Au-Interaction des SLP1 Polymères et monocouche de

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Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies. J. Vis. Exp. (107), e53572, doi:10.3791/53572 (2016).

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Abstract

Introduction

En raison de l'utilisation croissante de l'or pour plusieurs applications comme l'électronique, les catalyseurs, les biocapteurs, ou des instruments médicaux, à la demande de ce métal précieux a augmenté au cours du temps de ces dernières années 6-9. Or, ainsi que beaucoup d'autres métaux précieux et lourds sont libérés dans l'environnement par les effluents industriels à des concentrations diluées, à travers des activités minières, et l'élimination des déchets 7,8,10, bien que la plupart contamination de l'environnement par des métaux lourds ou précieux est un processus continu principalement causés par des activités technologiques. Cela conduit à une interférence significative des écosystèmes naturels et pourrait menacer la santé humaine 9. La connaissance de ces résultats négatifs favorise la recherche de nouvelles techniques pour éliminer les métaux provenant des écosystèmes et des améliorations dans le recyclage des métaux contaminés des eaux usées industrielles. Bien établies méthodes physico-chimiques comme la précipitation ou échange d'ions ne sont pas si efficaces, surtout en hauteLy dilué solutions 7,8,11. Biosorption, soit avec la vie ou la biomasse morte, est une alternative intéressante pour le traitement des eaux usées 10,12. L'utilisation de ces matériaux biologiques peut réduire la consommation de produits chimiques toxiques. De nombreux micro-organismes ont été décrits à accumuler ou d'immobiliser les métaux. Par exemple, les cellules de Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 ont montré des capacités de liaison élevée pour les métaux précieux, par exemple, Pd (II), Pt (II), Au (III), et d'autres métaux toxiques comme le plomb (II) ou U (VI) 4,13, les cellules de Bacillus megaterium pour Cr (VI) 14, les cellules de Saccharomyces cerevisiae de Pt (II) et Pd (II) 15, et Chlorella vulgaire de Au (III) et U (VI) 16 , 17. La liaison des métaux précédents comme Au (III), Pd (II), et Pt (II) a également été rapportée pour Desulfovibrio desulfuricans 18 et L. sphaericus JG-B53 19,20. Néanmoins, pas all microbes lient des quantités élevées de métaux et leur application en tant que matériau de sorption est limitée 12,21. En outre, la capacité de liaison du métal dépend de différents paramètres, par exemple, la composition de la cellule, la bio-composant utilisé, ou de l'environnement et des conditions expérimentales (pH, force ionique, température, etc.). L'étude de fragments de paroi cellulaire isolés 22,23, comme les lipides membranaires, peptidoglycane, des protéines ou d'autres composants, aide à comprendre le processus de cellules entières construites complexes 8,21 liaison du métal.

Les composants de la cellule ont porté sur dans cette étude sont des protéines de la couche S. Les protéines de la couche S sont des parties de l'enveloppe cellulaire externe de nombreuses bactéries et archaebactéries, et ils constituent environ 15 - 20% de la masse totale en protéines de ces organismes. Comme la première interface pour l'environnement, ces composés cellulaires influencent fortement les propriétés de sorption 3 bactériennes. Les protéines de la couche S avec des poids moléculaires allant de quaranteà des centaines de kDa sont produites à l'intérieur de la cellule, mais sont assemblés à l'extérieur où ils sont capables de former des couches sur les membranes lipidiques ou polymériques composants de la paroi cellulaire. Une fois isolé, presque tous de la couche S protéines ont la propriété intrinsèque d'auto assembler spontanément en suspension, au niveau des interfaces, ou sur des surfaces planes ou formant tubulaires structures 3. L'épaisseur de la monocouche de protéine dépend de la bactérie et est dans une plage de 5 à 25 nm 24. En général, les structures des protéines de la couche S formés peuvent avoir une oblique (P1 ou P2), carré (p4), ou hexagonal (p3 ou p6) symétrie avec des constantes de réseau de 2,5 à 35 nm 3,24. La formation du réseau semble être dans de nombreux cas, dépendant des cations divalents et principalement sur ​​Ca2 + 25,26, Raff, J. et al. S-couche de nanocomposites à base pour des applications industrielles à base de protéines dans Engineered nanostructures. (eds Tijana Z. Grove et Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (soumis)). Néanmoins, la cascade de réaction pleine de monomère pliage, l'interaction monomère-monomère, la formation d'un réseau, et le rôle des différents métaux, en particulier des cations bivalents tels que Ca 2+ et Mg 2+, ne sont pas encore pleinement compris.

La souche de bactéries gram-positives L. sphaericus JG-B53 (renommé de Bacillus sphaericus après nouvelle classification phylogénétique) 27 a été isolé à partir de la pile de déchets des mines d'uranium "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Saxe, Allemagne) 4,28,29. Son fonctionnelle de la protéine S-couche (SLP1) possède un réseau carré, un poids moléculaire de 116 kDa 30, et une épaisseur de ≈ 10 nm sur 31 cellules bactériennes vivant. Dans des études antérieures, la formation in vitro d'une couche de protéine fermée et stable d'une épaisseur d'environ 10 nm a été obtenue en moins de 10 min 19. La souche liée L. sphaericus JG-A12, également un isolat de la pile "Haberland", possède des capacités de liaison élevés des métaux et de sa protéine isolée de la couche S a montré un bon taux de sorption haute stabilité chimique et mécanique et pour les métaux précieux comme l'Au (III), Pt (II), et Pd (II) 4,32,33. Cette liaison de métaux précieux est plus ou moins spécifique pour certains métaux et dépend de la disponibilité des groupes fonctionnels sur la surface de protéine extérieure et intérieure du polymère et dans ses pores, la force ionique et le pH. Groupes fonctionnels pertinents pour l'interaction de métal par les protéines sont COOH-, NH 2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 -, et SO-. En principe, les capacités de liaison métalliques ouvrent un large éventail d'applications, Raff, J. et al. S-couche de nanocomposites à base pour des applications industrielles à base de protéines dans Engineered nanostructures. (eds Tijana Z. Grove et Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (soumis)). par exemple, en tant que composants biosorptive pour l'élimination ou la valorisationde métaux précieux ou toxiques dissoutes, des modèles pour la synthèse ou le dépôt de nanoparticules défini régulièrement structurés métalliques (IP) pour la catalyse, et d'autres matériaux de bio-ingénierie comme couches bio-sensorielle 3,5,18,33. NP tableaux disposés régulièrement comme Au (0) -NPs pourraient être utilisés pour des applications majeures allant de l'électronique moléculaire et les biocapteurs, des dispositifs de stockage ultra-haute densité, et des catalyseurs pour le CO-oxydation 34-37. Le développement de ces applications et la conception intelligente de ces matériaux nécessite une compréhension plus profonde des mécanismes contraignants de métal sous-jacent.

Une condition préalable pour le développement de ces matériaux à base de bio-est de la mise en œuvre fiable d'une couche d'interface entre la biomolécule et la surface technique 38,39. Par exemple, les polyélectrolytes assemblés avec la couche par couche (LBL) 40,41 technique ont été utilisées en tant que couche d'interface pour la recristallisation des protéines de la couche S 39 19,42, Raff, J. et al. S-couche de nanocomposites à base pour des applications industrielles à base de protéines dans Engineered nanostructures. (eds Tijana Z. Grove et Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (soumis)). Cependant, le mécanisme complexe de l'adsorption des protéines et l'interaction protéine-surface soit pas complètement compris. Surtout informations sur la conformation, l'orientation du motif, et les densités de revêtement est toujours manquant.

