Au-Wechselwirkung von SLP1 Polymere und Monolayer aus

Chemistry

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Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies. J. Vis. Exp. (107), e53572, doi:10.3791/53572 (2016).

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Abstract

Introduction

Aufgrund der zunehmenden Verwendung von Gold für verschiedene Anwendungen wie Elektronik, Katalysatoren, Biosensoren oder medizinische Instrumente hat sich die Nachfrage des Edelmetalls in den letzten Jahren 6-9 gewachsen. Gold sowie viele andere wertvolle und Schwermetalle in die Umwelt über industrielle Abwässer in verdünnten Konzentrationen durch Bergbauaktivitäten freigesetzt, und Entsorgungs 7,8,10, obwohl die meisten Umweltkontamination durch schwere oder Edelmetalle ist ein fortlaufender Prozess vor allem durch technologische Aktivitäten verursacht. Dies führt zu einer erheblichen Störung der natürlichen Ökosysteme und könnte möglicherweise die menschliche Gesundheit gefährden 9. Die Kenntnis dieser negativen Ergebnisse fördert die Suche nach neuen Techniken, um Metalle aus kontaminierten Ökosystemen und Verbesserungen beim Recycling von Metallen aus industriellen Abwässern zu entfernen. Etablierte physikalisch-chemische Methoden wie Fällung oder Ionenaustausch sind nicht so effektiv, vor allem in der Hochly verdünnten Lösungen 7,8,11. Biosorption entweder mit lebenden oder toten Biomasse, ist eine attraktive Alternative für die Abwasserbehandlung 10,12. Die Verwendung solcher biologischer Materialien kann der Verbrauch von toxischen Chemikalien zu verringern. Viele Mikroorganismen beschrieben worden zu sammeln oder zu immobilisieren Metallen. Zum Beispiel Zellen der Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 haben hohe Bindungskapazitäten für Edelmetalle, dargestellt beispielsweise Pd (II), Pt (II), Au (III) und anderen toxischen Metallen wie Pb (II) oder U (VI) 4,13, Zellen des Bacillus megaterium für Cr (VI) 14, Zellen von Saccharomyces cerevisiae für Pt (II) und Pd (II) 15 und Chlorella vulgäre zur Au (III) und U (VI) 16 , 17. Die Bindung von Metallen wie Au vorherigen (III), Pd (II) und Pt (II) wurde auch für Desulfovibrio desulfuricans 18 gemeldet und L. sphaericus JG-B53 19,20. Dennoch sind nicht all Mikroben binden große Mengen von Metallen und deren Anwendung als Sorptionsmaterial begrenzt 12,21. Weiterhin Metallbindungskapazität hängt von verschiedenen Parametern, beispielsweise Zell-Zusammensetzung, die verwendet Biokomponente oder Umwelt- und experimentellen Bedingungen (pH, Ionenstärke, Temperatur etc.). Das Studium der isolierten Zellwandfragmente 22,23, wie Membranlipiden, Peptidoglycan, Proteinen oder anderen Komponenten kann dabei die Metallbindungsverfahren komplexer aufgebaut ganzen Zellen 8,21 zu verstehen.

Die Zellbestandteile in dieser Studie konzentrierte sich auf sind S-Layer-Proteine. S-Layer-Proteine ​​sind Teile der äußeren Zellhülle von vielen Bakterien und Archaebakterien, und sie machen etwa 15 bis 20% der Gesamtproteinmasse dieser Organismen. Wie die erste Schnittstelle für die Umwelt, diese Zell Verbindungen beeinflussen die Bakterien Sorptionseigenschaften 3. S-Schicht-Proteine ​​mit Molekulargewichten im Bereich von vierzigHunderte von kDa sind innerhalb der Zelle produziert, aber außerhalb montiert, wo sie in der Lage, Schichten auf den Lipidmembranen oder polymere Zellwandbestandteile bilden. Nach der Isolierung fast alle S-Layer-Proteine ​​die intrinsische Eigenschaft, sich spontan durch Selbstorganisation in Suspension, an Grenzflächen oder auf Oberflächen bilden ebene oder röhrenförmige Gebilde 3. Die Dicke der Proteinmonoschicht hängt von den Bakterien und ist in einem Bereich von 5 bis 25 nm 24. Im Allgemeinen können die gebildeten S-Layer-Protein-Strukturen eine schräge (P1 oder P2), quadratisch (p4) oder hexagonal (p3 oder P6) symmetrisch Gitterkonstanten von 2,5 bis 35 nm 3,24 haben. Die Gitterbildung scheint in vielen Fällen abhängig von zweiwertigen Kationen und hauptsächlich Ca 2+ 25,26, Raff, J. et al. S-Layer-basierte Nanokomposite für industrielle Anwendungen in Proteinbasis Engineered Nanostrukturen. (Hrsg Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (eingereicht)). Dennoch ist die vollständige Reaktionskaskade des Monomers Faltung Monomer-Monomer-Wechselwirkung, die Bildung eines Gitters, und die Rolle, die aus unterschiedlichen Metallen, insbesondere zweiwertigen Kationen, wie Ca 2+ und Mg 2+, noch nicht vollständig verstanden.

Die Gram-positive Stamm L. sphaericus JG-B53 27 (von Bacillus sphaericus, nachdem neue phylogenetische Einordnung umbenannt) wurde aus dem Uranbergbau Halde "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Sachsen, Deutschland) 4,28,29 isoliert. Seine Funktions S-Layer-Protein (SLP1) einen quadratischen Gitter, ein Molekulargewicht von 116 kDa 30 und eine Dicke von ≈ 10 nm an lebenden Bakterienzellen 31. In früheren Studien wurde die in vitro Bildung einer geschlossenen und stabilen Proteinschicht mit einer Dicke von etwa 10 nm in weniger als 10 min 19 erreicht. Die verwandten Stammes L. sphaericus JG- angezeigtA12, auch ein Isolat aus dem "Haberland" Haufen, besitzt eine hohe Metallbindungskapazitäten und seiner isolierten S-Schicht-Protein hat eine hohe chemische und mechanische Stabilität und gute Sorptionsraten für Edelmetalle wie Au (III) gezeigt, Pt (II), und Pd (II) 4,32,33. Diese Bindung von Edelmetallen ist mehr oder weniger spezifisch für bestimmte Metalle und hängt von der Verfügbarkeit der funktionellen Gruppen auf der äußeren und inneren Proteinoberfläche des Polymers und die in ihren Poren, der Ionenstärke und dem pH-Wert. Relevante funktionelle Gruppen für die Metall-Wechselwirkung durch die Proteine ​​sind COOH-, NH 2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 - und SO. Grundsätzlich Metallbindungskapazitäten eröffnen ein breites Spektrum von Anwendungen, Raff, J. et al. S-Layer-basierte Nanokomposite für industrielle Anwendungen in Proteinbasis Engineered Nanostrukturen. (Hrsg Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (eingereicht)). zB als biosorptive Komponenten zur Entfernung oder Wiederherstellungvon gelösten toxischen oder wertvolle Metalle, Vorlagen für die Synthese oder definierte Abscheidung von regelmäßig strukturierten metallischen Nanopartikeln (NPs) für die Katalyse und andere Bio-engineered Materialien wie Bio-sensorischen Schichten 3,5,18,33. Regelmäßig angeordnet NP Arrays wie Au (0) -NPs könnte für große Anwendungen, die von der molekularen Elektronik und Biosensoren, Ultrahochdichte-Speichergeräte, und Katalysatoren für die CO-Oxidation 34-37 verwendet werden. Die Entwicklung solcher Anwendungen und intelligente Design dieser Materialien erfordert ein tieferes Verständnis der zugrundeliegenden Metallbindungsmechanismen.

Eine Voraussetzung für die Entwicklung solcher Materialien auf biologischer Basis ist die zuverlässige Ausführung eines Schnittstellenschicht zwischen dem Biomolekül und der technische Oberfläche 38,39. Zum Beispiel Polyelektrolyte mit der Schicht-für-Schicht (LBL) Technik 40,41 zusammengebaut wurden als Zwischenschicht zur Rekristallisation von S-Layer-Proteine ​​39 verwendet wurden 19,42, Raff, J. et al machen. S-Layer-basierte Nanokomposite für industrielle Anwendungen in Proteinbasis Engineered Nanostrukturen. (Hrsg Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (eingereicht)). Jedoch ist die komplexen Mechanismen der Proteinadsorption und Protein-Oberflächen-Wechselwirkung nicht vollständig verstanden. Vor allem Informationen über Konformation, Muster Orientierung und Beschichtungsdichten fehlt noch.

