डीएनए इलेक्ट्रोपोरेशन, Myofibers के अलगाव और इमेजिंग

Biology

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Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J. Vis. Exp. (106), e53551, doi:10.3791/53551 (2015).

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Abstract

Introduction

व्यक्तिगत myofibers बड़े, उच्च आयोजन syncytial कोशिकाओं रहे हैं। पेशी के लिए कुछ सेल संस्कृति मॉडल हैं; हालांकि, इन मॉडलों वे पूरी तरह से परिपक्व myofibers में अंतर नहीं है कि उनके प्रमुख सीमा के रूप में है। उदाहरण के लिए, C2C12 और L6 सेल लाइनों चूहों और चूहों, क्रमशः 1-4 से निकाली गई है। सीरम भुखमरी की शर्तों के तहत, मोनोन्यूक्लियर "myoblast की तरह" कोशिकाओं, प्रसार संघर्ष सेल चक्र वापसी से गुजरना है, और sarcomeres के साथ multinucleated कोशिकाओं के गठन myogenic कार्यक्रम में प्रवेश, myotubes के रूप में भेजा। लंबे समय तक संस्कृति शर्तों के साथ, myotubes सिकुड़ा गुणों का प्रदर्शन कर सकते हैं और संस्कृति में "चिकोटी"। मानव कोशिका लाइनों को भी अब 5 स्थापित किया गया है। इन अमर सेल लाइनों के अलावा, मोनोन्यूक्लियर myoblasts पेशी से और myotubes के रूप में होगा सीरम भुखमरी की ऐसी ही परिस्थितियों में अलग किया जा सकता है। ये सेल लाइनों और प्राथमिक myoblast संस्कृतियों अत्यधिक उपयोग कर रहे हैंful वे plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट या वायरस के साथ transduced और बुनियादी सेल जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Myotubes फार्म के लिए प्रेरित करते हैं फिर भी, इन कोशिकाओं को, यहां तक ​​कि, परिपक्व पेशी संगठन की मुख्य विशेषताओं में से कई की कमी है। विशेष रूप से, myotubes व्यक्ति परिपक्व myofibers तुलना में बहुत छोटे होते हैं और myofibers के सामान्य आकार की कमी है। गंभीर, myotubes अनुप्रस्थ (टी) नलिकाओं की कमी है, myoplasm भर कुशल सीए 2 रिहाई के लिए आवश्यक झिल्लीदार नेटवर्क।

प्राथमिक myoblast या myogenic सेल लाइनों के लिए एक वैकल्पिक विधि परिपक्व myofibers का उपयोग कर जरूरत पर जोर देता। Transgenesis टैग प्रोटीन की अभिव्यक्ति की स्थापना के लिए नियोजित किया जा सकता है, लेकिन इस विधि महंगा है और समय लेने वाली है। माउस पेशी के vivo इलेक्ट्रोपोरेशन अपनी गति और विश्वसनीयता 6-10 के लिए एक पसंदीदा विधि के रूप में उभरा है।

इन विवो electroporation और myofibers हेक्टेयर के कुशल अलगाव के लिए तरीकेमाउस flexor digitorum ब्रेविस मांसपेशियों (FDB) 6 के लिए अनुकूलित किया गया है। तरीकों को आसानी से पूरा कर लिया और प्लास्मिडों से विवो अभिव्यक्ति में प्रेरित करने के लिए न्यूनतम इनवेसिव होते जा सकता है। यह दृष्टिकोण अब sarcolemma 6.7 की लेजर विघटन के बाद इमेजिंग सहित उच्च संकल्प इमेजिंग तरीकों के साथ संयुक्त है। फ्लोरोसेंट रंगों और fluorescently लेबल प्रोटीन की अभिव्यक्ति के संयोजन परिपक्व myofibers में सेल जैविक प्रक्रियाओं की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

इस अध्ययन में तरीकों के दिशा निर्देशों को मंजूरी दी चिकित्सा संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय Feinberg स्कूल (IACUC) के साथ नैतिक अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे। सभी प्रयासों के दुख को कम करने के लिए किए गए थे।

माउस में flexor digitorum ब्रेविस के vivo electroporation (FDB) स्नायु बंडल के लिए 1. प्रायोगिक प्रक्रिया

  1. स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त करने के लिए जाना जाता है एक प्रमोटर का उपयोग कर इन विवो अभिव्यक्ति के लिए डिजाइन प्लास्मिडों (जैसे, cytomegalovirus, सीएमवी) या मांसपेशियों में (जैसे, मांसपेशियों creatine काइनेज, MCK) 6.7। बड़ी प्लास्मिडों निचले स्तर पर व्यक्त कर सकते हैं। सीएमवी प्रमोटर बड़े पैमाने पर 6.7 इस्तेमाल किया गया है।
  2. से प्लास्मिडों शुद्ध कोलाई निर्माता के निर्देशों के अनुसार अन्तर्जीवविष मुक्त शर्तों का उपयोग। 5 माइक्रोग्राम प्लाज्मिड / μl - 2 पर बाँझ, अन्तर्जीवविष मुक्त ते बफर में प्लाज्मिड भंग।
  3. पतला और एक concentratio को प्लाज्मिड विभाज्यबाँझ अन्तर्जीवविष मुफ्त ते (2 माइक्रोग्राम / μl) के 10 μl में डीएनए के 20 माइक्रोग्राम के n एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में इंजेक्शन प्रति बफर। इंजेक्शन के प्रति एक विभाज्य तैयार करें।
  4. 8 इकाइयों के अंतिम एकाग्रता देने कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना बाँझ खारा फॉस्फेट बफर के साथ 1x करने के लिए hyaluronidase का जायजा - (- / पीबीएस) पतला। अशेष एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में इंजेक्शन प्रति पतला hyaluronidase के 10 μl।
  5. बेहोश और पूंछ या पैर की अंगुली pinching के लिए अनुत्तरदायी जब तक 2.5% isoflurane का उपयोग माउस anesthetize। सामान्य शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड या हीटिंग मेज पर एक लापरवाह स्थिति में पशु रखें।
  6. एक प्रस्तुत करने का तकनीक सुई साइट से होने वाले और बाहर radiating का उपयोग कर एक povidone आयोडीन साफ़ और शराब की एक बारी आवेदन के साथ तीन बार माउस का लुटेरा साफ करें। इस तकनीक को रोगज़नक़ परिचय कम से कम एक सड़न रोकनेवाला हालत में सुई साइट रखता है।
  7. वें में से लुटेरा इंजेक्षनत्वचा और एक बाँझ 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग मांसपेशियों के बीच 1x hyaluronidase समाधान (2 मिलीग्राम / एमएल = 8 इकाइयों) के 10 μl के साथ ई माउस। Hyaluronidase myofibers में प्लाज्मिड के अधिक कुशल प्रवेश की अनुमति के लिए बाह्य मैट्रिक्स के घटकों को हज़म। एड़ी के आधार पर दर्ज करें और पैर की उंगलियों की दिशा में सुई अग्रिम। सुई मुकर गया है के रूप में धीरे धीरे तरल जारी। त्वचा के नीचे इंजेक्शन स्थल के विस्तार और गुलाबी बारी शुरू कर देंगे।
  8. दोहराएँ 1.6 और contralateral पैर पर 1.7 कदम।
  9. संज्ञाहरण डिस्कनेक्ट और वापस पिंजरे में माउस जगह है। माउस पूरी तरह से संज्ञाहरण से उबरने के लिए अनुमति दें।
  10. 2 घंटा तक प्रतीक्षा करें।
  11. , Anesthetizing और पैर नसबंदी प्रक्रियाओं को दोहराएँ 1.5 और 1.6 कदम।
  12. Hyaluronidase के रूप में एक ही फैशन में लुटेरा में पतला प्लास्मिड डीएनए इंजेक्षन। अधिकतम मात्रा 20 μl या उससे कम है कि सुनिश्चित करें। दोहरी प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के लिए 20 और की एक अधिकतम मात्रा के साथ प्रत्येक प्लाज्मिड के 20 माइक्रोग्राम इंजेक्षन# 181; एल या कम है।
  13. Contralateral लुटेरा पर प्लाज्मिड इंजेक्शन दोहराने या नियंत्रण इंजेक्शन के लिए contralateral पैर का उपयोग करें।
  14. शुरू में इंजेक्ट किया गया था कि पैर पर, दूर ठीक संदंश के साथ रेखांकित पेशी से त्वचा उठा और पैर की चंगा-पैर की अंगुली लाइन को सीधा स्थिति में पैर की उंगलियों के पास की त्वचा की गेंदों के माध्यम से एक 27 जी सुई जगह है। एक दूसरे बाँझ 27 जी सुई ले लो और एड़ी में त्वचा के माध्यम से क्षैतिज जगह है। जगह सुइयों के अलावा प्रत्येक ~ अन्य 1 सेमी के समानांतर।
  15. सुई एक दूसरे से संपर्क नहीं कर सुनिश्चित बनाने समानांतर सुइयों के लिए मगरमच्छ अकड़न, दबाना इलेक्ट्रोड का उपयोग करना। क्ले मॉडलिंग का उपयोग जगह में अकड़न सुरक्षित कर सकते हैं।
  16. एक बिजली उत्तेजक इलेक्ट्रोड कनेक्ट करें।
  17. 100 वी / सेमी में, 1 हर्ट्ज पर, 20 दालों, अवधि में 20 मिसे / प्रत्येक को लागू करने से मांसपेशियों Electroporate। पैर की उंगलियों उत्तेजना के साथ चिकोटी सकता है।
  18. यदि जरूरी हुआ तो contralateral पैर पर उत्तेजना प्रक्रिया को दोहराएँ।
  19. सुई निकालें। Povidone आयोडीन हाथ धोने के साथ लुटेरा साफ कर लें।
  20. संज्ञाहरण बंद कर दें। वसूली पिंजरे और मॉनिटर गतिविधि करने के लिए माउस लौटें। उम्मीद के रूप में प्रक्रिया का आयोजन किया गया था, तो जानवर 30 मिनट के भीतर सामान्य ambulation पाने और पूर्व इंजेक्शन व्यवहार से ambulation या गतिविधि के स्तर में कोई अंतर प्रदर्शन करना चाहिए। इसलिए, कोई बाद प्रक्रिया दर्दनाशक दवाओं की जरूरत है। वसूली करने पर, मछली पालने का बाड़ा के लिए जानवरों की वापसी।
    नोट: प्रोटीन अभिव्यक्ति electroporation के बाद के रूप में जल्दी के रूप में 48 बजे यत्न किया जा सकता है। 14 दिनों इलेक्ट्रोपोरेशन 10 के बाद - हालांकि, electroporation के बाद और अधिक पूरी तरह ठीक होने की अनुमति देने के लिए, हम 7 अलगाव और myofibers के अध्ययन पसंद करते हैं। अभिव्यक्ति 4 सप्ताह electroporation के बाद के रूप में लंबे समय के रूप यत्न किया जा सकता है।

Flexor digitorum ब्रेविस (FDB) फाइबर के अलगाव के लिए 2. प्रायोगिक प्रक्रिया

  1. पिघलना कोलैजिनेज़। प्रत्येक FDB बंडल के लिए 12 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में दो कुओं तैयार करते हैं। एक में अच्छी तरह से 1 मीटर जोड़नेपूर्व गर्म Dulbecco संशोधित ईगल्स मीडिया प्लस गोजातीय सीरम albumin (DMEM + बीएसए) की और दूसरे में एल अच्छी तरह से पूर्व गर्म Ringers समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। इसके अतिरिक्त, पकवान sylgard 35 मिमी के लिए 1x Ringers समाधान की ताजा 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. मौत सुनिश्चित करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या अन्य विधि के द्वारा पीछा किया, सीओ 2 या संवेदनाहारी गैस साँस के माध्यम से पशु बलि।
  3. एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग टखने संयुक्त ऊपर पिछले पैर निकालें और पकवान sylgard 35 मिमी में 1x Ringers समाधान में डूब।
  4. एक पैर तंग पिन, 5 पैर की अंगुली सुझावों में से प्रत्येक के माध्यम से और टखने में 30 जी सुइयों के साथ Sylgard पकवान पर, एकमात्र सामना करना पड़ रहा।
  5. टखने पर शुरू, सावधान नहीं निक के लिए, सीधे पैर की उंगलियों की दिशा में सिर के मध्य साथ पैर के ऊपर की ओर त्वचा के नीचे मांसपेशियों त्वचा धज्जी। पैर के दूसरे पक्ष पर दोहराएँ।
  6. ठीक संदंश के साथ टखने के आधार पर त्वचा पकड़े, एड़ी भर में त्वचा में कटौती।
  7. त्वचा भारोत्तोलनत्वचा के रूप में नहीं निक मांसपेशी की ओर अपनी कैंची का कहना है, संदंश के साथ प्रालंब। प्रभावी ढंग से त्वचा को हटाने, अंतर्निहित संयोजी ऊतक धज्जी।
  8. FDB मांसपेशियों बंडल हड्डी से कण्डरा मुक्त करने के लिए एड़ी पर बड़े कण्डरा में कटौती को दूर करने के लिए। संदंश के साथ कण्डरा होल्डिंग, ध्यान से कैंची से FDB से जुड़ी किसी भी संयोजी ऊतक को हटाने के बड़े सफेद कण्डरा से FDB बंडल काटना। ठीक से किया है बंडल आसानी से व्यक्तिगत अंक के लिए अग्रणी चमकदार सफेद tendons खुलासा अंतर्निहित tendons की लिफ्ट बंद होगा। पैर से बंडल को मुक्त कराने के पैर की उंगलियों के पास tendons पर FDB कट।
  9. अच्छी तरह से युक्त DMEM + BSA में पूरे मांसपेशियों बंडल रखें।
  10. Contralateral पैर पर दोहराएँ।
  11. एक बार सभी FDB मांसपेशियों प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त DMEM + बीएसए और पेशी के लिए collagenase के 100 μl जोड़ने, अलग कर रहे हैं।
  12. पाचन के लिए पहले एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर electroporation की सफलता की जाँच करें। किया properl हैंवाई, 90% अभिकर्मक दक्षता के ऊपर से हासिल किया जा सकता है।
  13. लगभग 1 घंटे के लिए 10% सीओ 2 पर एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं। ऊष्मायन समय रोग मॉडल और पृष्ठभूमि और collagenase के बहुत के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
  14. एक घंटे के बाद, ध्यान से अच्छी तरह से युक्त केवल Ringers समाधान के लिए FDB बंडल हस्तांतरण।
  15. 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग Ringers समाधान के साथ अच्छी तरह से में FDB बंडल Triturate। बंडल आसानी पिपेट टिप के माध्यम से पारित कर सकते हैं कि इस तरह की एक साफ धार के साथ विंदुक टिप के अंत कट। धीरे बंडल के ऊपर से गुजरती हैं और टिप के समानांतर नीचे करने के लिए अनुमति पेशी (~ 15 बार) triturate। बरकरार फाइबर Ringers समाधान में गिर जाएगा। फाइबर आसानी से बंडल गिर नहीं है, जब collagenase समाधान में वापस पेशी जगह है।
  16. प्रति प्लेट पकवान ~ 500 μl पर पृथक फाइबर प्लेट।
  17. पेशी 15 मिनट के लिए अच्छी तरह से हजम करने की अनुमति दें।
  18. दोहराएँ 2.15 कदम2.17 करने के बंडल आकार में कम हो जाती है और जब तक फाइबर के बहुमत के बंडल (2-3 बार के आम तौर पर एक कुल) से अलग कर रहे हैं। एक बार पेशी आसानी से एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप के माध्यम से गुजरता अलग हो गई।
  19. फाइबर 15 मिनट की एक न्यूनतम के लिए पकवान के लिए देते हैं। ताजा Ringers समाधान समय की कमी के आधार पर अवशिष्ट कोलैजिनेज़ कमजोर करने के लिए थाली करने के लिए जोड़ा या बदला जा सकता है।
    नोट: फाइबर अब इमेजिंग के लिए तैयार कर रहे हैं।

Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग लेजर प्रेरित झिल्ली क्षति के दृश्य के लिए 3. प्रायोगिक प्रक्रिया

  1. लोड फाइबर 2.5 माइक्रोन की 300 μl Ringers समाधान में एफएम 4-64 डाई की एफएम 1-43 साथ इमेजिंग के लिए तुरंत पहले। आम तौर पर, अलगाव के बाद छवि फाइबर 15 मिनट के लिए 2 घंटा। हालांकि, फाइबर 24 घंटे बाद अलगाव के लिए ऊपर imaged किया जा सकता है।
  2. एक यूवी लेजर और एक 60X / 63X उद्देश्य से लैस एक confocal खुर्दबीन पर गिलास नीचे डिश रखें।
  3. एक फाइबर का पता लगा। फाइबर मजबूती से जुड़ा हुआ है सुनिश्चित करेंमाइक्रोस्कोप आधार दोहन से डिश के लिए। हदबंदी की प्रक्रिया में क्षतिग्रस्त हो गया है कि फाइबर बाहर निकालें। क्षतिग्रस्त फाइबर कर्ल झिल्ली blebs, एफएम डाई की तेज उच्च स्तर होते हैं या तीव्रता से मोड़ सकता है।
  4. फाइबर पर झिल्ली क्षति के लिए प्रेरित करने के लिए, नाभिक की स्पष्ट एक क्षेत्र के साथ इमेजिंग खिड़की के केंद्र में sarcolemma स्थिति। Sarcolemma बहुत तेज है कि इस तरह के एफएम डाई चैनल का उपयोग sarcolemma पर ध्यान दें।
  5. एफएम 4-64 चैनल का उपयोग sarcolemma पर रॉय पार बाल रखें।
  6. 3 सेकंड (~ x 350 समुद्री मील क्षेत्र में 350 एनएम) के लिए 80% बिजली में एक 1 पिक्सेल बिंदु चमकाना। एफएम डाई चोट के स्थल पर सेल में प्रवेश करेंगे। शक्ति और समय बढ़ाने या अपमान के क्षेत्र में कमी करने के लिए समायोजित किया जा सकता है।
  7. , क्षति के समय में, क्षति से पहले हर 2 सेकंड के बाद क्षति, अप करने के लिए 5 मिनट के लिए तो हर 10 सेकंड फाइबर की छवियों पर कब्जा। समय की जरूरत के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। व्यक्तिगत छवियों छवि जे में समय चूक फिल्मों के लिए परिवर्तित किया जा सकता
  8. दोहराएँ कदमपकवान प्रति अप करने के लिए 3 तंतुओं पर 3.7 के माध्यम से 3.3।

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Representative Results

Electroporation कुशलता flexor digitorum ब्रेविस मांसपेशियों (FDB) बंडल (चित्रा 1 ए) में शुद्ध प्लास्मिड डीएनए का परिचय है कि एक न्यूनतम इनवेसिव तकनीक है। सात दिनों अभिकर्मक fluorescently टैग प्रोटीन पृथक myofibers (चित्रा 1 बी) में कल्पना की है पोस्ट। पृथक तंतुओं तो चढ़ाया और एक confocal खुर्दबीन पर इमेजिंग के लिए तैयार कर रहे हैं। फाइबर लेजर प्रेरित चोट के अधीन किया जा सकता है। एफएम डाई झिल्ली क्षति की साइट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 1 सी)

पाचन प्रक्रिया के दौरान, myofibers की एक छोटी संख्या (सफेद तीर) (2A चित्रा) घायल हो सकता है। क्षतिग्रस्त myofibers sarcolemma (काला तीर) पर झिल्ली blebbing उपस्थित द्वारा पहचाना जा सकता है। क्षतिग्रस्त फाइबर आगे प्रयोग के लिए उपयुक्त नहीं है और उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। अभिव्यक्ति ओ दिखा प्रतिनिधि confocal छवियोंपृथक myofibers चित्रा 2 बी भीतर एफए फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन। सीएमवी प्रमोटर के उपयोग myofibers में इष्टतम प्रोटीन अभिव्यक्ति ड्राइव। डीआईसी इमेजिंग एक इष्टतम फाइबर से पता चलता है। एफएम 4-64 निम्न स्तर से पहले क्षति के लिए (चित्रा -2) पर झिल्ली पर मौजूद है।

एक Leica सपा 5 confocal खुर्दबीन पर imaged एफएम 4-64 से लदे एक myofiber के प्रतिनिधि छवि। sarcolemma दृश्य (सफेद बक्से) और रॉय crosshair (सफेद एक्स) के क्षेत्र में केंद्रित है myonuclei से रहित एक क्षेत्र (चित्रा 3, मध्य) में sarcolemma के कुरकुरा, फ्लोरोसेंट किनारे पर गठबंधन किया है। नाभिक वे एफएम डाई विश्लेषण के बाद इमेजिंग प्रभावित कर सकते हैं के रूप में परहेज कर रहे हैं। झिल्ली क्षति पर, एफएम डाई न्यूनतम (सही चित्रा 3) सामान्य myofibers प्रवेश करती है। झिल्ली की मरम्मत में दोषपूर्ण मांसपेशी फाइबर लेजर प्रेरित नुकसान पर एफएम डाई तेज के स्तर में वृद्धि को प्रदर्शित करेगा।

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इन विवो electroporation और लेजर क्षति प्रोटोकॉल का चित्रा 1. योजनाबद्ध। (ए) hyaluronidase एक anesthetized माउस का लुटेरा में इंजेक्ट किया जाता है। प्लास्मिड डीएनए तो इंजेक्ट किया जाता है और वोल्टेज लागू किया जाता है। (बी) के सात दिनों के बाद इंजेक्शन, flexor digitorum ब्रेविस (FDB) बंडल (सफेद तीर मध्यम पैनल) के पीछे उजागर tendons (काला तीर) छोड़ने लुटेरा से अलग है। (सी) फाइबर चढ़ाया जाता है और लेजर प्रेरित क्षति लाइव myofibers पर किया जाता है। वाम पैनल, पैमाने 50 माइक्रोन। राइट पैनल, पैमाने 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Fluorescently टैग प्रोटीन व्यक्त चित्रा 2. पृथक Myofibers। सात दिनों के बाद इलेक्ट्रोपोरेशन, प्रोटीन अभिव्यक्ति myofiber भर में पाया जाता है। (ए) अलग झिल्ली blebbing (काला तीर) और झिल्ली अवरोधों (सफेद तीर) के साथ व्यर्थ myofibers की एक छोटी संख्या में अलगाव की प्रक्रिया का परिणाम है। स्केल 5 माइक्रोन। (बी) के एक स्वस्थ myofiber के प्रतिनिधि छवि। समान रूप से स्थान sarcomeres डीआईसी इमेजिंग (बाएं) में कल्पना कर रहे हैं। एक myofiber व्यक्त Annexin ए 6 GFP (केंद्र पैनल) के साथ टैग। प्रायर क्षति (सही पैनल) के लिए कम से कम एफएम डाई संकेत नहीं है। स्केल 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
लेजर की चित्रा 3. संरेखणएफएम पॉजिटिव sarcolemma पर crosshairs। Sarcolemma पर ब्याज के क्षेत्र को देखने के क्षेत्र के भीतर केंद्रित है। sarcolemma बढ़ाया है (सफेद बिंदीदार बॉक्स) और रॉय क्रॉसहेयर नाभिक (केंद्र पैनल) से रहित एक क्षेत्र में sarcolemma के तेज एफएम पॉजिटिव किनारे पर गठबंधन। क्षति पर, एफएम डाई चोट की साइट (सही पैनल, सफेद तीर) में प्रवेश करती है। स्केल 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

विवो में fluorescently टैग प्रोटीन का अध्ययन करने के इलेक्ट्रोपोरेशन के उपयोग के आदर्श ईमानदारी से पेशी के पूरे सेल संरचना को दोहराने कि उपयुक्त सेल लाइन मॉडल के अभाव को देखते हुए पेशी के अध्ययन के लिए अनुकूल है। इस प्रोटोकॉल लेजर लोग घायल हो गए बाद प्रोटीन स्थानीयकरण और स्थानान्तरण की विस्तृत इमेजिंग प्रदान करने के लिए electroporation और उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी के उपयोग का वर्णन करता है। इस विधि cytoskeleton पुनर्गठन, तस्करी, और फ्यूजन सहित अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

FDB मांसपेशियों बंडल एक्सप्रेस प्लाज्मिड भीतर myofibers का 90% करने के लिए, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, और इस से पहले और myofiber हदबंदी के बाद दोनों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा आसानी से देखा जा सकता है। इंजेक्शन साइट के लिए करीब मनाया उच्च अभिव्यक्ति के साथ अभिव्यक्ति की एक ढाल वहां आम तौर पर है। क्योंकि अभिव्यक्ति की ढाल के अलग प्रोटीन अभिव्यक्ति के प्रभाव fro पर नजर रखी जा सकती हैमा ही प्रयोग। सभी अभिकर्मक तरीकों के साथ के रूप में, इस दृष्टिकोण overexpression से संबंधित मुद्दों तक सीमित है। उल्लेखनीय है कि उच्च स्तर की अभिव्यक्ति के साथ, प्रोटीन एकत्रीकरण हो सकता है। हमारे अनुभव में, mCherry फ्लोरोसेंट टैग (उदाहरण के लिए 7 में 4 चित्र देखें) संकल्प और प्रोटीन डोमेन के तीखेपन को कम करने बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) टैग की तुलना में अधिक एकत्रीकरण को दर्शाता है। इसके अतिरिक्त, mTurquise2 और वीनस फ्लोरोसेंट टैग दोनों पर्याप्त प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति प्रदर्शित करता है। हालांकि, दोनों प्रोटीन EGFP से कम चमकदार हैं।

इस विधि का परीक्षण दवा एजेंटों और सेल लोग घायल हो गए सहित स्थितियों की एक किस्म के तहत छवि रहने वाले myofibers के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम sarcolemma को बाधित करने के लिए लेजर चोट का इस्तेमाल किया है, लेकिन अन्य लोग घायल हो गए प्रक्रियाओं इस विधि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह अंत करने के लिए, झिल्ली के गठन के लिए भी किया जा सकता है कांच के मोती रोलिंग द्वारा प्रेरित आसमाटिक आघात के रूप में अच्छी तरह से झिल्ली की चोट के द्वारा बनाई गई blebsमूल्यांकन electroporated myofibers 11,12 का उपयोग। लेजर लोग घायल हो गए के लिए, टाइप और लेजर की शक्ति, साथ ही उद्देश्य के लिए एक झिल्ली घाव 13,14 बनाने के लिए आवश्यक समय की लंबाई को प्रभावित करती है। इसके अलावा, बफर के भीतर बाहरी बफ़र्स, विशेष रूप से कैल्शियम की एकाग्रता और एफएम डाई की मरम्मत की प्रक्रिया 13,15 को प्रभावित करती है। इस पद्धति दोनों Nikon और लीका confocal इमेजिंग सिस्टम पर परीक्षण किया गया है और दोनों तकनीक का प्रदर्शन करने में सक्षम हैं। एफएम 4-64 हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन 7 के साथ प्रयोग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। दूसरों एफएम 1-43, नकारात्मक इस डाई 13,15,16 के आवेदन सीमा है, जो 610 एनएम, पर 470 एनएम और उत्सर्जन चरम पर एक उत्तेजना चोटी के साथ फॉस्फोलिपिड आरोप लगाया कि बांध एक और lipophilic डाई का इस्तेमाल किया है। Photobleaching और phototoxicity की वजह से अधिक-इमेजिंग के लिए दोनों संभावित परिणामों हैं। Imaged जोखिम समय, छवि आवृत्ति और चैनलों की संख्या के बीच उचित संतुलन का निर्धारणआसानी से इन प्रभावों को कम करने के लिए चालाकी मानकों हैं।

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Disclosures

हित के कोई द्वन्द्व नहीं हैं।

Acknowledgements

इस काम NS047726, NS072027, और AR052646 राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा अनुदान समर्थन किया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11995-073 Dissection Media
Dilution: 50 ml +100 g BSA
Collagenase, Type II Life Technologies 17101-015 Fiber Digestion
Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot)
Falcon 12-well dishes Fisher Scientific 877229 Fiber Digestion
Ringers Solution Fiber Digestion and Imaging
Dilution: 146 mM NaCl
5 mM   KCl
2 mM   CaCl2
1 mM   MCl2
10 mM HEPES
pH7.4 in H2O
1 ml Pipettes Axygen T-1000-C-R Digestion
Razor Blades Personna 94-120-71 Digestion
Precision Glide 30 G needle BD Biosciences 305128 Dissection
1x PBS (-/-) Life Technologies 14190-250 Dissection
Sylgard 184 Fisher Scientific 50-366-794 Dissection
Forceps FST by Dumont #5/45 Dissection
Forceps Roboz RS-4913 Dissection
Scissors World Precision Instruments 500260 Dissection
BSA Sigma A7906 Dissection media
Dilution: 100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm dishes Fisher Scientific 08772B Dissection- used to hold sylgard
Clay Electroporation
Stimulator  Grass s88x Electroporation
Clamps Radio Shack 270-356 Electroporation
Triadine Aplicare 82-220 Electroporation
Precision Glide 27 G needle BD Biosciences 305136 Electroporation
Simulator Grass SIU-V Electroporation
Gauze Covidien 2146 Electroporation
Hyaluronidase Sigma H4272 Injection
Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock
1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)  BD Biosciences 329420 Injection
Eppendorf Tubes Fisher Scientific 02-682-550 Injection
35 mm glass bottom Microwell dish MaTek P35G-1.5-14-C Microscopy
FM 4-64 Life Technologies T-13320 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43 Life Technologies T-35356 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid Purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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