Microbalance à cristal de quartz avec la surveillance de dissipation (QCM-D) technique a attiré l'attention ces dernières années comme un outil pour l'étude de l'adsorption des protéines, de la cinétique de revêtement, et l'interaction proles processus à l'échelle du nanomètre 19,43-45. Cette technique permet la détection de masse en détail adsorption en temps réel, et peut être utilisé comme un indicateur pour le processus d'auto-assemblage de protéines et de couplage de molécules fonctionnelles sur 19,20,42,46-48 réseaux de protéines. En outre, les mesures QCM-D ouvrent la possibilité d'étudier les processus d'interaction de métal avec la couche protéique dans des conditions biologiques naturelles. Dans une étude récente, l'interaction de la protéine S-couche avec des métaux choisis comme Eu (III), Au (III), Pd (II), et Pt (II) a été étudié avec QCM-D 19,20. La couche de protéine adsorbée peut servir comme un modèle simplifié d'une paroi cellulaire des bactéries gram-positives. L'étude de ce seul composant peut contribuer à une meilleure compréhension de l'interaction de métal. Cependant, uniquement expériences QCM-D ne permettent pas de déclarations concernant les structures et les influences de métaux à la protéine de surface. D'autres techniques sont nécessaires pour obtenir ces informations. Un POSbilité pour l'imagerie bio-nanostructures et l'obtention d'informations sur les propriétés structurelles est la microscopie à force atomique (AFM).

L'objectif de l'étude présentée était d'enquêter sur la sorption de l'or (Au ​​(III) et Au (0) -NPs) aux protéines de la couche S, en particulier SLP1 de L. sphaericus JG-B53. Des expériences ont été faites avec des protéines en suspension sur l'échelle de lots dans une gamme de pH de 2,0 à 5,0 en utilisant l'ICP-MS et S-couches immobilisées en utilisant QCM-D. En outre, l'influence de la solution de sel métallique sur la stabilité du réseau a été étudié par des études ultérieures de la FAM. La combinaison de ces techniques contribue à une meilleure compréhension des processus in vitro dans d'interaction de métal comme un outil pour apprendre plus sur les événements de cellules bactériennes entières concernant les affinités de liaison métalliques spécifiques. Cette connaissance est essentielle non seulement pour le développement de matériaux filtrants applicables pour la récupération des métaux pour la protection de l'environnement et la conservation des re49 sources, mais aussi pour le développement de réseaux de IP métalliques hautement ordonnés pour diverses applications techniques.

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Protocol

1. Microorganismes et la culture Conditions

Note:. Toutes les expériences ont été effectuées dans des conditions stériles L. sphaericus JG-B53 a été obtenu à partir d'une culture de cryo-conservé 29,30.

  1. La culture (1,5 ml) sous le banc propre transfert cryo-conservés jusqu'à 300 ml de bouillon nutritif stérile (NB) médias (3 g / L extrait de viande, 5 g / l de peptone, 10 g / l de NaCl). Ensuite agiter la solution pendant au moins 6 heures à 30 ° C pour obtenir la pré-culture pour la culture.
  2. Cultiver les bactéries dans des conditions aérobies dans les médias NB à pH = 7,0, 30 ° C dans un bioréacteur de 70 L escaladèrent la vapeur en place. Par conséquent, remplir le réacteur avec ≈ 57 L d'eau déminéralisée. Ajouter et dissoudre médias NB solide directement dans bioréacteur (concentrations voir ci-dessus).
    1. En outre ajouter un agent antimousse (30 pl / L NB-médias) pour les médias pour supprimer la formation de mousse lors de la culture, puis l'autoclave (122 ° C, température de maintien de temps de 30 min) les médiasà l'intérieur de l'installation du réacteur.
  3. Refroidir les médias et effectuer la saturation complète de l'oxygène. Ajuster le pH à 7,0 (en utilisant une MH 2 SO 4 et 2 M de NaOH) et commencer l'inoculation automatique de la 300 ml de pré-culture. Commencez l'enregistrement de données de paramètres de culture au point d'inoculation. Connectez paramètres en ligne par exemple, le niveau d'oxygène dissous (OD 2), plus acide et de base, et des valeurs de pH au sein de la culture.
    1. Surveiller la croissance bactérienne en ligne par des mesures de turbidité non invasives.
  4. Effectuer un prélèvement supplémentaire après chaque heure de la culture et de déterminer autre paramètre, comme le poids à sec bio (BDW) et une densité optique déconnecté (DO). Par conséquent, recueillir 20 ml de bouillon de culture à chaque point d'échantillonnage dans des conditions stériles.
    1. Déterminer déconnecté OD par des mesures photométriques de l'adsorption à 600 nm. Utilisez-NB moyen filtré stérile comme une valeur vide. À l'arrièreer atteindre adsorption> 0,4 ​​dilué la suspension cellulaire suivant la linéarité de la loi de Lambert-Beer.
    2. Pour la détermination de BDW une centrifugeuse de 5 ml de suspension bactérienne (en fonction de la densité cellulaire) à 5000 g pendant 5 min à température ambiante. Sécher le culot cellulaire obtenu à 105 ° C dans un four de chauffage jusqu'à stabilité masse et mesurer la masse de granules.
  5. Prendre des images microscopiques en phase de recherche optique microscope à contraste 400 et 1000 fois grossissement (contraste de phase de condenseur 2 et 3 respectivement) pour le contrôle de la croissance bactérienne et à titre de témoin de contamination croisée.
  6. Après avoir atteint la phase de croissance exponentielle détecté par ligne DO 2 et la turbidité en ligne, récolter la biomasse par centrifugation à flux continu à 15.000 xg, 4 ° C et laver la biomasse à deux reprises avec un tampon standard (TRIS 50 mM, MgCl2 10 mM, 3 mM NaN3, pH = 7,5).
    Remarque: Le culot de biomasse obtenue peut être stocké à -18 & #176; C jusqu'à utilisation ultérieure pour l'isolement.

2. La protéine de la couche S Isolement et purification

Remarque: Purifier SLP1 polymères selon un procédé adapté tel que décrit précédemment 2,19,30,32,50,51.

  1. Homogénéiser la biomasse brut lavé et décongelé obtenu à partir de la culture dans un tampon standard (1: 1 (p / v)) pour éliminer flagelles en utilisant un disperseur (niveau 3, 10 min) dans un bain de glace de refroidissement à 4 ° C.
  2. Centrifuger la suspension (8000 xg, 4 ° C pendant 20 min) et on lave le culot deux fois avec du tampon obtenu standard (1: 1 (p / v)). Après lavage et centrifugation (8000 xg, 4 ° C pendant 20 min), remettre en suspension le culot dans un tampon standard (1: 1 (p / v)), ajouter de la DNase II et de la RNase (0,4 unité / g de biomasse) de la suspension et se désintègrent les cellules à 1000 bars avec un homogénéisateur haute pression. Ensuite centrifuger la suspension à 27 500 xg, 4 ° C pendant 1 heure.
    Remarque: Contrôle suspension de cellules avec les mi de recherchecroscope. Rupture est terminée lorsque moins de 2 - 3 cellules intactes sont visibles dans le champ du microscope au grossissement 400 fois de la vue.
  3. Laver le culot deux fois avec un tampon standard (1: 1 (p / v)) et effectuer une nouvelle centrifugation. Ensuite resuspendre le culot dans un tampon standard (2: 1 (p / v)) en mélange avec 1% de Triton X-100 et incuber pendant 20 min sous agitation successifs (100 rpm) à solubiliser les dépôts lipidiques.
  4. Centrifuger la solution (27 500 xg, 4 ° C pendant 1 heure) et laver le culot obtenus trois fois avec un tampon standard (1: 1 (p / v)).
  5. Incuber le culot obtenu après centrifugation supplémentaire (27 500 xg, 4 ° C pendant 1 heure) pendant 6 heures dans un tampon standard (1: 1 (p / v)) mélangé à 0,2 g / l de lysozyme, pour hydrolyser des liaisons de peptidoglycane 50. En outre ajouter de la DNase et de la RNase II (chaque 0,4 unités / g de biomasse) à la suspension.
  6. Après centrifugation (45 500 xg, 4 ° C, 1 h), remettre en suspension la phase de protéine de blanc supérieur avec un faible volume de til surnageant de centrifugation (<30 ml) contenant de sous-unités protéiques.
  7. Solubiliser la suspension blanche par mélange de 1: 1 avec 6 M de chlorhydrate de guanidine (GuHCl 6 M, Tris 50 mM, pH = 7,2). La solution devient lumineux.
  8. Effectuer une filtration stérile (0,2 pm) de la solution traitée GuHCl suivie d'une centrifugation à grande vitesse supplémentaire (45 500 xg, 4 ° C pendant 1 heure).
  9. Transférer le surnageant dans des tubes à membrane de dialyse (MWCO de 50 000 Dalton) et dialysées contre le tampon de ce recristallisation (TRIS 1,5 mM, CaCl2 10 mM, pH = 8,0) pendant 48 heures.
  10. Transférer la solution de polymère protéique recristallisée blanc dans des tubes et centrifuger à 45 500 xg, 4 ° C pendant 1 heure. Remettre en suspension le culot dans un petit volume d'eau ultrapure (<30 ml).
  11. Ensuite, transférer la suspension dans des tubes membranaires de dialyse et d'effectuer une dialyse contre de l'eau ultra pure pendant 24 heures pour éliminer le contenu de la mémoire tampon.
    Remarque: Plusieurs changements de tampon ou de l'eau ultra pure durant la dialyse sont indispensables.
  12. Lyophiliser la SLP1 purifié dans un lyophilisateur.