Quarzmikrowaage mit Verlustüberwachung (QCM-D) Technik hat sich die Aufmerksamkeit in den letzten Jahren als ein Werkzeug für die Untersuchung der Proteinadsorption, Beschichtungs Kinetik und Interaktion pro zogenProzesse auf der Nanometerskala 19,43-45. Diese Technik ermöglicht die detaillierte Erfassung der Masse Adsorption in Echtzeit und kann als Indikator für das Protein selbst Montage und die Kopplung der funktionellen Moleküle auf Proteingitter 19,20,42,46-48 verwendet werden. Darüber hinaus öffnen QCM-D-Messungen die Möglichkeit, Metallwechselwirkungsprozesse mit der proteinhaltigen Schicht unter natürlichen biologischen Bedingungen zu studieren. In einer neueren Studie der Wechselwirkung des S-Layer-Protein mit ausgewählten Metallen wie Eu (III), Au (III), Pd (II) und Pt (II) wurde mit der QCM-D 19,20 sucht. Die adsorbierte Proteinschicht kann als vereinfachtes Modell eines Zellwand von gram-positiven Bakterien dienen. Die Untersuchung dieses einzelne Komponente kann zu einem tieferen Verständnis der Metall-Wechselwirkung beitragen. Allerdings wissen nur QCM-D-Experimente nicht Aussagen in Bezug auf Oberflächenstrukturen und Einflüsse von Metallen, um Protein zu ermöglichen. Andere Techniken sind notwendig, um diese Informationen zu erhalten. Eine postung für Abbildungs ​​bio-Nanostrukturen und Gewinnung von Informationen über Struktureigenschaften ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM).

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Sorption von Gold (Au (III) und Au (0) -NPs) bis S-Layer-Proteine ​​zu untersuchen, insbesondere SLP1 von L. sphaericus JG-B53. 5.0 Verwendung von ICP-MS und immobilisiert S-Schichten unter Verwendung von QCM-D - Experimente wurden mit suspendierten Proteine ​​auf Ansatzgröße in einem pH-Bereich von 2,0 durchgeführt. Zusätzlich wurde der Einfluß der Metallsalzlösung auf dem Gitter Stabilität mit anschließender AFM-Studien untersucht. Die Kombination dieser Techniken trägt zu einem besseren Verständnis der in-vitro-Metall-Interaktionsprozesse als Werkzeug für das Lernen mehr über Bindungsereignisse auf ganze Bakterienzellen in Bezug auf bestimmte Metall Affinitäten. Diese Erkenntnis ist nicht nur wichtig für die Entwicklung von anwendbaren Filtermaterialien zur Rückgewinnung von Metallen für den Umweltschutz und zur Erhaltung der WiederQuellen 49, sondern auch für die Entwicklung von hoch geordneten Arrays von metallischen Nanopartikeln für verschiedene technische Anwendungen.

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Protocol

1. Mikroorganismus und Anzuchtbedingungen

Anmerkung:. Alle Experimente wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt L. sphaericus JG-B53 wurde von einem kryokonserviert Kultur 29,30 erhalten.

  1. Transfer kryokonserviert Kultur (1,5 ml) unter der Sterilbank auf 300 ml sterile Nährbrühe (NB) Medien (3 g / l Fleischextrakt, 5 g / l Pepton, 10 g / l NaCl). Danach rühren Sie die Lösung für mindestens 6 h bei 30 ° C, um die Vorkultur für den Anbau zu erhalten.
  2. Kultivieren der Bakterien unter aeroben Bedingungen in NB Medien bei pH 7,0, 30 ° C in einem 70 L skaliert Dampf-in-place-Bioreaktor. Deshalb füllen den Reaktor mit ≈ 57 L VE-Wasser. Hinzufügen und lösen feste NB Medien direkt im Bioreaktor (Konzentrationen siehe oben).
    1. Zusätzlich fügen Antischaummittel (30 & mgr; l / L NB-Medium) an die Medien, um während der Kultivierung die Schaumbildung zu unterdrücken, dann Autoklaven (122 ° C, Temperaturhaltezeit 30 min) die Medienim Inneren des Reaktoranlage.
  3. Kühlen Sie sich die Medien und führen komplette Sauerstoffsättigung. Den pH-Wert auf 7,0 (mit 1 MH 2 SO 4 und 2 M NaOH) und starten Sie die automatische Impfung des 300 ml Vorkultur. Starten Sie die Datenaufzeichnung der Kultivierungsparameter an der Impfstelle. Melden Sie sich Online-Parameter zB gelöstem Sauerstoff (DO 2), Säure- und Basenadditions und pH-Werte im Anbau.
    1. Überwachung des Bakterienwachstums Online durch die nicht-invasive Trübungsmessungen.
  4. Führen Sie zusätzliche Probenahme nach jeder Stunde des Anbaus und der Bestimmung weiterer Parameter wie Bio Trockengewicht (BDW) und Offline-optische Dichte (OD). Daher sammeln 20 ml Kultivierungsbrühe an jedem Probenpunkt unter sterilen Bedingungen.
    1. Bestimmen Sie offline OD durch photometrische Messung der Absorption bei 600 nm. Verwenden Sie sterile filtrierte NB-Medium als Leerwert. Achterner erreichte Adsorption> 0,4 ​​verdünnten Zellsuspension nach der Linearität des Lambert-Beer'schen Gesetz.
    2. Zur Bestimmung BDW Zentrifuge 1 bis 5 ml Bakteriensuspension (abhängig von der Zelldichte) bei 5000 × g für 5 min bei RT. Trocknen des erhaltenen Zellpellets bei 105 ° C in einem Heizofen bis Massenstabilität und messen die Pelletmasse.
  5. Nehmen mikroskopische Bilder mit optischen Phasenkontrastforschungsmikroskop in 400 und 1000 facher Vergrößerung (Phasenkontrast Kondensator 2 und 3) zur Überprüfung des bakteriellen Wachstums und als Kreuzkontaminationskontrolle.
  6. Nach dem Erreichen der nach online erfasst exponentiellen Wachstumsphase DO 2 und Online-Trübung, Ernte der Biomasse von Flow-Through-Zentrifugation bei 15.000 × g, 4 ° C und zweimal waschen der Biomasse mit Standard-Puffer (50 mM Tris, 10 mM MgCl 2, 3 mM NaN 3, pH = 7,5).
    Hinweis: Die gewonnene Biomasse Pellet bei -18 & # gespeichert werden176; C bis zur weiteren Verwendung zur Isolierung.

2. S-Layer-Protein Isolierung und Reinigung

Hinweis: Reinigen SLP1 Polymere gemäß einem angepassten Verfahren wie zuvor 2,19,30,32,50,51 beschrieben.

  1. Homogenisieren gewaschen und aufgetauten rohen Biomasse aus dem Anbau in Standardpuffer erhalten (1: 1 (w / v)), um Geißeln mit Hilfe eines Dispergators (Ebene 3, 10 min) unter Eisbadkühlung bei 4 ° C zu entfernen.
  2. Zentrifugieren Sie die Suspension (8.000 × g, 4 ° C für 20 min) und zweimal waschen das erhaltene Pellet mit Standard-Puffer (1: 1 (w / v)). Nach Waschen und Zentrifugation (8000 x g, 4 ° C für 20 min), das Pellet in Standardpuffer (1: 1 (w / v)), fügen DNase II und RNase (0,4 Einheiten / g Biomasse) zu der Suspension und zerfallen die Zellen bei 1000 bar mit einem Hochdruckhomogenisator. Danach zentrifugieren der Suspension bei 27.500 x g, 4 ° C für 1 Stunde.
    Hinweis: Steuerzellsuspension mit den Forschungs mikop. Bruch ist abgeschlossen, wenn weniger als 2-3 intakte Zellen in das Gesichtsfeld des Mikroskops in 400-facher Vergrößerung sichtbar sind.
  3. Zweimal Waschen des Pellets mit Standard-Puffer (1: 1 (w / v)) und führen Sie die Zentrifugation erneut. Anschließend das Pellet in Standardpuffer (2: 1 (w / v)) mit 1% Triton X-100 gemischt und inkubiert für 20 Minuten unter aufeinander Schütteln (100 UpM), um Lipidablagerungen solubilisieren.
  4. Zentrifuge die Lösung (27.500 × g, 4 ° C für 1 h), und die erhaltenen Pellets dreimal Waschen mit Standardpuffer (1: 1 (w / v)).
  5. Inkubieren nach zusätzlicher Zentrifugation (27.500 × g, 4 ° C für 1 h) 6 h lang in Standardpuffer erhaltene Pellet (1: 1 (w / v)) mit 0,2 g / l Lysozym, gemischt werden, um Bindungen in Peptidoglycan 50 hydrolysieren. Zusätzlich zu der Suspension hinzu DNase II und RNase (jeweils 0,4 Einheiten / g Biomasse).
  6. Nach Zentrifugation (45.500 × g, 4 ° C, 1 h), resuspendieren obere weiße Proteinphase mit einem geringen Volumen von ter Zentrifugationsüberstand (<30 ml), die Protein-Untereinheiten.
  7. Solubilisierung des weißen Suspension durch Mischen von 1: 1 mit 6 M Guanidinhydrochlorid (6 M GuHCl, 50 mM TRIS, pH = 7,2). Die Lösung wird hell.
  8. Zuführen Sterilfiltration (0,2 um) des GuHCl behandelte Lösung gefolgt von einer zusätzlichen Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation (45.500 × g, 4 ° C für 1 h).
  9. Den Überstand in einen Dialysemembranrohre (MWCO 50.000 Dalton) dialysiert gegen Rekristallisation Puffer (1,5 mM Tris, 10 mM CaCl 2, pH = 8,0) für 48 Stunden.
  10. Übertragen Sie die weißen rekristallisierte Proteinpolymerlösung in Rohren und Zentrifuge bei 45.500 × g, 4 ° C für 1 Stunde. Das Pellet in einem geringen Volumen von ultrareinem Wasser (<30 ml).
  11. Anschließend übertragen Sie die Suspension in Dialysemembran Röhren und führen Sie eine Dialyse gegen Reinstwasser für 24 Stunden, um Pufferinhalt zu entfernen.
    Hinweis: Mehrere Pufferwechsel oder Reinstwasser dährend der Dialyse sind unverzichtbar.
  12. Lyophilisieren die gereinigt SLP1 in einem Gefriertrockner.

