全山解剖和成年小鼠耳蜗的免疫

Neuroscience

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Summary

我们提出了一个方法,以分离科尔蒂的成年器官三个完整耳蜗匝(先端,中间,和碱)。我们还演示了一个程序,用荧光标记的抗体免疫染色。连同这些技术允许毛细胞,支持细胞,以及其他细胞类型中的耳蜗研究发现。

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Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (107), e53561, doi:10.3791/53561 (2016).

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Abstract

Introduction

内耳的螺旋形耳蜗,包含在颞骨内,容纳尔蒂,在哺乳动物听觉感官端器官的器官。耳蜗是tonotopically组织并通常分为顶,中间,和基底轮流对应于不同的频率范围具有高频率的声音的检测,在碱和低频检测在顶点1。毛细胞,Corti器的mechanosensory细胞,运行耳蜗,这大约是6毫米长的小鼠2,3的长度。这些细胞将声波转换,这是通过填充流体的膜迷路发送,进入通过中央听觉结构处理的神经信号的机械能。此处所描述的技术提供了制备柯蒂氏器的全样载耳蜗后钙化的方法完成(为样本范围从年龄一周成年)。我们还提出了immunosta的方法都进不去,整个安装耳蜗组织。人工耳蜗整个坐骑是所有毛细胞的可视化和周边配套细胞在自然空间布局的关键,并允许进行分析的三个维度与使用共焦显微镜。

博士。汉斯恩斯特龙和哈洛阿德斯最初描述整个支架耳蜗解剖法在1966年他们详述的技术迅速修复和解剖钙化耳蜗浸没在液体中从各种哺乳动物,保留柯蒂氏器的短完好分段微观分析4。不固定,钙化大鼠耳蜗的解剖也已在教学视频5所示 。博士。芭芭拉Bohne和加里·史密斯在华盛顿大学取得了一些重要的修改这个方法。在他们的耳蜗整装方法的版本,颞骨是脱钙,嵌入塑料,和五个半圈,十四分之一圈是dissec特德6,7。查尔斯·利伯曼博士,并在伊顿皮博迪实验室,麻省眼耳医院的同事,修改了此技术使塑料包埋是不需要8。该技术的进一步修改发生在践祚博士的实验室在圣裘德儿童研究医院9-12该通知这里介绍的清扫方法。我们使用了不同的策略来访问科尔蒂比Bohne和利伯曼,的器官,它允许完全根尖,中间,和基底匝隔离。因此,解剖组织较大且较不可能在解剖或免疫染色过程丢失或损坏。此外,目前的方法有利于从心尖尖端或基底钩,以确定的频率区域的距离的测量。

尽管许多实验室进行耳蜗组织免疫,目前还不清楚其中这些方法起源。其结果是有各种配方用于阻断buffeRS和抗体孵育缓冲液可能影响个体初级抗体的性能。这里,我们提出的一种方法使用本身是适用于听觉领域最常用的抗体荧光标记的抗体的免疫染色。

形状复杂的耳蜗,柯蒂氏器的精巧结构,和骨包套提供用于组织学和生物化学分析的一个挑战。多种技术的听证会现场,目前用于克服这些困难的特点和尔蒂,每种技术都有自己的优点和缺点的器官内可视化的细胞。这里介绍的协议允许成年小鼠耳蜗的整装解剖和,稍加修改,可潜在地用于检查耳蜗内的关键结构从各种在该领域中使用的其他模型生物。

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Protocol

伦理声明:涉及动物主题程序已经批准的机构动物护理和使用委员会在南伊利诺伊大学医学院。

1.提取颞骨的

  1. 识别颞骨在小鼠头骨13的基极和刮掉使用标准图案镊子脑神经。
  2. 放置标准图案镊子在听囊的前端与具有相反手压机的拇指向下后半规管撞出包封耳蜗。
  3. 从头骨用拇指和食指或用10.5厘米细剪刀手工释放底部的颞骨的一半。

2.定位后颞骨

  1. 放置颞骨到含有250 2 ml微量离心管 - 加入500μl的4%多聚甲醛(PFA)稀释在10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4的和incub吃在RT 2 - 20小时。
    注:没有开放的顶帽疫区或注射入圆形或椭圆形窗是必要的。推荐使用甲醇自由,超纯水,电子显微镜(EM)级的PFA,可以在玻璃小瓶中16%的浓度被购买。一旦小瓶打开,稀释1:在PBS中的4,制备4%的溶液,它可用于长达2周贮存 4℃时(一些抗体需要短固定和其他人可以容忍O / N(O / N)固定)。

3.脱钙颞骨

  1. 固定后,用移液管除去PFA,并替换为120毫乙二胺四乙酸(EDTA),略超过2毫升确保以填充整个2 ml离心管,以防止当管闭合气泡。
    1. 如果不立 ​​即脱钙,用10毫米的PBS pH值7.4并确保样品更换PFA在4℃。
      注:固定后,颞骨可存放variab乐大量的时间脱钙取决于抗原被检测之前。
  2. 在最终的过肩年底将管和旋转在4转速在室温。用吸管每日更换EDTA溶液。脱钙长度取决于样品的年龄和科学家做夹层的偏好。
    1. 使用孵化倍以下准则孵育颞骨的EDTA:
      对于样品产后天(P)8〜P15:2 - 4小时;如需样品P15到P21:O / N;如需样品P21到P30:2 O / N;对于年龄大于P30样品:3以上的O / N。
      注:脱钙时间都受到用户的喜好,并可以根据需要进行扩展。脱钙时间可以由天改变EDTA溶液两次,大约8小时,相隔降低。一些实验室加1%PFA中于EDTA溶液脱钙时为长于3天,以防止污染。
  3. 要确定样品充分脱钙,将颞骨Ø呐硅弹性体涂层剥离菜,轻轻按下钳到蜗形耳蜗。如果组织是spongey,然后脱钙完成。
  4. 一旦脱钙完成后,用移液管除去EDTA和添加10mM的pH 7.4的PBS 500 -1,000微升。样品储存在摄氏 4度,直到准备解剖。

4.创建有机硅弹性体涂层夹层菜

  1. 结合的基极和有机硅弹性体密封剂的试剂盒,根据制造商的说明固化剂并充分混合。
  2. 添加约2 - 3汤匙木炭粉,直到解决的办法是黑色的,拌匀。
    注:液体油墨或液体木炭不会与溶液混合,并且不能使用。有机硅弹性体密封袋可以在黑色购买,允许步骤4.2省略。
  3. 将溶液倒入60毫米的玻璃或塑料培养皿,充足的外套的底部。如果BUbbles都存在,粉扑与空气的表面上。静置至少24小时,在RT下凝固。
    注:硅酮弹性体涂覆的菜肴,可反复使用多年。然而不使用乙醇进行清洗,因为这将导致有机硅弹性体产生裂纹。

耳蜗的5整装夹层(为P7和较旧的示例)

  1. 分离底转由中间/顶圈
    1. 放置在硅氧烷弹性体涂覆的解剖菜填充三分之二全用10mM pH 7.4的PBS 1脱钙颞骨和使用立体声解剖显微镜以下步骤。
    2. 持在前庭区域的颞骨与#4或#5直珠宝商的镊子,并使用5毫米Vannas-杜宾根弹簧剪刀,剪去多余的听囊组织沿着侧面和顶点的上方。
    3. 使用2.5毫米Vannas弹簧剪刀,将一个刀片插入椭圆形窗口,并沿着螺旋韧带/横向几个小伤口壁的底转。
    4. 使用5毫米Vannas,蒂宾根弹簧剪刀,将一个刀片插入只是削减了区域并将另一个刀片上的颞骨外,内侧卵圆窗。这种切割分离底转由中部和心尖圈。
  2. 的底转完成清扫。
    1. 使用2.5毫米Vannas弹簧剪,连接到蜗轴来释放在底转的张力,切下底转,以从前庭器官分离螺旋神经节神经纤维。
    2. 使用2.5毫米Vannas弹簧剪刀,使一系列小切口,以从上方和下方Corti器除去螺旋韧带/侧壁。使用4号或5#直珠宝商的镊子来指导组织。引脚上的螺旋神经节神经纤维的有机硅弹性体涂层剥离菜,但不要抱到本地区的组织会撕裂。
    3. 在前面的步骤,一些赖斯纳的MEMBRAN的则e会经常被移除。如果任何仍然存在,把握赖斯纳的膜#4或5#直珠宝商的镊子和Corti器的绝尘而去。
      注:盖膜很少是可见的,通常浮离开,而无需去除特定的步骤。
    4. 终于使几个切口以减小螺旋神经节轴突的厚度,以使转尽可能平整并使用#4或#5直珠宝商的镊子转移解剖底转,通过抓住螺旋神经节的剩余轴突,到一个48孔板(或腔室滑动)含有〜500微升的10mM pH 7.4的PBS。
  3. 独立的中部和顶端圈
    1. 将剩余的三分之二的耳蜗,顶面朝下的。
    2. 使用2.5毫米Vannas弹簧剪刀,插入一个刀片成当所用的中间转连接到底转中阶,并且使沿第的螺旋韧带/侧壁几个小伤口Ë中间转。
    3. 用5毫米Vannas-杜宾根弹簧剪刀,插入一个刀片成刚切断与中间转放置在叶片的顶部的区域中,并把其他刀片上的骨迷路外,在从顶端末端的90°角。这种分离顶圈中间转。
  4. 中间转以类似的方式,以底转完整解剖(见步骤5.2.2至5.2.4节)。
  5. 的顶圈完成清扫。
    1. 使用2.5毫米Vannas弹簧剪刀,打开盖顶转帽。以类似的方式,以底转完整解剖(见步骤5.2.2至5.2.4节)。
      注:解剖耳蜗匝免疫染色之前存储在10毫米的PBS pH值7.4在48孔板(或玻片) 4℃数周。然而PBS将蒸发,需要定期补充和存储长于2 - 3个星期可能会导致对细菌或真菌生长组织,可以降低图像的质量。我们建议长期存放的样品作为undissected颞骨的。

6.免疫染色与荧光标记的抗体

  1. 解剖后,存储每个耳蜗轮流在一个单独的井在48孔板(或玻片),淹没在〜500微升10毫PBS pH值7.4。对于每一个执行以下步骤的耳蜗转弯应该浸没在液体中,而不是浮在上面或粘到井的侧面。
    注:从每个去除液体很好,很容易失去耳蜗转弯或吸起来的枪头。更改使用解剖范围200微升枪头,解决方案将帮助防止这一点。
  2. 使用移液管,从每个孔除去的PBS,并替换为〜200 - 每阻断/透化溶液(井300微升1%的Triton X-100,1%牛血清白蛋白(BSA)和10%正常山羊血清(NGS)稀释在10mM PBS中p^ h 7.4)。孵育1小时,在室温上的三维旋转。
    注意:如果使用的任何第一抗体是在山羊宿主,然后一个第二抗羊抗体将需要和NGS 应该被用于任何的步骤。正常马血清可以用作替代NGS。
  3. 使用移液管除去阻断/透化溶液,并替换为每一次抗体溶液以及〜100微升(0.1%的Triton X-100,稀释在10mM pH 7.4的PBS的1%BSA和5%NGS)。每个初级抗体的稀释因子而变化。孵育O / N(最小14小时),在摄氏 4度的三维旋转。
    注意:如果一个以上的一级抗体时,所有可组合成孵育相同的溶液,只要确保每个主抗体具有不同的主机。
  4. 使用移液管除去第一抗体溶液,并以每孔〜500微升执行的10mM pH 7.4的PBS洗涤3次。每次洗涤孵化上的3D旋转器最少5分钟,在室温。
  5. 删除后PBS洗涤利用移液管,并替换为〜100μl的每二次抗体溶液以及(0.1%的Triton X-100,稀释在10mM pH 7.4的PBS的1%BSA和5%NGS)。每个稀释因子荧光标记的第二抗体,通常为1:500,或1:1000。将48孔板在一个黑盒子,以保护荧光从光标记二级抗体。孵育2 - 3小时,在室温上的三维旋转。
    注意:如果一个以上的第二抗体是需要的,它们可以组合成用于孵育的相同溶液。确保有交叉标记的可能性例如,使用山羊抗兔和鸡抗山羊二抗)
  6. 使用移液管除去二级抗体溶液,并在每孔〜500微升执行的10mM pH 7.4的PBS洗涤3次。孵育每次洗涤为至少5分钟,在室温上的三维旋转。保持48孔板的一个黑盒子避光。
  7. 用吸管取出最后的PBS洗涤和更换,每Hoec的嘛〜100微升HST 33342(稀释1:2000在10mM的PBS pH 7.4)中来标记细胞核。孵育15 - 在3D肩在室温下20分钟。保持48孔板的一个黑盒子避光。不要孵育时间超过20分钟。
  8. 使用移液管除去Hoechst的溶液,并在每孔〜500微升执行的10mM pH 7.4的PBS洗涤3次。孵育每次洗涤为至少5分钟,在室温上的三维旋转。保持48孔板的一个黑盒子避光。
  9. 如果需要的话所有步骤可以延长,除Hoechst的孵化,由几个小时。要暂停反应在任何阶段,只是淹没在〜500微升10毫PBS pH7.4的样品,并 4℃,直到准备在48 -嗯板(或玻片)存储恢复协议小时或1 -后2天。

7.安装人工耳蜗打开幻灯片

  1. 标签幻灯片关于所使用的样品和抗体的相关信息。
  2. 吸取〜50微升安装介质到每张幻灯片,小心以防止泡沫。离心管中的安装介质,以消除任何气泡。
  3. 使用#4或#5直珠宝商的镊子,把握螺旋神经节的轴突从48孔板在安装介质轻轻传送一个耳蜗转于滑动和地点。每滑动摩1耳蜗转,以防止在成像过程中曝光和光漂白。
  4. 使用立体声解剖显微镜,以确保耳蜗转弯不折叠,扭曲或附近的气泡。如果这些情况发生,使用#4或5#直珠宝商的镊子重新定位耳蜗转。
  5. 放置在幻灯片上的盖玻片的一端,轻轻松开,让盖玻片下降。
  6. 使用立体声解剖显微镜,以确保耳蜗转弯没有被折叠,扭曲或附近的气泡。如果这些情况发生时,轻轻将盖玻片来回重新定位耳蜗转。
  7. 将幻灯片在一个幻灯片文件夹,以便他们放平。让安装媒体治愈O / N在室温(保持在黑暗中)
  8. 密封盖玻片透明指甲油和储存在室温或-20℃,直到成像。玻片可以存储在一个文件夹中滑动或滑动箱。
    注:幻灯片可以在-20℃-80℃,荧光保存长期将维持数月。
  9. 使用共聚焦显微镜与基于免疫染色过程中所用的第二抗体的合适的波长的图像的幻灯片。亮度和对比度调整可以使用由共焦供应商提供的成像软件来执行。

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Representative Results

我们提出了一个方法,以分离Corti器的三个完整的耳蜗匝(先端,中间,和碱)从耳蜗组织即钙化, 1中呈现键清扫步骤。在第一产后周的发展,钙化小鼠耳蜗是不完整的,更简单的夹层方法可用于13。使用新生儿整装解剖法耳蜗Corti器从P7和小鼠的结果流泪老年人和碎纸。螺旋韧带/侧壁现在更牢固地附着,并且不能剥离远离感觉上皮不造成损伤。因此,“成人”整装解剖的方法是需要超过P6样本。我们提出的已解剖并免疫染色毛细胞和支持细胞标记物图2)一个P15小鼠耳蜗的中间转的例子。光交叉C节一个也可与整个装载技术图3)获得的。

可发生在整个安装过程中剥离的几个问题或安装人工耳蜗,当打开幻灯片。在拆除螺旋韧带/侧壁的,有切割过多或不足之间的窄窗口。旁边的外毛细胞的最后行发生切口可能导致毛细胞在这个最后一排在不同的角( 图4A)来安装。削减太大的可去除尔蒂( 图4B)的器官切片。处理用钳子将样品非常谨慎,经常有在尔蒂,其中钳被放错了地方的器官( 图4C)的孔。最后安装耳蜗转弯时,科尔蒂的器官可以折叠它掩盖了图像( 图4D)。

图1
图中的全山解剖的“成人”的老鼠耳蜗。(A)1。重要步骤后,协议的步骤5.1.4,耳蜗的底转由中间/顶圈分离,但仍附着于前庭区。 (二)在协议的步骤5.3.3,中间又是从根尖依次分离。的中间转,其中螺旋韧带/侧壁被删除已完成清扫三)实例。 请点击此处查看大图这个数字。

图2
图中间的2共焦切片图像从P15鼠标打开隔离。四20X图像叠加来重建整个中间转。毛细胞标记有兔抗肌球蛋白Ⅶa因子初级抗体(1:200稀释)结合的驴抗兔Alexa的488结合的第二抗体(1:1000稀释)(品红色)。支持细胞标记有山羊抗Sox2的初级抗体(1:500稀释)结合的驴抗山羊的Alexa 568缀合的第二抗体(1:1000稀释)(绿色)。赫斯特(蓝色)标签所有的核。使用蔡司LSM 700共聚焦显微镜,405,488,555波长影像的拍摄。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
中间的图3.光交叉部分关闭隔离从6周老鼠。 (一)整装准备(底部)和光交叉截面在XZ平面(上图)的共聚焦切片图像。(B)(A)增加了顶部面板的放大倍率,除去了十字星。毛细胞标记有兔抗肌球蛋白Ⅶa因子初级抗体(1:200稀释)结合的驴抗兔Alexa的647缀合的第二抗体(1:1000稀释)(品红色)。支持细胞标记有山羊抗Sox2的初级抗体(1:500稀释)结合的驴抗山羊的Alexa 568缀合的第二抗体(1:1000稀释)(绿色)。使用蔡司LSM 700共聚焦显微镜,405,555,647波长影像的拍摄。比例尺= 20微米请点击此处查看该图的放大版本。

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图问题4.示例,可以发生在全山解剖或当安装人工耳蜗打开幻灯片。( 一)关于影像的左侧,耳蜗组织被切断旁边外毛细胞的最后一排造成了许多的待安装这些细胞在不同的角度。(B)的尔蒂在图像的左侧的器官的部分已经被切断。(C)的有冲压的外毛细胞区域中的中间有孔图像(D)中,柯蒂氏器被折叠在几个地方。图片取自4 - 8周的小鼠耳蜗。毛细胞标记有兔抗肌球蛋白Ⅶa因子初级抗体(1:200稀释)结合的山羊抗兔Alexa的488结合的第二抗体(1:1000稀释)或驴抗兔Alexa的488标记的二抗(1:1000稀释)(品红色)。在C外毛CEL的ls标记有山羊抗prestin无初级抗体(1:200稀释)结合的驴抗兔Alexa的568缀合的第二抗体(1:1000稀释)(绿色)。使用Leica SP5共焦显微镜405,488,和555的波长的图像拍摄。标尺:在AB = 20微米;在CD = 40微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

有成功的整装解剖和免疫组化的几个关键步骤。但是前两种方法之一被执行,需要耳蜗组织的正确固定。我们建议使用甲醇免费,超纯水,EM级PFA。 PFA从粉末制成的可以有甲醇和不稳定的pH值从而降低免疫荧光的质量的痕迹。其他组也表明类似夹层是可能使用的固定剂不含有甲醛14-16。固定的长度也很重要,是抗体特异性的。一些抗体能够容忍的O / N固定,而另一些人不只是1小时正常工作的PFA(然而,这是罕见的)。下固定的组织可能是有问题的夹层方法作为组织分崩离析。在我们的经验,3 - 4小时的固定提供了足够的固定和不与大多数在听力领域中常用的一级抗体的干扰。

jove_content“>这也有可能是EDTA可与初级抗体干扰;因此一些抗体将很好新生组织,但不是在P7以上组织被脱钙固定后,颞骨可存放的时间之前不同量脱钙取决于抗原被检查,有些抗原需要几天内脱钙和解剖到周固定后,而另一些可以被存储为年(之前或之后脱钙)而不降低免疫染色的质量。我们建议存储样本作为颞骨由于从48孔板的和潜在的污染真菌或细菌的存储介质(PBS)中的蒸发的风险。我们通常执行整个装载清扫不到一周提前到免疫染色。

一旦固定,脱钙,整个安装解剖与浸没在液体中的颞骨进行。除去过量的骨和软组织早期围绕迷宫的解剖将在除去螺旋韧带/侧壁的通过促进组织的操纵和提供关键结构的较少模糊的视图有助于在稍后阶段。当执行前几个步骤,钳可以用来保持在前庭区域中的组织。然而,一旦匝隔离,避免将镊子上科尔蒂或螺旋韧带/侧壁的器官是重要的。相反,保持钳闭和脚螺旋神经节神经纤维的有机硅弹性体涂层剥离菜。不要抓住本地区的组织会撕裂。在一般情况下,一旦组织已被划分成三圈,抓和拉动操纵可导致不可预测的结果,这往往有损于柯蒂氏器,应该避免。从年轻的动物(P7-P21)组织往往比年龄超过P21动物组织更宽容。另外,与发单元d耳蜗样品豪悦国际更难解剖。如果鼠标接收噪声暴露组织特别脆弱。无论组织的状态,我们目前的清扫技术要求高,需要很多实践尝试的能力。

期间免疫染色,重要的是,每个耳蜗依次浸没在液体中,不能浮在上面或粘到井的侧面。这允许仓鼠和抗体的更完全渗透进入组织。当从每个去除液体很好,很容易失去耳蜗转弯或绘制成枪头。更改使用解剖范围200微升枪头,解决方案将帮助防止这一点。慢慢的提取液与移动枪头,如果耳蜗转太接近。此外pipetteting废溶液放入一个干净的试管可以是一个很好的策略,因为这废旧灯管可以被搜索,如果又是不小心吸进吸管。如果转卡在移液管尖,叔他尖端可以切割开用刀片,但往往柯蒂氏器,如果发生这种情况将被损坏。

当故障排除抗体免疫染色,可以加入额外的步骤,例如抗原修复或信号增强。有低pH值和高pH值的抗原,可以购买揭露试剂。如果抗体不与这里所描述的方法的工作,第一协议改变尝试是这些抗原修复方法之一。另外,使用信号增强器。有市售的解决方案,以使用可被用于扩增来自第二抗体的信号之前免疫染色,或酪酰胺扩增的试剂盒。

我们提出的技术中的意义是保持Corti器的三维结构,并在器官内可视的所有细胞的能力。耳蜗的整个长度被分成仅三匝而其它相似的技术,即第ËBohne和利伯曼方法,需要分成5 - 10 6-8,增加的采样数在免疫染色和成象过程操纵。这是由科斯格罗夫和格拉顿开发的人工耳蜗外侧壁切开需要技巧的水平相似,并有可能在不固定的,新鲜组织,以及在脱钙组织,但尔蒂的器官被剥夺,并破坏了隔离的过程侧壁17。另一组已经从三个周龄大鼠其中螺旋韧带/侧壁把持而剥离远离柯蒂氏器执行类似的解剖中未定影的,新鲜的耳蜗组织,而使器官完好无损。然而,这仅仅是在顶圈5分 。剥离螺旋韧带/侧壁远离Corti器的方法,是一只小老鼠(<P7)13例程固定的组织解剖。然而,在我们与年纪比P6小鼠,固定在后经验ð脱钙,这个动作经常流泪Corti器的不可靠的方式。除了这里所描述的过程允许中间和基底的隔离变成为好。

石蜡包埋后获得的冷冻切片和部分也常用在听觉域。这些方法允许其它结构的可视化,如血管纹,Reissner变的膜,和盖膜,但每个部分只允许尔蒂在每个耳蜗依次器官的一个小区域的可视化。因而,调查发生在一个镶嵌图案的事件,诸如细胞损失或细胞分裂,用切片法,50个或更多的幻灯片需要被染色并成像捕捉耳蜗的整个长度。相比之下,整个安装解剖协议有准备尔蒂的整个器官在短短的三个优势。除了保留Corti器的纵向架构,这TEC的好处hnique允许简化的数据收集和储存。整个装载夹层的一个限制是它破坏周围结构如螺旋韧带,血管纹,Reissner变的膜,和盖膜。另一个限制是该技术难度和的时间长度为一个单一的清扫。这主要是由于Corti器和小幅度的脆弱性错误去除螺旋韧带/侧壁时。 30分钟 - 一旦掌握了,可以在20进行的一种耳蜗的整装清扫。

虽然上述协议描述了整个装载清扫方法成年小鼠,我们希望这种技术适用于听觉领域中使用的其他模式生物。我们的实验室正在修改此技术的大鼠耳蜗的清扫。的大鼠的较大耳蜗被装在一个较厚的听囊被更密集地钙化比鼠标。因此,颞骨必须通过电子邮件xcised大剪刀。固定和脱钙用EDTA前,耳囊应打开用剪刀允许耳蜗组织更好地进入。还脱钙过程较长,可能需要长达3个星期取决于样品的年龄。对于整个装载解剖,骨迷路的大小影响的技术。大鼠耳蜗的增加的大小提供螺旋韧带/侧壁和柯蒂氏器官之间略大的距离,提供误差为单个切口的一个较大的幅度。但是,而较大的组织可以提供更多的材料,以掌握操纵样品的,这还需要更多数量的削减,除去螺旋韧带/侧壁的整个长度。我们相信,类似的修改,可能会从栗鼠,沙鼠和豚鼠耳蜗的解剖进行。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard  pattern forceps Fine Science Tools 11000-12 can be purchased from other vendors
10.5 cm fine scissors Fine Science Tools 14060-11 can be purchased from other vendors
2 ml microcentrifuge tubes MidSci AVSS2000 can be purchased from other vendors
16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade Polysciences 18814 TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. 
PBS pH 7.4  Sigma P3813-10PAK can be purchased from other vendors
EDTA Fisher BP118-500 can be purchased from other vendors
end-over-end tube rotator Fisher 05-450-127 can be purchased from other vendors
60 mm petri dish Fisher 50-202-037 can be purchased from other vendors
Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
activated charcoal Fisher AC134372500 can be purchased from other vendors
stereo dissection microscope Zeiss Stemi 2000 can be purchased from other vendors
Dumont #4 jeweler's forceps Fine Science Tools 11241-30
Dumont #5 jeweler's forceps Fine Science Tools 11251-20
2.5 mm Vannas spring scissors Fine Science Tools 15001-08 curved 
5 mm Vannas-Tubingen spring scissors Fine Science Tools 15003-08 straight
48-well plates Fisher 08-772-52 can be purchased from other vendors
8-well chamber slides Fisher 1256518 can be purchased from other vendors
Triton X-100 Sigma X100-500 can be purchased from other vendors
BSA, fraction V Fisher BP1605 can be purchased from other vendors
NGS Vector labs S-1000 can be purchased from other vendors
NHS Vector labs S-2000 can be purchased from other vendors
3D rotator Midsci R3D-710 can be purchased from other vendors
Western blot incubation box XL Licor 929-97401
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 can be purchased from other vendors
Prolong gold antifade mounting media Life Technologies P36930 can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching
Superfrost Plus Slides Fisher 12-550-15 can be purchased from other vendors
coverslips 22 x 22 x 1 Fisher 12-548-B can be purchased from other vendors
clear nail polish Local drug store can be purchased from other vendors
cardboard slide folder Fisher 12-587-10 can be purchased from other vendors
plastic slide box Fisher 03-448-10 can be purchased from other vendors

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References

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