon. I begrenset analysen volumet av ekstracellulært fluks måling, CO 2 råvarerd av respirasjon forblir fanget i analysemedium. Det meste av det innfangede CO2 blir hydrert til H 2 CO 3, som deretter spaltes til HCO 3 - + H +. En liten fraksjon forblir oppløst, men ikke hydrert, og en annen liten fraksjon er hydratisert men ikke dissosiert, som diktert termodynamisk ved den kombinerte likevektskonstanten til CO 2 hydrering og dissosiasjon til HCO 3 - + H + ved forsøkstemperatur (37 ° C) og pH- (~ 7,4).

Således, den fullstendige ligning for beregning av PPR g ved å subtrahere PPR resp fra PPR tot er:

PPR glyc = ECAR tot / BP - (10 pH-pK 1 / (1 ​​+ 10 pH-pK 1)) (maks H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / MYX) Equation 5

jegn denne måten, priser av respirasjon og glykolyse, samt tilhørende ATP produksjonsrater, kan kvantitativt bestemmes fra enkle målinger (oksygenforbruk, ekstracellulære forsuring, bufferkapasitet) og import eller beregning av andre nødvendige verdier (H + / O 2 , P / O, og likevektskonstanten K 1) 6. Eksperimentet er beskrevet her utdyper standard teknikker for å bruke Ekstracellulær Flux Analyzer som Seahorse XF24 10,11; for andre ekstracellulære fluks måle formater (f.eks XF e 96, eller XFP), bør alle volumer under skaleres riktig.

Bufring kraften i analysemediet kan måles ved konstruksjon av en standard kurve, enten direkte i den ekstracellulære flux plattformen eller separat ved hjelp av en kalibrert pH-probe. Her er tre alternativer for måling bufring av ekstracellulære flux assaymedium gitt, blant annet ved hjelp av alle injectipå portene på ekstracellulære flux analysator med cellefrie prøvebrønner, eller med bare den siste injeksjonen port i celleholdige brønner (§ 1) eller ved hjelp av en ekstern måling av pH (§ 2). Se vedlagte regneark for de fullstendige beregninger av eksempeldata.

For å måle bufring strømkilde ved hjelp av pH-detektering av evnen av det ekstracellulære fluks instrument, er det tryggeste for å bruke cellefrie brønner for å minimalisere signalvariasjon. Imidlertid eksisterer innenfor feil noen statistisk forskjell mellom cellefrie og celle-inneholdende brønner ved å utføre denne målingen (data ikke vist). MERK: variasjon er beskrevet i trinn 1,7 bærer den fordel står for eventuelle endringer av buffer som er tillagt av tilsatte forbindelser eller ved tilstedeværelse av celler, med den ulempe at mer støyende signal. Men som nevnt ovenfor, ble ingen signifikante forskjeller funnet i den beregnede bufring kraft mellom den cellefrie utforming er vist i tabell 1 ogpost-eksperimentet i tabell 2 under eksperimentelle forhold som er beskrevet her.

I tillegg over små ΔpH områder (<0,4 enheter; eksperimentelt beste begrenset til 0,2 enheter), den lineære skråningen oppnådd ved å plotte Δ mph / pmol H + tilstrekkelig tilnærmet logaritmisk forholdet mellom ΔpH og [H +]. Helningen av denne standardkurve representerer derfor buffer kraften i analysemedium under test i pH / nmol H + i 7 ul, eller mph / pmol H + i 7 mL. Vi anbefaler å øke medium buffering makt eller redusere celletetthet for prøver som overstiger en 0,2 pH-enhet endring i løpet av måletiden. Måletiden kan også bli redusert, men dette kan redusere den stabile tilstanden surgjøring hastighet og innføre feil i beregningen rate.

Protocol

1. Måling Buffering Power i en Ekstracellulær Flux Instrument: To Variasjoner

MERK: beregningene og metodene som er beskrevet her ble utviklet ved hjelp av en Ekstracellulær Flux Analyzer. For andre instrumenter, må målevolumet bli skalert på riktig måte.

  1. Forbered 0,1 M standard HCl i vann ved hjelp av HCl konsentrat (se Materialer og utstyr) i henhold til produsentens instruksjoner.
    Merk: Et eksempel på beregning for fremstilling HCl injeksjoner for bruk i alle fire injeksjonsportene er vist i tabell 1:

Tabell 1
Tabell 1. Fortløpende HCl injeksjoner i et ekstracellulært flux assay vel.

  1. Forbered fortynninger av standard HCl i mediet som skal analyseres som i tabell 1 for antall tekniske replikater blir CarrIED ut i én plate, pluss en til å tillate pipetteringsfeil, for eksempel, for fire tekniske replikater av havnen En injeksjon, forberede et lager av (1,1 mL x 5) 0,1 M HCl i (48,9 mL x 5) analysemedium.
  2. Fordel 50 ul i hver port A til målesonden patronen. Gjenta denne prosedyren for de resterende havner B, C og D.
  3. Kjør et ekstracellulært fluks assay 10 med en standard kalibreringssyklus, fulgt av to sykluser med [2 min blanding, 1 min vente, og 5 min måling] for hver av de fire porttillegg (se figur 2).
    1. Programmere eksperimentet ovenfor i instrumentets programvare i henhold til bruksanvisningen for programvaren. Laste forberedt kassetten inn i maskinen og utføre kalibrering i henhold til programvareinstruksjoner.
    2. Når du blir bedt av programmet, fjern kalibreringsholdige plate, og sett platen inneholder analysen medium i hver brønn inn i instrumentet; fortsette programmet.
  4. U synge gjennomsnittet av 8-10 datapunkter som oppnås ved stabil tilstand (typisk de siste 8-10 poeng) fra før og etter hver port tillegg beregne (kumulativ) forskjellen i pH (ΔpH) forårsaket av hver injeksjon av standard syre.
  5. Plott ΔpH mot nmol H + inneholdt i 7 ul volum fanget av målesonden. Den lineære skråningen er buffereffekt (BP) i mph / pmol H +.
  6. Alternativt til trinnene 1,2-1,3, utføre målinger ΔpH følgende en analyse hvor porter A, B og C blir brukt for å gjennomføre et eksperiment, etterfulgt av en HCl-injeksjon i havn D. Som i tabell 2, fire replikater er teknisk brukes til å generere hvert punkt av en 5-punkts standardkurve i de 20 forsøksbrønner (unntatt fire bakgrunn temperatur korreksjon brønnene) av ekstracellulære flux analyseplaten.

53464table2.jpg "/>
Tabell 2. Enkelt HCl injeksjon i et ekstracellulært flux analysebrønn.

2. Måling Buffering Strøm bruk av en ekstern pH Meter

NB: For å måle kraften bufring av et medium ved hjelp av en ekstern pH-probe, kalibrerer proben ved 37 ° C og opprettholde denne temperaturen i alle reagenser i løpet av eksperimentet.

  1. Forbered 0,1 M standard HCl i vann ved hjelp av HCl konsentrat i henhold til produsentens instruksjoner.
  2. Varm pH-probe, pH-standarder, analysemedium som buffer kraft som skal måles, og 0,1 M HCl til 37 ° C i et vannbad.
  3. Kalibrere pH probe ved 37 ° C i henhold til produsentens instruksjoner. Vedlikeholde alle reagenser ved 37 ° C i løpet av analysen ved hjelp av en varmeplate eller et vannbad.
  4. Alikvot 10 ml av analysemedium inn i et lite begerglass eller konisk rør. Overvåke pH kontinuerlig ved hjelp av en nedsenket pH probe.
  5. Tilsett 0,1 M HCl til somsi medium i 10-20 ul porsjoner.
    1. Sørg for å blande ved å bruke en rørepinne, eller ved å manuelt virvlende beholderen etter hvert syreaddisjons-.
    2. Vent noen sekunder for pH-måling for å stabilisere, så registrerer pH etter hvert tillegg.
    3. Som vist i tabell 3, kan et tilstrekkelig antall tilsetninger for å sikre nøyaktig helling beregning og for å dekke pH-området forventes i løpet av eksperimentet.

Tabell 3
Tabell 3. Måling buffering strøm ved hjelp av en pH-meter. Data representerer et typisk eksperiment med seks 20 mL tillegg av 0,1 M HCl.

  1. Plot ΔpH mot nmol H + lagt per 7 ul, noe som gir en lineær skråning som representerer buffering effekt (figur 1).


Figur 1. Bestemme buffering makt. HCl standardkurve målt som i tabell 1, Tabell 2 eller (her) som i tabell 3. Helningen av det lineære kurvetilpasningen gir buffereffekt (pH / nmol H + i 7 mL). Hvert punkt representerer gjennomsnitt ± SEM av n = 9 tekniske replikater.