3. Charakterisierung und Quantifizierung von SLP1 für Experimente

Anmerkung: SLP1 Konzentration zur Sorption und Beschichtungsexperimente wurden durch UV-VIS-Spektrophotometrie quantifiziert.

  1. Pipette 2 ul SLP1 Probe direkt auf die untere Mess Sockel des Photometers. Bestimmen Proteinkonzentration bei Adsorptionsbedingungen Maximum bei einer Wellenlänge von 280 nm, die charakteristisch für Proteine. Verwenden Sie die Extinktionskoeffizienten von 0,61 bis SLP1 Konzentration zu bestimmen. Verwenden SLP1 kostenlose Lösung für Referenzmessungen.
  2. Verdünnen des Proteins mit dem Puffer (für Sorptionsexperimenten im Batch-Modus zu verwenden 0,9% NaCl, pH = 6,0 und für die QCM-D Experimenten Umkristallisation Puffer, pH = 8,0) bis zur gewünschten Konzentration für die Experimente (1 g / L und 0,2 g / L beziehungsweise).
  3. Analysieren SLP1 Qualität und Molekulargewicht durch die Standard bioanalytical Verfahren Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Elektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli, UK 52 beschrieben.
    1. Führen SDS-PAGE, bevor Sie SLP1 in Experimenten und zB nach Au (0) -NP Inkubation mit 10% Polyacrylamid Trenn Gele.
    2. Für SDS-Proben-Mix ≈10 ul der Anbau oder Proteinprobe mit Probenpuffer (1,97 g TRIS, 5 mg Bromphenolblau, 5,8 ml Glycerin, 1 g SDS, 2,5 ml β-Mercaptoethanol, füllen mit hochreinem Wasser bis 50 ml) in ein Verhältnis von 1: 1 (v / v) und Pipetten der Mischung nach 4 min Inkubation bei 95 ° C in die Geltaschen.
    3. Run SDS-PAGE 30 Minuten bei einer Spannung von 60 V, bis die Proben übergeben Sie die Sammlung Gel und Änderungsspannung bis 120 V, wenn das Bestehen der Trennung Gel.
    4. Entfernen Sie die Gele aus dem Gel-System gründlich mit hochreinem Wasser und Platz für 1 h in Fixierungslösung (10% Essigsäure, 50% absolutem Ethanol). Danach spülen Sie die Gele mit hochreinem Wasser.
    5. Stain Geledurch die Verwendung eines geeignet unspezifische kolloidale Coomassie-Brilliantblau-Methode 53,54. Nach Entfärben 72,73 nehmen SDS-PAGE-Bilder von der Gel-Dokumentations-System nach Herstellerprotokoll.

4. Sorptionsexperimenten im Batch-Modus und Metall Quantifizierung

  1. Für Batch Sorptionsexperimenten vorzubereiten Au (III) Stammlösung von HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O verdünnt man das Metallsalz und mischen Sie es mit dem SLP1 / NaCl-Lösung auf einen anfänglichen Metallkonzentration von 1 mM und letzte SLP1 Konzentration von 1 g / l . Führen Sie Experimente in Dreiergruppen mit einem zusätzlichen Negativkontrolle ohne SLP1. Verwenden Sie ein Gesamtvolumen von 5 ml für Sorptionsexperimenten.
  2. Schütteln Sie die Suspension kontinuierlich bei RT an verschiedenen voreingestellten pH-Werten zwischen 2,0 bis 5,0 während 24 Stunden (pH-Einstellung mit niedriger konzentrierte HCl und NaOH-Lösung).
  3. Nach der Sorption Zentrifugation der Proben bei 15000 x g, 4 ° C für 20 min), um Separaß SLP1 vom Überstand.
  4. Den Überstand in die Ultrafiltrationsröhrchen (MWCO 50.000 Da) und Zentrifuge diese bei 15.000 × g, 4 ° C für 20 min, um gelösten Proteins Monomere zu entfernen.
  5. Bestimmen Sie die Metallkonzentration in dem erhaltenen Filtrat durch ICP-MS 19,20 und die Ergebnisse für die Rückrechnung des sorbierten Metall vom SLP1 Trockenmasse. Messprinzipien wurden Möglichkeiten des Verfahrens und der Komponenten des verwendeten ICP-MS in der Literatur 55 beschrieben.
    1. Vorbereitung der Proben und Referenzen für ICP-MS-Messungen unter Verwendung von 1% HNO 3 als Matrix und Rhodium als interner Standard (1 mg / ml).

5. Synthese von Au-NP und Bestimmung von Partikelgröße

Anmerkung: Citrat stabilisiert Au (0) -NP wurden gemäß einem zuvor durch Mühlpfordt, H. et al angepasst Verfahren synthetisiert. (1982), um kugelförmige Teilchen mit einem Durchmesser unter Erhalt von 10 bis 15 nm 56,57

  1. Bereiten Sie eine stabilisierte 25 mM HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O Lager für den NP-Bildung.
  2. Verdünnen Sie 250 ul dieser Stammlösung in 19,75 ml hochreinem Wasser und Inkubation diese auf 61 ° C für 15 Minuten unter Schütteln aufeinander.
  3. Vorbereitung 5 ml einer zweiten Stammlösung (12 mM Gerbsäure, 7 mM Natriumcitrat-Dihydrat, 0,05 mM K 2 CO 3) und inkubiere die 2. Lösung getrennt bei 61 ° C für 15 min.
  4. Fügen Sie unter konstantem Rühren der 2. Stammlösung zu einer Lösung. Rühre das Reaktionsgemisch für mindestens 10 Minuten bei 61 ° C. Danach abkühlen lassen die Lösung und es für NP-Beschichtung auf SLP1 Gitter innerhalb QCM-D-Experimente.
    Hinweis: Die resultierende Au (0) -NP wurden mit UV-VIS-Spektroskopie bei dem Absorptionsmaximum von 520 nm, typischerweise zum Nachweis von Au gebildet (0) -NPs 58 verwendet wird. Die Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden.
  5. Analysieren Sie die Größe des gebildetenAu (0) -NP durch Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS), die auch als dynamische Lichtstreuung, ist bekannt.
    1. Zur Bestimmung der NP Größe, über 1,5 ml synthetisiert Au (0) -NP Lösung in Küvetten unter staubfreien Bedingungen in einer Laminar-Flow-Box und analysieren sie mit einer Größe und Zetapotential-Partikelmessgerät. Eine detaillierte Beschreibung des PCS und Probenvorbereitung ist in Schurtenberger, P. et al. (1993) 59 und Jain, R. et al. (2015) 60.

6. QCM-D-Experimente - SLP1 Beschichtung auf Oberflächen und Au-NP Adsorption auf SLP1 Lattice

Hinweis: Die Messungen wurden mit einem QCM-D mit bis zu vier Flow-Module ausgestattet ist. Alle QCM-D Versuche wurden mit einer konstanten Fließgeschwindigkeit von 125 ul / min bei 25 ° C durchgeführt. Slp1 Beschichtung und Metall / NP Inkubation wurden auf SiO 2 piezo AT-geschnittenen Quarz-Sensoren (Ø 14 mm) mit einer Grundfrequenz von ≈ 5 MHz durchgeführt. Spülschritte und fügenition der Lösung sind in den Figuren der repräsentative Ergebnisse Teil markiert. Die QCM-D Experimenten könnte als ein Schritt für Schritt Weise beginnend mit Reinigen und Oberflächenmodifikation der verwendeten Sensoren, gefolgt von SLP1 Rekristallisation und später auf dem Metall und Metalloxid NP Wechselwirkung beschrieben.

  1. Reinigungsverfahren:
    1. Statten Sie die Flüssigkeitszellen mit Sensor-Attrappen. Pumpe mindestens 20 ml (jeweils pro Modul) eines alkalischen flüssigen Reinigungsmittel (2% Reinigungsmittel in ultrareinem Wasser (v / v)) über die QCM-D und Schlauchsystem. Danach pumpen das fünffache Volumen (jeweils pro Modul) von ultrareinem Wasser durch das System (Durchflussmenge bis zu 300 & mgr; l / min). Führen Sie die Reinigung nach dem Protokoll des Herstellers.
    2. Reinigen Sie die SiO 2 Sensoren außerhalb der Flow-Module durch Inkubation (mindestens 20 min) in 2% SDS-Lösung und mehrmals gründlich die Sensoren danach mit Reinstwasser 61,62.
    3. Trocknen Sie die Kristalle gefiltert compressed Luft und legen Sie sie in einem Ozonreinigungskammer für 20 min 63,64.
    4. Wiederholen Sie den Reinigungsvorgang zweimal, um alle organischen Inhaltsstoffe zu entfernen.
    5. Um von der Sensoroberfläche zu entfernen gebundenen Metallen spülen Sie die Sensoren mit 1 M HNO 3. Danach führen alle Spülschritte mit hochreinem Wasser.
  2. Sensor Oberflächenmodifikation durch Polyelektrolyte:
    Hinweis: Die Oberflächenmodifizierung kann entweder im Inneren (durchströmen Verfahren) oder außerhalb des Strömungsmoduls (LbL-Technik). In diesen Experimenten, die auf folgende Weise, um die Oberflächen zu modifizieren, verwendet.
    1. Ändern Sie die Sensoren mit 3 g / l aus alternierenden Schichten von PE Polyethylenimin (PEI, MW 25.000) und Polystyrolsulfonat (PSS, MW 70.000) über Tauchbeschichtung mit LbL-Technik 40,41 vorher für den speziellen verbreitete System in dem Artikel von beschrieben Suhr, M. et al. (2014) 19.
    2. Legen Sie die Sensoren im Inneren des entsprechenden PE-Lösung in tiefen well Platten und inkubieren Sie diese für 10 min bei RT.
    3. Nehmen Sie die Sensoren aus der PE-Lösung und spülen Sie die Sensoren zwischen jedem Tauchbeschichtungsschritt intensiv mit hochreinem Wasser.
      Hinweis: Der neue Oberflächenmodifikation aus mindestens drei PE-Schicht endet mit positiv geladenen PEI.
    4. Nach dieser externen Modifikation platzieren Sie die Sensoren im Inneren des Durchflussmodul und ins Gleichgewicht kommen die Sensoren durch Spülen mit hochreinem Wasser vor dem Start der Experimente.
  3. SLP1 Monolayer Umkristallisation:
    1. Aufzulösen SLP1 in 4 M Harnstoff zum Umwandeln Polymeren in Monomeren.
    2. Zentrifugieren monomerisiert Proteine ​​bei 15.000 × g, 4 ° C für 1 Stunde, um größere Agglomerate zu entfernen Protein.
    3. Mischen das solubilisiert und zentrifugiert SLP1 Stand mit Umkristallisieren Puffer auf eine endgültige Proteinkonzentration von 0,2 g / L.
      Hinweis: Das Kalzium abhängig Rekristallisation SLP1 (Selbstmontage) beginnt mit der Zugabe des recrystallization Puffer. Daher pumpen die gemischte Lösung mit einer Fließgeschwindigkeit von 125 ul / min zu den Sensoren (im Strömungsmodulen platziert) unmittelbar. Die Rekristallisation nach stabilen Werten der Frequenz und Verlust Verschiebungen wurden innerhalb von QCM-D-Experimente nachgewiesen wurde.
    4. Nach erfolgreicher Protein Umkristallisation oben auf den PE-modifizierten Sensoren innerhalb der Strömungsmodule Spülen der beschichteten Sensoren Umkristallisation Puffer oder ultra waterintensively mit einer Fließgeschwindigkeit von 125 ul / min, bis stabile Werte der Frequenz und der Verlust Verschiebungen wurden nachgewiesen.
      Hinweis: Der SiO 2 Oberflächenmodifizierung mit PE zur späteren Sorptionsexperimenten auf SLP1 Monoschicht und AFM-Untersuchungen ist in Abbildung 1 visualisiert.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematischer Aufbau PE Oberflächenmodifizierung und SLP1 MonolayerBeschichtung; Diese Zahl hat sich von Suhr, M. et al modifiziert. (2015) 19 mit Genehmigung von Springer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Metall und Metall NP Interaktion:
    Anmerkung: Die Sorption mit dem Au-Metallsalzlösung (HAuCl 43 H 2 O) wurde in einer Konzentration von 1 mM oder 5 mM bei pH = 6,0 mit 0,9% NaCl-Lösung durchgeführt. Au-NP-Adsorption wurde mit unverdünntem Au-NPs in 1,6 mM Tri-Natrium-Citrat-Puffer bei pH ≈ 5,0 getan.
    1. Nach erfolgreicher SLP1 Beschichtung in den Flow-Module, spülen Sie die erhaltenen SLP1 Schicht intensiv mit 0,9% NaCl-Lösung, bis stabile Werte für Frequenz und Verlustverschiebungen festgestellt wurden.
    2. Pumpe den vorbereiteten Metalllösung (1 mM) und NP-Lösung für die Leistungsmodule mit einer Fließgeschwindigkeit von 125 ul / min und verfolgen die Massen Adsorption an der Slp1 Schicht. Massen Adsorption kann direkt durch die Verfolgung der Frequenzverschiebungen für den Sauerbrey Gleichung (Gleichung 1) ermittelt werden.
    3. Nach Abschluss der Metalle und Metall NP Wechselwirkung, spülen Sie die Schicht mit Metall / NP freien Puffer zu schwach gebundenen oder schwach befestigt Metalle oder Nanopartikel zu entfernen.
      Wichtig: eine Darstellung der Versuchsaufbau ist in Figur 2 gezeigt.

Figur 2
Abbildung 2. Schematischer Aufbau QCM-D-Setup unter Verwendung von Flow Modul QFM 401 * 66. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Datenerfassung und Auswertung:
    1. Notieren Sie sich die Verschiebungen in der Frequenz in Hz (Af n) und Verlustleistung (& Delta; D n) Innerhalb der QCM-D-Experimente unter Verwendung von QCM-D spezifische Software.
    2. Verwenden Sie für die Auswertung des adsorbierten Massensensitivität (Delta; m) die Sauerbrey-Gleichung / Modell (Gleichung 1) 65 66, das gilt für ohne Reibung auf der Sensoroberfläche zu der n-ten Oberschwingung angewendet gekoppelt dünn und Hartfolien ist. Der Begriff C (Sauerbrey konstant) für das verwendete 5 MHz AT-Quarzsensor 17,7 ng ∙ ∙ Hz -1 cm -2 68. Für starre, gleichmäßig verteilt, und ausreichend dünn adsorbierten Schichten zu verwenden Gleichung 1 als eine gute Annäherung.
      Gleichung 1
    3. Führen Sie zusätzliche Modellierung nach der Kelvin-Voigt-Modell gilt für viskoelastische Moleküle 68-71 mit dem herstellerspezifischen Software und vergleichen die Ergebnisse mit dem der Sauerbrey-Modell.
    4. Für die Berechnung der Schichtdicke und Masse Adsorption Verwendungals wichtige Modellparameter eine Schichtdichte der adsorbierten Schicht von 1,35 g cm -3 ∙ entsprechend zuvor für S-Schicht-Proteine ​​72-75 beschriebenen Werte. Verwenden Sie den gleichen Wert für die Berechnung der Metall-Wechselwirkung mit dem proteinhaltigen Schicht.

7. AFM-Messungen

  1. Führen Studien mit vollständig in der Lage AFM auf einer umgekehrten Lichtmikroskop.
    1. Nehmen Sie AFM-Aufnahmen in flüssiger mit dem Umkristallisieren Puffer oder ultrareinem Wasser direkt auf die beschichtete QCM-D-Sensoren.
    2. Spülen Sie die Sensoren mit hochreinem Wasser nach der QCM-D-Experimente und legen Sie sie im Inneren des AFM Fluidzelle. Daher geschlossenes Flüssigkeitszelle mit einem Gesamtvolumen von etwa 1,5 ml. Halten der Temperatur der Fluidzelle konstant bei 30 ° C.
    3. Verwenden einen Ausleger mit einer Resonanzfrequenz von ≈ 25 kHz in Wasser und einer Steifigkeit von <0,1 N / m. Einstellen der Abtastgeschwindigkeit zwischen 2,5 und 10 & mgr; m / sec.
    4. 76.
      Achtung: Höhe Bilder mit z-Skala gezeigt, während der z-Werte die genaue Topographie der Oberfläche. Amplitude (Pseudo 3D) Bilder ohne z-Skala gezeigt, weil Amplitude z-Werte hängen von Scan-Parameter und tragen begrenzte Informationen. Die Analyse der Bilder wurde unter Verwendung von drei verschiedenen Auswertungssoftware 77 getan.

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Representative Results

Kultivierung von Mikroorganismen und SLP1 Charakterisierung

Die aufgezeichneten Daten des Bakterienwachstums zeigt das Ende der exponentiellen Wachstumsphase bei etwa 5 Stunden. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass SLP1 können von diesem Zeitpunkt der Ernte (4,36 g / L nasser Biomasse (≈ 1,45 g / L (BDW)) mit einer maximalen Ausbeute 19 isoliert werden. Dennoch Optimierung der Kultivierung mithilfe von definierten Medien Komponenten oder Fed- Batch-Kultivierung Strategien zu höheren Biomasseerträge zu der Zeit führen. Dies ist unabdingbar für die Nutzung der hohen Menge an Biomasse für industrielle Anwendungen. Die Werte aus der Online- und Offline-zeichneten Kultivierungsparameter sind in der 3A zusammengefasst. Die mikroskopische Kontrolle (3B) Ernte Show nicht-sporenbildenden Zellen von L. sphaericus JG-B53.


Abbildung 3: (A) Online- und Offline-Messkultivierungsparameter von L. sphaericus JG-B53 und (B) mikroskopische Aufnahme von lebenswichtigen Bakterienzellen von L. sphaericus JG-B53 zum Zeitpunkt der Ernte in 400-facher Vergrößerung; Diese Zahl hat sich von Suhr, M. et al modifiziert. (2014) 19 mit Genehmigung von Springer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Auch ein zusätzlich aus SDS-PAGE-Proteinprofil (4A) gibt die maximale Menge von SLP1 zum Zeitpunkt von 5 h der Kultivierung. Die Proteinbande entsprechend SLP1 (≈ 150 kDa) dicker ist, aber von hier an einem Intensitätsverlust wurde beobachtet Tischtdurch eine Erhöhung der Proteine ​​mit niedrigerem Molekulargewicht durch mögliche Proteinfragmentierung oder Abgrenzung von anderen Proteinen verursacht ied. Die Banden isolierte und gereinigte Proteine, die von der obigen (4B) erwähnten Verfahren erhalten entsprechen einem Molekulargewicht von etwa 150 kDa, das schwerer ist als das berechnete Gewicht basierend auf Sequenzdaten von SLP1 (116 kDa) 30 ist. Dies ist wahrscheinlich auf posttranslationale Modifikationen. Andere Gründe für die Diskrepanz zwischen theoretischen Molekülmasse und der beobachteten Molekülmasse in SDS-Gelen sind möglicherweise gebührenpflichtig abhängigen Artefakten im SDS-Gel 30.

Figur 4
Abbildung 4. Protein-Profilen durch SDS-PAGE (A) zerfiel Bakterienzellen aus dem Anbau Proben und (B) nach der erfolgreichen Isolierung gereinigt SLP1 erhalten; Diese fiAbbildung aus Suhr, M. et al modifiziert. (2014) 19 mit Genehmigung von Springer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Batch-Sorptionsexperimenten und Bestimmung von Au mit ICP-MS

Die maximale Metallbindungskapazitäten (q max) von Au (III) durch suspendiert SLP1 sind in Abbildung 5 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass Au (III) wurde stabil durch SLP1 während der 24-stündigen Inkubation in der untersuchten pH-Bereich gebunden. Ergebnisse zeigen, q max in dem Bereich von etwa 80 - 100 mg Au (III) / g SLP1. Die zusammengefassten Werte (Tabelle 1) wurden mit der Sorptionskapazität von ca. 75 mg Au (III) / g SLP1 zuvor berichtet von Suhr, M. et al verglichen. (2014) aus Versuchen mit selbsteinstellend erhaltenpH-Wert durch Zugabe der Metallsalzlösung (pH ≈ 4,3) 19. Zusammenfassend hat SLP1 die Fähigkeit, große Mengen an zunächst hinzugefügt Au (III) zu binden, beweist seine hohe Bindungskapazitäten für dieses Element angezeigt.

Figur 5
Abbildung 5. Schematische Darstellung der Maximalmetallbindungskapazitäten (q max) von Au (III), um SLP1 Polymere im pH-eingestellte Experimenten im Vergleich zu Sorption Ergebnisse mit selbst eingestellten pH-Werte (≈ 4.3) von Suhr, M. et al. (2014) 19. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die berechneten Metallentfernungseffizienz (RE) im untersuchten pH-Bereich lagen zwischen 50 - 60% und bestätigte damit die Wiedernisse von Suhr, M. et al. (2014), wobei Werte von etwa 40% erreicht wurden. In bisherigen Experimenten starken Wechselwirkungen von Au (III) mit den funktionellen Gruppen beispielsweise Carboxyl-, Hydroxyl- und Aminogruppen, für S-Schicht-Proteine ​​wie SLP1 und für das Vergleichsprotein SlfB von L. beobachtet sphaericus JG-A12 1,78. Jankowski, U. et al. (2010) festgestellt spektroskopisch eine starke Wechselwirkung der Au (III) vor allem mit Carbongruppen SlfB, die auch für SLP1 von L. abgeleitet werden könnte sphaericus JG-B53 20,79,80. Auch intrinsische Proteineigenschaften, die Au (III), um Au reduzieren würde (0) in Abwesenheit von Reduktionsmitteln könnte ein Grund für die starke Wechselwirkung 79 sein. Weiterhin sind die Ergebnisse dieser Studie zeigen, die Tendenz einer bevorzugten Bindung von SLP1 bei niedrigeren pH-Werten. Auf der anderen Seite, eine verbindliche bei niedrigeren pH-Werten könnte auch zu einer Denaturierung von SLP1 führen. Studien zur SLP1 erwies sich als Proteinstabilität auf pH =3,0 (unveröffentlichte Ergebnisse). Aus Desorptionsexperimente unter sauren Bedingungen unter Verwendung von beispielsweise Salpetersäure oder mit Komplexbildnern wie EDTA oder Citrat (Daten nicht gezeigt), überprüft, dass Gold wurde stabil gebunden und konnte nicht von SLP1 Polymere gelöst werden.

Au (III) am SLP1 von L. sphaericus JG-B53
c Anfangs (mg / L) 196,97
pH 5 4.5 ≈ 4,3 23 4 3.5 3 2.5 2
Wert
q max 88,3 85,3 74,7 102,5 94,1 81 101,9 96,9
(mg Au (III) / g SLP1)
RE 47,1 47,8 37,9 57,1 54,1 44,8 58,7 56,5
(%)

Tabelle 1: Maximale Metallbindungskapazitäten (q max) und Metallentfernungseffizienz (RE) von Batch-Sorptionsexperimenten mit Au (III) und SLP1 Polymeren in Lösung mittels ICP-MS analysiert. Daten gegenüber früher veröffentlichten Ergebnisse von Suhr, M. et al. (2014) 19.

SLP1 Monolayer Umkristallisation durch QCM-D Raupen

Die sofortige Abnahme der Frequenz (& Dgr; 5, & Dgr; 7, & Dgr; 9, & Dgr; 11) zeigt eine schnelle Adsorption und eine hohe Affinität der Proteine ​​an die PE-modifizierte Oberfläche (6A). Gleich der schnellen Veränderung der Frequenz, die Verlustleistung (& Delta; D 5, & Delta; D 7, & Delta; D 9, & Delta; D 11) erhöht sich auch sofort. Diese Tatsache zeigt, eine Adsorption von viskoelastischen Molekülen an der Oberfläche, weil der schnelle Dämpfung, was zu zunehmenden Verlustwerte. Die maximale Frequenzverschiebung wird nach 5 min mit einem Wert von ≈ 95 Hz, und & Delta; D von 4,2 erreicht. Zu einem späteren Zeitpunkt auftreten nur Umordnungen umkristallisiert SLP1. SLP1 Adsorption wurde auf diese Weise für mehr als 60 Minuten, um sicherzustellen, t durchgeführter Bildung einer fast vollständig bedeckten Oberfläche und regelmäßig geordneten Proteingitter. Das Experiment zeigt, dass die positiv geladenen PE Schicht unverzichtbar zum Erreichen einer stabilen Beschichtungen führt negativen Ende Modifikation einer schwachen Adsorption und mehr Beschichtungs Kinetik 38 (Daten nicht gezeigt). Schwach befestigt Proteine ​​und Agglomerate wurden durch Spülen mit SLP1 freie Rekristallisation Puffer entfernt. Die kleine Änderungen der Af n bestätigen die geringe Protein Desorption und stabile Adsorption von SLP1. Trotzdem die Dissipation sinkt auf ≈ 2,8 anzeigt, dass größere elastische Moleküle werden entfernt.

Figur 6
Abbildung 6. Umkristallisation SLP1 Modifiziert SiO 2 Sensoren von QCM-D analysiert werden; (A) in Af / & Delta; D Handlung und (B) Oberflächendicke profile; Diese Zahl hat sich von Suhr, M. et al modifiziert. (2014) 19 mit Genehmigung von Springer und Suhr, M. (2015) 20. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Das Oberflächenprofil, indem Sie die oben genannte Modelle berechnet zeigen eine SLP1 Mono Dicke ≈ 11,2 nm (Kelvin-Voigt-Modell für elastische Folien) und von 10,0 nm (Sauerbrey Modell für starre Schicht) (6B). Diese Werte sind niedriger als die von Suhr, M. et al. (2014). Die Unterschiede können von einem anderen gedruckten Wert der Proteinschichtdichte innerhalb der Modellierungs erläutert. Die aktuellen Werte sind näher an Realitäten der Schichtdicke der S-Schicht-Proteine ​​auf der Zelloberfläche von lebenden Zellen von L. sein sphaericus JG-B53 31,42. Diese Modellierung zeigt, dass das Verhältnis i Sauerbreys ungeeignet für akustische Dünnproteinhaltige Schicht, wegen einer Ausbreitung der Scherschallwelle in viskoelastischen Flüssigkeitsfilmen 81,82, die in einer Unterschätzung der adsorbierten SLP1 Masse und Dicke ergibt. Dies kann durch die elastischen Eigenschaften der S-Schicht-Proteine ​​und ihre Kopplung von Wassermolekülen während der Adsorption erläutert. Die Wechselwirkung von Wasser mit Proteinen kann leicht durch Bildung von Hydrathüllen, Reibungswiderstand oder Einschluss in Hohlräume in der adsorbierten Schicht 83 beschrieben. Dies bewirkt eine höhere Schichtdicke durch die Kelvin-Voigt-Modell gemessen und auch die Unterschiede in der Schichtdicke durch die zwei verschiedenen Modellen erhalten zu klären. In früheren AFM Untersuchungen wurden Schichtdicken von SLP1 Gittern von rund 8-12 nm gemessen. Durch Berechnung des Massen Adsorption von SLP1 anstelle Schichtdicke, & Delta; m von insgesamt 1506,6 ng ∙ cm -2 (Kelvin-Voigt-Modell) berechnet. Die Daten der Massen Adsorption an surfAsse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt und zeigen eine hohe Massen Adsorption unter Verwendung der Werte der Kelvin-Voigt-Modell.

m max & Dgr; m max Dicke Dicke
(ng / cm 2) (ng / cm 2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
Slp1 nach der Beschichtung und Spülen 1,505.6 1,351.6 11.2 10

Tabelle 2: Adsorb Masse SLP1 Modifiziert Polyelectrolyte SiO 2 Kristalle durch QCM-D Nach dem Spülen mit Umkristallisation Buffer analysiert (pH = 8,0) und berechnete Schichtdicke.

QCM-D als Werkzeug für die Detektion von Metall und NP Wechselwirkungen mit Proteinhaltige SLP1 Monolayer

Die Wechselwirkung von umkristallisiert SLP1 Monoschicht mit 1 mM und 5 mM gelöst Au (III) untersucht. Die Ergebnisse der Gesamt adsorbierte Menge von Berechnungen und Modellierung der aufgezeichneten Daten der Änderungen in der Frequenz und der Verlust erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Die QCM-D-Studien von Au (III) Interaktion mit der Monoschichten zu einem tieferen Verständnis der Metall-Biomolekül Interaktion. Zum ersten Mal, die Bindungskapazität, Sorptionskinetik, und wie die metal beeinflusst die Proteinstabilität wurden in einem Nano-Bereich untersucht. Nach der Zugabe der Metallsalzlösung zu der SLP1 Monoschicht die Frequenz verringert wird innerhalb der ersten 5 min, die eine schnelle Massen Adsorption. Dennoch ist die Adsorption von Au wurde nach 60 min für andere Metalle wie Pd (II) in früheren Studien beschrieben 19 abgeschlossen. Die Massenzunahme tritt bis zu 18 Std. Nach dieser Zeit wurden die Spülschritte mit Metall freien Puffers zeigt, dass die adsorbierten Metall nahezu stabil an rekristallisierten SLP1 Schicht gebunden geführt. Schließlich wurde ein Gesamtmetall Absorption von 955,0 ± 2,7 ng ∙ cm -2 (Kelvin-Voigt-Modell) im Falle der 1 mM Au (III) -Lösung und 4,534.4 ± 5,5 ng ∙ cm -2 (Kelvin-Voigt-Modell), erhalten Bei 5 mM Au (III). Die höheren Werte durch 5 mM Au (III) Lösungen erhalten kann durch intrinsische Reduktion Eigenschaften SLP1 wo kleinste metallische Au (0) -NP wurden aus dieser Lösung gebildet erläutert. Diese Verringerung der richtigenBande der SLP1 wurden bereits in früheren Studien für Pd (II) und Au gemeldet (III) 32,33,79,84. Die Daten zeigten auch, dass die Wechselwirkung mit der Goldlösung führt nicht zu einer Destabilisierung der Proteinschichten führen. Dies zeigt die spezifische und stabile Bindung von Au (III), um SLP1, die auch durch ICP-MS-Messungen unter Verwendung von Protein-Polymere bestätigt wurde.

Die Bildung von Au (0) -NP während der Synthese konnte durch Farbwechsel von der Start gelbe Lösung zu einem rötlichen einem visualisiert werden. Diese Farbänderung wird durch die Anregung der Oberflächenplasmonenschwingungen metallischer Nanopartikel verursacht wird, und belegt die Bildung von Au (0) -NPs 1,78. Weiterhin kleineren NPs können durch die Variation der Konzentration des Reduktionsmittels (höhere Gerbsäurekonzentration) 85 in einer unterschiedlichen Farbgebung Lösung sichtbar und als Ergebnis der PCS-Messungen verifiziert synthetisiert werden (Daten nicht gezeigt). Auf demAndererseits erhöht Gerbsäurekonzentration führt zu einem Verlust an Stabilität und NP NP zum Agglomerieren neigen 20. Als Beweis für das Prinzip, vorsynthetisierten Au (0) -NPs (Größenverteilung von 10 bis 18 nm durch PCS in 7A gesehen, gemessen) wurden mit suspendierten SLP1 für 48 Stunden inkubiert und durch SDS-PAGE analysiert. Das Proteinprofil in 7B gezeigt prüft den Abschluß von QCM-D Daten gezogen, dass Au (0) -NPs nicht SLP1 Struktur stören. Die beobachteten Proteinbanden bei 150 kDa beweisen die Anwesenheit von intakten SLP1.

Figur 7
Abbildung 7 (A) Anzahl gewichtet Größenverteilung vorsynthetisierten Au (0) -NPs von PCS und (B) SDS-PAGE Proteinprofil SLP1 gemessen; Spur 1: 2 ug SLP1 vor Au (0) -NPs Interaktion und Spur 2: 1 ug SLP1 Polymeren in Suspension nach 48 h Incuba tion mit vorsynthetisierten Au (0) -NPs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Nach dem NP-Synthese und Charakterisierung wurden QCM-D Experimente durchgeführt. Die Adsorption von vorsynthetisierten metallischen Au (0) -NPs ist exemplarisch für die QCM-D Versuche Af / & Delta; D Parzellen (Figur 8 A) und als Dicke und Masse Profile (8B) gezeigt.

Abbildung 8
Abbildung 8. Die Adsorption von Pre-synthetisiert Au (0) -NPs auf Rekristallisiertes SLP1 Lattice von QCM-D, (A) in Af / & Delta; D Handlung und (B) Schichtoberfläche und der Massenprofil analysiert.blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Es konnte bestätigt werden, dass QCM-D verwendet werden, um die Adsorption des 10 erkennen werden - 18 nm sphärischen Au (0) -NPs. Nach Zugabe von unverdünntem Au-NP-Lösung (A 520 nm = 1) durch die beschriebene Synthese erhalten, wird die Frequenz verringert, was ein direkter Indikator für die Vorhersage der Sauerbrey Gleichung (Gleichung 1) definierte Masse Adsorption. Die Adsorption von Au (0) -NPs fast innerhalb von weniger als 60 Minuten abgeschlossen. Nach dieser Zeit wurden keine weiteren Nanopartikeln auf der Oberseite der SLP1 Gitter abgeschieden, so dass davon auszugehen ist, daß alle reaktiven Stellen oder Poren wurden durch Au (0) -NPs besetzt werden. Die dargestellte Rückgang der Verlustleistung kann zur Versteifung des SLP1 Gitter Ursache von der NP-Interaktion assoziiert werden. Die Werte der Gesamtmasse der Adsorption sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Auch Intensiv Spülen mit dem NP-freie Citratpuffer führt neither zu einer Desorption von Nanopartikeln noch zu einer Ablösung der SLP1 Monoschicht. Daher kann eine stabile und starke Interaktion für die Au (0) -NP Interaktion in gleicher Hinsicht wie bei Au (III) vorhergesagt werden.

Metall c Metall & Dgr; m max & Dgr; m max Dicke Dicke
(ng / cm 2) (ng / cm 2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
1 mM 955 932,6 --- ---
5 mM 4,534.4 4,687.9 --- ---
Au (0) - --- 1,382.9 1,382.7 10.2 10.2
NPs

Tabelle 3: Adsorb Messe am Rekristallisiertes SLP1 Lattice nach Au (III) Interaction (pH = 6,0) und Au-NP Adsorption (pH = 4,7) durch QCM-D und Berechnung der Schichtdicke nach Au (0) -NP Coating analysiert. Daten gegenüber früher veröffentlichten Ergebnisse von Suhr, M. et al. (2014) 19.

AFM für die Visualisierung von Nanometer-Strukturen Scaled

Abbildung 9 ist die Proteingitter SLP1 umkristallisiert PE modifiziert Sensoren mit ihren typischen quadratischen Gitter (p4) als Amplitudenbilder gezeigt. 14 nm, die vergleichbar mit den Ergebnissen früherer Versuche 30 - die Gitterkonstante könnte als 13 bestimmt werden. Die Schichtdicke von 10 nm ± 2,0 nm durch AFM gemessen, überprüft die vorhergesagte Schichtdicke der QCM-D Messungen ≈ 11,2 nm (Kelvin-Voigt-Modellierung). Der geringe Unterschied in der Oberflächenhöhe kann durch die Tatsache, dass die calcul erklärtATED QCM-D fit hält die gesamte Sensorfläche, während die hochauflösende AFM Studie zeigt, nur einen Teilbereich. Angesichts dieser Tatsache wurden die Protein Agglomerate, die an die Sensoroberfläche gebunden wurden bei der Berechnung der Masse des adsorbierten bzw. der Schichtdicke enthalten und zu einer höheren Schichtdicke als durch AFM bestimmt.

Figur 9
Abbildung 9. AFM Amplitudenbild rekristallisierter SLP1 Lattice von L. sphaericus JG-B53 auf QCM-D-Kristalle Direkt nach dem Beschichten und Spülen mit Puffer und Vergrößerung des markierten Bereichs; Diese Zahl hat sich von Suhr, M. et al modifiziert. (2014) 19 mit Genehmigung von Springer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 10 zeigt die intakte SLP1 Gitter nach Inkubation mit Au (III) -Lösung. Es kann gezeigt werden, dass nach der Inkubation wurde das Proteingitter vollständig intakt blieben. Dies bestätigt die Ergebnisse der QCM-D Experimente, die die Stabilität der Beschichtung vorausgesagt. In 11A und B die adsorbierte vorsynthetisierten Au (0) -NPs (Größe variiert von 10 bis 18 nm durch PCS bestimmt) auf den SLP1 Gitter gezeigt. Durch die Partikelgröße, die Au (0) -NPs sind in den SLP1 Poren adsorbiert und nicht die p4 -Symmetrie der SLP1 folgen. Au (0) -NPs statistische auf Proteingitter verteilt. Durch die Messung der Partikelgrößen im AFM Höhenbilder (Daten nicht gezeigt), die Größe der Nanopartikel im Bereich von 16 bis 23 nm und sogar noch kleiner, und zwar im Bereich von etwa 10 nm 19,20. Dies verifies die bestimmt NP Größe zuvor gemessen durch PCS (in 8 zu sehen).

Figur 10
Abbildung 10. AFM-Amplitudenbild von umkristallisiert und Intact SLP1 Lattice auf QCM-D-Sensor-Kristalle nach der Inkubation von 5 mM Au (III) Lösung und Vergrößerung des markierten Bereichs; Diese Zahl hat sich von Suhr, M. et al modifiziert. (2014) 19 mit Genehmigung von Springer und Suhr, M. (2015) 20. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

11
Abbildung 11 (A) AFM-Amplitudenbild adsorbierter Au (0) -NPs auf umkristallisiert SLP1 Gitter auf QCM-D-Sensor-Kristalle (links) Und (B) 3D-Rekonstruktionsoberflächenprofil (rechts); Diese Zahl hat sich von Suhr, M. (2015) 20 mit Genehmigung von Springer und Raff, J. et al modifiziert. (2016) Raff, J. et al. S-Layer-basierte Nanokomposite für industrielle Anwendungen in Proteinbasis Engineered Nanostrukturen. (Hrsg Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (eingereicht)). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

In dieser Arbeit untersuchten die Bindung von Au auf S-Layer-Proteine ​​wurde unter Verwendung einer Kombination von verschiedenen analytischen Methoden untersucht. Insbesondere die Bindung von Au ist sehr attraktiv, nicht nur für die Wiedergewinnung von Au aus dem Bergbau, Wasser oder Prozesslösungen, sondern auch für die Konstruktion von Materialien, zB sensorischen Oberflächen. Für Studien der Wechselwirkung Au (Au (III) und Au (0) -NPs) mit suspendierten und umkristallisiert Monoschicht von SLP1, das Protein mussten isoliert werden. Daher hat diese Studie die erfolgreiche Kultivierung des grampositiven Bakterienstamm L. gezeigt sphaericus JG-B53 und die Isolierung des Oberflächenschichtprotein SLP1. Dennoch ist der Anbau und die Proteinisolierung bleiben anspruchsvoll und sollte optimiert werden. Eine großtechnische Herstellung von Biomasse und S-Layer-Proteine ​​ist eine Voraussetzung für eine industrielle Anwendung von beiden, beispielsweise für die Herstellung von Metall-selektive Filtermaterialien. Ihr Anwendungspotenzial ist undoubtedly Hoch für die Entfernung von toxischen Metallen oder die Rückgewinnung wertvoller Metalle in Prozess Wasser gelöst, Abwasser oder Drainagewasser. Darüber hinaus ist das Anwendungspotenzial für die S-Schichten noch größere Berücksichtigung ihrer zusätzliches Potenzial in anderen bio-inspirierte Materialien, wie Biosensoren und Katalysatoren.

Die chargen Sorptionsexperimenten suspendierter SLP1 Polymeren zeigte einen hohen und stabilen Bindung von Au (III) im untersuchten pH-Bereich von 2,0 bis 5,0. Dadurch könnten Metallentfernungswirkungsgrade von bis zu 60% erreicht werden. Diese bemerkenswerte Bindungsverhalten kann durch eine starke Wechselwirkung zwischen Au (III) mit SLP1 wahrscheinlich durch die Wechselwirkung von Carbongruppen und stickstoffhaltige Gruppen auf der Oberfläche des Proteins vorliegen induzierte erläutert. Diese Argumente, die von FTIR und EXAFS Untersuchung des ähnlichen Stamm L. gestärkt werden könnte sphaericus JG-A12 32,79. Auch kann intrinsische reduzierenden Eigenschaften SLP1 die hohe RE von Au (III) durch redu erklärencing es um Au nanopartikuläre (0). Es kann angenommen werden, dass S-Schicht als erste Schnittstelle von Bakterien für die Umwelt, sollte vor allem in der Metallbindung beteiligt sein werden. Innerhalb der untersuchten pH-Bereich, der höchsten Metallbindevermögen mit 102,5 mg Au (III) / g SLP1 wurde bei pH 4,0 erreicht. Diese Bindungskapazität ist höher als für andere bio-Komponenten, zB für isolierte Zellwand von Bacillus subtilis (71,5 mg Au (III) / g) berichteten 86 oder Biomasse von Chlorella vulgaris (98,5 mg Au (III) / g) 8 .

ICP-MS zur Bestimmung des gebundenen Metalls durch SLP1 Polymeren ist sehr sensitives Verfahren und ermöglicht die Detektion auch kleinster Mengen von Gold in dieser Studie. ICP-MS bietet viele Vorteile für die Durchführung Spurenmetallbestimmungen, beispielsweise einfache Handhabung System und niedrige Nachweisgrenzen; im Fall von Gold auf 0,1 bis 1 ppt. Dies macht diese Methode einen vielseitiges Werkzeug für die Untersuchung biosorptive Prozesse im niedrigen Konzentrationsbereichs. Jedoch waren die Ergebnisse in dieser Untersuchung mit suspendierten S-Layer-Polymere gewonnen und können nicht leicht an S-Schicht-Gitter auf Oberflächen umkristallisiert übertragen werden, und daher zeigen die Begrenzung der ICP-MS. Zum Beispiel könnte keine direkte Beziehung von isolierten Proteinpolymere zu diesen S-Schichtstrukturen auf vitalen Bakterienzellen hergestellt werden. Hinzu kommt, dass die ICP-MS-Messungen nicht zulassen, dass die Bestimmung der Kinetik der Metall Sorption. Daher ist es notwendig, Verfahren besser geeignet für die Untersuchung der Metallbindung, die durch dünne immobilisierten Proteinfilmen finden.

In der vorliegenden Studie wurden die QCM-D Analysen angewendet, um die in situ-Bildung von S-Schicht-Gitter auf Oberflächen als auch die Abscheidung von Gold auf die Proteine ​​zu detektieren. Daher ist QCM-D ein stabiles und reproduzierbares Verfahren zur Erkennung von Molekülen Adsorption und Interaktionsprozesse. Zusätzlich QCM-D ist eine relativ einfache, kostengünstige und ungefährliche Verfahren zur Überwachung such Prozesse online. Das Verfahren hat den Vorteil, Massenänderung mit einer Höchstmasse Empfindlichkeit in Flüssigkeiten von ≈ 0,5 ng ∙ cm -2 zu erkennen. Dies ermöglicht es die Möglichkeit, selbst schwache Wechselwirkung, zB mit gelösten Metalle erkennen, von Protein oder Adsorptionen in niedrigen Konzentrationsbereichen zu messen. Der Nachteil der QCM-D ist, dass dies nicht eine Struktur bildgebendes Verfahren, die Visualisierung von zB Proteingitter ermöglicht. Deshalb sind andere Techniken notwendig.

Die QCM-D-Analysen in dieser Studie wurden durch AFM verfolgt. Die Kombination dieser Verfahren erlaubt die Untersuchung der Sorptionskinetik und Folgen von Au Sorption für die Beschichtung, was beweist, dass sie vielseitige Werkzeuge zur Untersuchung von Metall-Wechselwirkung von dünnen proteinartigen Filmen. Weiterhin wurde gezeigt, dass ein zuverlässiges Rekristallisation der S-Schicht-Proteine ​​auf Orthesen ist wichtig für die anschließende Proteininteraktionsstudien. DortVordergrund, sind Modifikationen der Oberflächen mit Haftvermittler von Interesse. Die beschriebene Umsetzung von Polyelektrolyten (endend mit positiv geladenen PEs) als Zwischenschicht zwischen SiO 2 Oberflächen und Proteinschicht führen zu einem verbesserten Verfahren für die schnelle Proteinbeschichtung. Der positive Effekt einer positiv geladenen Polyelektrolytschicht zuvor für Beispiel Immobilisierung von vitaler Bakterien-Zellen von L. beschrieben sphaericus JG-B53 31. Die Implementierung der vorgestellten PE-Schichten sind die wichtigsten und kritischer Schritt für die spätere erfolgreiche und reproduzierbare Rekristallisation von S-Layer-Proteine.

Es konnte gezeigt werden, daß für die Untersuchung von dünnen Schichten von SLP1 ist QCM-D eine gute Methode, um die Masse Adsorption jeweiligen an das Protein Rekristallisation als Monoschichtfolien in Echtzeit zu zeigen. Dies könnte auch zuvor für das Wiederzusammensetzen des S-Layer-Protein von L. SbpA beachten sphaericus </ em> CCM2177 47. Mithilfe nachfolgenden Hochauflösung AFM analysiert Änderungen der Gitterstruktur der Proteinselbstanordnungen visualisiert werden. AFM-Messungen zeigte die p4 Symmetrie SLP1 und bestätigen Sie die modellierten Schichtdicke von SLP1 von etwa 10 nm. Auch könnte die direkte Wechselwirkung von gelösten Metallionen mit der Proteinschicht durch QCM-D überwacht werden beweisen eine gute Bindung von Au (III) durch die darunterliegende Proteinschicht. Die wahrscheinliche Bildung des kleinsten Au (0) -NPs von Au (III) Lösung innerhalb Proteinporen durch intrinsische reduzierenden Eigenschaften des SLP1 Gitter innerhalb QCM-D-Messungen verursacht nicht durch nachfolgende AFM-Messungen festgestellt. Dies könnte zu der Auflösungsgrenze des AFM und dem experimentellen in dieser Studie festgelegt bezogen werden. Dies zeigt die Begrenzung dieser Technik und die Notwendigkeit der hochauflösende Abbildung für Biomoleküle im Sub-Nanometer-Maßstab. Jedoch könnte eine hohe Stabilität des umkristallisierten SLP1 Schicht von th ableitene erhalten QCM-Ergebnisse und wurde von AFM Untersuchung bestätigte.

Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass SLP1 Polymere haben hohe Metallbindungskapazitäten für Gold innerhalb der untersuchten pH-Bereich. Ferner die Untersuchung, daß die Gitter SLP1 ist eine gute Matrixmetallionenbindung und für die Immobilisierung von metallischen Nanopartikeln. Es konnte gezeigt werden, dass jeder in diesem Artikel verwendete Methode hat die Möglichkeit, auch kleine Metall-Wechselwirkungen, oder im Falle eines AFM erkennen können Strukturen im nanoskaligen Bereich zu visualisieren. Obwohl, es ist nur durch die Kombination dieser Methoden dargestellt, die es ermöglicht hat, um das Wissen und Verständnis der untersuchten Proteine ​​auf molekularer Ebene zu verbessern.

Hauptsächlich QCM-D und AFM sind die bevorzugten Verfahren der Wahl für zukünftige Untersuchungen der Proteinmonoschicht Adsorption und ihre Wechselwirkung mit Metallen und funktionellen Molekülen. Durch die Kombination dieser beiden Methoden, die Detektion von S-Layer-Protein adSorptionsprozesse und Oberflächenbildgebungs gibt einen Einblick in molekulare Prozesse, die in der Lage, überführt, um das Wissen von lebenden Bakterien und das Zusammenspiel mit ihrer Umgebung zu verbessern sein können. Diese Studie zeigte einen Ausschnitt der möglichen Methoden hilfreich für das Verständnis Protein und Metall-Wechselwirkung. Weitere hilfreiche Techniken, die das Wissen über solche Prozesse im Detail von verschiedenen spektrometrischen und chromatographische Methoden zur Untersuchung von Biomolekülen spektroskopischen und erhöhen könnten, sollten in zukünftigen Studien aufgenommen werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die vorliegende Arbeit wurde teilweise durch die IGF-Projekt "S-Sieve" (490 ZBG / 1) durch das BMWi und des BMBF-Projektes "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A) finanziert finanziert. Besonderen Dank an Tobias J. Günther für seine wertvolle Hilfe bei der AFM-Studien und um Erik V. Johnstone zum Lesen des Manuskripts als englischer Muttersprachler. Ferner würde der Autor dieses Papieres gerne Aline Ritter und Sabrina Gurlit (vom Institut für Ressourcenökologie zur Unterstützung bei der ICP-MS-Messungen) zu danken, Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava und die Gruppe Biotechnologie des Helmholtz-Institut Freiberg für Ressourcentechnologie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System Applikon Biotechnology, Netherlands Z6X Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 BugLab, Concord (CA), USA Z9X ---
Spectrometer Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain 80-2109-10 Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifuge VWR, Germany 521-2844 For centrifugation of cultivation samples
Research system microscope BX-61 Olympus Germany LLC, Germany 037006 Microscope in combination with imaging software
Cell^P (version 3.1) Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany --- together with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S Carr Centritech, Florida, USA 9010PLT For biomasse harvesting
T18 basic Ultra Turrax IKA Labortechnik, Germany 431-2601 For flagella removal and sample homogenization
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA 728411 Used within protein isolation
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot Microfluidics, Massachusetts, USA M110EH30K Used for cell rupture
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany 102041 ---
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) Thermo Fisher Scientific, USA 91-ND-2000C-L For determination of protein concentration
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 165-3322 For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 1708030 Used for imaging of SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000 PerkinElmer, Waltham (MA), USA N8120536 For determination of metal concentration
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom ZEN3600 For determination of nanoparticle size
Q-Sense E4 device  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-E4 ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform)
Q-Soft 401 (data recording) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
QCM-D flow modules QFM 401  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QFM401 ordered via LOT quantum design
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QSX303 ordered via LOT quantum design
Ozone cleaning chamber Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA QS-ESA006 ordered via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA MFP-3DBio AFM measurements and imaging software
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software WaveMetrics, Inc., USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA Bioheater Sample heater for AFM measurements
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2 Olympus Germany LLC, Germany  BL-AC40TS-C2 Prefered cantilever for AFM measurements
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) Nanotec Electronica S.L. , Spain freeware Software for AFM analysis
Name Company Catalog Number Comments
Detergents and other equiment
acidic acid, 100 %, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3738.5 Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Antifoam 204 Sigma-Aldrich Co. LLC. A6426 For foam suppression
bromophenol blue, sodium salt Sigma-Aldrich Co. LLC. B5525 ---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3862.1 ---
Deoxyribonuclease II from porcine spleen Sigma-Aldrich Co. LLC. D4138 Typ IV , 2,000 - 6,000 Kunitz units/mg protein
Ethanol, 95% VWR, Germany 20827.467 Danger, flammable
glycerine, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3783.1 ---
Guanidine hydrochloride (GuHCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 0037.1 ---
Hellmanex III Hellma GmbH & Co. KG 9-307-011-4-507 ---
Hydrochloric acid (HCl) (37%) CARL ROTH GmbH+CO.KG 4625.2 Danger; Corrosive, used for pH adjustment
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich Co. LLC. L6876  Lyophilized powder, protein = 90 %, = 40,000 units/mg protein (Sigma) 
Magnetic stirrer with heating,  MR 3000K Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany 504.10100.00 Standard stirrer within experiment
NB-Media DM180 Mast Diagnostica GmbH 121800 ---
Nitric acid (HNO3) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN50.1 Danger; Oxidizing, Corrosing
PageRuler Unstained Protein Ladder ThermoScientific-Pierce 26614 ---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) Sigma-Aldrich Co. LLC. 243051 Average Mw ~70,000
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich Co. LLC. 408727 Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) Sigma-Aldrich Co. LLC. 60108 Warning; Harmful
Ribonuclease A from bovine pancreas  Sigma-Aldrich Co. LLC. R5503 Type I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein 
Sodium azide (NaN3) Merck KGaA 106688 Danger; very toxic and Dangerous for the environment
Sodium chloride (NaCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3957.2 ---
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich Co. LLC. L-5750 Danger; toxic
Sodium hydroxide (NaOH) CARL ROTH GmbH+CO.KG 6771.1 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000  CARL ROTH GmbH+CO.KG 1893.1 ---
Sulfuric acid (H2SO4) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN52.2 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation
Tannic acid (C76H52O46) Sigma-Aldrich Co. LLC. 16201 ---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 9090.2 ---
Triton X-100 CARL ROTH GmbH+CO.KG 3051.3 Warning; Harmful, Dangerous for the environment
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO Ultrafiltration tubes Sartorius AG VS0132 ---
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich Co. LLC. M6250 Danger, toxic

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