3. caractérisation et la quantification des SLP1 pour les expériences

Remarque: concentration SLP1 pour des expériences de sorption et de revêtement ont été quantifiés par spectrophotométrie UV-Vis.

  1. Pipette 2 pl de l'échantillon dissous SLP1 directement sur le socle de mesure inférieure du photomètre. Déterminer la concentration en protéine à un maximum d'adsorption à une longueur d'onde de 280 nm, caractéristique des protéines. Utiliser le coefficient d'extinction de 0,61 pour déterminer la concentration SLP1. Utiliser une solution libre pour SLP1 mesures de référence.
  2. Diluer la protéine avec du tampon (pour des expériences de sorption en mode batch utilisant 0,9% de NaCl, pH = 6,0 et pour des expériences QCM-D utilisent tampon de recristallisation, pH = 8,0) à la concentration désirée pour les expériences (1 g / L et 0,2 g / L respectivement).
  3. Analyser SLP1 la qualité et le poids moléculaire par la norme bioanalProcédé ytical sodium dodécyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE) décrit par Laemmli, Royaume-Uni 52.
    1. Effectuer SDS-PAGE avant d'utiliser SLP1 dans les expériences et, par exemple, après Au (0) -NP incubation en utilisant 10% de gels de séparation de polyacrylamide.
    2. Pour SDS-échantillons mélange ≈ 10 pi de la culture ou de la protéine échantillon avec un tampon d'échantillon (1,97 g de Tris, 5 mg de bleu de bromophénol, 5,8 ml de glycérine, 1 g de SDS, 2,5 ml β-mercaptoéthanol, se remplissent de l'eau ultrapure à 50 ml) dans un rapport de 1: 1 (v / v) et la pipette le mélange après 4 min d'incubation à 95 ° C dans les poches de gel.
    3. Exécuter SDS-PAGE 30 min sous une tension de 60 V jusqu'à ce que les échantillons passent le gel et le changement de collecte tension 120 V, une fois le passage du gel de séparation.
    4. Retirer les gels du système de gel, rincer à l'eau ultra pure et lieu pendant 1 heure dans une solution de fixation (acide acide de 10%, 50% d'éthanol absolu). Ensuite, rincer les gels avec de l'eau ultra-pure.
    5. Gels Stainen utilisant un colloïdale non spécifique adapté Coomassie méthode au bleu de 53,54. Après décoloration 72,73, prendre des images de SDS-PAGE par le système de documentation de gel selon le protocole du fabricant.

4. Les expériences de sorption en mode batch et la quantification de Métal

  1. Pour le lot des expériences de sorption préparent Au (III) solution stock de HAuCl4 ∙ 3 de H 2 O, diluer le sel de métal et le mélanger avec la solution SLP1 / NaCl à une concentration de métal initiale de 1 mM et la concentration finale SLP1 de 1 g / L . Effectuer des expériences dans des triplets avec un contrôle négatif supplémentaire sans SLP1. Utiliser un volume total de 5 ml pour des expériences de sorption.
  2. Secouez la suspension en continu à la température ambiante à différentes valeurs pré-ajusté pH entre 2,0 à 5,0 pendant 24 heures (ajuster le pH avec une faible solution de HCl et NaOH concentré).
  3. Après sorption, centrifuger les échantillons à 15 000 xg, 4 ° C pendant 20 min) à SEPARmangé SLP1 à partir du surnageant.
  4. Transférer le surnageant dans des tubes d'ultrafiltration (MWCO 50 000 Da) et centrifuger à 15 000 xg ce, 4 ° C pendant 20 min pour éliminer les monomères protéiques dissous.
  5. Déterminer la concentration de métaux dans le filtrat résultant par ICP-MS 19,20 et utiliser les résultats pour le dos-calcul de sorption métallique par la masse sèche SLP1. Principes de mesure, les possibilités de la méthode et des composants de l'occasion ICP-MS ont été décrits dans la littérature 55.
    1. Préparation des échantillons et des références pour les mesures ICP-MS en utilisant 1% de HNO 3 et du rhodium en tant que matrice comme étalon interne (1 mg / ml).

5. Synthèse de Au-NP et Détermination de la taille des particules

Remarque: Au Citrate stabilisé (0) -NP ont été synthétisés selon une méthode décrite précédemment par adaptée Mühlpfordt, H. et al. (1982) pour obtenir des particules sphériques avec un diamètre de 10 - 15 nm 56,57

  1. Préparer un stabilisée mM HAuCl 25 4 ∙ 3 H 2 O stock pour la formation NP.
  2. Diluer 250 pi de cette solution mère dans 19,75 ml d'eau ultra pure et incuber ces à 61 ° C pendant 15 min sous agitation successives.
  3. Préparer 5 ml d'une deuxième solution de réserve (12 mM d'acide tannique, 7 mM de citrate de sodium di-hydrate, 0,05 mM de K 2 CO 3) et incuber la solution 2 ème séparément à 61 ° C pendant 15 min.
  4. Ajouter sous constante agitation de la solution stock de 2 ème à la solution d'un. On agite le mélange réactionnel pendant au moins 10 min à 61 ° C. Ensuite refroidir la solution et l'utiliser pour NP revêtement sur SLP1 réseau à l'intérieur des expériences QCM-D.
    Note: Au résultant (0) -NP ont été caractérisés par spectroscopie UV-VIS au maximum d'absorbance de 520 nm, typiquement utilisé pour la détection de forme Au (0) 58 -NPs. La solution peut être conservé à 4 ° C.
  5. Analyse de la taille de la formeAu (0) -NP par spectroscopie par corrélation de photons (PCS) qui est également connu comme diffusion de lumière dynamique.
    1. Pour la détermination de la taille NP, transférer 1,5 ml de Au synthétisé (0) -NP solution dans des cuvettes dans des conditions exemptes de poussière dans une zone d'écoulement laminaire et de l'analyser avec une taille des particules et potentiel calibreur zêta. Une description détaillée de PCS et préparation de l'échantillon est donnée dans Schurtenberger, P. et al. (1993) 59 et Jain, R. et al. (2015) 60.

6. QCM-D Essais - SLP1 revêtement sur des surfaces et Au-NP adsorption sur SLP1 Lattice

Note: Les mesures ont été effectuées avec un QCM-D équipé avec jusqu'à quatre modules d'écoulement. Toutes les expériences QCM-D ont été réalisées avec un débit constant de 125 pi / min à 25 ° C. SLP1 revêtement métallique et / NP incubation ont été effectuées sur SiO 2 capteurs piézoélectriques AT-coupe quartz (Ø 14 mm) avec une fréquence fondamentale de ≈ 5 MHz. Étapes de rinçage et d'ajouterition de la solution sont marqués dans les chiffres de la partie représentative des résultats. Les expériences QCM-D pourraient être décrites comme une étape par étape en commençant par le nettoyage et la modification de la surface des capteurs utilisés suivie d'une recristallisation SLP1 et par la suite l'interaction de NP métal et le métal.

  1. Procédures de nettoyage:
    1. Equiper les cellules du liquide avec des mannequins de capteurs. Pompe à au moins 20 ml (chacun par module) d'un agent de nettoyage liquide alcalin (2% nettoyant en eau ultra-pure (v) / v) par le système QCM-D et le tube. Ensuite pomper le volume cinq fois (chaque par module) d'eau ultra pure dans le système (débit jusqu'à 300 pi / min). Effectuer le nettoyage conformément au protocole du fabricant.
    2. Nettoyer les capteurs de SiO 2 à l'extérieur des modules de débit par incubation (20 min au moins) dans une solution de SDS à 2% et ensuite rincer les capteurs à plusieurs reprises avec de l'eau ultrapure 61,62.
    3. Sécher les cristaux avec comp filtréeressed air et placez-les dans une chambre de nettoyage d'ozone pendant 20 min 63,64.
    4. Répétez la procédure de nettoyage deux fois pour éliminer tous les contenus organiques.
    5. Pour éliminer les métaux consolidés à partir de la surface du capteur rincer les capteurs avec 1 M HNO 3. Ensuite, effectuer toutes les étapes de rinçage avec de l'eau ultra-pure.
  2. Capteur Modification de surface par Polyelectrolytes:
    Remarque: La modification de surface peut se faire soit à l'intérieur (circuler à travers la procédure) ou à l'extérieur du module de flux (technique LBL). Dans ces expériences de la manière suivante pour modifier les surfaces a été utilisé.
    1. Modifiez les capteurs à 3 g / L d'une alternance de couches de PE de polyéthylène (PEI, MW 25000) et le polystyrène sulfonate (PSS, MW 70000) via le revêtement par immersion en utilisant la technique LbL 40,41 décrit précédemment pour le système utilisé spéciale dans l'article de Suhr, M. et al. (2014) 19.
    2. Placez les capteurs à l'intérieur du PE-solution appropriée dans une profonde well plaques et incuber ceux-ci pendant 10 min à température ambiante.
    3. Prenez les capteurs de PE-solution et rincer les capteurs entre chaque étape de revêtement par immersion intensive avec de l'eau ultra-pure.
      Remarque: La nouvelle modification de surface se compose d'au moins trois PE couche terminaison avec chargée positivement PEI.
    4. Après cette modification externe placer des capteurs à l'intérieur du module de débit et équilibrer les capteurs par rinçage avec de l'eau ultrapure avant de commencer les expériences.
  3. SLP1 monocouche recristallisation:
    1. Dissoudre SLP1 à 4 M d'urée pour convertir polymères en monomères.
    2. Centrifuger les protéines à 15 000 xg monomerized, 4 ° C pendant 1 heure pour éliminer les plus gros agglomérats de protéines.
    3. Mélanger le surnageant et on le centrifuge SLP1 solubilisée avec le tampon de recristallisation à une concentration finale en protéines de 0,2 g / L.
      Remarque: Le calcium selon recristallisation de SLP1 (auto-assemblage) commence par addition de la recrystallization tampon. Par conséquent, pomper la solution mixte avec un débit de 125 ul / min pour les capteurs (placé à l'intérieur des modules d'écoulement) immédiatement. La recristallisation se fait après des valeurs stables de la fréquence et de dissipation des changements ont été détectées dans des expériences QCM-D.
    4. Après avoir réussi recristallisation de protéines au-dessus des capteurs de PE modifiée à l'intérieur des modules de débit rincer les capteurs enrobés avec du tampon de recristallisation ou ultrapure waterintensively avec un débit de 125 ul / min jusqu'à ce que des valeurs stables de la fréquence et de dissipation des changements ont été détectés.
      Remarque: La modification de la surface de SiO 2 avec du PE pour les expériences ultérieures de sorption SUR DES monocouches et AFM études SLP1 est visualisé sur la figure 1.

Figure 1
Figure 1. Schéma Design du PE Modification de surface et SLP1 monocoucheRevêtement; Ce chiffre a été modifié de Suhr, M. et al. (2015) 19 avec l'autorisation de Springer. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Métal et Métal NP Interaction:
    Remarque: La sorption de la solution de sel de métal Au (HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O) a été réalisée à des concentrations de 1 mM ou 5 mM à pH = 6,0 à 0,9% de NaCl. Au-NP adsorption a été fait avec non dilué au-IP dans 1,6 mM de tampon tri-sodium-citrate à pH ≈ 5,0.
    1. Après succès revêtement SLP1 dans les modules de débit, rincer la couche SLP1 obtenu intensivement avec une solution de NaCl à 0,9% jusqu'à ce que les valeurs stables de la fréquence et de dissipation des changements ont été détectés.
    2. Pomper la solution préparée en métal (1 mM) et une solution de NP les modules d'écoulement avec un débit de 125 ul / min et l'écoulement de suivre l'adsorption de masse à la Slcouche de p1. Adsorption de masse peut être détectée directement par le suivi des décalages de fréquence se référant à l'équation Sauerbrey (équation 1).
    3. Après avoir terminé l'interaction de métal et NP métallique, rincer avec la couche tampon sans métal / NP pour enlever faibles des métaux ou des nanoparticules attachées liés ou faibles.
      Remarque: Une illustration du montage expérimental est représenté sur la figure 2.

Figure 2
Figure 2. Schéma de conception de l'installation QCM-D à l'aide du module de flux QFM 401 * 66. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Enregistrement des données et de l'évaluation:
    1. Enregistrer les changements dans la fréquence en Hz (Af n) et la dissipation (AD n) Dans les expériences QCM-D en utilisant QCM-D logiciel spécifique.
    2. Utilisation pour évaluation de la sensibilité masse adsorbée (Δm) de l'équation / modèle Sauerbrey (Equation 1) 65 66 qui est valable pour des films minces et rigides couplés sans frottement à la surface du capteur appliqué à la n-ième harmonique. Le terme C (Sauerbrey constant) utilisé pour la 5 MHz au niveau du capteur de quartz de coupe est de 17,7 ng ∙ Hz -1 ∙ cm -2 68. Pour rigide, répartis uniformément, et suffisamment minces couches adsorbées utiliser l'équation 1 comme une bonne approximation.
      Equation 1
    3. Effectuer la modélisation supplémentaires selon le modèle de Kelvin-Voigt valable pour molécules viscoélastiques 68-71 avec le logiciel spécifique au fabricant et de comparer les résultats avec celui du modèle Sauerbrey.
    4. Pour le calcul de l'épaisseur de la couche et l'utilisation d'adsorption de massecomme paramètre de modélisation importante une densité de couche de la couche adsorbée de 1,35 g cm -3 ∙ correspondant à des valeurs décrites ci-dessus pour les protéines de la couche S 72-75. Utiliser la même valeur pour le calcul de l'interaction avec le métal de la couche protéique.

7. Mesures de l'AFM

  1. Réaliser des études avec tout à fait capable AFM sur un microscope optique inversé.
    1. Images AFM d'enregistrement à l'état liquide à l'aide du tampon de recristallisation ou de l'eau ultra pure directement sur les capteurs revêtus QCM-D.
    2. Rincer les capteurs avec de l'eau ultra pure après des expériences QCM-D et de les placer à l'intérieur de la cellule fluide AFM. Par conséquent, en utilisant une cellule de fluide fermé avec un volume total d'environ 1,5 ml. Gardez la température de la constante de cellule fluide à 30 ° C.
    3. Utiliser un cantilever avec une fréquence de résonance de 25 kHz ≈ dans l'eau et une raideur de <0,1 N / m. Réglez la vitesse de balayage entre 2,5 et 10 um / sec.
    4. 76.
      Remarque: Les images de hauteur sont illustrées avec z-échelle tout en valeurs z représentent la topographie exacte de la surface. Amplitude (pseudo 3D) images sont montrées sans z-z-échelle en raison des valeurs d'amplitude dépendent de paramètres de numérisation et portent des informations limitées. Analyse des images a été fait à l'aide de trois logiciels d'évaluation différente de 77.

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Representative Results

La culture de micro-organismes et SLP1 Caractérisation

Les données enregistrées de la croissance bactérienne indique la fin de la phase exponentielle de croissance à environ 5 heures. Enquêtes précédentes ont montré que SLP1 peut être isolé à partir de ce moment de la récolte (4,36 g / biomasse humide L (≈ 1,45 g / L (BDW)) avec un rendement maximal 19. Néanmoins, l'optimisation de la culture en utilisant des composants de médias définis ou fédé- les stratégies de culture discontinue conduirait à une hausse des rendements de la biomasse. Cela est inaliénable à l'utilisation de grande quantité de biomasse pour des applications industrielles. Les valeurs de la ligne et les paramètres de culture déconnecté enregistrées sont résumés dans la figure 3A. commande microscopique (figure 3B) au moment de la récolte montrent cellules non sporulées de L. sphaericus JG-B53.


Figure 3: (A) ligne et hors ligne mesurée culture paramètres de L. sphaericus JG-B53 et (B) image microscopique d'vitales des cellules bactériennes de L. sphaericus JG-B53 au moment de la récolte dans 400 fois agrandissement; Ce chiffre a été modifié de Suhr, M. et al. (2014) 19 avec l'autorisation de Springer. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

En outre, un profil de protéine SDS-PAGE en outre réalisé (figure 4A) indique la quantité maximale de SLP1 au moment de 5 heures de culture. La bande de protéine correspondant à SLP1 (≈ 150 kDa) est plus épaisse, mais à partir d'ici sur une perte d'intensité a été observée agrémié par une augmentation des protéines ayant un poids moléculaire inférieur causée par la fragmentation de la protéine ou de ségrégation possible d'autres protéines. Les bandes de protéines isolés et purifiés obtenus par le procédé mentionné ci-dessus (figure 4B) correspond à un poids moléculaire d'environ 150 kDa, qui est plus lourd que le poids calculé sur la base de données de séquençage de SLP1 (116 kDa) 30. Cela est probablement dû à modifications post-traductionnelles. Autres raisons de l'inadéquation entre la masse moléculaire théorique et la masse moléculaire observée dans des gels de SDS sont éventuellement facturer artefacts dépendants dans le gel SDS 30.

Figure 4
Figure 4. Profils de protéine fabriquée par SDS-PAGE de (A) désintégrées cellules bactériennes obtenues à partir d'échantillons de culture et (B) purifié SLP1 après isolement succès; Ce fifigure a été modifiée de Suhr, M. et al. (2014) 19 avec l'autorisation de Springer. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Expériences Lot-sorption et détermination de l'UA ICP-MS

Les capacités de liaison de métal maximal (q max) de Au (III) en suspension SLP1 sont présentés sur la figure 5. Les résultats montrent que Au (III) a été stablement lié par SLP1 au cours de l'incubation de 24 heures dans la plage de pH étudiée. Les résultats indiquent q max dans la gamme d'environ 80 - 100 mg d'Au (III) / g SLP1. Les valeurs résumées (tableau 1) ont été comparées à la capacité de sorption de l'ordre de 75 mg de Au (III) / g SLP1 rapporté précédemment par Suhr, M. et al. (2014) obtenu à partir d'expériences avec l'auto-réglagela valeur du pH par addition de la solution de sel métallique (pH ≈ 4,3) 19. Pour résumer, SLP1 a montré la capacité de lier de grandes quantités d'abord ajoutée Au (III) prouver ses capacités de liaison élevée pour cet élément.

Figure 5
Figure 5. Schéma de Maximum Metal capacités de liaison (Q max) de Au (III) à des polymères SLP1 dans les expériences de pH ajusté par rapport aux résultats de sorption en utilisant des valeurs de pH auto-ajusté (≈ 4.3) déclarés par Suhr, M. et al. (2014) 19. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les rendements d'enlèvement de métal calculées (RE) dans la gamme de pH étudiées étaient entre 50 - 60%, confirmant ainsi la resultats faites par Suhr, M. et al. (2014) où les valeurs de l'ordre de 40% ont été atteints. Dans les expériences faites précédemment, fortes interactions de Au (III) avec les groupes fonctionnels, par exemple carboxylic-, hydroxyle et amino, a été observé pour les protéines de la couche S comme SLP1 et pour la protéine comparative SLFB de L. sphaericus JG-A12 1,78. Jankowski, U. et al. (2010) ont détecté une forte interaction par spectroscopie de Au (III), principalement avec des groupes carboxyliques de SLFB qui pourrait également être déduites de SLP1 de L. sphaericus JG-B53 20,79,80. En outre, les propriétés intrinsèques de la protéine qui réduiraient Au (III) de Au (0) en l'absence d'agents réducteurs peuvent être une raison de la forte interaction 79. En outre, les résultats de cette étude montrent la tendance d'une liaison préférée de SLP1 à des valeurs de pH inférieures. D'autre part, une liaison à des valeurs de pH inférieures pourrait également conduire à une dénaturation de SLP1. Études à l'SLP1 prouvé une stabilité de la protéine jusqu'à pH =3,0 (résultats non publiés). A partir d'expériences de désorption dans des conditions acides, en utilisant par exemple l'acide nitrique ou au moyen d'agents complexants tels que l'EDTA de citrate ou (données non présentées), vérifie que l'or a été lié de manière stable et ne peut être libéré à partir de polymères SLP1.

Au (III) sur SLP1 de L. sphaericus JG-B53
c initiale (mg / L) 196,97
pH 5 4.5 ≈ 4,3 23 4 3.5 3 2.5 2
valeur
q max 88,3 85,3 74,7 102,5 94,1 81 101,9 96,9
(mg Au (III) / g SLP1)
47,1 47,8 37,9 57,1 54,1 44,8 58,7 56,5
(%)

Tableau 1: Maximum Metal capacités de liaison (Q max) et les efficiences d'enlèvement de métal (RE) de Lot-sorption expériences avec Au (III) et SLP1 polymères en solution analysés par ICP-MS. Données modifiées par rapport aux résultats déjà publiés de Suhr, M. et al. (2014) 19.

SLP1 monocouche recristallisation chenilles par QCM-D

La diminution immédiate de fréquence (Af 5, 7 Af, Af 9, 11 Af) indique une adsorption rapide et une forte affinité des protéines à la surface modifiée de PE (figure 6A). Égale à la variation rapide de la fréquence, la dissipation (AD 5, 7 AD, AD 9, AD 11) augmente également immédiatement. Ce fait indique une adsorption des molécules viscoélastiques à la surface en raison de l'amortissement rapide résultant de l'augmentation des valeurs de dissipation. Le décalage de fréquence maximale est atteinte après 5 min d'une valeur de ≈ 95 Hz et AD de 4,2. À un stade ultérieur seulement réarrangements de recristallisation SLP1 se produisent. SLP1 adsorption a été thusly effectuée pendant plus de 60 min pour assurer til formation d'une surface presque entièrement couvert et régulièrement ordonné réseau de protéines. L'expérience montre que la couche PE chargée positivement est inaliénable pour la réalisation de revêtements stables, la modification de fin négative conduit à une adsorption plus faible et la cinétique de revêtement (données non présentées) 38. Faiblement attachée protéines et agglomérats ont été enlevés par un rinçage avec un tampon de recristallisation SLP1-libre. Les petits changements de Af n confirment la désorption faible en protéines et l'adsorption stable de SLP1. Malgré cela, la dissipation descend à ≈ 2,8 indiquant que les molécules plus grandes élastiques sont retirés.

Figure 6
Figure 6. recristallisation du SLP1 sur modifiés SiO 2 capteurs analysés par QCM-D; (A) dans Af / parcelle AD et (B) l'épaisseur de la surface profile; Ce chiffre a été modifié de Suhr, M. et al. (2014) 19 avec l'autorisation de Springer et de Suhr, M. (2015) 20. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Le profil de surface calculée en utilisant les modèles mentionnés précédents montrent une épaisseur monocouche SLP1 de ≈ 11,2 nm (modèle de Kelvin-Voigt pour les films élastiques) et de 10,0 nm (modèle Sauerbrey pour la couche rigide) (figure 6B). Ces valeurs sont inférieures à celles déclarés par Suhr, M. et al. (2014). Les différences peuvent être expliquées par une valeur utilisé différentes de la densité de la couche de protéines dans la modélisation. Les valeurs de courant doivent être plus proche de la réalité de l'épaisseur de couche de protéines de la couche S sur la surface cellulaire de cellules vivantes de L. sphaericus JG-B53 31,42. Cette modélisation montre que la relation Sauerbrey is inapproprié acoustique mince couche protéique, en raison d'une propagation de l'onde acoustique de cisaillement dans les films liquides viscoélastiques 81,82 qui se traduit par une sous-estimation de la masse adsorbé SLP1 et l'épaisseur. Ceci peut être expliqué par les propriétés élastiques des protéines de la couche S et son couplage des molécules d'eau au cours du processus d'adsorption. L'interaction des protéines avec l'eau peut être facilement décrite par formation de coquilles d'hydratation, traînée visqueuse ou le piégeage dans les cavités dans la couche adsorbée 83. Ceci effectue une épaisseur de couche plus élevée mesurée par le modèle de Kelvin-Voigt et peut également expliquer les différences dans l'épaisseur de la couche obtenue par les deux modèles différents. Dans les études précédentes de l'AFM, des épaisseurs de couche de l'ordre de treillis SLP1 8-12 nm ont été mesurées. En calculant l'adsorption masse de SLP1, à la place de l'épaisseur de la couche, un total de 1506,6 Δm ng ∙ cm -2 (modèle de Kelvin-Voigt) a été calculée. Les données de l'adsorption de masse sur de surfAces sont résumées dans le tableau 2 et montrent une adsorption masse élevée en utilisant les valeurs du modèle de Kelvin-Voigt.

m max Δm max épaisseur épaisseur
(ng / cm 2) (ng / cm 2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
SLP1 après revêtement et rinçage 1,505.6 1,351.6 11.2 10

Tableau 2: masse adsorbée de SLP1 sur SiO 2 modifiés Polyelectrolyte cristaux analysés par QCM-D après rinçage à l'recristallisation tampon (pH = 8,0) et l'épaisseur de la couche Calculé.

QCM-D comme outil pour la détection des métaux et leurs NP Interaction avec Proteinaceous SLP1 monocouche

L'interaction de recristallisée avec une monocouche SLP1 mm et 5 mm dissous Au (III) a été étudiée. Les résultats de masse adsorbé total obtenu à partir de calculs et de la modélisation des données enregistrées de changements dans la fréquence et la dissipation sont résumés dans le tableau 3. Les études QCM-D de Au (III) l'interaction avec les monocouches fournissent une compréhension plus profonde du métal-biomolécules interaction. Pour la première fois, la capacité de liaison, la cinétique de sorption, et la façon dont le métal influence la stabilité de la protéine ont été étudiés dans un nano-gamme. Après l'addition de la solution de sel métallique à la monocouche SLP1 la fréquence a diminué à l'intérieur de la première 5 min indique une adsorption rapide de masse. Néanmoins, l'adsorption de Au n'a pas été achevé après 60 minutes comme décrit pour d'autres métaux tels que Pd (II) 19 dans des études précédentes. L'augmentation de la masse se produit jusqu'à 18 h. Après cette période, étapes de rinçage avec du tampon ont été effectuées sans métal montrant que le métal adsorbé est presque de manière stable lié à la couche SLP1 recristallisé. Enfin, une absorption de métal de 955,0 ± 2,7 ng ∙ cm -2 (modèle de Kelvin-Voigt) a été obtenu en cas de (III) la solution 1 mM Au et 5,5 ± 4,534.4 ng ∙ cm -2 (modèle de Kelvin-Voigt) dans Au cas d'mM 5 (III). Les valeurs plus élevées obtenues par mM Au (III) 5 solutions peuvent être expliqués par les propriétés intrinsèques de réduction de SLP1 où plus petite métallique Au (0) -NP ont été formés à partir de cette solution. Ces réduisant bonliens de SLP1 ont déjà été rapportés dans les études précédentes pour le Pd (II) et Au (III) 32,33,79,84. Les données ont également montré que l'interaction avec la solution d'or ne conduit pas à une déstabilisation des couches de protéines. Ceci indique la liaison spécifique et stable de Au (III) de SLP1, qui a été également confirmé par des mesures ICP-MS en utilisant des polymères de protéines.

La formation de Au (0) -NP lors de la synthèse peut être visualisée par un changement de couleur de la solution jaune de départ à une une rougeâtre. Ce changement de couleur est provoqué par l'excitation des oscillations de plasmons de surface de nanoparticules métalliques et montre la formation de Au (0) -NPs 1,78. De plus petites IP peuvent être synthétisés par la variation de la concentration de l'agent réducteur (concentration plus élevée d'acide tannique) 85 visible dans une solution de coloration différente et vérifié par le SCP résultats de mesures (données non présentées). SurD'autre part, l'augmentation de la concentration de l'acide tannique conduit à une perte de stabilité et NP NP ont tendance à agglomérer 20. Comme preuve de principe, Au pré-synthétisé (0) (distribution de taille de 10 - 18 nm mesuré par PCS vu dans la figure 7A) de -NPs ont été incubées avec sursis SLP1 pendant 48 heures et analysé par SDS-PAGE. Le profil de protéine représentée sur la figure 7B vérifie la conclusion tirée de données QCM-D, que Au (0) -NPs ne pas déranger la structure SLP1. Les bandes de protéines observées à 150 kDa prouvent la présence de SLP1 intact.

Figure 7
Figure 7. (A) Nombre pondéré distribution de taille de pré-synthétisé Au (0) -NPs mesurée par PCS et (B) du profil de protéine SDS-PAGE de SLP1; piste 1: 2 pg SLP1 avant Au (0) -NPs interaction et la piste 2: 1 pg polymères SLP1 en suspension après 48 heures incuba tion avec pré-synthétisé Au (0) -NPs. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Après le NP-synthèse et la caractérisation, les expériences QCM-D ont été effectuées. L'adsorption de pré-synthétisé métallique Au (0) -NPs est exemplairement illustré pour des expériences QCM-D en Af / AD parcelles (Figure 8 A) et que l'épaisseur et les profils de masse (figure 8B).

Figure 8
Figure 8. L'adsorption de pré-synthétisé Au (0) -NPs sur recristallisé SLP1 Lattice Analysé par QCM-D, (A) dans Af / parcelle AD et (B) surface de la couche et le profil de masse.blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Il a pu être confirmé que QCM-D peut être utilisée pour détecter l'adsorption de la 10 - 18 nm de Au sphérique (0) -NPs. Après addition de la solution non diluée au-NP (A 520 nm = 1) obtenu par la synthèse décrite, la fréquence diminue, ce qui est un indicateur direct de la masse d'adsorption décrite par la prédiction de l'équation Sauerbrey (équation 1). L'adsorption de Au (0) -NPs était presque terminée en moins de 60 min. Après cette période a pas d'IP ont été déposés sur le dessus du treillis SLP1, alors on peut supposer que tous les sites réactifs ou des pores étaient occupées par des Au (0) -NPs. La diminution montré dans la dissipation peut être affilié à la rigidification de SLP1 cause réseau par l'interaction NP. Les valeurs d'adsorption de masse totale sont résumées dans le tableau 3. Même rinçage intensif avec le tampon citrate NP sans conduit neiTher à une désorption des infirmières praticiennes, ni à un détachement de la monocouche SLP1. Par conséquent, une interaction forte et stable peut être prévu pour l'Au (0) -NP interaction dans le même respect comme avec Au (III).

Métal c métal Δm max Δm max épaisseur épaisseur
(ng / cm 2) (ng / cm 2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
1 mM 955 932,6 --- ---
5 mM 4,534.4 4,687.9 --- ---
Au (0) - --- 1,382.9 1,382.7 10.2 10.2
IP

Tableau 3: masse adsorbée sur recristallisé SLP1 Lattice après Au (III) Interaction (pH = 6,0) et Au-NP Adsorption (pH = 4,7) analysé par QCM-D et Calcul de l'épaisseur de la couche après Au (0) -NP Coating. Données modifiées par rapport aux résultats déjà publiés de Suhr, M. et al. (2014) 19.

AFM pour la visualisation des structures nanométriques Scaled

Dans la figure 9, le réseau de protéines de SLP1 recristallisé le PE modifiée capteurs est représenté avec son réseau carré typique (p4) que des images d'amplitude. La constante de réseau peut être déterminée comme 13 - 14 nm, ce qui est comparable aux résultats d'expériences antérieures 30. L'épaisseur de couche de 10 nm ± 2,0 nm mesurée par AFM a vérifié l'épaisseur de la couche prédit des mesures de QCM-D ≈ 11,2 nm (de modélisation Kelvin-Voigt). La légère différence dans la hauteur de la surface peut être expliqué par le fait que le calculATED QCM-D ajustement considère l'ensemble de la zone du capteur tandis que l'étude de l'AFM à haute résolution montre seulement une zone partielle. Compte tenu de cela, des agglomérats de protéines qui ont été attachées à la surface du capteur ont été inclus dans le calcul de la masse adsorbée respectivement à l'épaisseur de la couche et conduit à une épaisseur de couche supérieure à celle déterminée par AFM.

Figure 9
Figure 9. AFM Image Amplitude recristallisé SLP1 Lattice de L. sphaericus JG-B53 sur Cristaux QCM-D Directement après le revêtement et le rinçage avec le tampon et le grossissement de la région marquée; Ce chiffre a été modifié de Suhr, M. et al. (2014) 19 avec l'autorisation de Springer. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La figure 10 montre l'SLP1 intacte après incubation avec treillis Au solution (III). On peut montrer que, après l'incubation, le réseau de protéines est restée intacte. Ceci confirme les résultats des expériences QCM-D qui prédit la stabilité du revêtement. Dans la figure 11A et B adsorbé pré-synthétisé Au (0) -NPs (taille varie de 10 à 18 nm déterminée par SCP) sur le réseau SLP1 sont présentés. En raison de la taille des particules, l'UA (0) -NPs sont adsorbé dans les pores SLP1 et ne suivent pas les -symmetry p4 de SLP1. Au (0) -NPs sont statistique distribuée sur réseau de protéines. En mesurant les tailles de particules dans l'AFM images de hauteur (données non présentées) la taille des infirmières praticiennes est dans la gamme de 16 à 23 nm et encore plus faible, à savoir dans la gamme d'environ 10 nm 19,20. Ce verInès de la taille NP déterminé précédemment mesurée par PCS (voir la figure 8).

Figure 10
Figure 10. AFM Image Amplitude recristallisé et Intact SLP1 Lattice sur Cristaux QCM-D capteur après incubation de 5 mM Au (III) Solution et le grossissement de région marquée; Ce chiffre a été modifié de Suhr, M. et al. (2014) 19 avec l'autorisation de Springer et de Suhr, M. (2015) 20. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 11
Figure 11. (A) AFM amplitude image de adsorbé Au (0) -NPs sur recristallisé réseau SLP1 sur QCM-D cristaux de capteurs (à gauche) Et (B) 3D reconstruite profil de surface (à droite); Ce chiffre a été modifié de Suhr, M. (2015) 20 avec l'autorisation de Springer et Raff, J. et al. (2016) Raff, J. et al. S-couche de nanocomposites à base pour des applications industrielles à base de protéines dans Engineered nanostructures. (eds Tijana Z. Grove et Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (soumis)). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Dans ce travail étudié la liaison aux protéines de Au S-couche a été étudiée en utilisant une combinaison de différentes méthodes analytiques. En particulier, la fixation de Au est très intéressante, non seulement pour la récupération des eaux de Au miniers ou des solutions de traitement, mais également pour la construction de matériaux, par exemple des surfaces sensorielles. Pour les études de l'UA interaction (Au (III) et Au (0) -NPs) avec sursis et monocouche de SLP1 recristallisé, la protéine a dû être isolé. Par conséquent, cette étude a montré la culture réussie de la souche bactérienne gram-positive L. sphaericus JG-B53 et l'isolement de la protéine de couche de surface SLP1. Néanmoins, la culture et l'isolement de la protéine restent difficiles et doivent être optimisés. Une production à grande échelle de protéines de la biomasse et de la couche S est une condition préalable pour une application industrielle à la fois, par exemple, pour la production de matériaux de filtre sélectif de métal. Leur potentiel d'application est undoubtedlY élevé pour l'élimination des métaux toxiques ou la récupération de métaux précieux dissous dans l'eau de process, des eaux usées ou de l'eau de drainage. En outre, le potentiel d'application pour le S-couches est encore plus important compte tenu de leur potentiel supplémentaire dans d'autres matériaux bio-inspirés, tels que les biocapteurs et les catalyseurs.

Les expériences lot-sorption de polymères SLP1 suspension indiquent une liaison élevée et stable de Au (III) au sein de la gamme de pH étudiée de 2,0 à 5,0. Ainsi, l'efficacité d'enlèvement de métal de jusqu'à 60% pourraient être atteints. Ce comportement remarquable de liaison peut être expliquée par une forte interaction de Au (III) avec SLP1 probablement induite par l'interaction de groupes carboxyliques et des groupes d'azote portant présents sur la surface de la protéine. Cette arguments pourraient être renforcer par FTIR et EXAFS enquête de la souche similaire L. sphaericus JG-A12 32,79. Aussi, propriétés réductrices intrinsèques de SLP1 peuvent expliquer la forte RE de Au (III) par ReduCING à nanoparticulaire Au (0). On peut supposer que S-couche, en tant que première interface de bactéries dans l'environnement, doit être principalement impliquée dans la liaison métal. Dans la gamme de pH étudiée, la plus grande capacité avec 102,5 mg d'Au (III) la liaison métal / g SLP1 a été réalisée à pH 4,0. Cette capacité de liaison est plus élevée que celle rapportée pour d'autres bio-composants, par exemple, pour la paroi cellulaire isolée de Bacillus subtilis (71,5 mg d'Au (III) / g) 86 ou pour la biomasse de Chlorella vulgaris (98,5 mg d'Au (III) / g) 8 .

ICP-MS utilisé pour la détermination du métal lié par des polymères est SLP1 méthode très sensible et permet la détection de petites quantités d'or dans cette étude. ICP-MS offre de nombreux avantages pour effectuer des déterminations de traces métalliques, par exemple, le système de manipulation facile et basses limites de détection; dans le cas de l'or vers le bas pour 0.1 - 1 ppt. Cela rend cette méthode un outil polyvalent pour l'étude des processus biosorptive en basse gamme de concentrations. Cependant, les résultats de cette enquête ont été acquises avec des polymères de la couche S suspendus et ne peuvent pas être facilement transférés vers réseaux S-couche recristallisés sur les surfaces, et donc montrent la limitation de ICP-MS. Par exemple, pas de relation directe de polymères de protéines isolées pourrait être faite à ces structures S-couche sur les cellules de bactéries vitales. En outre, les mesures ICP-MS ne permettent pas la détermination de la cinétique de sorption de métal. Par conséquent, il est nécessaire de trouver des méthodes plus approprié pour l'enquête de la liaison par de minces films de protéines immobilisées métal.

Dans la présente étude, une analyse QCM-D ont été appliquées pour détecter la formation in situ du treillis de la couche S sur des surfaces, ainsi que le dépôt d'Au sur les protéines. Par conséquent, QCM-D est une méthode robuste et reproductible pour la reconnaissance des procédés d'adsorption et d'interaction molécule. En outre QCM-D est relativement simple, rentable, et la méthode non dangereux à surveiller sUCH traite en ligne. La méthode a l'avantage de détecter les changements de masse avec une sensibilité maximale de masse dans les liquides de ≈ 0,5 ng ∙ cm -2. Ceci permet la possibilité de détecter même interaction faible, par exemple de protéines avec des métaux dissous ou adsorptions pour mesurer dans des gammes de concentrations faibles. L'inconvénient de QCM-D est que ce pas est un procédé d'imagerie de la structure qui permet la visualisation de par exemple, les réseaux de protéines. Par conséquent, d'autres techniques sont nécessaires.

Le QCM-D analyse dans cette étude ont été suivis par imagerie AFM. La combinaison de ces méthodes a permis l'étude de la cinétique de sorption et les conséquences de Au sorption pour le revêtement, ce qui prouve que ce sont des outils polyvalents pour enquêter sur l'interaction de métal de films protéiques minces. En outre, il a été montré qu'une recristallisation fiable des protéines S-couche sur des supports techniques est indispensable pour des études d'interactions protéiques ultérieurs. Làconséquent, des modifications des surfaces à l'aide de promoteurs d'adhérence présentent un intérêt. Le mode de réalisation décrit de polyélectrolytes (PE se terminant par chargés positivement) en tant que couche intermédiaire entre SiO 2 et des surfaces couche de protéines conduit à un procédé amélioré pour un revêtement de protéine rapide. L'effet positif d'une couche de polyélectrolyte charger positivement a été décrit précédemment pour, par exemple, l'immobilisation du vitales des cellules bactériennes de L. sphaericus JG-31 B53. La mise en œuvre des PE-couches qui sont présentés sont l'étape la plus importante et cruciale pour la recristallisation succès et reproductible tard des protéines de la couche S.

Il a pu être démontré que, pour l'enquête de couches minces de SLP1, QCM-D est une bonne méthode pour montrer l'adsorption de masse respective à la recristallisation de protéines comme des films monocouches en temps réel. Cela pourrait également être observé précédemment pour le remontage de la protéine S-couche SBPA de L. sphaericus </ em> CCM2177 47. En utilisant ultérieur à haute résolution AFM analyse des changements de la structure en treillis des auto-assemblages de protéines peuvent être visualisées. Mesures AFM révèlent la symétrie p4 de SLP1 et confirment l'épaisseur de la couche modélisée de SLP1 d'environ 10 nm. De plus, l'interaction directe des ions métalliques dissous à la couche de protéines peut être contrôlée par QCM-D prouvant la bonne fixation de Au (III) par la couche de protéines sous-jacent. La formation probable de la plus petite Au (0) -NPs de Au solution (III) à l'intérieur des pores de protéines causées par propriétés réductrices intrinsèques du réseau SLP1 sein mesures QCM-D n'a pas pu être détecté par des mesures AFM ultérieures. Cela pourrait être lié à la limite de résolution de l'AFM et de l'expérimental mis en place dans cette étude. Cela montre la limitation de cette technique et la nécessité de l'imagerie haute résolution pour les biomolécules à l'échelle du nanomètre sous. Cependant, une grande stabilité de la couche recristallisée SLP1 pourrait être déduite de the obtenue QCM résultats et a été confirmée par l'enquête AFM.

En conclusion, il pourrait être démontré que les polymères SLP1 ont des capacités de liaison de métal élevés pour l'or au sein de la gamme de pH de l'enquête. En outre, l'enquête révèle que le réseau est SLP1 liaison d'un ion métallique de bonne matrice et pour l'immobilisation de nanoparticules métalliques. Il pourrait être démontré que chaque méthode utilisée dans cet article a la possibilité de détecter même de petites interactions métalliques, ou en cas de l'AFM peut visualiser les structures dans la gamme à l'échelle nanométrique. Bien, il est seulement par la combinaison de ces méthodes indiquées, qui a permis d'améliorer la connaissance et la compréhension des protéines étudiées au niveau moléculaire.

Principalement, QCM-D et l'AFM sont les méthodes préférées de choix pour les recherches à venir de protéines monocouche adsorption et leur interaction avec les métaux et molécules fonctionnelles. En combinant ces deux méthodes, la détection de la S-protéine couche annonceprocessus de sorption et de l'imagerie de surface donne un aperçu des processus moléculaires qui peuvent être en mesure d'être transféré à améliorer la connaissance de bactéries vivantes et de l'interaction avec leur environnement. Cette étude a montré un extrait de méthodes possibles utile pour comprendre l'interaction de protéines et de métal. D'autres techniques utiles qui pourraient améliorer la connaissance de ces processus en détail allant de méthodes de spectrométrie et chromatographiques à diverses spectroscopique enquête de biomolécules et devraient être inclus dans les études futures.

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Disclosures

Les auteurs ont rien à révéler.

Acknowledgments

Le présent travail a été partiellement financé par l'IGF-projet "S-Sieve" (490 ZBG / 1) financé par l'BMWi et le BMBF-projet "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A). Un merci spécial à Tobias J. Günther pour son aide précieuse pendant les études de l'AFM et à Erik V. Johnstone pour lire le manuscrit comme une langue maternelle anglaise. En outre, l'auteur de cet article tient à remercier Aline Ritter et Sabrina Gurlit (de l'Institut pour l'écologie des ressources de l'aide pour les mesures par ICP-MS), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava et de la biotechnologie de groupe de la Helmholtz-Institut Freiberg pour Technology Resource.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System Applikon Biotechnology, Netherlands Z6X Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 BugLab, Concord (CA), USA Z9X ---
Spectrometer Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain 80-2109-10 Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifuge VWR, Germany 521-2844 For centrifugation of cultivation samples
Research system microscope BX-61 Olympus Germany LLC, Germany 037006 Microscope in combination with imaging software
Cell^P (version 3.1) Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany --- together with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S Carr Centritech, Florida, USA 9010PLT For biomasse harvesting
T18 basic Ultra Turrax IKA Labortechnik, Germany 431-2601 For flagella removal and sample homogenization
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA 728411 Used within protein isolation
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot Microfluidics, Massachusetts, USA M110EH30K Used for cell rupture
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany 102041 ---
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) Thermo Fisher Scientific, USA 91-ND-2000C-L For determination of protein concentration
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 165-3322 For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 1708030 Used for imaging of SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000 PerkinElmer, Waltham (MA), USA N8120536 For determination of metal concentration
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom ZEN3600 For determination of nanoparticle size
Q-Sense E4 device  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-E4 ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform)
Q-Soft 401 (data recording) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
QCM-D flow modules QFM 401  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QFM401 ordered via LOT quantum design
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QSX303 ordered via LOT quantum design
Ozone cleaning chamber Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA QS-ESA006 ordered via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA MFP-3DBio AFM measurements and imaging software
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software WaveMetrics, Inc., USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA Bioheater Sample heater for AFM measurements
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2 Olympus Germany LLC, Germany  BL-AC40TS-C2 Prefered cantilever for AFM measurements
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) Nanotec Electronica S.L. , Spain freeware Software for AFM analysis
Name Company Catalog Number Comments
Detergents and other equiment
acidic acid, 100 %, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3738.5 Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Antifoam 204 Sigma-Aldrich Co. LLC. A6426 For foam suppression
bromophenol blue, sodium salt Sigma-Aldrich Co. LLC. B5525 ---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3862.1 ---
Deoxyribonuclease II from porcine spleen Sigma-Aldrich Co. LLC. D4138 Typ IV , 2,000 - 6,000 Kunitz units/mg protein
Ethanol, 95% VWR, Germany 20827.467 Danger, flammable
glycerine, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3783.1 ---
Guanidine hydrochloride (GuHCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 0037.1 ---
Hellmanex III Hellma GmbH & Co. KG 9-307-011-4-507 ---
Hydrochloric acid (HCl) (37%) CARL ROTH GmbH+CO.KG 4625.2 Danger; Corrosive, used for pH adjustment
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich Co. LLC. L6876  Lyophilized powder, protein = 90 %, = 40,000 units/mg protein (Sigma) 
Magnetic stirrer with heating,  MR 3000K Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany 504.10100.00 Standard stirrer within experiment
NB-Media DM180 Mast Diagnostica GmbH 121800 ---
Nitric acid (HNO3) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN50.1 Danger; Oxidizing, Corrosing
PageRuler Unstained Protein Ladder ThermoScientific-Pierce 26614 ---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) Sigma-Aldrich Co. LLC. 243051 Average Mw ~70,000
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich Co. LLC. 408727 Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) Sigma-Aldrich Co. LLC. 60108 Warning; Harmful
Ribonuclease A from bovine pancreas  Sigma-Aldrich Co. LLC. R5503 Type I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein 
Sodium azide (NaN3) Merck KGaA 106688 Danger; very toxic and Dangerous for the environment
Sodium chloride (NaCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3957.2 ---
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich Co. LLC. L-5750 Danger; toxic
Sodium hydroxide (NaOH) CARL ROTH GmbH+CO.KG 6771.1 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000  CARL ROTH GmbH+CO.KG 1893.1 ---
Sulfuric acid (H2SO4) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN52.2 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation
Tannic acid (C76H52O46) Sigma-Aldrich Co. LLC. 16201 ---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 9090.2 ---
Triton X-100 CARL ROTH GmbH+CO.KG 3051.3 Warning; Harmful, Dangerous for the environment
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO Ultrafiltration tubes Sartorius AG VS0132 ---
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich Co. LLC. M6250 Danger, toxic

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