Author Produced

En neonatal mus ryggmärgskompression skada Modell

Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Züchner, M., Glover, J. C., Boulland, J. L. A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model. J. Vis. Exp. (109), e53498, doi:10.3791/53498 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ryggmärgsskada (SCI) orsakar vanligtvis förödande neurologiska underskott, i synnerhet genom skador på fibrer som härstammar från hjärnan till ryggmärgen. En stor aktuell forskningsområde är inriktat på mekanismer för adaptiv plasticitet som ligger till grund för spontan eller inducerad funktionell återhämtning efter SCI. Spontan funktionell återhämtning rapporteras vara större tidigt i livet, lyfta intressanta frågor om hur adaptiv plasticitet förändringar som ryggmärgen utvecklas. För att underlätta utredningen av denna dynamiska, har vi utvecklat en SCI modell i den neonatala musen. Modellen har relevans för pediatrisk SCI, som är alltför lite studeras. Eftersom neural plasticitet i den vuxna innebär några av samma mekanismer som neural plasticitet i början av livet en, kan denna modell potentiellt ha en viss relevans även för vuxna SCI. Här beskriver vi hela förfarandet för att generera en reproducerbar ryggmärgskompression (SCC) skada i neonatal musså tidigt som postnatal (P) dag 1. SCC uppnås genom att utföra en laminektomi vid en given spinal nivå (här beskrivs i bröstkorg nivåer 9-11) och sedan använda en modifierad Yasargil aneurysm mini-klämma för att snabbt komprimera och dekomprimera ryggmärgen . Som tidigare beskrivits, kan den skadade neonatala möss testas för beteendestörningar eller offras för ex vivo fysiologiska analys av synaptiska anslutningar med hjälp av elektrofysiologiska och hög kapacitet optisk inspelningstekniker 1. Tidigare och pågående studier med beteendemässiga och fysiologiska bedömning har visat en dramatisk, akut försämring av bakdelen rörlighet följt av en fullständig funktionell återhämtning inom 2 veckor, och det första beviset på förändringar i funktionell kretsar på samma nivå som identifierade fallande synapsförbindelser 1.

Protocol

Denna experimentella protokoll har godkänts av den nationella Animal Research myndigheten i Norge (Forsøksdyrutvalget, lokal försöksgodkännandenummer 12,4591) i enlighet med reglerna EU djurskötsel (Federation Europeiska försöksdjurs Science Association). Ansträngningar gjordes för att minimera antalet djur som används och deras lidande. I den här artikeln det förfarande som användes på postnatal (P) dag en vild-typ ICR (Imprinting kontrollområdet) möss (Jackson, USA) beskrivs, men samma tillvägagångssätt kan också användas i senare skeden.

1. Att bygga en gas anestesisystemet för neonatala möss (Figur 1)

  1. Bygga en näsa-mask från spetsen av en spruta. Anslut detta till 3-vägskranen med plastslang (figur 1 - röd slang och figur 2A1).
  2. Borra ett litet hål i sidan av näsan masken och anslut detta till plaströr för att avlägsna överflödet av gas frånmask. Avsluta slangen antingen vid en vakuumpump inställd för ett svagt negativt tryck, eller i ett dragskåp (figur 1 - ljust gröna slangar).
  3. Gör en anestesi kammare från en 150 mm x 25 mm plast petriskål (figur 2A2).
    1. Å ena sidan gör ett hål stort nog att rymma huvudet av musen och näsmask.
    2. På den motsatta sidan, göra två mindre hål, genom vilka plaströren till och från näsmask kan införas (figur 1 - röd och ljust grönt slangar, respektive).
    3. Göra en tredje hål på ovansidan av locket och fästa till detta en tredje plaströr som slutar vid vakuumpumpen (figur 1 - mörkgrön slangar). Syftet med detta tredje rör är att säkerställa att varje överskott gas som inte har fångats av utloppet från näsan masken tas bort.
  4. Bygg en sömn kammare genom att göra ett hål i botten av någon form av labb maträtt som är tillräckligt stor för att contain musen och har en slät och jämn kant (öppnandet av skålen måste ligga i plan med bordet för att förhindra läckage av gas). Ansluta hålet i kammaren till den 3-vägskranen med plaströr (figur 1 - brun slangar). Placera sömn kammaren under ett dragskåp.
  5. Anslut en 3-vägskranen till utloppsröret från förångaren (Figur 1 - gul slang och figur 2A3).
  6. Ansluta inloppet till förångaren till syrgastillförseln (figur 1 - blå slangar).