  1. Når bufring strømmen er kjent gjennom Metode 1 eller 2 ovenfor, konvertere ECAR signal (mph / min) til PPR (pmol H + / min / ug protein) ved å dividere ECAR ved bufring kraft (BP) (mph / pmol H +) og skalering til proteininnholdet i hver brønn:
    PPR tot (pmol H + / min / ug protein) = ECAR (mph / min) / BP (mph / pmol H + i 7 pl) / protein per brønn (mikrogram) Ligning 6
  2. Alternativt kan du bruke de samme eksperimentene i metodes 1 eller 2 for å beregne bufferkapasitet (BC) verdien som brukes av instrumentet programvare for å automatisk regne PPR under datainnsamling.
    MERK: Instrumentet brukerveiledning 12 (side 107) gir detaljert informasjon om beregning og bruk av bufferkapasitet, hvor BC er beskrevet som
    BC (mol / L) = mol H + / (ΔpH x buffer volum (L)) Ligning 7
    MERK: bufferkapasitet som definert i ligning 7 kan beregnes på instrumentet eller ekstern pH probe analysene beskrevet ovenfor. Konvertering mellom buffering makt og bufferkapasitet er fort gjort (se vedlagte regneark):
    BC = 1 x 10 -9 / BP ((mph / pmol H + i 7 pl) / 7 pl) Equation 8
    MERK: Hvis kjent før du utfører analysen, kan bufferkapasiteten tastes direkte inn i instrumentet programvaren under eksperimentelt oppsett.
  3. Anvende denne fremgangsmåten, og de ​​beregninger som benyttes ovenfor for de fleste konvensjonelle buffersystemer, slik som beskrevet i foregående publikasjon 6.
    MERK: Tabell 4 lister bufring makt og bufferkapasiteten til flere konvensjonelle medier.

Tabell 4
Tabell 4. Buffering makt og bufferkapasiteten til utvalgte medier.

3. Utføre en Ekstracellulær Flux analysen Bruke C2C12 Myoblast Cells

MERK: I trinn 3.4.3, var det ingen observerte forskjeller i CO 2 avledede syreproduksjonen avhengig av tilstedeværelse av karboanhydrase i C2C12 kultur, noe som tyder på at dens tilstedeværelse ikke er nødvendig for full konvertering av CO 2 til HCO 3 - + H +. Men empirisk teste dette i ulike eksperimentelle systemer er anbefalt før omitting karbonanhydrase.

  1. Culture mus C2C12 myoblaster 13 ved 37 ° C under 95% luft / 5% CO2 i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) med 11,1 mM glukose, 2 mM glutamin, 10% volum / volum føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin.
  2. 24 timer før analysen, plate / frø-celler i 100 ul av den samme dyrkningsmedium på 20.000 celler / brønn i en 24-brønners polystyren ekstracellulære fluks analyseplate (se Materialer og Metoder) med ingen ekstra belegg.
  3. Fortynne oligomycin, FCCP, og rotenon pluss myxothiazol, og HCl (valgfritt) 10x endelig konsentrasjon i Krebs Ringer Phosphate HEPES (KRPH) assaymedium (2 mM HEPES, 136 mM NaCl, 2 mM NaH 2 PO 4, 3,7 mM KCl, en mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2, 0,1% w / v fettsyrefritt bovint serumalbumin, pH 7,4 ved 37 ° C).
  4. Cellepreparat
    1. 30 min før assayet, vaskes adherente celler tre ganger ved å suge til gently fjerne mediet fra brønnen, og deretter langsomt å tilsette 500 ul KRPH.
    2. Inkuber cellene etter den tredje vasketrinnet ved 37 ° C under luft (som ikke er under 5% CO2, noe som vil endre pH i denne bikarbonat fritt medium).
    3. I analysen start, bytt KRPH i brønner med 500 mL frisk KRPH inneholder 500 U / ml karbonanhydrase og enten glukose (10 mm) eller medium bare, uten ekstra underlaget.
  5. Legge sensoren patron
    1. Pipetter 50 pl aliquoter av hver 10x forbindelsen fremstilt i trinn 3,3 i patron portene på en ekstracellulær flussmiddel sensor patron som følger (sluttkonsentrasjoner i analysebrønn gitt): Port A: 2 ug / ml oligomycin, Port B: 0,5 uM FCCP, Port C : 1 uM rotenon, 1 uM myxothiazol, Port D: HCl (om å utføre en in-assay syre kalibrering som beskrevet ovenfor og i tabell 2).
      MERK: for formålet med komplett åndedretts kjeden hemming beskrevet her, 1 mikrometer minexothiazol kan bli anvendt om hverandre med 1 uM antimycin
  6. Ekstracellulære flux analysen:
    1. Utføre en standard ekstracellulær fluks assay for bestemmelse av luftkontroll som beskrevet i 10.

NB: For hvert segment av eksperimentet, bestemme blandingen, vent, og måletider ønskelig, så vel som antall sykluser per segment.

MERK: Dataene i tabell 5 ble samlet inn over to analyse sykluser med 2 min mix, 1 min ventetid, og 5 min mål for hvert segment, med tre analyse sykluser som skjer etter at Port D tilsetting av ulike mengder HCl (for kalibrering av bufring kraft som i tabell 2).

Tabell 5
Tabell 5. Ekstracellulær flux analysen konfigurasjon.

4. Measuring End-point laktatkonsentrasjonen

NB: For å bekrefte den indirekte målingen som er beskrevet her i noen annet system, endepunkt laktatkonsentrasjonen ved slutten av et ekstracellulært fluks eksperiment kan bestemmes direkte på en konvensjonell 96-brønn plate ved å måle den innledende hastighet (i løpet av 2 min) med reduksjon av NAD + → NADH katalysert av laktatdehydrogenase, beskrevet i detalj i vår tidligere publikasjon 6. For de data som presenteres i Representant Resultater, endepunktet laktatkonsentrasjonen i inneholder glukose analysebrønnene var ~ 40 mikrometer.

  1. Forbered 2x hydrazin medium: 1 M Tris, 20 mM EDTA, 400 mM hydrazin, pH 9,8 ved 22 ° C). Umiddelbart før analysen start, legge NAD + 4 mm og laktat dehydrogenase (LDH) til 40 U / ml. Endelige analysemedium sammensetning (1x): 500 mM Tris, 10 mM EDTA, 200 mM hydrazin, 2 mM NAD +, 20 U / ml LDH.
  2. Umiddelbart etter den ekstracellulære flux analysen, fjerne 100ul analysemedium fra hver brønn av det ekstracellulære flux analyseplaten og overføring til en brønn av en opak (sort) 96-brønns plate.
  3. Til hver prøve godt, tilsett 100 mL 2x hydrazin medium.
  4. Umiddelbart laste platen inn i en mikroplateleser og begynne å overvåke NADH fluorescens ved 340 nm eksitasjon / 460 nm utslipp.
  5. Ta opp den innledende hastighet i ca. 2 min.
  6. Kjør et lignende eksperiment for å konstruere en standardkurve ved å avsette innledende hastighet mot laktatkonsentrasjonen for tilsatte laktatkonsentrasjoner fra 0 til 50 uM.
  7. Beregn laktatkonsentrasjonen i hver forsøks brønnen ved hjelp av standardkurven.

5. Måle proteininnhold

  1. Fjerne gjenværende analysemedium fra hver brønn av analyseplaten.
  2. Vask brønnene tre ganger med 250 mL BSA-free KRPH, er forsiktig med å minimere løsner av celler fra bunnen godt underlag.
  3. Legg 25 mL RIPA lysemedium (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% volum / volum Triton X-100, 0,5% vekt / volum natrium-deoksycholat, 0,1% volum / volum SDS, pH 7,4 ved 22 ° C) til hver brønn av analyseplaten.
  4. Inkuber plate på is i 30 min.
  5. Agitere plate på en plate rister ved 1200 rpm i 5 min.
  6. Måle proteinkonsentrasjon ved hjelp av standardmetoder, for eksempel ved BCA-analyse, slik at lysis buffer sammensetningen er kompatible med målemetoden. Proteininnholdet i eksperimentet i figur 2 var ~ 4 ug / brønn.

Representative Results

Figur 2 viser den rå data for et typisk forsøk. De siste 10 målepunkter fra punkt-til-punkt-opptak av både OCR og pH (skravert vertikale linjene) ble brukt for beregningene. Første bekymringer at gjennomsnittsverdien (i midten punktmåling) for hver analyse syklus ville ikke gi tilstrekkelig oppløsning på sats for en nøyaktig beregning, spesielt nå som det syntes å være en liten forsinkelse mellom port tillegg og steady state forsuring rate, ble ikke båret ut, da dette ikke synes å bidra i betydelig grad til regnefeil (ikke vist). Alternativt, hvis riktig bufferkapasitet oppgis under eksperimentelle oppsettet, PPR kan leses direkte fra instrument datainnsamling avlesning ved å vise PPR produksjonen i instrumentets programvare eller i PC-kompatibelt format tilgjengelig som en av de data utgangsinnstillingene.

ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg "/>
Figur 2. Representative ekstracellulære flux spor av O 2 og H +. OCR og pH sporer for eksempel forsøket i tabell 5, inneholdende 10 mM glukose ved analyse start. Porten D hadde forskjellige HCl-konsentrasjoner for kalibrering av buffer kraft (ikke vist i disse spor i gjennomsnitt). Data fra forrige publisering 6. Hvert punkt representerer gjennomsnitt ± SEM av n = 8 biologiske replikater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Data analyse av representative resultater

Bruke regnearket vist i tabell 6 og gitt som et vedlegg, kan dataverdier fra enkelte brønner oppgis i kolonnene vist med gule overskrifter. Alle seks kolonner til høyre er beregnet ut fra disse oppføringene. Eksemplet i tabell 6 viser beregninger av PPR resp og PPR glyc ECAR ved hjelp av OCR og data fra de enkelte brønner for de native betingelser med eller uten tilsatt glukose, før tilsetning av Port A oligomycin. Tekniske replikater på hver biologisk fremstilling av disse er normalt i gjennomsnitt for å gi enkeltverdiene av utgangene i de siste fire kolonner, så blir data fra forskjellige biologiske preparater midles med passende spredning av feilstatistikk i BP og disse fire verdier.

Tabell 6
Tabell 6. Beregning av luftveier og glycolytic forsuring. Columns ledet i gult indikerer verdier legges inn fra beregning (f.eks, BP, max H + / O 2), eller fra datainnsamling (f.eks ECAR tot, OCR). ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen |. Klikk her for å laste ned denne tabellen som et Excel-regneark .

Bidragene fra glykolyse og respirasjon til PPR etter korrigering

Figur 3 viser den grafiske visningen av data beregnet som i tabell 6 for innfødte priser av glykolytisk og åndedretts forsuring, priser følgende oligomycin tillegg (Port A), og priser Følgende FCCP tillegg (Port B). Disse dataene viser tydelig hvordan proporsjonene av respiratorisk og glycolytic forsuring endring med valg av underlag (glukose vs. kontroll (CTL) med ingen ekstra) og med mitokondrie status (native funksjon vs. farmakologisk endret funksjon).

"> Figur 3
Figur 3. Proton produksjonsrate (PPR) fra glykolyttiske og luftveis kilder. PPR fra respirasjon (åpne deler) og glykolyse (fylte porsjoner) av C2C12 celler beregnet ved hjelp av ligning 5 med ekstra glukose (tre venstre søyler) eller uten tilsatt glukose (tre riktige søyler). Data fra seks. Alle data representerer gjennomsnitt ± SEM av n = 8 biologiske replikater.

Discussion

Ekstracellulære forsuring er et enkelt målt indikasjon på cellular metabolic rate. Til riktig bestemme frekvensen av cellulær glykolysen (som definert av laktatproduksjon) er det viktig å kjenne bufring kraften i analysemedium, og for å omdanne de ekstracellulære fluks målinger av oksygenforbruk og surgjøring til proton produksjonshastigheter. Ved å utføre denne beregning, kan surgjøringen som følge av CO 2 frigjøres i sitronsyresyklusen trekkes, slik at surgjøring at resultatene fra laktatproduksjon.

De mange ulike måter gitt her å måle buffering makt for denne korreksjonen gjennomføre ulike fordeler og ulemper. Ekstern måling ved hjelp av en pH-probe er svært nøyaktig og reproduserbar, men viser ikke nødvendigvis små forskjeller i pH deteksjon introdusert av fluoroforene som finnes i analyseplaten, tilsetningen av forbindelser som i løpet av analysen, eller tilstedeværelse av than cellene selv. Den in-plate pH-målinger løse disse problemene, men også innføre varierende grad av eksperimentell støy.

CO 2 korreksjon ECAR muliggjør for første gang den utvetydige og kvantitativ beregning av glykolytisk hastighet, og viser variasjonen i luftveiene og glykolytisk bidrag til total ECAR i løpet av et eksperiment. Ved hjelp av likning 5 og målinger av OCR, ECAR, og bufring kraft, kan glycolytic rente beregnes ved hjelp av enkle regneark gitt (tabell 6). Denne prisen kan verifiseres av post-hoc laktatmåling hvis ønskelig 6. I celler hvor pentose-fosfat veien er meget aktiv, kan bruk av sti-inhibitorer så som 6-aminonicotinamide være nyttig for å isolere glykolytisk hastighet. Beregning av bidrag fra både CO 2 - og laktat-avledet H + fra den totale målte Extra Cellular Forsuring og oksygen Consumption Rate er et uvurderlig verktøy for å bruke ekstracellulære flux data til å lage kraftige og kvantitative uttalelser om metabolsk aktivitet.

Ved hjelp av fremgangsmåtene som er beskrevet her, innbefattende forskjellige modifikasjoner for å måle bufring kraft, og å optimalisere den ekstracellulære fluks eksperiment for cellene som undersøkes og data ønskelig, kan frekvensen av glykolyse i intakte celler kvantifiseres under et bredt spekter av eksperimentelle betingelser. Denne metoden er begrenset til celler som kan vokse i kultur vedheftende på (eller celler eller organeller som kan være festet til) en polystyren-overflate. Det er mest pålitelige når dyrkede celler er ensartet og konfluent, selv om nyttige data fortsatt kan oppnås over et område av slike betingelser. Beregningene krever litt kunnskap om metabolismen av cellene, som maks H + / O 2 varierer fra 0,65 til 1,0 for fullt oksidasjon av ulike underlag og mer for partiell oksidasjon 6, men hvis cellene er known å oksidere glukose, kan en verdi på 1,0 bli antatt.

Selv om det er relevant for alle metabolske karakterisering, kan denne metode være spesielt nyttig når den brukes i systemer der en forskyvning mellom luftveiene og glykolytisk metabolisme for å opprettholde cellulær ATP tilførsel er en kritisk fenotype, herunder karakterisering av stamceller og tumor-avledet kreftceller. Forståelse metabolske kontroll endringer i disse og andre sammenhenger vil tillate en større grad av raffinement og nøyaktighet i eksperimentell design og analyse av disse celletyper.

Disclosures

Dr. Shona Mookerjee erklærer at hun ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser. Dr. Martin Brand har konsultert for Seahorse biovitenskap, som produserer instrumenter og reagenser som brukes i denne artikkel. Open Access avgifter for denne artikkelen ble betalt av Seahorse biovitenskap.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pherastar FS BMG n/a microplate reader
Seahorse XF-24 Seahorse Bioscience n/a extracellular flux instrument
Seahorse XF assay plate Seahorse Bioscience V7-PS consumable
XF Calibrant Seahorse Bioscience 100840-000 solution
HCl standard Sigma 38280 chemical
oligomycin Sigma O4876 chemical
FCCP Sigma C2920 chemical
Rotenone Sigma R8875 chemical
Myxothiazol Sigma T5580 chemical
DMEM Corning 10-013-CV medium component
FBS Corning 35-010-CV medium component
penicillin/streptomycin Corning 30-002-CI medium component
carbonic anhydrase Sigma C2624 chemical
96-well assay plate Corning CLS3991 consumable
NAD+ Sigma N7004 chemical
LDH Sigma L1254 chemical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, (2), 297-312 (2011).
  2. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Anal. Chem. 81, (16), 6868-6878 (2009).
  3. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Meth. Enzymol. 547, 309-354 (2014).
  4. Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption. Mol. Biol. Rep. 29, (1-2), 83-87 (2002).
  5. Helmlinger, G., Sckell, A., Dellian, M., Forbes, N. S., Jain, R. K. Acid production in glycolysis-impaired tumors provides new insights into tumor metabolism. Clin. Cancer Res. 8, (4), 1284-1291 (2002).
  6. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. G., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim. Biophys. Acta. 1847, 171-181 (2015).
  7. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am. J. Physiol. 292, (1), C125-C136 (2006).
  8. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. J. Bioenerg. Biomembr. 44, (4), 421-437 (2012).
  9. Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Meth. Enzymol. 542, 125-149 (2014).
  10. Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. A. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J. Vis. Exp. (46), 2511 (2010).
  11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS ONE. 6, (7), e21746 (2011).
  12. Seahorse Biosciences. F24 Extracellular Flux Analyzer and Prep Station Installation and Operation Manual. 1.7, (2010).
  13. Blau, H., Chiu, C., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in human heterocaryons. Cell. 32, 1171-1180 (1983).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics