DNA Eletroporação, Isolamento e imagem das miofibras

Biology

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Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J. Vis. Exp. (106), e53551, doi:10.3791/53551 (2015).

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Abstract

Introduction

Myofibers individuais são células sinciciais grandes, altamente organizados. Existem alguns modelos de cultura celular para o músculo; No entanto, estes modelos têm como principal limitação que não diferenciar plenamente em myofibers maduros. Por exemplo, as linhas de células C2C12 e L6 são derivados de ratinhos e ratos, respectivamente 1-4. Sob condições de privação de soro, as células mononucleares "mioblastos-like" cessar proliferação, submetido a retirada do ciclo celular, e entrar no programa miogênica formando células multinucleadas com sarcômeros, referido como myotubes. Com condições de cultura prolongados, myotubes podem exibir propriedades contráteis e "contração" na cultura. Linhas de células humanas têm também sido agora estabelecido 5. Em adição a estas linhas celulares imortalizadas, mioblastos mononucleares podem ser isoladas a partir do músculo e sob as mesmas condições de privação de soro irá formar miotubos. Estas linhas celulares e culturas primárias de mioblastos são altamente usarful porque eles podem ser transf ectadas com plasmídeos ou transduzidas com vírus e utilizado para estudar processos celulares biológicas básicas. No entanto, essas células, mesmo quando induzidos a formar miotubos, não têm muitas das características marcantes da organização músculo maduro. Especificamente, miotubos são muito menores do que miofibras maduras individuais e não têm a forma normal de miofibras. Criticamente, myotubes falta transversais (T-) túbulos, a rede membranoso necessária para eficiente liberação de Ca2 + em todo o myoplasm.

Um método alternativo para mioblastos primários ou linhas de células miogénicas implica a utilização de miofibras maduras. Transgénese pode ser utilizada para determinar a expressão de proteínas marcadas, mas este método é dispendioso e demorado. Electroporação in vivo de músculo do rato tem surgido como um método preferido para a sua velocidade e fiabilidade 6-10.

Métodos para electroporação in vivo e o isolamento eficiente de miofibras have foi otimizado para o flexor digitorum brevis rato (FDB) 6. Os métodos podem ser prontamente concluída e são minimamente invasiva para induzir a expressão in vivo a partir de plasmídeos. Esta abordagem é agora combinado com métodos de imagem de alta resolução de imagem, incluindo após a interrupção do laser do sarcolema 6,7. A combinação de corantes fluorescentes e de expressão de proteínas marcado por fluorescência pode ser utilizado para monitorar os processos biológicos das células em miofibras maduras.

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Protocol

Os métodos neste estudo foram realizados de acordo com a ética Feinberg School of Medicine da Northwestern University Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) aprovou diretrizes. Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento.

1. Processo Experimental para in vivo Eletroporação do brevis flexor (FDB) Bundle Muscle no mouse

  1. Plasmídeos de desenho para expressão in vivo utilizando um promotor conhecido para expressar em células de mamífero (por exemplo, citomegalovírus, CMV) ou no músculo (por exemplo, músculo de creatina quinase, MCK) 6,7. Plasmídeos maiores podem expressar em níveis mais baixos. O promotor CMV foi usado extensivamente 6,7.
  2. Purifica-se plasmídeos a partir de E. coli utilizando endotoxina condições livres por as instruções do fabricante. Dissolve-se o plasmídeo em estéril, livre de endotoxinas tampão TE a 2 - 5 ug de plasmídeo / ul.
  3. Dilui-se o plasmídeo e aliquotar para um ConcentraçãN com 20 ug de ADN em 10 ul de TE estéril isento de endotoxina (2 ug / uL) em tampão por injecção um tubo de microcentrífuga estéril. Prepare uma aliquota por injecção.
  4. Diluir o stock de hialuronidase para 1x com solução salina estéril tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio (PBS - / -), dando uma concentração final de 8 unidades. Alíquota de 10 ul de hialuronidase diluído por injecção num tubo de microcentrífuga estéril.
  5. Anestesiar o rato usando 2,5% de isoflurano até sedado e não responde a cauda ou beliscar dedo do pé. Colocar o animal numa posição supina sobre uma almofada de aquecimento ou mesa de aquecimento para manter a temperatura corporal normal.
  6. Limpe a pata do rato com uma aplicação alternada de um matagal iodopovidona e álcool três vezes, usando uma técnica de preparação originada pela instalação agulha e irradiando para fora. Esta técnica mantém o site agulha em uma condição asséptica, minimizando introdução de agentes patogénicos.
  7. Injectar a pata de the rato com 10 ul da solução 1x hialuronidase (2 mg / ml = 8 unidades) entre a pele e o músculo utilizando uma seringa esterilizada de 1 ml. Hialuronidase digere componentes da matriz extracelular para permitir a entrada mais eficiente do plasmídeo em miofibras. Introduzir na base do calcanhar e promover a agulha na direcção dos dedos do pé. Libertam lentamente o líquido quando a agulha é retraída. O local de injecção sob a pele vai se expandir e começar a virar rosa.
  8. Repita os passos 1.6 e 1.7 no pé contralateral.
  9. Desligue a anestesia e coloque o mouse de volta na gaiola. Permitir que o mouse para se recuperar totalmente da anestesia.
  10. Espere 2 horas.
  11. Repita os procedimentos de esterilização anestesiar e do pé, os passos 1.5 e 1.6.
  12. Injectar o ADN plasmídico diluído na almofada da pata da mesma forma como a hialuronidase. Verifique se o volume máximo é de 20 l ou menos. Para plasmídeo de expressão dupla injectar 20 ug de cada plasmídeo com um volume máximo de 20 &# 181; l ou menos.
  13. Repetir a injecção do plasmídeo em planta da pata contralateral ou usar o pé contralateral para injecções de controlo.
  14. No pé que foi inicialmente injectado, levantar a pele para longe do músculo sublinhado com uma pinça fina e colocar uma agulha G 27 com as bolas de pele perto dos dedos numa posição perpendicular à linha de curar-dedo do pé. Tome um segundo estéril 27 G agulha e colocá-lo horizontalmente através da pele no calcanhar. Coloque agulhas paralelas entre si ~ 1 cm de distância.
  15. Usando grampos jacaré, eletrodos de fixação para as agulhas paralelas certificando-se de que as agulhas não entre em contato com o outro. O uso de massa de modelar pode proteger os grampos no lugar.
  16. Conectar eléctrodos de um estimulador eléctrico.
  17. Electroporate o músculo através da aplicação de 20 pulsos, 20 ms de duração / cada, em 1 Hz, a 100 V / cm. Os dedos podem se contrair com a estimulação.
  18. Repetir o procedimento de estimulação no pé contralateral, se necessário.
  19. Remover agulhas. Limpe a pata com iodopovidona matagal.
  20. Desligue a anestesia. Devolver o mouse para a gaiola de recuperação e atividade monitor. Se o processo foi conduzido como se esperava, o animal deve recuperar a deambulação normal dentro de 30 minutos e não exibem nenhuma diferença no nível de actividade de locomoção ou comportamento pré-injecção. Portanto, não há necessidade de analgésicos pós-procedimento. Após a recuperação, devolver o animal para o viveiro.
    Nota: A expressão da proteína pode ser ensaiada tão cedo quanto 48 horas após a electroporação. No entanto, para permitir a recuperação mais completa após a electroporação, nós preferimos o isolamento e estudo de miofibras 7 - 14 dias após a electroporação 10. A expressão pode ser ensaiada tanto tempo quanto 4 semanas após a electroporação.

2. Procedimento Experimental para o isolamento do brevis flexor (FDB) Fibers

  1. Colagenase Thaw. Para cada pacote FDB preparar dois poços em uma placa de 12 poços de cultura de tecidos. Numa bem adicionar 1 ml de pré-aquecido Eagles Modificado por Dulbecco Meios mais albumina de soro bovino (DMEM + BSA) e na outra bem adicionar 1 ml de pré-aquecido Solução de Ringer. Além disso, adicione frescos 10 ml de solução de Ringer 1x aos 35 mm SYLGARD prato.
  2. Sacrificar o animal através de CO 2 ou inalação de gás anestésico, seguido por deslocamento cervical ou outro método para garantir a morte.
  3. Retire os pés traseiros acima da articulação do tornozelo utilizando uma lâmina de barbear limpa e mergulhe na solução de Ringer 1x nos 35 mm SYLGARD prato.
  4. Pin um pé apertado, único virado para cima, para o prato Sylgard com 30 g agulhas através de cada uma das 5 pontas do dedo do pé e no tornozelo.
  5. Começando no tornozelo, corte a pele para cima o lado do pé ao longo da linha do cabelo para os dedos dos pés, cuidado para não nick o músculo sob a pele. Repita no outro lado do pé.
  6. Segurando a pele na base do tornozelo com uma pinça fina, cortar a pele do outro lado do calcanhar.
  7. Levantar a pelebater com uma pinça, apontar sua tesoura para a pele, para não nick o músculo. Cortar o tecido conjuntivo subjacente, removendo eficazmente a pele.
  8. Para remover o feixe muscular FDB cortar o grande tendão no calcanhar para libertar o tendão a partir do osso. Segurando o tendão com uma pinça, disseque o pacote FDB do tendão grande branco cuidadosamente remover qualquer tecido conjuntivo anexado ao FDB com uma tesoura. Se feito corretamente o pacote será fácil decolar dos tendões subjacentes revelando tendões brancas brilhantes que conduzem aos dígitos individuais. Corte o FDB nos tendões perto dos dedos liberando o pacote do pé.
  9. Coloque todo o feixe muscular no poço contendo DMEM + BSA.
  10. Repita com o pé contralateral.
  11. Uma vez que todos os músculos FDB são isolados, adicionar 100 ul de colagenase a cada poço contendo DMEM + BSA e músculo.
  12. Verificar o sucesso de electroporação num microscópio de fluorescência invertido antes da digestão. Se properl feitoy, para cima de 90% de eficiência de transfecção pode ser alcançado.
  13. Incubar a placa numa atmosfera humidificada, a 37 ° C na incubadora de CO2 a 10% durante cerca de 1 h. O tempo de incubação pode variar, dependendo do modelo da doença e do fundo e o lote de colagenase.
  14. Após 1 hora, transferir cuidadosamente o pacote FDB para a solução de Ringer bem contendo somente.
  15. Tritura-se o feixe de FDB no poço com a solução de Ringer, utilizando uma pipeta de 1 ml. Cortar a extremidade da ponta da pipeta com uma lâmina de barbear limpa de tal forma que o pacote pode facilmente passar através da ponta da pipeta. Gentilmente triturar o músculo (~ 15 vezes) permitindo que o pacote para passar cima e para baixo paralela à ponta. Fibras intactas vai cair no Ringers Solution. Quando as fibras não são facilmente cair fora do pacote, coloque o músculo volta para solução de colagenase.
  16. Placa das fibras isoladas no prato ~ 500 mL por placa.
  17. Permitir que o músculo para digerir no poço durante 15 minutos.
  18. Repita os passos de 2.15para 2,17 até que o feixe diminui em tamanho e a maioria das fibras está dissociado do feixe (geralmente um total de 2-3 vezes). Uma vez que o músculo facilmente dissociado passa através de uma ponta de pipeta de 1 ml.
  19. Vamos fibras anexar ao prato para um mínimo de 15 min. Solução de Ringer fresca pode ser adicionado à placa para diluir colagenase residual ou alterada dependendo das limitações de tempo.
    Nota: As fibras estão agora prontos para a imagem latente.

3. Procedimento Experimental para a visualização da membrana induzida por laser danos usando microscopia confocal

  1. Fibras de carga imediatamente antes da imagiologia com 300 ul de 2,5 mM FM 1-43 de FM 4-64 corante em solução de Ringer. Geralmente, as fibras de imagem de 15 min a 2 horas após o seu isolamento. No entanto, as fibras podem ser visualizados até 24 horas após o isolamento.
  2. Coloque o prato com fundo de vidro em um microscópio confocal equipado com um laser UV e um objetivo 60X / 63X.
  3. Localize uma fibra. Certifique-se a fibra está firmemente ligadopara o prato tocando a base de microscópio. Excluir fibras que foram danificados durante o processo de dissociação. Fibras danificadas podem conter bolhas de membrana, altos níveis de captação do corante FM, onda ou dobrar intensamente.
  4. Para induzir danos na membrana da fibra, o sarcolema posicionar no centro da janela de imagem com um campo claro de núcleos. Concentre-se no sarcolemma utilizando o canal de FM corante tal que a sarcolemma é extremamente afiada.
  5. Coloque o cabelo ROI cruz no sarcolema utilizando o canal de FM 4-64.
  6. Irradiar um ponto 1 pixel a 80% de potência por 3 segundos (~ 350 nm x 350 nm área). Corante FM irá entrar na célula, no local da lesão. Potência e tempo pode ser ajustada para aumentar ou diminuir a área de insulto.
  7. Captar imagens da fibra antes do dano, no momento do dano, a cada 2 s de pós-dano, em seguida, a cada 10 segundos até 5 minutos. Tempo pode ser ajustado, dependendo da necessidade. Imagens individuais podem ser convertidos em filmes de lapso de tempo em Image J.
  8. Repita os passos3.3 a 3.7 em até 3 fibras por prato.

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Representative Results

A electroporação é uma técnica minimamente invasiva que introduz eficientemente DNA de plasmídeo purificado no brevis flexor (FDB) feixe muscular (Figura 1A). Sete dias após a transfecção proteína marcada fluorescentemente é visualizado em miofibras isolados (Figura 1B). Isolado fibras são então colocadas em placas e preparado para imagiologia de um microscópio confocal. As fibras podem ser submetidas a uma lesão induzida por laser. Corante FM pode ser utilizado para identificar o local da lesão da membrana (Figura 1C)

Durante o processo de digestão, um pequeno número de miofibras podem ser feridos (seta branca) (Figura 2A). Miofibras danificadas podem ser identificados por formação de bolhas de membrana presente no sarcolema (seta preta). A fibra danificada não é adequado para experimentação adicional e não devem ser usados. Imagens confocais representativas que mostram a expressão ófa proteína de fusão fluorescente dentro das fibras musculares isoladas Figura 2B. A utilização do promotor de CMV dirige a expressão da proteína óptima em miofibras. DIC imagem mostra uma fibra ideal. FM 4-64 está presente na membrana em níveis baixos antes de danos (Figura 2C).

Imagem representativa de um myofiber carregado com FM 4-64 fotografada em uma Leica SP 5 microscópio confocal. O sarcolemma está centrada no campo de visão (caixas brancas) e mira ROI (branco x) é alinhada na borda crocante, fluorescente do sarcolema em uma área desprovida de myonuclei (Figura 3, no meio). Os núcleos são evitados, pois podem influenciar corante FM análise post de imagem. Após dano à membrana, corante FM minimamente entra myofibers normais (Figura 3, à direita). As fibras musculares defeituosos no reparo da membrana irá exibir níveis de corante FM absorção aumentada após a lesão induzida por laser.

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Figura 1. Esquema de electroporação in vivo Protocolo de danos e Laser. (A) A hialuronidase é injectado na almofada da pata de um rato anestesiado. O DNA de plasmídeo é então injectado e a tensão é aplicada. (B) Sete dias após a injecção, o flexor curto do digitorum (FDB) feixe (seta branca meio painel) é isolado a partir de tendões da pata deixando atrás expostos (seta preta). (C) As fibras são plaqueadas e dano induzido por laser é realizada em miofibras vivo. O painel esquerdo, escala de 50 mm. Painel direito, escala de 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. myofibers Isolado Expressando fluorescente etiquetado proteínas. Sete dias após a eletroporação, a expressão da proteína é detectada durante todo o myofiber. (A) O isolamento procedimento resulta em um pequeno número de miofibras inutilizáveis ​​com blebbing distinta membrana (seta preta) e rupturas de membranas (seta branca). Escala de 5 uM. (B) Imagem representativa de uma fibra muscular saudável. Sarcômeros uniformemente espaçados são visualizados em imagens DIC (à esquerda). A myofiber expressar anexina A6 marcadas com GFP (painel de centro). Não há sinal mínimo FM corante antes de dano (painel direito). Escala de 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Alinhamento de laserCrosshairs no Sarcolema FM-positivo. A região de interesse no sarcolema é centrado dentro do campo de visão. O sarcolemma é ampliada (caixa pontilhada branca) e mira ROI alinhados à beira-FM positiva acentuada do sarcolema em uma área desprovida de núcleos (painel de centro). Após o dano, corante FM entra no local da lesão (painel da direita, seta branca). Escala de 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O uso de electroporação para estudar as proteínas marcadas por fluorescência in vivo, é idealmente adequado para o estudo do músculo devido à ausência de modelos de linhas celulares adequadas que reproduzem com fidelidade a estrutura da célula de músculo inteira. Este protocolo descreve a utilização de electroporação e microscopia confocal de alta resolução para fornecer imagens detalhadas de localização de proteínas e translocação após o ferimento a laser. Este método pode ser adaptado para estudar processos celulares, incluindo outras reorganização do citoesqueleto, tráfico e fusão.

Usando este protocolo, até 90% das miofibras no FDB feixe muscular plasmídeo expressa, e esta pode ser facilmente visto por microscopia de fluorescência antes e depois da dissociação de células musculares. Não é tipicamente um gradiente de expressão com maior expressão observada mais perto do local da injecção. Devido ao gradiente de expressão, o efeito da variação da expressão da proteína pode ser monitorizado froma experiência única. Tal como acontece com todos os métodos de transfecção, esta abordagem é limitada por questões relacionadas com a sobre-expressão. Notavelmente, com expressão de nível elevado, pode ocorrer a agregação de proteínas. Em nossa experiência, a etiqueta fluorescente mCherry demonstra mais do que a agregação tag reforçada proteína verde fluorescente (eGFP) reduzindo a resolução e nitidez de domínios de proteínas (por exemplo, ver Figura 4 em 7). Além disso, mTurquise2 e Venus marcadores fluorescentes ambos demonstrar a expressão de fluorescência suficiente. No entanto, ambas as proteínas são menos brilhante do que eGFP.

Este método pode ser usado para miofibras imagem vivos sob uma variedade de condições, incluindo agentes farmacêuticos teste e ferindo célula. Utilizou-se lesão laser para interromper o sarcolema, mas outros processos ferindo poderia ser adaptado para este método. Para este fim, a formação de bolhas de membrana criado por choque osmótico, bem como lesão de membrana induzida por laminagem pérolas de vidro também pode seravaliada utilizando myofibers eletroporados 11,12. Para ferimento do laser, o tipo e a potência do laser, bem como o objectivo vai influenciar o período de tempo necessário para criar uma lesão na membrana 13,14. Além disso, os buffers externas, especificamente da concentração de cálcio e corante FM dentro do tampão irá influenciar o processo de reparação 13,15. Esta metodologia tem sido testada em ambos os sistemas de imagem confocal Nikon e Leica e ambos são capazes de realizar a técnica. FM 4-64 é bem adequado para experimentação com proteína fluorescente verde 7. Outros têm utilizado FM 1-43, outro corante lipofílico que se liga fosfolípidos carregados negativamente, com um pico de excitação a 470 nm e de emissão de pico a 610 nm, o que limita a aplicação do presente corante 13,15,16. Fotodegradação e fototoxicidade são ambos possíveis resultados devido ao excesso de criação de imagens. A determinação do justo equilíbrio entre o tempo de exposição, frequência de imagem e número de canais fotografadasão parâmetros facilmente manipulados para reduzir esses efeitos.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede NS047726, NS072027, e AR052646.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11995-073 Dissection Media
Dilution: 50 ml +100 g BSA
Collagenase, Type II Life Technologies 17101-015 Fiber Digestion
Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot)
Falcon 12-well dishes Fisher Scientific 877229 Fiber Digestion
Ringers Solution Fiber Digestion and Imaging
Dilution: 146 mM NaCl
5 mM   KCl
2 mM   CaCl2
1 mM   MCl2
10 mM HEPES
pH7.4 in H2O
1 ml Pipettes Axygen T-1000-C-R Digestion
Razor Blades Personna 94-120-71 Digestion
Precision Glide 30 G needle BD Biosciences 305128 Dissection
1x PBS (-/-) Life Technologies 14190-250 Dissection
Sylgard 184 Fisher Scientific 50-366-794 Dissection
Forceps FST by Dumont #5/45 Dissection
Forceps Roboz RS-4913 Dissection
Scissors World Precision Instruments 500260 Dissection
BSA Sigma A7906 Dissection media
Dilution: 100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm dishes Fisher Scientific 08772B Dissection- used to hold sylgard
Clay Electroporation
Stimulator  Grass s88x Electroporation
Clamps Radio Shack 270-356 Electroporation
Triadine Aplicare 82-220 Electroporation
Precision Glide 27 G needle BD Biosciences 305136 Electroporation
Simulator Grass SIU-V Electroporation
Gauze Covidien 2146 Electroporation
Hyaluronidase Sigma H4272 Injection
Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock
1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)  BD Biosciences 329420 Injection
Eppendorf Tubes Fisher Scientific 02-682-550 Injection
35 mm glass bottom Microwell dish MaTek P35G-1.5-14-C Microscopy
FM 4-64 Life Technologies T-13320 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43 Life Technologies T-35356 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid Purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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