2. Ändring av Yasargil tillfälliga Aneurysm Mini-klipp att skapa pressverktyget (Figur 2 och tabell 1)

  1. Fäst klämman stadigt till ett stativ med en klämma. Med användning av en binokulär lupp för visuell kontroll, fila ner den yttre ytan av spetsen på varje klipp blad till en slutlig tjocklek av cirka 150 ^ m med användning av en skärpnings sten monterad på en borr (figur 2B och C). Gör en propp för klämman genom att skära en kort sträcka av polyeten kapillärrör (tabell 1) under ett stereomikroskop under användning av en mikro-kniv (tabell 1), och placera detta på ett av bladen (figur 2A4 och figurerna 2B och C). Detta förhindrar fullständig stängning av klippet och skapar standardiserade komprimerings dimensioner. När klämman är stängd interblade avståndet är ca 230 pm. Gör en ny propp för varje experiment som polyetenmaterialet kan komprimeras under användning, vilket skulle ändra interblade utrymme.
    Obs: fjäderspänning klämman minskar över tiden så att efter ca 80 kompressioner klippet inte längre stänger fullt ut proppen och behöver bytas ut.

3. Beredning före operation

  1. Placera musen i sömnen kammaren (Figur 1) och initiera anestesi med 4% isofluran (figur 2A5 (figur 2A3 och tabell 1).
  2. Testa tillbakadragande reflex av musen genom att försiktigt klämma banan av huden mellan tårna med en tunn plast pincett. Gör detta noggrant som nyfödda möss lätt skadade. Nypa för hårt omedelbart medför blåmärken. Utförande av detta test i början av sedering utlöser reflexen och ger en god indikation på den mängd kraft som är nödvändig.
  3. När reflex avskaffas, ta bort musen från sömn kammaren och placera den i en liggande ställning på operationsbordet med nosen in i näsmask som ger en kontinuerlig tillförsel av 4% isofluran blandas i rent syre (Figur 1). Se till att uppvärmningen pad är påslagen och inställd på 37-38 ° C som hypotermi under operation kan vara dödlig.
  4. För att uppnå fullständig smärtlindring, injicera subkutant 50 fil av lokalbedövning bupivacain (2,5 mg / ml, figur 2A7 och tabell 1) att utföra injektionen.
  5. Minska Isoflurankoncentration levereras till näsmask till 1-2%.

4. Dorsal Laminektomi

  1. Operera vid mikroskopisk kontroll.
  2. Efter rengöring operationen med klorhexidinglukonat (Tabell 1 # 19) för åtminstone 30 sekunder, gör en 1-2 mm tvär hudsnitt vid T9-T11 med hjälp av en microknife (figur 2A8).
    Obs: I ICR neonatala möss rostralt delen av magen som syns när den innehåller mjölk, står inför vertebrala nivåer T12-T13 (Figur 3). En annan milstolpe är rostralt delen av bröst subkutan fettvävnad aggregat som slutar vid om T8-9. Denna milstolpe är endast synlig efter hudsnitt.
  3. (Figur 2A9 och A10) för att vidga öppningen huden i en tvärgående riktning till 8-9 mm genom att dra i huden försiktigt rostrally och kaudalt (huden tårar lätt att skapa en jämn och rak sår). Detta ger tillräcklig lateral tillgång till ryggraden.
  4. Dra tillbaka kanterna av snittet huden från underliggande strukturer genom att infoga sterila bitar av hemostatisk gelatinsvamp (Figur 2A11 och tabell 1) subkutant rostralt och kaudalt om snittet. Detta förstorar öppningen och förhindrar huden från att dra tillbaka och skymmer området under operationen. Den hemostatiska gelatinsvamp behöver inte blötläggas i saltlösning före användning.
  5. Att exponera ryggraden, dissekera paravertebrala muskler med hjälp av tunna sax (Figur 2A12, och tabell 1). Skär bilagor i musklerna med ryggraden och exponera lamina (Figur 4A). Intee också att i detta skede spinal processen är underutvecklad.
  6. Identifiera mittlinjen och skär på tvären mellan de två laminaten (som i detta skede är brosk) med tunna sax (Figur 4B). Försiktigt placera ett blad av en tunn pincett mellan lamina och dura (Figur 4C), ta tag i lamina med pincett och lyft den försiktigt tills en bit bryter bort, lämnar dura intakt (Figur 4D). Upprepa detta 2-3 gånger för att erhålla en 1-2 segment lång laminektomi.
  7. Använda tunna pincett som rongeurs, ta bort delar av facettleder bilateralt för att få tillräckligt med utrymme för att placera klämman i ryggradskanalen. Rengöra det kirurgiska området och kontrollera blödning med små bitar av hemostatisk gelatinsvamp.

5. ryggmärgskompression skada

  1. Öppna den modifierade aneurysm mini-klipp i klippet hållaren (Figur 2A13 och figur 2B) och plats the blad på båda sidor av ryggmärgen i utrymmena mellan aspekt förenar och sladden. Se till att bladen är införda djupt nog för att påverka den ventrala delen av ryggmärgen. Om detta inte är möjligt, att ta bort flera av de facettleder.
  2. Släpp mini-clip snabbt, håller den på plats med klämhållaren för att hindra den från att glida. Bibehålla komprimering för 15 sek.
  3. Öppna mini-clip snabbt och ta bort den. För att uppnå en symmetrisk kompression, omvänd orientering av mini-klippet och använda lätt ses varumärket gjorts av hemorragisk ödem från den första kompressions som en guide, flytta klämman i motsatt riktning för en andra 15-sek kompression (tidigare experiment visade att detta genererar symmetriska histologiska och fysiologiska underskott, medan enstaka kompressioner inte en). Dura bör inte skadas av den kompression.
  4. Rengöra området och bibehålla hemostas med bitar av hemostatisk gelatinsvamp.
  5. Ta bort de bitar av hemostatisk gelatinsvamp som placerades under kanterna på huden snittet vid början av operationen och stänga huden snitt med steril 6,0 sutur och en nålhållare (Figur 2A14 och 15).
  6. Injicera subkutant 0,75 mg / kg kroppsvikt Buprenorfin (Figur 2A16) utspädd i steril PBS med användning av en insulinspruta (300 | il, 30 G).

6. postoperativ vård

  1. Ta bort musen från näsmask och placera den i en temperaturreglerad kammare inställd på 30 ° C tills anestesi avtar och musen blir alert (1-3 h är typiskt tillräckligt).
  2. Injicera Diazepam (Figur 2B17) intraperitonealt i modern (8 g / kg kroppsvikt). Detta skapar en dvala som minskar risken för kannibalism under den första natten, när denna risk är störst.
  3. Returnera drivs musen till kullen.
  4. Om kullen är large (> 12 valpar), ta bort några av de oanvänd valpar, företrädesvis de större djuren om de skiljer sig åt i storlek, för att minska konkurrensen om mjölken. Vård av det opererade valparna är bäst i ICR linje om kullstorleken är cirka 9 valpar.
  5. För smärtlindring, administrera buprenorfin (0,75 mg / kg kroppsvikt) subkutant en gång per dag under de första postoperativa dagarna, med användning av en insulinspruta (300 | il, 30 G). En lämplig volym för subkutan injektion är 30-50 l. I neonatala möss vocalization och agitation är goda indikatorer på smärta.
  6. Utföra en daglig undersökning av de skadade möss med användning av en poängark att utvärdera näring, kroppsvikt, uttorkning, smärta, sårläkning, urinretention och infektionsstatus. Enligt poängen erhållna ge särskild omsorg, såsom injektioner av en steril lösning pediatrisk nutrition (Tabell 1 # 18) i händelse av onormal näring. Matchprotokollet också0; definierar humana endpoint kriterier. En mamma som inte avvisar de skadade valpar är den bästa vårdgivare.
  7. I det ovanliga fallet med blåsdysfunktion, utföra blås massage två gånger om dagen tills funktion är återställd. Detta görs genom att placera musen i ryggläge i en hand och massera den nedre delen av magen försiktigt i en rostro-caudal riktning med användning av en fingertopp.

Representative Results

Ryggmärgskompression skada och förlust av funktion

Som tidigare beskrivits, genom att optimera preoperativ, kirurgi och postoperativa procedurer, kan en reproducerbar kompressions SCI modell i den neonatala musen erhållas en. Polyeten propp placeras på ett blad av klämman (figur 2B och C) förhindrar att helt stänga av klippet och håller mellan blad avstånd konsekvent vid ca 230 nm. Omkastning av orienteringen av klippet i mellan de två kompressioner resulterar i en symmetrisk skada, såsom bedömdes genom histologisk sequelae (figur 5A och en). Omedelbart efter mini-klipp bort, blir den komprimerade ryggmärg mörkare på grund av hemorragisk kontusion och ödem. Observation av seriesnitt av den skadade ryggmärgen färgade för Eosin och Hematoxylin redan en dagfter skada avslöjar gradvis försämring av vävnaden när man närmar lesionen epicenter (figur 5A). Närvaron av intraspinala håligheter eller blod i lesionen är inte ovanligt.

Beteendebedömning, exempelvis genom att spåra bakben banor under icke-viktbärande förhållanden några timmar efter operationen, visar en dramatisk försämring av bakdelen motilitet i SCC skadade möss jämfört med skenkontrollmöss, i vilka endast en laminektomi utförs (figur 5B och en) . Detta test kan upprepas tills musen är i stånd att utföra andra beteendetester som kräver bär dess egen vikt en.

Dödlighet och återhämtning efter operation

Intraoperativ dödlighet beror främst på apné och hjärtstillestånd orsakad av den höga koncentrationen av isofluran som krävs för att uppnå tillräcklig anesthesien. Presentation av lokalbedövning Bupivakain i den kirurgiska protokollet medger minskning av isofluran koncentration och därmed minskar avsevärt dödligheten. I en nyligen genomförd försöksserien, inklusive mer än 20 djur, den intraoperativ dödligheten var noll. Däremot är postoperativ överlevnad främst påverkas av godkännande av drivs möss av sin mor. En betydande förbättring inträffade när ångest och aggressivitet reducerades genom att leverera en enda injektion av diazepam (ip 8 g / kg kroppsvikt) till modern innan de återvänder den opererade möss till kull 1. Acceptans och postoperativ återhämtning av de drivs möss kan övervakas genom närvaro av mjölk i magen. Magen på en P1-P7 mus som har drucken mjölk är klart vit och synliga genom den abdominala huden (Figur 3). Jämförelse av matning i drift, bluff kontroll och oanvänd möss är användbar för att bedöma nutritionsstatus hos injured möss. Bedöma tillväxten av drivs mot oanvänd möss visar att trots en liten viktminskning under den första postoperativa dagen, tillväxtkurvan för drivs möss normaliserar snabbt därefter (Figur 6). Dödligheten i samband med blåsdysfunktion eller infektion observerades aldrig ens i möss studeras så länge som 7 veckor.

<td> 10
Nummer i fig. 2 Namn Tillverkare / leverantör Referens # Länk Kommentar
1 Plastspruta (30 eller 50 ml)
2 Plastpetriskål (150 x 25 mm)
3 Fortec isofluran förångare Cyprane http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ Vi använder och gamla enheten ur produktion, kolla på länken för nyare enhet
4a Yasargil tillfälligt aneurysm mini-klipp Aesculap FE681K http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
4b Fina hål polyeten kapillärrör ID 0,58 mm OD 0,96 mm Smiths Medical 800/100/200 http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/
5 Isofluran (Forene) Abbott GmbH & Co. KG http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html
6 Marcain (bupivacain) AstraZeneca http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine
7 Insulin spruta 0,3 ml 30 G x 8 mm VWR 80086-442 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138
8 Ultrafin Micro Knife 5 mm framkant Fina Science Tools 10315-12 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0019900000 & reloadmenu = 1
9 Extra Fine GRAEFE Tång - 0,5 mm Spets Fina Science Tools 1153-1110 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0055700000 & reloadmenu = 1
Egentligen inte nödvändigt, ofta tänderna är för stora
Pincett Supergrip Rak Fina Science Tools 00632-11 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0053500000 & reloadmenu = 1
Två pincett behövs
11 Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm Ferrosan
12 Vannas våren sax - 2 mm klingor Rak Fina Science Tools 15000-03 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0012800000 & reloadmenu = 1
13 Vario Clip Tillämpa Tång Aesculap FE502T http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
14 Vicryl 6-; 0 (Ethicon) Johnson och Johnson J105G
15 Diethrich mikro nålhållaren 11-510-20 http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html
16 Temgesic (buprenorfin) Schering-Plough
17 Stesolid (diazepam) Actavis Även känd som Valium
18 Pedamix Fresenius Kabi http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ern%C3%A6ring/parenteral-ern%C3%A6ring
19 Klorhexidinsprit (klorhexidinglukonat) Fresenius Kabi D08A C02 http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639

Tabell 1. Förteckning över verktyg och utrustning för att generera ett klipp driven ryggmärgskompression skada i en neonatal mus.

Figur 1
Figur 1. Schematisk av anestesi installationen. Denna schematiska visar anestesi inställningar utformad för neonatal mus, med en sömn kammare för initial anestesi och en näsmask anordning för fortsatt anestesi under operationen.

figur 2
Figur 2. Huvudsakliga verktyg och kompressionsklämma. (A) Verktyg som används under förfarandet. Siffrorna motsvarar annoteringen används i tabell 1. (B och C) A Yasargil tillfällig aneurysm mini-klämma med spetsen på varje blad manuellt trimmas ner till ca 150 | j, m tjocklek. En propp gjord av ett segment av polyetenrör (tabell 1) placeras på ett av bladen för att förhindra fullständig stängning av klämman. Skala bar: 2 mm. App: klipp applikator (# 12 i A); St:. Proppen klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Landmark för preoperativ bedömning av spinalnivån i neonatal ICR-mus. (A) Lateral vy av en P1 ICR-mus med vit mjölk i de s tomach. Rostralt delen av magsäcken motsvarar T12-T13 spinal nivå. (B) P1 ICR mus under anestesi i liggande ställning. Även svårare att visualisera än i (A), är magen fylld med mjölk igenkännbar. Rostralt delen av magsäcken indikerar T12-T13 spinal nivå. Skala barer: 0,5 cm.

figur 4
Figur 4. Dorsal laminektomi. (A) Dissekering av paravertebrala muskler. Observera att ryggrads processen vid denna ålder är underutvecklad. (B) Tvärgående sektionering av laminatet med tunna sax. (C) Införande av ett blad av en tunn pincett mellan lamina och dura. Startpunkten framgår av pilspetsen. (D) Borttagning av lamina. Skala bar: 2 mm.

filer / ftp_upload / 53498 / 53498fig5.jpg "/>
Figur 5. Histologisk och beteende resultat efter ryggmärgskompression skada på P1. (A) Eosin och Hematoxylin färgning i ryggmärgssektioner från en skadad mus (en dag efter skada) på olika avstånd från den skada epicentrum. (B) Representativa spår av forelimb och bakdelen banor observerade 6 timmar efter skada eller efter en simulerad kontrollgrupp laminektomi. Spår på toppen representerar banor tittade från en lateral vy av djuret. Spår i botten representerar banor tittade från den ventrala aspekten av djuret. Se även 1. Skala bar: 250 pm. DH: dorsalhorn; L, vänster; R: höger; SCC: ryggmärgskompression; VH. Ventrala horn klicka god här för att se en större version av denna siffra.

"Bild Figur 6. Jämförande tillväxtkurvor. Histogram som visar viktökningen hos oanvänd och SCC skadade mössen från postnatal dag 1 till postnatal dag 9.

Discussion

I den här artikeln förfarandena för ett klipp genererat SCC skada i P1 möss beskrivs. Samma förfaranden kan även utföras i senare skeden. Kompressionsskador utfördes framgångsrikt på P5, P7, P9 och P12 (Züchner, et al., Manuskript under utarbetande). Vid alla efter födseln, är narkos uppnås med isofluran förångas i rent syre, men anestesi utfallet beror i hög grad på ålder. I första försök till P1-P4, innan lokalbedövning infördes i protokollet, var det svårt att få en djup och långvarig sedering på grund av en smal dos-effekt fönster mellan otillräcklig sedering och överdosering. Dessutom har oro i samband med en neurotoxiska effekten av isofluran hos nyfödda djur höjts 27-30. En kombination av isofluran och lokalbedövningsmedlet bupivakain resulterar i en djupare och mer stabil anestesi samtidigt tillåter en isofluran dosreduktion med en faktor av 2-3. Olika typer av anestesisia har beskrivits för nyfödda gnagare, inklusive cryoanesthesia 31,32, men en potentiell olägenhet av cryoanesthesia är dess neuroprotektiva effekt (granskas av 33,34), vilket kan försvåra bildandet av en effektiv och reproducerbar skada. Barbiturat-baserade anestesi anses ha lägre effektivitet i neonatala möss på grund av lägre nivåer av serum albumin och kroppsfett än hos vuxna 35,36.

Även om ganska invasiv och traumatiska, är låg när förfarandet är etablerad dödligheten under operation. Men det finns kritiska steg under förfarandet som kräver särskild uppmärksamhet för att förbättra återvinningen och överlevnad av de drivs möss. En viktig fråga är att välja valpar som kommer att ha störst chans att överleva operationen. När kullen är stor näringstillstånd för de enskilda valpar varierar. Förutom den oundvikliga blödning som uppstår under operation, som drivs pups bringar timmeär borta från modern, och de ofta inte dricker mjölk innan nästa morgon. Det är således en fördel att välja valpar som redan har en viss mängd mjölk i magen. Detta är väl synlig genom bukhuden från P0 till P7.

Under den första natten drivs valp är stor risk att bli cannibalized av mamman. Under den initiala utvecklingen av denna modell mer än hälften av det opererade möss saknade följande morgon, med tydliga tecken på blod i buren. Necrophagy, kannibalism och barnamord i gnagare har studerats under decennier 37-40. I denna studie var kannibalism bara sett en gång, men ansågs vara en mer trolig förklaring än necrophagy eftersom valparna som återvände till buren var typiskt i så god form att döden av naturliga orsaker under natten verkade osannolikt. Detta föranledde idén att använda en reversibel farmakologiskt medel såsom diazepam att minska ångest och aggressivitet in mamman (översikt av 41). Intraperitoneal injektion av Diazepam avsevärt förbättrat situationen, släppa dödligheten under den första natten från mer än 60% till mindre än 20%.

Minska kullstorleken genom utgallring och störa kullen så lite som möjligt efter postoperativ avkastning är ytterligare faktorer som kan gynna drivs djuren. Men vilket innebär att endast drivs valpar med mamman är inte bra. Den bästa balansen mellan drivs / oanvänd valpar kan variera beroende på linjen, men för ICR och SCID-ICR-möss lämnar 4-5 drivs valpar (skada eller sken) tillsammans med 3-4 oanvänd valpar gav de bästa resultaten.

I en allmän mening, är den främsta begränsningen av denna neonatal SCI modell som neonatal ryggmärgen skiljer sig i många avseenden från den vuxna ryggmärgen, och kan således inte tillhandahålla experimentella resultat som är jämförbara med de som erhölls från vuxna SCI modeller. Sådana skillnader inkluderar totala storlek ochvolym av ryggmärgen, mobilnummer, underrepresentation av specifika celltyper såsom oligodendrocyter, omogna immunsvar och omogna neuronala kretsar. De slutsatser som dras från försök i denna modell måste därför övervägas noga. Å andra sidan, är den modell som är relevant för den relativt mindre undersökta scenariot med pediatrisk SCI. Dessutom är den skenbara svaghet när det gäller vuxna SCI modeller också en potentiell styrka eftersom det kan tillåta att klarlägga plasticitet mekanismer som, trots minimalt bevarade i den vuxna ryggmärgen, skulle kunna utgöra en terapeutisk substratet om återinföras. Det är tänkbart att återställande av neonatala eller embryonala tillstånd kan genomföras genom implantation av mindre utvecklade celler eller vävnad eller genom behandling med reagens som alstrar den vuxen vävnad med tidigare egenskaper utvecklings. Användning av enzymer för att eliminera perineuronal nät är ett exempel på det senare tillvägagångssättet 42,43.

till exempel tran, hemisection, slag, ballong kompression, pincett krossa, statisk vikt kompression, etc. När det gäller att påverka enheter insatser i denna riktning har lett till SCI modeller vuxna gnagare där flera parametrar av påverkan såsom hastighet, kraft och längd kan manipuleras (granskas av 44). En annan metod, som innebär mindre utrustning, använder en modifiering av Kerr-Lougheed aneurysm klämma 45,46. Dessa 2 metoder kompletterar som kroppen härmar en kontusion skada medan klipp härmar en kompressionsskada med en viss grad av samtidig ischemi. På grund av de betydande begränsningar storlek och ökad sårbarhet neonatala möss, desto högre dödlighet i samband med längre operationer samt kostnaderna för developing mindre skala utrustning, var det valt att utveckla ett klipp genererad kompression snarare än en kroppen genererade blåmärken strategi. Detta åstadkoms genom att anpassa en kommersiellt tillgänglig aneurysm mini-klämma för att rymma storleken på ryggraden av neonatala möss en. Lägga till en propp säkerställer en standardiserad komprimerings bredd, och så länge som spänningen på klämman komprimerar till gränsen av proppen, bör kraften av kompression under den statiska fasen på minimal bredd variera lite. Vad är inte standardiserad är hastigheten av kompressionen under dess dynamiska fasen, eftersom detta kommer att variera när klipp spänningsförändringar över dess livstid. Som den statiska fasen av kompressions varar mycket längre än den dynamiska fasen, och det finns mycket som tyder på att den ryggmärg utövar mycket av en motkraft mot mini-klipp blad, är det troligt att graden av skada är mest beroende av den statiska fasen. Detta är dock återstår att testas. Skadasvårighetsgraden är sannolikt att bero på flera faktorer, bland annat den statiska tryckkraften och varaktighet, hastighet komprimering och dekomprimering, placeringen av mini-klippet och antalet kompressioner som utförs på samma plats. Sålunda kunde kombinato variation i dessa parametrar resulterar i generering av ett spektrum av skadesvårighetsgrader från svag till svår. Trots risken för variabilitet i vår tidigare publicerad studie 1 vi fått konsekventa resultat på histologiska, fysiologiska och beteendemässiga nivåer, så det finns mycket som tyder på att godtagbar standardisering är svårt att uppnå. Vi noterar att vi i denna studie använde flera metoder för validering på varje nivå, inklusive beteendetester såsom luft stepping som visas i Figur 5.

I denna neonatal SCI modell skadan reservdelar en viss andel av axoner och därmed ger en situation gynnsamt för att framkalla adaptiva plasticitet genom åter modeling skonas anslutningar och bildandet av nya kretsar. Eftersom den neonatala musen är väl lämpad för undersökning av många experimentella metoder är det möjligt att använda denna modell för att studera funktionell återhämtning och adaptiv plasticitet med en integrerad strategi, inklusive beteendetester, bakåtsträvande och antero axonal spårning, immunohistokemi, elektrofysiologi och hög -throughput optisk registrering 1. Som ett exempel, vi drog fördel av denna integrerad strategi för att visa nätverks omformning i nivå med särskilda fallande ingångar med hög genomströmning kalcium avbildning i ex vivo wholemount förberedelser i hjärnstammen och skadade ryggmärgen 1. Detta kan skjutas ytterligare genom att använda neuro optogenetic och optogenetic farmakologiska verktyg för att bedöma den ombyggnad av synaptiska kopplingar mellan specifika subpopulationer av spinal nervceller.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic syringe (30 or 50 ml)
Plastic Petri dish (150 x 25 mm)
Fortec isoflurane vaporizer Cyprane We use and old device out of production, check the link for newer device
Yasargil temporary aneurysm mini-clip Æsculap FE681K
Fine-Bore Polyethylene tubing ID 0.58 mm, OD 0.96 mm Smiths Medical 800/100/200
Isoflurane (Forene) Abbott GmbH & Co. KG
Marcain (Bupivacain) AstraZeneca
Insuline seyringe 0.3 ml 30 G x 8 mm VWR 80086-442
Ultra Fine Micro Knife 5 mm cutting edge Fine Science Tools 10315-12
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tip Fine Science Tools 1153-10 Not really necessary, often the teeth are too large
Forceps SuperGrip Straight Fine Science Tools 00632-11 Two forceps are necessary
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm Ferrosan
Vannas Spring Scissors – 2 mm Blades Straight Fine Science Tools 15000-03
Vario Clip Applying Forceps Aesculap FE502T
Vicryl 6–0 (Ethicon) Johnson and Johnson J105G
Diethrich micro needle holder 11-510-20
Temgesic (buprenorphine) Schering-Plough
Stesolid (diazepam) Actavis Also known as Valium
Pedamix Fresenius Kabi
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) Fresenius Kabi D08A C02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boulland, J. -L., Lambert, F. M., Züchner, M., Strom, S., Glover, J. C. A Neonatal Mouse Spinal Cord Injury Model for Assessing Post-Injury Adaptive Plasticity and Human Stem Cell Integration. PLoS ONE. 8, (8), (2013).
  2. Raineteau, O., Schwab, M. E. Plasticity of motor systems after incomplete spinal cord injury. Nat. Rev. Neurosci. 2, (4), 263-273 (2001).
  3. Edgerton, V. R., Tillakaratne, N. J. K., Bigbee, A. J., de Leon, R. D., Roy, R. R. Plasticity of the spinal neural circuitry after injury. Annu. Rev. Neurosci. 27, 145-167 (2004).
  4. Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat. Neurosci. 7, (3), 269-277 (2004).
  5. Cai, L. L., et al. Plasticity of functional connectivity in the adult spinal cord. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B., Biol. Sci. 361, (1473), 1635-1646 (2006).
  6. Courtine, G., Song, B., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14, (1), 69-74 (2008).
  7. Courtine, G., et al. Transformation of nonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of brain input. Nat. Neurosci. 12, (10), 1333-1342 (2009).
  8. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Axons with highly branched terminal regions successfully regenerate across spinal midline transections in the adult cat. J. Comp. Neurol. 519, (16), 3240-3258 (2011).
  9. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Spinal interneuron axons spontaneously regenerate after spinal cord injury in the adult feline. J. Neurosci. 29, (39), 12145-12158 (2009).
  10. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat. Methods. 9, (3), 297-302 (2012).
  11. Oshima, Y., et al. Intravital multiphoton fluorescence imaging and optical manipulation of spinal cord in mice, using a compact fiber laser system. Lasers Surg. Med. 46, (7), 563-572 (2014).
  12. Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range. PloS One. 9, (8), e104250 (2014).
  13. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. 588, (Pt 24), 4905-4925 (2010).
  14. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Vestibular-mediated synaptic inputs and pathways to sympathetic preganglionic neurons in the neonatal mouse. J. Physiol. 590, (Pt 22), 5809-5826 (2012).
  15. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Differential origin of reticulospinal drive to motoneurons innervating trunk and hindlimb muscles in the mouse revealed by optical recording. J. Physiol. 586, (Pt 21), 5259-5276 (2008).
  16. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, (12), 4731-4742 (2011).
  17. Szokol, K., Perreault, M. -C. Imaging synaptically mediated responses produced by brainstem inputs onto identified spinal neurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. Meth. 180, (1), 1-8 (2009).
  18. Pang, D. Spinal cord injury without radiographic abnormality in children, 2 decades later. Neurosurgery. 55, (6), 1325-1342 (2004).
  19. Lee, J. H., Sung, I. Y., Kang, J. Y., Park, S. R. Characteristics of pediatric-onset spinal cord injury. Pediatr. Int. 51, (2), 254-257 (2009).
  20. Parent, S., Mac-Thiong, J. -M., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: a systematic review of the literature. J. Neurotrauma. 28, (8), 1515-1524 (2011).
  21. Basu, S. Spinal injuries in children. Front Neurol. 3, 96 (2012).
  22. Chien, L. -C., et al. Age, sex, and socio-economic status affect the incidence of pediatric spinal cord injury: an eleven-year national cohort study. PloS One. 7, (6), e39264 (2012).
  23. Maier, I. C., Schwab, M. E. Sprouting, regeneration and circuit formation in the injured spinal cord: factors and activity. Philos. T. R. Soc. Lond. B. 361, (1473), 1611-1634 (2006).
  24. Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr. Opin. Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
  25. Jakeman, L. B., Hoschouer, E. L., Basso, D. M. Injured mice at the gym: review, results and considerations for combining chondroitinase and locomotor exercise to enhance recovery after spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84, (4-5), 317-326 (2011).
  26. Rhodes, K., Fawcett, J. Chondroitin sulphate proteoglycans: preventing plasticity or protecting the CNS? J. Anat. 204, (1), 33-48 (2004).
  27. Zhu, C., et al. Isoflurane anesthesia induced persistent, progressive memory impairment, caused a loss of neural stem cells, and reduced neurogenesis in young, but not adult, rodents. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, (5), 1017-1030 (2010).
  28. Loepke, A. W., et al. The effects of neonatal isoflurane exposure in mice on brain cell viability, adult behavior, learning, and memory. Anesth. Analg. 108, (1), 90-104 (2009).
  29. Rothstein, S., Simkins, T., Nunez, J. L. Response to neonatal anesthesia - effect of sex on anatomical and behavioral outcome. Neuroscience. 152, (4), 959-969 (2008).
  30. Rizzi, S., Carter, L. B., Ori, C., Jevtovic-Todorovic, V. Clinical anesthesia causes permanent damage to the fetal guinea pig brain. Brain Pathol. 18, (2), (2008).
  31. Janus, C., Golde, T. The effect of brief neonatal cryoanesthesia on physical development and adult cognitive function in mice. Behav. Brain Res. 259, 253-260 (2014).
  32. Nuñez, J. L., Koss, W. A., Juraska, J. M. Hippocampal anatomy and water maze performance are affected by neonatal cryoanesthesia in rats of both sexes. Horm. Behav. 37, (3), 169-178 (2000).
  33. Batchelor, P. E., et al. Systematic review and meta-analysis of therapeutic hypothermia in animal models of spinal cord injury. PloS one. 8, (8), e71317 (2013).
  34. Kwon, B. K., et al. Hypothermia for spinal cord injury. The Spine Journal. 8, (6), 859-874 (2008).
  35. Benjamin, M. M. Outline of veterinary clinical pathology. 3rd ed, (1978).
  36. Cunningham, M. G., McKay, R. D. G. A hypothermic miniaturized stereotaxic instrument for surgery in newborn rats. J. Neurosci. Methods. 47, (1-2), 105-114 (1993).
  37. Lane-Petter, W. Cannibalism in rats and mice. Proc. R. Soc. Med. 61, (12), 1295-1296 (1968).
  38. Gandelman, R., Simon, N. G. Spontaneous pup-killing by mice in response to large litters. Dev. Psychobiol. 11, (3), 235-241 (1978).
  39. Taylor, G. T. Urinary odors and size protect juvenile laboratory mice from adult male attack. Dev. Psychobiol. 15, (2), 171-186 (1982).
  40. Weber, E. M., Algers, B., Hultgren, J., Olsson, I. A. Pup mortality in laboratory mice -- infanticide or not? Acta Vet Scand. 55, (1), 83 (2013).
  41. Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neurosci. Biobehav. Rev. 9, (1), 37-44 (1985).
  42. Kwok, J. C. F., Heller, J. P., Zhao, R. -R., Fawcett, J. W. Targeting inhibitory chondroitin sulphate proteoglycans to promote plasticity after injury. Methods Mol. Biol. 1162, 127-138 (2014).
  43. Kwok, J. C. F., Afshari, F., Garcìa-Alìas, G., Fawcett, J. W. Proteoglycans in the central nervous system: plasticity, regeneration and their stimulation with chondroitinase ABC. Restor. Neurol. Neurosci. 26, (2-3), 131-145 (2008).
  44. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog. Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  45. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J. Neurosurg. 49, (6), 844-853 (1978).
  46. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Effect of duration of acute spinal cord compression in a new acute cord injury model in the rat. Surg. Neurol. 10, (1), 38-43 (1978).
  47. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 1. Clip design, behavioral outcomes, and histopathology. J. Neurotrauma. 19, (2), 175-190 (2002).
  48. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 2. Quantitative neuroanatomical assessment and analysis of the relationships between axonal tracts, residual tissue, and locomotor recovery. J. Neurotrauma. 19, (2), 191-203 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics